Summary

Fingeravtrykk Kardiolipin i Leukocytter ved massespektrometri for en rask diagnose av barthsyndrom

Published: March 23, 2022
doi:

Summary

Denne protokollen viser hvordan du får et massespektrometrisk “fingeravtrykk” av leukocytt kardiolipin for diagnostisering av Barth syndrom. Vurderingen av forhøyet monolysocardilipin til kardiolipinforhold diskriminerer pasienter med Barth syndrom fra kontroll hjertesviktpasienter med 100% følsomhet og spesifisitet.

Abstract

Kardiolipin (CL), en dimerisk fosfolipid som bærer fire fettsyrekjeder i sin struktur, er lipidmarkøren for mitokondrier, hvor den spiller en avgjørende rolle i den indre membranens funksjon. Dens metabolitt monolysocardiolipin (MLCL) er fysiologisk nesten fraværende i lipidekstraktet av dyreceller, og utseendet er kjennetegnet på Barth-syndromet (BTHS), en sjelden og ofte feildiagnostisert genetisk sykdom som forårsaker alvorlig kardiomyopati i barndommen. Metoden beskrevet her genererer et “kardiolipin fingeravtrykk” og tillater en enkel analyse av de relative nivåene av CL- og MLCL-arter i cellulære lipidprofiler. Når det gjelder leukocytter, er det bare nødvendig med 1 ml blod for å måle MLCL / CL-forholdet via matriseassistert laseravledningsionisering – flytid / massespektrometri (MALDI-TOF / MS) bare innen 2 timer fra bloduttak. Analysen er enkel og kan enkelt integreres i det rutinemessige arbeidet til et klinisk biokjemilaboratorium for å screene for BTHS. Testen viser 100% følsomhet og spesifisitet for BTHS, noe som gjør den til en passende diagnostisk test.

Introduction

Barth syndrom (BTHS) er en sjelden X-koblet sykdom preget av tidlig utbrudd kardiomyopati, skjelettmuskulatur myopati, vekstforsinkelse, nøytropeni, variabel mitokondrie respiratorisk kjede dysfunksjon, og unormal mitokondriestruktur 1,2,3,4,5. BTHS har en utbredelse på ett tilfelle per million menn med i dag mindre enn 250 kjente tilfeller over hele verden, selv om det er allment akseptert at sykdommen er underdiagnostisert 2,6. BTHS er et resultat av tap av funksjon mutasjoner av Tafazzin (TAFAZZIN) genet lokalisert til kromosom Xq28.12 7,8 forårsaker mangelfull remodeling av mitokondrie fosfolipid kardiolipin (CL), en prosess som normalt fører til en svært symmetrisk og umettet acylsammensetning 9,10. CL har blitt ansett som signaturen lipid av mitokondrier, hvor det er en viktig bestanddel av den indre membranen, avgjørende for oksidativ fosforylering (dvs. mitokondrieenergimetabolisme), supercomplexdannelse, proteinimport og involvert i mitokondriedynamikk, mitophagy og apoptose 11,12,13,14,15,16 . Ved TAFAZZIN tap av funksjon, CL ombygging mislykkes og spesifikke fosfolipid abnormiteter oppstår i mitokondrier av BTHS pasienter: moden CL nivå (CLm) er redusert, mens økte nivåer av monolysocardiolipin (MLCL) og endret CL acyl sammensetning (dvs. umodne CL arter, CLi) oppstår. Dette fører til en dramatisk økning av MLCL / CL-forholdet17.

Diagnose av BTHS er ofte vanskelig, da lidelsen presenterer ekstremt variable kliniske og biokjemiske egenskaper og kan variere mellom berørte personer fra samme familie og hos en pasient over tid 3,5. Mange BTHS-gutter viser et svært høyt nivå av urinutskillelse av 3-metylglutaconic acid (3-MGCA), men urinnivået kan være normalt eller bare mildt økt hos pasienter over tid3. Økt 3-MGCA er imidlertid en funksjon av ulike andre mitokondrie- og ikke-mitokondrieforstyrrelser, som 3-metylglutakonyl-CoA hydratasemangel (AUH-defekt), 3-metylglutaconic aciduria, dystoni-døvhet, encefalopati, Leigh-lignende (MEGDEL) syndrom, Costeff syndrom og fortynnet kardiomyopati med ataksi (DCMA) syndrom18,19 . Derfor gjør den dårlige spesifisiteten til 3-MCGA som markør for BTHS og den enorme variasjonen hos pasienter den biokjemiske diagnosen tvetydig.

Videre har over 120 forskjellige TAFAZZIN-mutasjoner blitt beskrevet som forårsaker lidelsen5 , og derfor kan en genetisk diagnose være komplisert, langsom og dyr. Videre kan molekylær analyse av TAFAZZIN-genet føre til falske negative resultater i nærvær av mutasjoner i ikke-koding eller regulering av sekvenser3. BTHS kan testes entydig ved å bestemme de relative mengdene og fordelingen av (monolyso-)CL-arter og bekreftes ved TAFAZZIN gensekvensering eller omvendt.

En praktisk test for diagnose er målingen av MLCL/CL-forholdet ved høyytelses væskekromatografi (HPLC) og elektrosprayionisering / massespektrometrianalyse (ESI/MS) i blodflekk20,21. Måling av CL-nivå alene er ikke tilstrekkelig for diagnose, da noen pasienter har nesten normale nivåer av CL, men endret MLCL / CL-forhold. Derfor har måling av MLCL / CL-forholdet 100% følsomhet og spesifisitet for BTHS-diagnose21. En annen validert metode basert på HPLC- og ESI/MS-analyse er satt opp på leukocytter22, men de komplekse kromatografiske teknikkene for separasjon av lipider som tidligere er ekstrahert og dyrheten av instrumentene begrenser denne analysen til noen få kliniske laboratorier. Alle disse faktorene, sammen med mangelen på en enkel diagnostisk test, har bidratt til underdiagnosen av tilstanden.

MALDIV-TOF/MS er et ytterligere gyldig verktøy i lipidanalyse23,24. Denne analytiske teknikken kan brukes til å direkte innhente lipidprofiler av ulike biologiske prøver, og dermed hoppe over ekstraksjons- og separasjonstrinn 25,26,27,28,29, inkludert i vevsseksjoner for MS Imaging-applikasjoner 30. Gitt denne fordelen ble det utviklet en enkel og rask metode for å diagnostisere BTHS ved å profilere mitokondrie CL i intakte leukocytter med MALDI-TOF / MS. Leukocyttisolasjon fra bare 1 ml fullblod ved erytrocyttsedimentering og lysis er grei og krever ikke spesialutstyr eller reagenser. Videre ble en rask lipid “mini-ekstraksjon” -protokoll som gjelder for små mengder leukocytter beskrevet for å garantere vellykket oppkjøp av spektra som har renere MS-signaler med et høyere signal-til-støy-forhold (S / N) enn hos de som er hentet fra intakte leukocytter28. Dette videre trinnet tar lite tid og gjør det mulig å reprodusere analyser selv når de utføres på MS-instrumenter med dårlig følsomhet. Oppsummert krever den analytiske metoden som er beskrevet her minimal prøvepreparering fordi tidkrevende og arbeidsintensiv kromatografisk lipidseparasjon kan hoppes over, og dermed øke hastigheten på testen.

Protocol

Blodprøver av friske donorer og hjertesviktpasienter ble samlet inn ved Policlinic Hospital of Bari (Italia), mens prøver av BTHS-pasienter ble innhentet av National Health Service UK BTHS-klinikken ved Bristol Royal Hospital for Children (UK). Skriftlig informert samtykke fra friske givere, pasienter og foreldre (der det er hensiktsmessig) og godkjenninger fra de respektive etiske komiteene ble innhentet. MERK: Hvis det ikke brukes umiddelbart, kan blod (i K-EDTA gelrør) oppbevares ved 4 ?…

Representative Results

I denne studien er det beskrevet en enkel og rask metode for å isolere leukocytter fra 1 ml fullblod og få CL-fingeravtrykk av MALDI-TOF/MS (se figur 2). Figur 3 viser sammenligningen av representativ CL-fingeravtrykk av leukocytter, hentet fra kontrollpersoner og BTHS-unge gutter, i CL- og MLCL-masseområdet (m/z). Tabell 1 viser CL- og MLCL-arter som er påvist i disse massespektraene. Defekter i TAFAZZIN…

Discussion

Barth syndrom er en medfødt feil i metabolismen og en livsendrende tilstand som sannsynligvis vil bli underdiagnostisert 2,6. Som nevnt tidligere, kan en medvirkende faktor være mangelen på en enkel diagnostisk test. Her ble en enkel og rask metode for å måle MLCL/CL-forholdet ved MALDI-TOF/MS i leukocytter for BTHS-screening beskrevet. Videre er MALDI-TOF massespektrometre utbredt blant kliniske laboratorier over hele verden og krever ikke høy analyti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi er takknemlige for personene med BTHS og deres familier for å delta i vår forskning. Vi takker Barth Syndrome Foundation US og Barth Syndrome UK Trust for deres støtte og for å hjelpe til med innsamlingen av blodprøvene på årsmøtet i Bristol. Denne studien ble finansiert av Barth Syndrome Foundation US, Barth Italia Onlus og Apulia Region.

Materials

1,1′,2,2′-tetratetradecanoyl cardiolipin Avanti Polar Lipids 750332 Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,1′2,2′-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipin Avanti Polar Lipids 710335 Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 878130 Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate Avanti Polar Lipids 830845 Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) Avanti Polar Lipids 840445 Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Avanti Polar Lipids 840033 Lipid standard for MALDI-TOF calibration
2-Propanol, ACS reagent, ≥99.5% Merck Life Science S.r.l. 190764
9-Aminoacridine hemihydrate, 98% Acros Organics 134410010
Acetonitrile, ACS reagent, ≥99.5% Merck Life Science S.r.l. 360457
Chloroform, ACS reagent, ≥99.8% Merck Life Science S.r.l. 319988
Dextran from Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000 Merck Life Science S.r.l. 31392
Flex Analysis 3.3 Bruker Daltonics Software
MALDI-TOF mass spectrometer Microflex LRF Bruker Daltonics
Microsoft Excel Microsoft Office Software
OmniPur 10X PBS Liquid Concentrate Merck Life Science S.r.l. 6505-OP
Potassium chloride, ACS reagent, 99.0-100.5% Merck Life Science S.r.l. P3911
Sodium chloride, ACS reagent, ≥99.0% Merck Life Science S.r.l. S9888

References

  1. Barth, P. G., et al. X-linked cardioskeletal myopathy and neutropenia (Barth syndrome): respiratory-chain abnormalities in cultured fibroblasts. Journal of Inherited Metabolic Disease. 19 (2), 157-160 (1996).
  2. Steward, C. G., et al. syndrome (X linked cardiac and skeletal myopathy, neutropenia, and organic aciduria): rarely recognised, frequently fatal [abstract]. Archives of Disease in Childhood. 89, 48 (2004).
  3. Clarke, S. L. N., et al. Barth syndrome. Orphanet Journal of Rare Diseases. 8, 23 (2013).
  4. Zegallai, H. M., Hatch, G. M. Barth syndrome: cardiolipin, cellular pathophysiology, management, and novel therapeutic targets. Molecular and Cellular Biochemistry. 476 (3), 1605-1629 (2021).
  5. Taylor, C., et al. Clinical presentation and natural history of Barth Syndrome: An overview. Journal of Inherited Metabolic Disease. 45 (1), 7-16 (2022).
  6. Miller, P. C., Ren, M., Schlame, M., Toth, M. J., Phoon, C. A. Bayesian analysis to determine the prevalence of Barth syndrome in the pediatric population. The Journal of Pediatrics. 217, 139-144 (2020).
  7. Bione, S., et al. A novel X-linked gene, G4.5. is responsible for Barth syndrome. Nature Genetics. 12 (4), 385-389 (1996).
  8. Whited, K., Baile, M. G., Currier, P., Claypool, S. M. Seven functional classes of Barth Syndrome mutation. Human Molecular Genetics. 22 (3), 483-492 (2013).
  9. Schlame, M., Ren, M., Xu, Y., Greenberg, M. L., Haller, I. Molecular symmetry in mitochondrial cardiolipins. Chemistry and Physics of Lipids. 138 (1-2), 38-49 (2005).
  10. Schlame, M., Xu, Y. The function of Tafazzin, a mitochondrial phospholipid-lysophospholipid acyltransferase. Journal of Molecular Biology. 432 (18), 5043-5051 (2020).
  11. Schlame, M., Rua, D., Greenberg, M. L. The biosynthesis and functional role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 39 (3), 257-288 (2000).
  12. Mileykovskaya, E., Dowhan, W. Cardiolipin membrane domains in prokaryotes and eukaryotes. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (10), 2084-2091 (2009).
  13. Claypool, S. M., Koehler, C. M. The complexity of cardiolipin in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 37 (1), 32-41 (2011).
  14. Ren, M., Phoon, C. K., Schlame, M. Metabolism and function of mitochondrial cardiolipin. Progress in Lipid Research. 55, 1-16 (2014).
  15. Paradies, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M., Petrosillo, G. Role of cardiolipin in mitochondrial function and dynamics in health and disease: Molecular and pharmacological aspects. Cells. 8 (7), 728 (2019).
  16. Acoba, M. G., Senoo, N., Claypool, S. M. Phospholipid ebb and flow makes mitochondria go. The Journal of Cell Biology. 219 (8), 03131 (2020).
  17. Schlame, M., et al. Phospholipid abnormalities in children with Barth syndrome. Journal of the American College of Cardiology. 42 (11), 1994-1999 (2003).
  18. Wortmann, S. B., et al. Inborn errors of metabolism with 3-methylglutaconic aciduria as discriminative feature: proper classification and nomenclature. Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (6), 923-928 (2013).
  19. Ikon, N., Ryan, R. O. On the origin of 3-methylglutaconic acid in disorders of mitochondrial energy metabolism. Journal of Inherited Metabolic Disease. 39 (5), 749-756 (2016).
  20. Kulik, W., et al. Bloodspot assay using HPLC-tandem mass spectrometry for detection of Barth syndrome. Clinical Chemistry. 54 (2), 371-378 (2008).
  21. Vaz, F. M., et al. An improved functional assay in blood spot to diagnose Barth syndrome using the monolysocardiolipin/cardiolipin ratio. Journal of Inherited Metabolic Disease. 45 (1), 29-37 (2022).
  22. Bowron, A., et al. Diagnosis of Barth syndrome using a novel LC-MS/MS method for leukocyte cardiolipin analysis. Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (5), 741-746 (2013).
  23. Sun, G., et al. Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of cellular glycerophospholipids enabled by multiplexed solvent dependent analyte-matrix interactions. Analytical Chemistry. 80 (19), 7576-7585 (2008).
  24. Leopold, J., Popkova, Y., Engel, K. M., Schiller, J. Recent developments of useful MALDI matrices for the mass spectrometric characterization of lipids. Biomolecules. 8 (4), 173 (2018).
  25. Angelini, R., Babudri, F., Lobasso, S., Corcelli, A. MALDI-TOF/MS analysis of archaebacterial lipids in lyophilized membranes dry-mixed with 9-aminoacridine. The Journal of Lipid Research. 51 (9), 2818-2825 (2010).
  26. Angelini, R., et al. Lipidomics of intact mitochondria by MALDI-TOF MS. The Journal of Lipid Research. 53 (7), 1417-1425 (2012).
  27. Angelini, R., Vormieter, G., Corcelli, A., Fuchs, B. A fast method for the determination of PC/LPC ratio in intact horse serum by MALDI-TOF-MS: an easy-to-follow lipid biomarker of inflammation. Chemistry and Physics of Lipids. 183, 169-175 (2014).
  28. Angelini, R., et al. Cardiolipin fingerprinting of leukocytes by MALDI-TOF/MS as a screening tool for Barth syndrome. The Journal of Lipid Research. 56 (9), 1787-1794 (2015).
  29. Lobasso, S., et al. A lipidomic approach to identify potential biomarkers in exosomes from melanoma cells with different metastatic potential. Frontiers in Physiology. 12, 748895 (2021).
  30. Angelini, R., et al. Visualizing cholesterol in the brain by on-tissue derivatization and quantitative mass spectrometry imaging. Analytical Chemistry. 93 (11), 4932-4949 (2021).
  31. Greco, V., et al. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical proteomics. Expert Review of Proteomics. 15 (8), 683-696 (2018).
  32. Duncan, M., DeMarco, M. L. MALDI-MS: Emerging roles in pathology and laboratory medicine. Clinical Mass Spectrometry (Del Mar, Calif). 13, 1-4 (2019).

Play Video

Cite This Article
Angelini, R., Russo, S., Corcelli, A., Lobasso, S. Fingerprinting Cardiolipin in Leukocytes by Mass Spectrometry for a Rapid Diagnosis of Barth Syndrome. J. Vis. Exp. (181), e63552, doi:10.3791/63552 (2022).

View Video