Summary

Оценка окисления энергетического субстрата in vitro с улавливанием 14CO2

Published: March 23, 2022
doi:

Summary

Этот протокол описывает простой в использовании метод исследования окисления субстрата путем отслеживания производства 14CO2 in vitro.

Abstract

Митохондрии содержат механизм для цикла трикарбоновой кислоты (TCA) и цепи переноса электронов (ETC), которые генерируют аденозинтрифосфат (АТФ) для поддержания энергетического гомеостаза. Глюкоза, жирные кислоты и аминокислоты являются основными энергетическими субстратами, подпитывающими митохондриальное дыхание в большинстве соматических клеток. Фактические данные показывают, что различные типы клеток могут иметь явное предпочтение определенным субстратам. Однако использование субстрата различными клетками скелета подробно не изучено. Более того, поскольку клеточный метаболизм настроен на физиологические и патофизиологические изменения, прямые оценки субстратной зависимости в скелетных клетках могут дать важное представление о патогенезе заболеваний костей.

Следующий протокол основан на принципе высвобождения углекислого газа из молекул субстрата после окислительного фосфорилирования. Используя субстраты, содержащие радиоактивно меченые атомы углерода (14С), способ обеспечивает чувствительный и простой в использовании анализ скорости окисления субстрата в клеточной культуре. Тематическое исследование с первичными кальвариальными преостеобластами по сравнению с макрофагами, полученными из костного мозга (BMM), демонстрирует различное использование основных субстратов между двумя типами клеток.

Introduction

Окислительное фосфорилирование (OXPHOS) у эукариот — это процесс, посредством которого питательные вещества расщепляются внутри митохондрий для высвобождения химической энергии в виде АТФ за счет потребления кислорода.  Катаболизм различных субстратов внутри митохондрий через цикл трикарбоновой кислоты (TCA) генерирует несколько молекул АТФ напрямую, а скорее накапливает энергию за счет восстановления носителей электронов никотинамидадениндинуклеотида (NAD+) и флавинадениндинуклеотида (FAD+). Восстановленные носители затем окисляются ETC, расположенными на внутренней мембране митохондрий, чтобы генерировать градиент концентрации протонов по всей мембране. Протоны в конечном итоге текут вниз по своему градиенту обратно в митохондриальный матрикс через АТФ-синтазу с образованием АТФ. OXPHOS является наиболее эффективным средством производства АТФ из энергетических субстратов и, как правило, предпочтительным в аэробных средах. Ранее аэробный гликолиз – производство лактата из глюкозы при наличии кислорода – считался патофизиологическим, часто отличительной чертой раковых клеток. Все больше и больше обнаруживается, что некоторые нормальные типы клеток используют аэробный гликолиз по причинам, которые еще предстоит полностью расшифровать.

Метаболическая гибкость — это способность клеток или организмов адаптироваться к изменяющимся потребностям в энергии и доступным источникам топлива. Например, энергетическая потребность скелетных мышц в основном удовлетворяется OXPHOS в устойчивом состоянии, но анаэробным гликолизом во время высокоинтенсивных упражнений1. По мере увеличения продолжительности упражнений окисление глюкозы и жирных кислот вносит больший вклад в общее производство энергии2. Однако использование субстрата зависит не только от доступности, так как субстраты антагонистически конкурируют во время окисления. В частности, было показано, что окисление жирных кислот ингибирует утилизацию глюкозы скелетными мышцами в явлении, известном как эффект Рэндла3. Обратный эффект был продемонстрирован последующими исследованиями 4,5. Кроме того, многие заболевания связаны с изменением предпочтения субстрата и развитием метаболической негибкости в клетках. Например, окисление жирных кислот снижается в скелетных мышцах пациентов с диабетом II типа по сравнению с нормальными контрольными субъектами6. Метаболические изменения в условиях заболевания являются предметом интенсивного исследования, поскольку они могут способствовать патогенезу.

Энергетический метаболизм в типах скелетных клеток относительно недостаточно изучен, но привлек к себе внимание в последние годы7. Предыдущая работа показала, что аэробный гликолиз является доминирующим энергетическим путем в кальвариальных остеобластах, в то время как окисление глюкозы через цикл TCA играет роль в образовании остеокластов 8,9. Другие предоставили доказательства того, что жирные кислоты являются источником энергии для остеобластов10. Было также показано, что катаболизм глутамина поддерживает дифференциацию остеобластов от прародителей11,12. Тем не менее, всестороннее понимание использования субстрата различными типами клеток скелета все еще отсутствует. Кроме того, ожидается, что изменения клеточного метаболизма во время дифференцировки клеток или в ответ на патологические сигналы изменят использование топливного субстрата. Ниже описан простой в использовании протокол для анализа окисления субстрата in vitro.

Protocol

Использование радиоактивных материалов (ОЗУ) требует предварительного одобрения назначенного комитета по безопасности в каждом учреждении. RAM, используемые в этом протоколе, были одобрены Environmental Health & Radiation Safety (EHRS) в Университете Пенсильвании. Использование животных требует предвари?…

Representative Results

В этом примере метод улавливания CO2 используется для сравнения окисления субстрата первичными кальвариальными преостеобластами по сравнению с БММ, которые часто используются для дифференцировки остеобластов in vitro или остеокластов, соответственно. После того, как первичные…

Discussion

Протокол обеспечивает простой в использовании метод определения скорости окисления основных энергетических субстратов. Это более простая альтернатива другим протоколам, которые используют колбы, содержащие центральный колодец и увенчанные резиновыми пробками 14,15,16.<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Работа была частично поддержана грантом NIH R01 AR060456 (FL). Мы благодарим доктора Майкла Робинсона и Элизабет Кризман (Детская больница Филадельфии) за их щедрую помощь со сцинтилляционным счетчиком.

Materials

0.22 µm filters Sigma-Aldrich SLGVM33RS Used to filter BSA solution
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056 Dissociate cells from cell culture plates
1.5 mL Eppendorf tubes PR1MA PR MCT17 RB Used for reaction incubation
10 cm plates TPP 93100 Used for cell culture
10 mL syringe BD 302995 Used to flush marrow from long bones
10% FBS Atlanta biologicals S11550 For Cell culture medium preparation
14C-Glucose PerkinElmer NEC042X050UC Used to make hot media
14C-glutamine PerkinElmer NEC451050UC Used to make hot media
14C-oleate PerkinElmer NEC317050UC Used to make hot media
23 G needle BD 305120 Used to flush marrow from long bones
24-well plates TPP 92024 Used for cell culture
70 μm cell strainers MIDSCI 70CELL Used to filter supernatant during cavarial digestion
Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye Nexcelom Biosciences CS2-0106 Stains live cells to determine seed density
Bovine Serum Ablumin Proliant Biologicals 68700 Used for fatty acid conjugation
Cellometer Auto 2000 Nexcelom Biosciences Determine the number of viable cells
Centrifuge Thermo Fisher Legend Micro 21R Used to pellet cells
Collagenase type II Worthington LS004176 Dissociate cells from tissue
Custom MEM alpha GIBCO SKU: ME 18459P1 Used to create custom hot media
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 10010023 Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes
Filter Paper Millipore-Sigma WHA1001090 Traps CO2 with sodium hydroxide
Glucose Sigma-Aldrich g7528 Used to make custom media
HEPES Gibco 15630080 Traps CO2 during cell culture
L-carnitine Sigma-Aldrich C0283 Supplemented for fatty acid oxidation
L-Glutamine Sigma-Aldrich g3126 Used to make custom media
MEM alpha Thermo A10490 Cell culture medium
Parafilm Pecheney Plastic Packaging PM998 Used to seal cell culture dishes
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140122 Prevents contamination in cell culture
Perchloric Acid Sigma-Aldrich 244252 Releases CO2 during metabolic assay
Pyruvate Sigma-Aldrich p5280 Used to make custom media
Scintillation Counter Beckman Coulter LS6500 Determines radioactivity from the filter paper
Scintillation Fluid MP Biomedicals 882453 Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light
Scintillation Vial Fisher Scientific 03-337-1 Reaction containers for scintillation fluid
Sodium carbonate Sigma-Aldrich S5761 Balance buffer for medium
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 58045 Traps CO2 during metaboilc assay
Sodium oleate SANTA CRUZ SC-215879 BSA conjugated fatty acid preparation
Vaccum filtration 1000 TPP 99950 Filter cMEMα

References

  1. Hargreaves, M., Spriet, L. L. Skeletal muscle energy metabolism during exercise. Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).
  2. Jeukendrup, A. E. Regulation of fat metabolism in skeletal muscle. Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).
  3. Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus. Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).
  4. Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles. Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).
  5. Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).
  6. Cha, B. S., et al. Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).
  7. Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis. Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).
  8. Li, B., et al. Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation. FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).
  9. Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts. Cell Reports. 32 (10), 108108 (2020).
  10. Kim, S. P., et al. Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner. JCI Insight. 2 (16), 92704 (2017).
  11. Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
  12. Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
  13. Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
  14. Itoh, Y., et al. Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).
  15. Oba, M., Baldwin, R. L. 4. t. h., Bequette, B. J. Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels. Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).
  16. Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).
  17. Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines. Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).
  18. Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).
  19. Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), 0116195 (2015).

Play Video

Cite This Article
Song, C., Valeri, A., Long, F. Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping. J. Vis. Exp. (181), e63568, doi:10.3791/63568 (2022).

View Video