Denne protokollen viser hvordan du får et massespektrometrisk “fingeravtrykk” av leukocytt kardiolipin for diagnostisering av Barth syndrom. Vurderingen av forhøyet monolysocardilipin til kardiolipinforhold diskriminerer pasienter med Barth syndrom fra kontroll hjertesviktpasienter med 100% følsomhet og spesifisitet.
Kardiolipin (CL), en dimerisk fosfolipid som bærer fire fettsyrekjeder i sin struktur, er lipidmarkøren for mitokondrier, hvor den spiller en avgjørende rolle i den indre membranens funksjon. Dens metabolitt monolysocardiolipin (MLCL) er fysiologisk nesten fraværende i lipidekstraktet av dyreceller, og utseendet er kjennetegnet på Barth-syndromet (BTHS), en sjelden og ofte feildiagnostisert genetisk sykdom som forårsaker alvorlig kardiomyopati i barndommen. Metoden beskrevet her genererer et “kardiolipin fingeravtrykk” og tillater en enkel analyse av de relative nivåene av CL- og MLCL-arter i cellulære lipidprofiler. Når det gjelder leukocytter, er det bare nødvendig med 1 ml blod for å måle MLCL / CL-forholdet via matriseassistert laseravledningsionisering – flytid / massespektrometri (MALDI-TOF / MS) bare innen 2 timer fra bloduttak. Analysen er enkel og kan enkelt integreres i det rutinemessige arbeidet til et klinisk biokjemilaboratorium for å screene for BTHS. Testen viser 100% følsomhet og spesifisitet for BTHS, noe som gjør den til en passende diagnostisk test.
Barth syndrom (BTHS) er en sjelden X-koblet sykdom preget av tidlig utbrudd kardiomyopati, skjelettmuskulatur myopati, vekstforsinkelse, nøytropeni, variabel mitokondrie respiratorisk kjede dysfunksjon, og unormal mitokondriestruktur 1,2,3,4,5. BTHS har en utbredelse på ett tilfelle per million menn med i dag mindre enn 250 kjente tilfeller over hele verden, selv om det er allment akseptert at sykdommen er underdiagnostisert 2,6. BTHS er et resultat av tap av funksjon mutasjoner av Tafazzin (TAFAZZIN) genet lokalisert til kromosom Xq28.12 7,8 forårsaker mangelfull remodeling av mitokondrie fosfolipid kardiolipin (CL), en prosess som normalt fører til en svært symmetrisk og umettet acylsammensetning 9,10. CL har blitt ansett som signaturen lipid av mitokondrier, hvor det er en viktig bestanddel av den indre membranen, avgjørende for oksidativ fosforylering (dvs. mitokondrieenergimetabolisme), supercomplexdannelse, proteinimport og involvert i mitokondriedynamikk, mitophagy og apoptose 11,12,13,14,15,16 . Ved TAFAZZIN tap av funksjon, CL ombygging mislykkes og spesifikke fosfolipid abnormiteter oppstår i mitokondrier av BTHS pasienter: moden CL nivå (CLm) er redusert, mens økte nivåer av monolysocardiolipin (MLCL) og endret CL acyl sammensetning (dvs. umodne CL arter, CLi) oppstår. Dette fører til en dramatisk økning av MLCL / CL-forholdet17.
Diagnose av BTHS er ofte vanskelig, da lidelsen presenterer ekstremt variable kliniske og biokjemiske egenskaper og kan variere mellom berørte personer fra samme familie og hos en pasient over tid 3,5. Mange BTHS-gutter viser et svært høyt nivå av urinutskillelse av 3-metylglutaconic acid (3-MGCA), men urinnivået kan være normalt eller bare mildt økt hos pasienter over tid3. Økt 3-MGCA er imidlertid en funksjon av ulike andre mitokondrie- og ikke-mitokondrieforstyrrelser, som 3-metylglutakonyl-CoA hydratasemangel (AUH-defekt), 3-metylglutaconic aciduria, dystoni-døvhet, encefalopati, Leigh-lignende (MEGDEL) syndrom, Costeff syndrom og fortynnet kardiomyopati med ataksi (DCMA) syndrom18,19 . Derfor gjør den dårlige spesifisiteten til 3-MCGA som markør for BTHS og den enorme variasjonen hos pasienter den biokjemiske diagnosen tvetydig.
Videre har over 120 forskjellige TAFAZZIN-mutasjoner blitt beskrevet som forårsaker lidelsen5 , og derfor kan en genetisk diagnose være komplisert, langsom og dyr. Videre kan molekylær analyse av TAFAZZIN-genet føre til falske negative resultater i nærvær av mutasjoner i ikke-koding eller regulering av sekvenser3. BTHS kan testes entydig ved å bestemme de relative mengdene og fordelingen av (monolyso-)CL-arter og bekreftes ved TAFAZZIN gensekvensering eller omvendt.
En praktisk test for diagnose er målingen av MLCL/CL-forholdet ved høyytelses væskekromatografi (HPLC) og elektrosprayionisering / massespektrometrianalyse (ESI/MS) i blodflekk20,21. Måling av CL-nivå alene er ikke tilstrekkelig for diagnose, da noen pasienter har nesten normale nivåer av CL, men endret MLCL / CL-forhold. Derfor har måling av MLCL / CL-forholdet 100% følsomhet og spesifisitet for BTHS-diagnose21. En annen validert metode basert på HPLC- og ESI/MS-analyse er satt opp på leukocytter22, men de komplekse kromatografiske teknikkene for separasjon av lipider som tidligere er ekstrahert og dyrheten av instrumentene begrenser denne analysen til noen få kliniske laboratorier. Alle disse faktorene, sammen med mangelen på en enkel diagnostisk test, har bidratt til underdiagnosen av tilstanden.
MALDIV-TOF/MS er et ytterligere gyldig verktøy i lipidanalyse23,24. Denne analytiske teknikken kan brukes til å direkte innhente lipidprofiler av ulike biologiske prøver, og dermed hoppe over ekstraksjons- og separasjonstrinn 25,26,27,28,29, inkludert i vevsseksjoner for MS Imaging-applikasjoner 30. Gitt denne fordelen ble det utviklet en enkel og rask metode for å diagnostisere BTHS ved å profilere mitokondrie CL i intakte leukocytter med MALDI-TOF / MS. Leukocyttisolasjon fra bare 1 ml fullblod ved erytrocyttsedimentering og lysis er grei og krever ikke spesialutstyr eller reagenser. Videre ble en rask lipid “mini-ekstraksjon” -protokoll som gjelder for små mengder leukocytter beskrevet for å garantere vellykket oppkjøp av spektra som har renere MS-signaler med et høyere signal-til-støy-forhold (S / N) enn hos de som er hentet fra intakte leukocytter28. Dette videre trinnet tar lite tid og gjør det mulig å reprodusere analyser selv når de utføres på MS-instrumenter med dårlig følsomhet. Oppsummert krever den analytiske metoden som er beskrevet her minimal prøvepreparering fordi tidkrevende og arbeidsintensiv kromatografisk lipidseparasjon kan hoppes over, og dermed øke hastigheten på testen.
Barth syndrom er en medfødt feil i metabolismen og en livsendrende tilstand som sannsynligvis vil bli underdiagnostisert 2,6. Som nevnt tidligere, kan en medvirkende faktor være mangelen på en enkel diagnostisk test. Her ble en enkel og rask metode for å måle MLCL/CL-forholdet ved MALDI-TOF/MS i leukocytter for BTHS-screening beskrevet. Videre er MALDI-TOF massespektrometre utbredt blant kliniske laboratorier over hele verden og krever ikke høy analyti…
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige for personene med BTHS og deres familier for å delta i vår forskning. Vi takker Barth Syndrome Foundation US og Barth Syndrome UK Trust for deres støtte og for å hjelpe til med innsamlingen av blodprøvene på årsmøtet i Bristol. Denne studien ble finansiert av Barth Syndrome Foundation US, Barth Italia Onlus og Apulia Region.
1,1′,2,2′-tetratetradecanoyl cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
1,1′2,2′-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 710335 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 878130 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate | Avanti Polar Lipids | 830845 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) | Avanti Polar Lipids | 840445 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840033 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
2-Propanol, ACS reagent, ≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 190764 | |
9-Aminoacridine hemihydrate, 98% | Acros Organics | 134410010 | |
Acetonitrile, ACS reagent, ≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 360457 | |
Chloroform, ACS reagent, ≥99.8% | Merck Life Science S.r.l. | 319988 | |
Dextran from Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000 | Merck Life Science S.r.l. | 31392 | |
Flex Analysis 3.3 | Bruker Daltonics | Software | |
MALDI-TOF mass spectrometer Microflex LRF | Bruker Daltonics | ||
Microsoft Excel | Microsoft Office | Software | |
OmniPur 10X PBS Liquid Concentrate | Merck Life Science S.r.l. | 6505-OP | |
Potassium chloride, ACS reagent, 99.0-100.5% | Merck Life Science S.r.l. | P3911 | |
Sodium chloride, ACS reagent, ≥99.0% | Merck Life Science S.r.l. | S9888 |