Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Driedimensionaal, serumvrij kweeksysteem voor traanklierstamcellen

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63585
Automatic Translation
1, 1, 1
1MOE Key Laboratory of Gene Function and Regulation, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University

Summary

De driedimensionale, serumvrije kweekmethode voor volwassen traanklier (LG) stamcellen is goed ingeburgerd voor de inductie van LG organoïde vorming en differentiatie in acinaire of ductaal-achtige cellen.

Abstract

Traanklier (LG) stamcel-gebaseerde therapie is een veelbelovende strategie voor traanklieraandoeningen. Het ontbreken van een betrouwbare, serumvrije kweekmethode om een voldoende aantal LG-stamcellen (LGSC's) te verkrijgen, is echter een obstakel voor verder onderzoek en toepassing. De driedimensionale (3D), serumvrije kweekmethode voor LGSC's voor volwassen muizen is goed ingeburgerd en wordt hier getoond. De LGSC's kunnen continu worden gepasseerd en geïnduceerd om te differentiëren tot acinaire of ductaalachtige cellen.

Voor de LGSC primaire cultuur werden de PG's van 6-8 weken oude muizen verteerd met dispase, collagenase I en trypsine-EDTA. Een totaal van 1 × 104 enkele cellen werden gezaaid in 80 μL matrix gel-lacrimal gland stem cell medium (LGSCM) matrix in elke put van een 24-well plaat, vooraf gecoat met 20 μL matrix gel-LGSCM matrix. Het mengsel werd gestold na incubatie gedurende 20 minuten bij 37 °C en 600 μL LGSCM toegevoegd.

Voor LGSC-onderhoud werden LGSC's die gedurende 7 dagen werden gekweekt, uitgesplitst in afzonderlijke cellen door dispase en trypsine-EDTA. De afzonderlijke cellen werden geïmplanteerd en gekweekt volgens de methode die werd gebruikt in de primaire cultuur van LGSC. LGSC's kunnen meer dan 40 keer worden gepasseerd en continu stam/ voorlopercelmarkers Krt14, Krt5, P63 en nestin uitdrukken. LGSC's gekweekt in LGSCM hebben zelfvernieuwingscapaciteit en kunnen in vitro en in vivo differentiëren in acinaire of ductaalachtige cellen.

Introduction

Traanklier stamcellen (LGSCs) onderhouden traanklier (LG) celvernieuwing en zijn de bron van acinaire en ductale cellen. Daarom wordt LGSC-transplantatie beschouwd als een alternatieve benadering voor de behandeling van ernstige ontstekingsschade en waterig-deficiënte droge ogenziekte (ADDED)1,2,3. Verschillende kweekmethoden zijn toegepast om LGSC's te verrijken. Tiwari et al. scheidden en kweekten primaire LG-cellen met behulp van collageen I en matrixgel aangevuld met verschillende groeifactoren; de LG-cellen konden echter niet continu worden gekweekt4. Met behulp van tweedimensionale (2D) cultuur werden van LG afgeleide stamcellen van muizen geïsoleerd door You et al.5 en Ackermann et al. 6, gevonden om de stam / voorlopercelmarkergenen, Oct4, Sox2, Nanog en nestin, tot expressie te brengen en kan worden gesubcultureerd. Er zijn echter geen duidelijke aanwijzingen dat deze cellen kunnen differentiëren in acinaire of ductale cellen, en er is geen transplantatie-experiment om het differentiatiepotentieel in vivo te verifiëren.

Onlangs werden c-kit + dim / EpCAM + / Sca1-/ CD34-/CD45-cellen geïsoleerd uit muis-PG's door flowcytometrie, bleken LG-voorlopercelmarkers tot expressie te brengen, zoals Pax6 en Runx1, en gedifferentieerd in kanalen en acini in vitro. Bij muizen met ADDED kan orthotopische injectie met deze cellen beschadigde PG's herstellen en de secretoire functie van PG's2 herstellen. Het aantal stamcellen dat door deze methode werd geïsoleerd, was echter klein en er zijn geen geschikte kweekomstandigheden voor het uitbreiden van de geïsoleerde LGSC's. Samenvattend moet een passend kweeksysteem worden opgezet om volwassen LGSC's effectief te isoleren en te kweken met stabiele en continue uitbreiding voor de studie van LGSC's bij de behandeling van ADDED.

Organoïden afgeleid van stamcellen of pluripotente stamcellen zijn een groep cellen die histologisch vergelijkbaar zijn met de verwante organen en hun eigen vernieuwing kunnen behouden. Nadat de darmorganoïde van de muis in 2009 met succes werd gekweekt door Sato et al.7, werden organoïden uit andere organen achtereenvolgens gekweekt, op basis van het kweeksysteem van Sato, zoals galblaas8, lever9, pancreas10, maag11, borst12, long13, prostaat14 en speekselklier15 . Vanwege het hoge aandeel volwassen stamcellen vóór celdifferentiatie in organoïde cultuur, wordt de driedimensionale (3D) organoïde kweekmethode als optimaal beschouwd voor de isolatie en kweek van volwassen stamcellen van LG.

Een LGSC-kweeksysteem voor volwassen muizen werd in deze studie opgezet door de 3D, serumvrije kweekmethode te optimaliseren. Het is bewezen dat de LGSC's gekweekt uit zowel normale als TOEGEVOEGDE muizen een stabiel vermogen tot zelfvernieuwing en proliferatie vertoonden. Na transplantatie in de ADD-muis-PG's koloniseerden LGSCs de aangetaste PG's en verbeterden ze de traanproductie. Bovendien werden rode fluorescerende LGSC's geïsoleerd uit ROSA26mT/mG-muizen en gekweekt. Dit werk biedt een betrouwbare referentie voor LGSC-verrijking in vitro en LGSC-autograft in klinische toepassing voor TOEGEVOEGDE therapie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten in dit protocol volgden de richtlijnen voor dierverzorging van de Ethische Commissie voor Dierproeven van Sun Yat-sen University. Alle celgerelateerde bewerkingen moeten worden uitgevoerd op de ultraschone werkbank in de celoperatiekamer. Alle bewerkingen met xyleen moeten worden uitgevoerd in zuurkasten.

1. LGSC primaire cultuur

  1. LG isolatie
    1. Verkrijg een 6-8 weken oude BALB / c mannelijke muis en snijd de huid achter het oor om de LG en het bindweefsel eromheen bloot te leggen. Pel het bindweefsel af door stompe dissectie met behulp van een pincet en verwijder de LG.
    2. Spoel de PG's tweemaal met 4 ml steriele 10 mM PBS-oplossing om bloed in een schaal van 6 cm te verwijderen. Dompel de PG's onder in een schaal van 6 cm met 4 ml 75% ethanol gedurende 10 s en spoel tweemaal onmiddellijk met 10 mM PBS.
  2. Verkrijg enkele cellen van LG
    1. Gebruik DE HEPES-bufferoplossing (50 mM HEPES/KOH, pH 7,4; 150 mM NaCl in ultrapuur water) om 25 U/ml dispase te bereiden. Bereid de 0,1% collagenase I oplossing met ultrapuur water.
    2. Snijd de PG's in kleine fragmenten (ongeveer 1 mm3), breng ze over naar een steriele centrifugebuis van 15 ml en behandel de weefsels met 500 μL 25 U/ml dispase en 500 μL 0,1% collagenase I gedurende 1 uur bij 37 °C.
    3. Gebruik 10 mM PBS om trypsine-EDTA-oplossing te bereiden (0,05 g/L trypsine, 0,04 g/L EDTA). Behandel de LG-fragmenten uit stap 1.2.2 met 1 ml 0,05% trypsine-EDTA gedurende 10 minuten bij 37 °C en dissociëer de fragmenten in afzonderlijke cellen door herhaaldelijk te pipetteren.
    4. Filtreer de suspensie door een filter van 70 μm, vang het filtraat op in een steriele centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 150 × g .
    5. Verwijder na centrifugatie het supernatant, voeg 10 ml 10 mM PBS toe om de celpellet te wassen en centrifugeer de suspensie.
    6. Herhaal stap 1.2.5, verwijder het supernatant en voeg 1 ml DMEM/F12 (1:1 mengsel van Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium en Ham's F-12) toe om de celpellets te resuspenderen.
  3. LGSC primaire cultuur
    1. Bereid het traanklierstamcelmedium (LGSCM) voor dat DMEM / F12, 1x N2-supplement, 1x B27-supplement, 2 mM glutaminevervanger, 0,1 mM NEAAs (niet-essentiële aminozuren), 50 ng / ml murine epidermale groeifactor (EGF), 100 ng / ml fibroblastgroeifactor 10 (FGF10), 10 ng / ml Wnt3A en 10 μM Y-27632 (ROCK-remmer) bevat.
    2. Voeg 20 μL matrixgel-LGSCM matrix (matrixgel: LGSCM = 1:1) toe aan het midden van de put van een 24-well plaat. Gebruik een pipetpunt om deze uit te breiden tot een cirkel (diameter 6-8 mm) en incubeer het mengsel gedurende 20 minuten bij 37 °C om de put voor te coaten.
    3. Gebruik een celteller om het celnummer te bepalen en voeg 40 μL LGSCM met in totaal 1 × 104 cellen toe aan 40 μL van de matrixgel. Meng ze voorzichtig met een pipet om een matrixgel-LGSCM mengsel te verkrijgen (matrix gel: LGSCM= 1:1).
    4. Gebruik een pipet om voorzichtig 80 μL van het mengsel over het voorgecoate gebied in elk putje van de 24-wellsplaat te laten vallen in stap 1.3.2.
    5. Incubeer het mengsel gedurende 20 minuten bij 37 °C en voeg 600 μL LGSCM toe.
    6. Verander het cultuurmedium in elke put eens in de twee dagen. Zoek na 7 dagen cultuur naar LGSC-bollen met een diameter van 100-300 μm onder de omgekeerde microscoop (oculair: 10x, objectief: 4x).
      OPMERKING: LGSC's kunnen in totaal meer dan 14 dagen worden gekweekt.
  4. Isoleer en kweek primaire LGSC's van ROSA26mT/mG muizen en DED muizen (NOD/ShiLtJ) volgens de hierboven beschreven stappen.

2. LGSC onderhoud en doorgang

  1. Haal het cultuurmedium goed uit de bolcultuur.
  2. Desaggregatie van de LGSC-bollen die gedurende 7 dagen zijn gekweekt door incubatie in 20 μL van 10 U/ml dispase en 100 μL van 10 mM PBS gedurende 30 minuten bij 37 °C.
  3. Breng de suspensie over in een centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 4 minuten op 150 × g . Verwijder het supernatant.
  4. Behandel de bollen met 1 ml 0,05% trypsine-EDTA gedurende 5 minuten bij 37 °C. Voeg 1 ml 0,05% trypsineremmer (TI) en pipet herhaaldelijk toe om het trypsine te neutraliseren en de bolletjes in afzonderlijke cellen te dissociëren.
  5. Centrifugeer op 150 × g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant om LGSC's in de pellet te verkrijgen. Voeg 1 ml LGSCM toe om de LGSC-pellet te resuspenderen.
  6. Plaats de afzonderlijke cellen zoals beschreven in stap 1.3.1 tot en met 1.3.6.

3. LGSC differentiatie

  1. Procedure 1: Verleng de kweektijd van LGSC's van 7 naar 14 dagen met het LGSC-kweeksysteem voor willekeurige differentiatie.
  2. Procedure 2: Verander de verhouding van het matrixgel-LGSCM-mengsel van 1:1 naar 1:2 aan het begin van de LGSC-cultuur voor de differentiatie van kanaalcellen. Zaai de LGSC's gedurende 14 dagen in de matrix voor inductie (zie stap 1.3).
  3. Procedure 3: Vervang na passage de LGSCM door het LGSCM-10% foetale runderserum (FBS) mengsel voor de differentiatie van acinaire cellen. Induceer differentiatie gedurende 14 dagen.

4. LG weefsel dehydratie

  1. Verkrijg LG-weefsels (stap 1.1.1) en spoel de PG's gedurende 2 minuten af met 4 ml steriele 10 mM PBS-oplossing in een schaal van 6 cm. Verplaats de weefsels naar 10% formalineoplossing voor fixatie gedurende 24 uur.
  2. Spoel de vaste weefsels met 10 mM PBS gedurende 2 minuten om het formaline te verwijderen en breng het weefsel over naar een weefselinsluitdoos. Plaats de insluitdoos in de automatische dehydrator.
  3. Gebruik de automatische dehydrator om de weefsels als volgt uit te drogen: 70% ethanol, 2 uur; 80% ethanol, 2 uur; 90% ethanol, 30 min; 95% ethanol, 30 min; absolute ethanol, 30min; absolute ethanol, 2 uur; absolute ethanol: 100% xyleen (1: 1) mengsel, 30 min; 100% xyleen, 30 min; 100% xyleen, 2 uur; 100% xyleen: paraffine (1: 1) mengsel, 30 min; paraffine, 2 uur; paraffine,3 u.

5. LG organoïde / bol uitdroging

  1. Verkrijg LG organoïden/bolletjes (stappen 2.1-2.3) in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en spoel de LG-organoïden/-bollen gedurende 2 minuten af met 1 ml steriele PBS-oplossing van 10 mM.
  2. Centrifugeer op 100 × g gedurende 1 min en verwijder het supernatant.
  3. Bereid de 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing als volgt: voeg 20 g PFA toe aan een mengsel van 400 ml 10 mM PBS en 40 μL 1 M NaOH, schud de oplossing goed en verwarm deze gedurende 2 uur in een waterbad van 65 °C totdat de PFA volledig is opgelost. Gebruik na afkoeling tot kamertemperatuur 10 mM PBS om het volume op te maken tot 500 ml en bewaar het bij 4 °C.
  4. Voeg 1 ml 4% PFA toe aan de microcentrifugebuis met de organoïde/bolpellet en plaats de buis gedurende ten minste 24 uur in een koelkast van 4 °C voor fixatie.
  5. Na fixatie centrifugeer u gedurende 1 minuut op 100 × g en verwijdert u het supernatant. Voeg 1 ml 10 mM PBS toe aan de microcentrifugebuis met de organoïde/bolpellet en meng voorzichtig door gedurende 2 minuten te pipetteren om de PFA af te spoelen. Herhaal deze stap twee keer.
  6. Centrifugeer op 100 × g gedurende 1 min en verwijder het supernatant.
  7. Warmte-inbedding hydrogel om op te lossen en voeg 50-60 μL insluitende hydrogel toe aan de organoïde / bolpellet en meng. Pipetteer het mengsel op de parafilm in de vorm van een druppel en wacht 5 minuten tot het bij kamertemperatuur stolt.
  8. Droog de gel met de organoïden/bolletjes in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml als volgt uit.
    1. Voeg 1 ml 50% ethanol toe aan de buis, wacht 30 minuten bij kamertemperatuur en verwijder de vloeistof uit de buis door te pipetteren. Herhaal deze stap door achtereenvolgens de ethanolconcentratie te wijzigen in 70%, 80%, 90%, 95%.
    2. Voeg 1 ml absolute ethanol toe aan de buis, wacht 30 minuten bij kamertemperatuur en verwijder de vloeistof uit de buis door te pipetteren. Herhaal deze stap.
    3. Voeg 1 ml van een mengsel van 0,5 ml absolute ethanol en 0,5 ml 100% xyleen toe aan de buis, wacht 30 minuten bij kamertemperatuur en verwijder de vloeistof uit de buis door te pipetteren.
    4. Voeg 1 ml 100% xyleen toe aan de buis, wacht 30 minuten bij kamertemperatuur en verwijder de vloeistof uit de buis door te pipetteren. Herhaal deze stap.
      OPMERKING: Stap 5.8.5-5.8.6 moet worden uitgevoerd in een metalen bad bij 65 °C.
    5. Voeg 1 ml van een mengsel van 0,5 ml paraffine en 0,5 ml 100% xyleen toe aan de buis, wacht 30 minuten bij 65 °C en verwijder de vloeistof uit de buis door te pipetteren.
    6. Voeg 1 ml paraffine toe aan de buis, wacht 30 minuten bij 65 °C en verwijder de vloeistof uit de buis door te pipetteren. Herhaal deze stap en verleng de verwerkingstijd tot 1 uur.

6. Paraffine inbedding en sectie

  1. Paraffine inbedding
    1. Voordat u insluit, schakelt u de insluitmachine in en verwarmt u deze voor om de paraffinewas in de paraffinetank te smelten.
    2. Plaats het gedehydrateerde weefsel of de organoïde/bolgel in de groef van de insluitijzeren doos en plaats de ijzeren doos in de paraffine van de insluitmachine.
    3. Verwijder het plastic deksel en plaats de plastic insluitdoos op de ijzeren doos om deze te bedekken. Verplaats de insluitijzeren doos naar een koeltafel.
    4. Nadat de paraffine in blokken in de inbouwdoos is gecondenseerd, haalt u deze uit de ijzeren doos en snijdt u deze direct in plakjes of bewaart u deze tijdelijk in een koelkast van 4 °C.
  2. Paraffine sectie
    1. Voordat u paraffine snijdt, monteer de paraffinesnijmachine voor en voeg gedestilleerd water toe aan de gootsteen van de snijmachine voor het voorverwarmen. Begin met snijden wanneer de watertemperatuur stijgt tot 42 °C.
    2. Bevestig het monster op de monstersleuf van de paraffinesnijder. Stel de sectiedikte tijdens het snijden in op 5 μm.
    3. Sectie het monster continu. Bevestig het volledig betegelde gedeelte op de antislipschuif in de snijtank.
    4. Plaats na het snijden de met monsterweefsel aangebrachte dia's in een biochemische incubator bij 37 °C om gedurende 24 uur te drogen. Bewaar de dia's tijdelijk in de koelkast bij 4 °C.

7. Hematoxyline en eosine kleuring

  1. Smelt de paraffinesecties bij 60 °C gedurende 30 minuten, week de secties gedurende 15 minuten in 100% xyleen en herhaal.
  2. Behandel de secties met absolute ethanol op een shaker gedurende 5 minuten.
  3. Behandel de secties met 90% ethanol, 80% ethanol en 70% ethanol op een shaker, elk gedurende 3 minuten.
  4. Behandel de secties met gedeïoniseerd water op een shaker gedurende 5 minuten en 2 minuten achter elkaar.
  5. Bevlek de secties op een natte doos gedurende 5 minuten met 4 mg / ml hematoxyline-oplossing. Spoel de secties gedurende 10 minuten af in stromend water.
  6. Roer de secties eerst op een shaker met gedeïoniseerd water gedurende 2 minuten en vervolgens met 0,5% -1% eosine gedurende 1 min.
  7. Roer de secties met 70% ethanol, 80% ethanol en 90% ethanol op een shaker gedurende 3 minuten (elk) achter elkaar. Roer de secties met absolute ethanol op een shaker gedurende 5 minuten.
  8. Week de secties in 100% xyleen gedurende 15 minuten en herhaal het weken.
  9. Gebruik een pipet of druppelaar om 3-4 druppels neutrale balsem aan de dia toe te voegen en bedek deze langzaam met een afdekplaat. Droog de dia's aan de lucht bij kamertemperatuur.

8. Immunohistochemische (IHC) kleuring

  1. Smelt de paraffinesecties op 60 °C gedurende 30 minuten, week de secties gedurende 100 minuten in 100% xyleen en herhaal deze stap tweemaal.
  2. Roer de secties eerst op een shaker met absolute ethanol, 90% ethanol en 80% ethanol gedurende 2 minuten (elk), achtereenvolgens, en vervolgens met gedeïoniseerd water gedurende 3 minuten. Herhaal de agitatie met gedeïoniseerd water tweemaal.
  3. Roer de secties eerst op een shaker met een mengsel van 20 ml 30% H2O2 en 180 ml methanol gedurende 10 minuten en vervolgens gedeïoniseerd water gedurende 5 minuten. Herhaal deze stap drie keer.
  4. Breng de secties over in voorgekookte citroenzuurbuffer (1 L gedeïoniseerd water met 3 g Na3C6H5O7,2H 2O en 0,4 g C6H8O7, pH 6,0), magnetron gedurende 10 minuten om ze op subkritisch kookpunt te houden en koel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Roer de secties met gedeïoniseerd water op een shaker gedurende 5 minuten. Herhaal deze stap drie keer.
  5. Roer de secties met 10 mM PBS op een shaker gedurende 5 minuten en herhaal deze stap drie keer. Omsluit het weefselgebied op de natte doos met een waterafstotende marker, voeg een druppel kant-en-klaar niet-immuun geitenserum toe om de monsters te bedekken en plaats ze gedurende 1 uur op kamertemperatuur.
  6. Verwijder het serum, voeg primair antilichaam toe aan de monsters (zie de tabel met materialen) en incubeer ze een nacht bij 4 °C. Verwijder het primaire antilichaam, roer de secties met 10 mM PBS op een shaker gedurende 5 minuten en herhaal deze agitatiestap met 10 mM PBS drie keer.
  7. Voeg secundair antilichaam toe (zie de tabel met materialen) om de monsters te bedekken en incubeer ze op een natte doos gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Roer de secties met 10 mM PBS op een shaker gedurende 5 minuten en herhaal de agitatiestap drie keer.
  8. Voeg vers bereide 0,03-0,05% 3,3'-diaminobenzidine (DAB) oplossing toe om de monsters op de natte doos en vlek gedurende 30-90 s te bedekken. Spoel de secties af met stromend water gedurende 10 min.
    OPMERKING: Controleer de kleuringstijd door te observeren onder een lichtmicroscoop totdat de gele kleur verschijnt.
  9. Voeg 4 mg / ml hematoxyline-oplossing toe om de monsters te bedekken, bevlek gedurende 5 minuten op een natte doos en spoel de secties gedurende 10 minuten af met stromend water.
  10. Roer de secties op een shaker met 80% ethanol, 90% ethanol en absolute ethanol gedurende 2 minuten elk, achtereenvolgens, en week de secties in 100% xyleen gedurende 30 minuten.
  11. Gebruik een pipet of druppelaar om 3-4 druppels neutrale balsem aan de dia toe te voegen en bedek deze langzaam met een afdekplaat. Droog de dia's aan de lucht bij kamertemperatuur.

9. Globale immunofluorescentiekleuring van organoïden/bolletjes

OPMERKING: Verzamel de organoïden/bollen die zijn bevestigd met 4% PFA-oplossing in een microcentrifugebuis van 1,5 ml (zie stappen 5.1 tot 5.4). Voer de fluorescentielabeling als volgt uit.

  1. Droog de organoïden/bolletjes uit door 1 ml sucrose-oplossing aan de buis toe te voegen en deze een nacht in een koelkast bij 4 °C te incuberen.
  2. Voeg 100 μL PBST-oplossing (10 mM PBS-oplossing met 0,1% Triton X-100) toe aan de buis om de organoïden/bolletjes gedurende 5 minuten te spoelen, centrifugeer de buis op 100 × g gedurende 1 minuut en verzamel de pellet. Herhaal deze stap drie keer.
  3. Voeg 0,5-1 ml kant-en-klaar niet-immuun geitenserum toe aan de buis en sluit het gedurende 1 uur af bij kamertemperatuur. Centrifugeer de buis op 100 × g gedurende 1 min en vang de pellet op.
  4. Voeg enkele druppels verdund primair antilichaam toe om de pellet te bedekken en incubeer in een koelkast bij 4 °C gedurende 48 uur. Centrifugeer de buis op 100 × g gedurende 1 min en vang de pellet op.
  5. Herhaal stap 9.2.
  6. Voeg enkele druppels fluorescerend secundair antilichaam en 4',6-diamidino-2-fenyladool (DAPI) oplossing toe aan de buis om de pellet te bedekken en incubeer in een koelkast bij 4 °C gedurende 24 uur, waarbij licht wordt vermeden.
  7. Herhaal stap 9.2 en vermijd licht.
  8. Voeg 100 μL PBST-oplossing toe aan de buis en bewaar deze tijdelijk in een koelkast van 4 °C, uit de buurt van licht. Observeer en fotografeer de organoïden/bollen met behulp van de light-sheet scanning microscoop.

10. LGSC pLX-mCherry transfectie

OPMERKING: De productie van lentivirale deeltjes moet worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast en een schone bank op BSL2-bioveiligheidsniveau.

  1. Kweek de lentivirus verpakkingscel 293T in een 6-well plaat met DMEM + 10% FBS bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 3-5 dagen om 80% celconfluentie te bereiken.
  2. Transfecteer de lentivirusvector pLX-mCherry in LGSC's.
    OPMERKING: Reagensbereiding is geïndiceerd voor één put van een 6-wellsplaat.
    1. Bereid twee steriele centrifugebuizen van 1,5 ml en voeg 250 μL DMEM/F12 toe aan elke buis.
    2. Voeg 7,5 μL transfectiereagens toe aan één buis en meng het reagens grondig door te pipetteren.
    3. Voeg 2 μg pLX-mCherry plasmide zonder endotoxine en overeenkomend lentivirusverpakkingsplasmide toe aan een andere buis en voeg het transfectiereagens (2 μL/μg plasmide) toe.
    4. Meng de vloeistof in beide centrifugebuizen en laat de mengsels 5 minuten staan bij kamertemperatuur.
    5. Verwijder het kweekmedium van de 293T-cellen en voeg het mengsel uit stap 10.2.4 toe aan de 293T-cellen. Verander het kweekmedium naar verse DMEM + 10% FBS na 8 uur.
    6. Verzamel na 48 uur het virussupernatant voor de eerste keer en filter het door een filter van 0,45 μm. Verzamel na 72 uur het virussupernatant voor de tweede keer en filter het opnieuw door een filter van 0,45 μm.
      OPMERKING: Bewaar beide gefilterde supernatanten op ijs tot lentivirustransductie.
  3. Verkrijg de LGSC's van DED-muizen (NOD/ShiLtJ) (zie stap 1).
  4. Voeg 1 ml van het vooraf verzamelde pLX-mCherry lentivirus supernatant toe om de cellen te resuspenderen.
  5. Zet de centrifugebuis op een shaker in de CO2-incubator op 37 °C. Schud het op 100 tpm om het contact tussen het lentivirus en de cellen te maximaliseren. Na 8 uur centrifugeert u het mengsel gedurende 4 minuten op 250 × g en verwijdert u het supernatant.
  6. Voeg 1 ml DMEM/F12 toe om de celpellet te resuspenderen. Gebruik een celteller om het celnummer te bepalen en zaai in totaal 1 × 104 cellen in 100 μL matrixgel-LGSCM matrix (matrixgel: LGSCM = 1:1) in elke put van een 24-well plaat vooraf gecoat met 20 μL matrix gel-LGSCM matrix (zie stap 1.3.2).
  7. Na 7 dagen cultuur (zie stap 1) selecteert u bollen met rode fluorescentie onder een fluorescentiemicroscoop om de cultuur uit te breiden.

11. LGSC orthotopische transplantatie

OPMERKING: Alle chirurgische operaties worden uitgevoerd in een SPF-operatiekamer en alle chirurgische instrumenten worden gesteriliseerd.

  1. Verkrijg de LGSC-bollen van ROSA26mT/mG-muizen met rode fluorescentie (td-Tomato) of mCherry-transfectie gekweekt gedurende 7 dagen (zie stap 1).
  2. Koel een microcentrifugebuis van 1,5 ml met een 1:1 mengsel van matrixgel en DMEM/F12 voor gebruik af op ijs. Verwerk de LGSC-bollen in enkele cellen en resuspensieer de cellen met een dichtheid van 2 × 106 cellen / ml in de buis.
  3. Verdoof de NOD/ShiLtJ muizen door intraperitoneale injectie van pentobarbital natrium (50 mg/kg).
    OPMERKING: NOD / ShiLtJ-muis is een ideaal model met idiopathische TOEGEVOEGDE symptomen, waaronder verminderde scheursecretie, inflammatoire infiltratie en orbitale ulceratie.
  4. Gebruik na anesthesie zoutoplossing of vetzalf op de ogen om uitdroging te voorkomen en gebruik vervolgens een oogheelkundige schaar om een snede van 5-8 mm in de huid achter het oor (bij het oog) van de anesthetische muizen te maken om de PG's bloot te stellen.
    OPMERKING: Jodophor moet strikt worden gebruikt voor desinfectie rond de incisie.
  5. Injecteer 2 × 104 cellen in de LG aan de linkerkant en injecteer het mengsel zonder cellen (zie stap 11.2) in de LG aan de rechterkant als bedieningsorgaan.
  6. Herstel na injectie de PG's in hun oorspronkelijke positie met een oogheelkundige tang en hecht de wond. Voer de muizen gedurende 2 maanden en observeer het effect van de behandeling.
    OPMERKING: Het kooikussenmateriaal moet ook strikt worden gesteriliseerd na de operatie en het kussenmateriaal moet eenmaal per dag worden vervangen. Na het hechten van de wond kan tramadol selectief in de staartader van muizen worden geïnjecteerd met de standaarddosis van 2,5 mg / kg om analgesie te bereiken.
  7. Verdoof deze muizen 2 maanden na het experiment (zie stap 11.3). Film de symptomen van het oculaire gebied.
    1. Zoek tijdens anesthesie naar de volgende symptomen: nek- en ledemaatspierontspanning; diepe, langzame en gestage ademhaling; pupilvernauwing; corneareflex verdwijning.
    2. Houd tijdens anesthesie en operatie de lichaamstemperatuur van muizen op 37 °C. Voeg na de operatie geschikte antibiotica toe aan het drinkwater voor muizen om het risico op wondinfectie te verminderen. Laat de muizen niet onbeheerd achter totdat ze weer voldoende bij bewustzijn zijn gekomen om de sternale lighouding te behouden. Breng de muizen die een operatie hebben ondergaan niet terug naar het gezelschap van andere muizen totdat ze volledig zijn hersteld.
    3. Na het filmen van de symptomen van het oculaire gebied, opent u de ImageJ-software, klikt u op Bestand | Open | Selecties uit de vrije hand, houd de linkermuisknop ingedrukt en selecteer het gebied van orbitale ulceratie in de afbeelding. Klik op | analyseren Meet om het relatieve gebied van ulceratie te verkrijgen.
  8. Leg de fenolrode katoendraad gedurende 10 s op de laterale canthus van anesthetische muizen; meet en noteer de lengte van het verkleurde deel van de katoendraad. Euthanaseer de muizen door cervicale werveldislocatie na scheurmeting.
  9. Ontleed de muizen en verkrijg de PG's voor IHC-analyse.

12. RNA-isolatie

OPMERKING: Koel de centrifuge vóór het experiment voor op 4 °C en garandeer dat alle reagentia en verbruiksartikelen vrij zijn van RNAse-verontreiniging.

  1. Verzamel LGSC's of LG-fragmenten in een microcentrifugebuis. Voeg 1 ml cellysebuffer toe en laat de cellen of weefsels volledig lyseren door vortexoscillatie.
  2. Voeg 0,2 ml chloroform toe en laat het 10 minuten op kamertemperatuur staan na vortexoscillatie gedurende 1 minuut. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 4 °C, 12.000 × g.
    OPMERKING: Na centrifugatie wordt de vloeistof verdeeld in drie lagen en bevindt het RNA zich in de bovenste transparante waterige fase.
  3. Pipetteer voorzichtig de bovenste transparante waterige fase en breng deze over naar een nieuwe RNAse-vrije centrifugebuis van 1,5 ml.
  4. Voeg een gelijk volume isopropylalcohol toe en meng voorzichtig. Laat het mengsel 10 min op kamertemperatuur staan en centrifugeer vervolgens gedurende 15 minuten bij 4 °C, 12.000 × g.
  5. Verwijder het supernatant en voeg 1 ml 75% ethanol toe. Keer de buis om om de pellet te wassen en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 °C, 7.500 × g. Herhaal deze stap.
  6. Verwijder het supernatant voorzichtig en plaats de centrifugebuis in de ultraschone werkbank om deze ongeveer 20 minuten te drogen.
    OPMERKING: Ga verder met de volgende stap wanneer de witte pellet doorschijnend wordt. Voer alle bewerkingen op ijs uit.
  7. Voeg 20 μL RNAse-vrij water toe om de pellet volledig op te lossen. Meet de RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer (zie de tabel met materialen) en bewaar de RNA-oplossing bij -80 °C.

13. PCR

  1. Reverse transcriptie reactie
    1. Voeg 1 μg totaal RNA toe (bereken het volume toegevoegde RNA-oplossing op basis van de concentratie van de RNA-oplossing) aan de PCR-reactiebuis en incubeer bij 65 °C gedurende 5 minuten voor denaturatie.
    2. Zet het 1 min in de ijskast en voeg vervolgens enzymvrij water toe tot het totale volume 12 μL bereikt. Voeg 4 μL 4x DNA Master Mix toe en incubeer het bij 37 °C gedurende 5 min.
    3. Zet de tube op ijs, voeg 4 μL 5x RT Master Mix toe en meng het voorzichtig. Stel de volgende PCR-instellingen in: 37 °C gedurende 15 min, 50 °C gedurende 5 min, 98 °C gedurende 5 min, 4 °C gedurende 1 min.
    4. Bewaar het bij -20 °C of ga verder met de volgende stap nadat de reverse transcriptiereactie is voltooid.
  2. PCR-reactie
    1. Bereid de PCR-reactie in de PCR-buis als volgt voor: 14,1 μL enzymvrij water, 2 μL dNTP, 2 μL 10x Buffer, 0,8 μL Primer (10 μM, 0,4 μL Forward Primer en 0,4 μL Reverse Primer, zie de Materiaaltabel), 1 μL reverse transcription cDNA (zie stap 13.1) en 0,1 μL Taq-enzym.
    2. Plaats de voorbereide PCR-reactie in het PCR-apparaat voor PCR. Raadpleeg de instructies van de Taq-enzymkit voor de PCR-procedure (zie de materiaaltabel).
  3. Agarose gel elektroforese
    1. Gebruik een analytische balans om 242 g Tris en 37,2 g Na 2 EDTA·2H2O te wegen en voeg deze toe aan een bekerglas van 1 L. Voeg ~ 800 ml gedeïoniseerd water en 57,1 ml ijsazijn toe aan het bekerglas, meng goed, voeg gedeïoniseerd water toe aan 1 l om 50x TAE-buffer te verkrijgen en bewaar het bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Verdun 50x TAE buffer met gedeïoniseerd water voor gebruik.
    2. Gebruik een analytische balans om 1,2 g agarose te wegen en voeg deze toe aan een erlenmeyer met 80 ml 1x TAE-buffer. Verwarm het herhaaldelijk in de magnetron tot het volledig is opgelost.
    3. Koel de kolf onder stromend leidingwater tot de temperatuur van de oplossing daalt tot 60 °C. Voeg 8 μL nucleïnezuurvlek toe, giet de oplossing in de gelatinisatietank na goed mengen, plaats de kam en laat deze 30 minuten op kamertemperatuur staan.
    4. Trek de kam eruit en laad de PCR-producten in de bereide agarose-gel. Voer elektroforese uit bij 120 V gedurende 30 minuten.
    5. Plaats de gel in het ECL Gel beeldvormingssysteem en fotografeer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

3D, serumvrij kweeksysteem opzetten
In deze studie werd LGSCM met EGF, Wnt3A, FGF10 en Y-27632 voor muis LGSC's ontwikkeld en werden LGSC's met succes geïsoleerd en gekweekt door een 3D-kweekmethode (figuur 1A). Een succesvol 3D, serumvrij kweeksysteem van LGSC's van C57BL/6 muizen, NOD/ShiLtJ muizen, BALB/c muizen en ROSA26mT/mG muizen is vastgesteld met behulp van deze methode16. Voor een mannelijke muis werden 1,5-2 × 106 cellen verkregen uit twee PG's door dissociatie. Na een week van cultuur werden 30-60 bollen gevormd bij het zaaien van 1 × 104 LG-cellen aan het begin van de kweek. Bovendien drukten de cellen die volgens deze methode werden gekweekt Epcam, Krt5, Krt14, P63, nestine en andere stamcelmarkers16 uit, wat aangeeft dat de verkregen cellen de eigenschappen van LGSCs hadden. Krt14 en Ki67 werden uitgedrukt in alle sferen gevormd door LGSC's die gedurende 7 dagen werden gekweekt (figuur 1B), wat aangeeft dat de LGSC's zelfvernieuwingscapaciteit hadden.

Tijdens een 7-daagse kweek bereikten LGSC-bollen een diameter van 100 μm. Hematoxyline en eosine (H&E) kleuring vertoonde cellulariteit op dag 7 (figuur 1C en figuur 1F). De verrijkingsfactoren van LGSC's verkregen na 7 dagen primaire cultuur en subcultuur gaven aan dat de LGSC's verrijkt met deze methode een sterk proliferatief vermogen hadden (figuur 1D). In dit systeem konden LGSC's meer dan 40 keer worden gepasseerd en ze behielden nog steeds stamcelkenmerken (figuur 1E en figuur 1G). Concluderend beschrijft dit artikel een protocol om een 3D, serumvrij kweeksysteem voor LGSC's in vitro op te zetten. De cellen gekweekt door dit protocol hebben een continu en stabiel proliferatief vermogen.

Induceer differentiatie in vitro
De differentiatiecapaciteit van LGSC's in vitro werd geanalyseerd. Wanneer lgscs langer dan 7 dagen werden gekweekt, verloren ze geleidelijk het groeivermogen en nam de expressie van AQP5, Ltf, Krt19 en andere markers geassocieerd met differentiatie toe, terwijl de expressie van Krt14 geleidelijk afnam16. LGSC's werden geïnduceerd om meer toppen te vormen door FBS en een laag aandeel matrixgel (figuur 2A, B). Bovendien gaf H&E-kleuring aan dat FBS de bollen ertoe zou kunnen aanzetten meer caviterende structuren te produceren (figuur 2C).

Het vorige werk suggereerde dat afnemende matrixhardheid de differentiatie van LGSC's in ductaal-achtige organoïden bevorderde. De basale laagcellen behielden de kenmerken van stamcellen die Krt14 tot expressie brachten, terwijl de basale bovenste laagcellen differentieerden in kanaalachtige structuren met holtes en Krt19 tot expressie brachten. Bovendien zou de toevoeging van FBS de differentiatie van LGSC's in acinair-achtige organoïden kunnen induceren, die de kenmerken van stamcellen met een hoge nucleaire / cytoplasmatische verhouding behouden. Sommige gedifferentieerde acinair-achtige cellen brachten hoge niveaus van AQP5 tot expressie met een lage nucleaire / cytoplasmatische verhouding16.

 Reparatie LGSC's  in vivo
Op basis van de bovenstaande experimenten werd het vermogen van LGSC's om beschadigde PG's te repareren onderzocht door orthotopische injectie. Na orthotopische injectie van ROSA-LGSC's bij NOD/ShiLtJ-muizen werden nieuwe traankwabben gevormd naast de PG's (figuur 3A-C). De meeste lobben waren samengesteld uit volwassen acinaire cellen met een hoge expressie van AQP5, en er was intralobulaire kanaalvorming met lage AQP5-expressie (figuur 3D-F). Na injectie van ROSA-LGSC's gedurende 8 weken werd het verval rond de baan van de ontvangers gemeten. De metingen gaven aan dat de injectie van LGSC's het vervalgebied met ~ 60% verminderde (figuur 3G, H). De dissectie toonde aan dat het LG-volume na injectie gedurende 10 weken toenam (figuur 3I). De hoeveelheid scheursecretie aan de rosa-lgscs-injectiezijde was hoger dan aan de controlezijde, maar lager dan bij wildtypemuizen (figuur 3J). Deze resultaten geven aan dat de cellen die door dit kweeksysteem worden geoogst, de kenmerken van LGSC's hebben en kunnen worden gebruikt voor stamceltherapie bij muizen met ADDED en xerophthalmia.

Figure 1
Figuur 1: Isolatie en karakterisering van LGSC's. (A) De strategie van lgsc primaire en continue passage cultuur. (B) Immunofluorescentiekleuring van LGSC's op dag 7. LGSC's drukken epitheelcelmarker E-cadherine (rood), stamcelmarker Krt14 (rood), proliferatieve celmarker Ki67 (rood) uit. Counterstain, DAPI (blauw). (C) De morfologie van LGSC's in cultuur gedurende 1, 3, 5 en 7 dagen. (D) Relatieve verrijkingsfactor van de LGSC-cultuur in de primaire cultuur en subcultuur. Relatieve verrijkingsfactor is de verhouding van het totale aantal cellen verkregen na 7 dagen cultuur tot het aantal cellen dat in cultuur is gezaaid. P < 0,01. (E) Transcriptie van volwassen stam/voorlopercelmarkers van de muis LG en verschillende passage LGSC's (P1, P10, P20 en P40). (F) De morfologie (links) en H&E-kleuring (rechts) van LGSC's in primaire cultuur op dag 7. (G) LGSC's gekweekt in verschillende passages (P1, P10, P20 en P40). Schaalstaven = 50 μm (B, F, G), 100 μm (C). Afkortingen: LG = lacrimal gland; LGSC's = LG stamcellen; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool;; NC = negatieve controle; TE = trypsine-EDTA; H&E = hematoxyline en eosine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Differentiatie van LGSC's in vitro. (A,B) Morfologie van LGSC's gekweekt in normaal medium of differentiatiemedium. (A) LGSC's gekweekt gedurende 10 dagen in P10 (links: normaal medium, rechts: FBS-bevattend medium). (B) LGSC's gekweekt gedurende 14 dagen in P31 (links: normaal medium, rechts: medium met 1/3rd matrixgel). (C) H&E-kleuring van de LGSC's gekweekt gedurende 14 dagen (boven: normaal medium, onder: FBS-bevattend medium). Schaalstaven = 100 μm (A), 200 μm (B), 50 μm (C). Afkortingen: LG = lacrimal gland; LGSC's = LG stamcellen; H&E = hematoxyline en eosine; FBS = foetaal runderserum. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Engraftment van LGSCs allotransplantatie en verlichting van TOEGEVOEGDE symptomen. (A-F) IHC-kleuring van NOD / ShiLtJ LG getransplanteerd met 7-daagse culturen van ROSA-LGSCs na 8 weken. Gebruik de linker- en rechterkant van dezelfde muis als de experimentele groep en de controlegroep. (A-C) IHC-kleuring met anti-td-tomatenantilichaam; (D-F) IHC-kleuring met anti-AQP5-antilichaam; (A, D) LG geïnjecteerd met voertuig (1:1 mengsel van matrixgel en DMEM/F12), (B, E) LG geïnjecteerd met ROSA-LGSC's, (C, F) de vergrote beelden van de zwarte vierkanten in B, E (rode pijl, intralobulair kanaal). (G, H) De toestand van de NOD/ShiLtJ muisoogbaan na injectie van ROSA-LGSC's na 8 weken. De injectie van LGSC's verlicht het verval rond de oogbaan aanzienlijk. (I) PG's van de NOD/ShiLtJ-muis na 10 weken (links: LG vanaf de celgeïnjecteerde kant, rechts: LG vanaf de controlezijde). (J) Scheurvolume van wild-type en NOD/ShiLtJ muizen getransplanteerd met 7-daagse culturen van ROSA-LGSCs na 8 weken. Het scheurvolume van ROSA-LGSC-geïnjecteerde PG's is hoger dan dat van de controle-PG's, maar aanzienlijk lager dan dat van WT PG's. n = 3; NOD/ShiLtJ muizen, n = 4; P < 0,01; *P < 0,05. Schaalstaven = 50 μm (A-F). Afkortingen: LG = lacrimal gland; LGSC's = LG stamcellen; IHC = immunohistochemisch; WT = wild-type; TOEGEVOEGD = waterig-deficiënte droge ogen ziekte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Er zijn gevestigde methoden voor de isolatie en in vitro kweek van traanstamcellen voor traanstamcelkweek en LG-letselherstel. Shatos et al.17 en Ackermannet al. 6 succesvol gekweekte en subculturele traanstamcellen van ratten en muizen door respectievelijk 2D-kweekmethoden, waardoor het mogelijk is om traanstamcellen te transplanteren voor de behandeling van ADDED. Studies op stamcellen18 en mesenchymale stamcellen19,20 van de PG's gekweekt in 2D toonden aan dat de transplantatie van deze cellen de symptomen van ADDED tot op zekere hoogte kon verlichten. Door fluorescentie-geactiveerde celsortering, Gromovaet al. 2 geselecteerde stamcellen die LG-voorlopercelmarkers van muis-PG's tot expressie brachten en differentieerden ze in kanalen en acini in vitro, waarbij met succes de differentiatie van volwassen stamcellen in functionele cellen van PG's werd gerealiseerd. Er werd ook aangetoond dat transplantatie van een voldoende aantal stamcellen de TOEGEVOEGDE symptomen bij muizen kon verlichten.

Om te voldoen aan de behoeften van stamcelverrijking en serumafhankelijkheid in bestaande traanstamcelkweekmethoden te elimineren, werd het serumvrije kweeksysteem van traanstamcellen in dit protocol opgezet op basis van eerder gepubliceerd onderzoek en organoïde 3D-kweektechnologie21. Verwacht wordt dat dit systeem klinisch onderzoek naar traanstamcellen zal bevorderen. In dit protocol omvatten de kritieke stappen primaire cultuur, subcultuur en uitbreiding van LGSC's en in situ transplantatie van LGSC's in gewonde PG's bij muizen.

Primaire cultuur is de basis voor het verkrijgen van LGSC's. Het is noodzakelijk om steriele omstandigheden te behouden tijdens primaire cultuur. De put is voorgecoat met matrix-gel om aanhechtende groei van cellen aan de onderkant van de celkweekput te voorkomen. Bij het gebruik van matrix-gel is het noodzakelijk om de instructies van de fabrikant te volgen en deze altijd in de vloeibare toestand te houden voordat deze aan de put wordt toegevoegd om matrix-gelverlies tijdens het experiment en de ongelijke matrix-gel in de cultuur te voorkomen.

Het aantal gezaaide cellen in primaire cultuur is 10.000 cellen / put. In de praktijk kan het aantal gezaaide cellen worden verhoogd als de juiste groeiruimte en nutriëntentoevoer van cellen worden gewaarborgd. Subcultuur is een belangrijke stap om stamcellen te zuiveren en te verrijken. Na passage vormden LGSC's in de P1-generatie meer bollen en waren er meer P1-generatiecellen dan de P0-generatie. Dit geeft aan dat LGSC's met proliferatief vermogen in dit systeem zijn verrijkt.

Toen LGSC's gedurende 10 dagen in dit 3D-systeem werden gekweekt, was 0,05% trypsine-EDTA soms niet voldoende om de organoïden tijdens de passage volledig in afzonderlijke cellen te verteren. Dit probleem werd opgelost door de verteringstijd op de juiste manier te verlengen. In situ injectietherapie is een noodzakelijke procedure om de klinische waarde van LGSC's te verifiëren. Vanwege het kleine formaat en de dunne en losse weefsels van PG's bij muizen, gaan cellen altijd verloren van de injectieplaats als de celsuspensie wordt bereid in normale zoutoplossing of 10 mM PBS voor injectie. Daarom wordt aanbevolen om de celsuspensie te mengen met matrix-gel voor injectie. Omdat de matrix-gel die in dit systeem wordt gebruikt stolt bij temperaturen boven 10 °C, kunnen cellen gemakkelijk koloniseren wanneer ze in de PG's worden geïnjecteerd. Het mengsel van cellen en matrix-gel moet altijd vóór de injectie op ijs worden gehouden en de injectie moet snel worden uitgevoerd.

Naast het isoleren van LGSC's van normale muizen, werden volwassen LGSC's van ADDED-muizen voor het eerst met succes geïsoleerd en gekweekt met behulp van dit protocol16. Dit systeem heeft echter nog steeds tekortkomingen en onopgeloste problemen. Ten eerste is de gebruikte matrix-gel afgeleid van muizen 22,23, die afstotingsreacties in het menselijk lichaam kunnen veroorzaken en daarom een beperkte klinische toepasbaarheid hebben. Het is noodzakelijk om het kweeksysteem te verbeteren door geschikte synthetische gels te vinden om de matrixgel te vervangen.

Ten tweede moet de differentiatiestrategie in dit protocol worden verbeterd. In plaats van de kweektijd voor differentiatie21 te verlengen of serum toe te voegen aan het kweekmedium, wordt verwacht dat het toevoegen van specifieke groeifactoren en het veranderen van specifieke omgevingsomstandigheden voor directionele inductie de gewenste resultaten zal opleveren. Het is noodzakelijk het mechanisme van het onderhoud en de differentiatie van LGSC's verder te onderzoeken door de signaalroutes die differentiatie veroorzaken, op te helderen. Bovendien hebben eerdere studies aangetoond dat myoepitheliale cellen die in vitro zijn gekweekt ook stamcelgenen tot expressie brengen, zoals Nestin, Musashi en Pax6, wat aangeeft dat myoepitheliale cellen ook stamcelkenmerken hebben17.

Deze studie besteedde geen aandacht aan myoepitheliale cellen en verifieerde daarom niet of myoepitheliale cellen bestaan in de LG-organoïden door specifieke expressiemarkers van myoepitheliale cellen te identificeren. Vanwege de beperking van de kweekomstandigheden konden myo-epitheelcellen niet worden geïnduceerd of dat hun aantal te klein was om te worden waargenomen. De kweektijd kan worden verlengd om te observeren of de organoïden verder differentiëren tot myoepitheliale cellen, of zich richten op myoepitheliale cellen in toekomstige studies van inductiedifferentiatie en systeemverbetering.

Kortom, dit protocol biedt een methode voor het bestuderen van LGSC's voor de ontwikkeling, reparatie en regeneratie van PG's. De differentiatie van LGSC's in vitro zou de basis kunnen vormen voor toekomstige in vitro regeneratie van PG's, terwijl de isolatie en kweek van LGSC's het probleem van afstoting bij stamcelallotransplantatie kan oplossen. Deze methode biedt een belangrijke basis voor klinische geïndividualiseerde behandeling van xerophthalmia met LGSC's.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Natural Science Foundation of China (nr. 31871413) en twee programma's van Guangdong Science and Technology (2017B020230002 en 2016B030231001). We zijn de onderzoekers die ons hebben geholpen tijdens het onderzoek en de medewerkers die in het dierencentrum werken echt dankbaar voor hun steun in de dierverzorging.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal(Mouse)
Bal B/C Model Animal Research Center of Nanjing University
C57 BL/6J Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University
NOD/ShiLtJ Model Animal Research Center of Nanjing University
ROSA26mT/mG Model Animal Research Center of Nanjing University
Equipment
Analytical balance Sartorius
Automatic dehydrator Thermo
Blood counting chamber BLAU
Cell Counter CountStar
CO2 constant temperature incubator Thermo
ECL Gel imaging system GE healthcare
Electric bath for water bath Yiheng Technology
Electrophoresis apparatus BioRad
Fluorescence quantitative PCR instrument Roche
Frozen tissue slicer Lecia
Horizontal centrifuge CENCE
Inverted fluorescence microscope Nikon
Inverted microscope Olympus
Laser lamellar scanning micrograph Carl Zeiss
Liquid nitrogen container Thermo
Low temperature high speed centrifuge Eppendorf
Micropipettor Gilson
Microwave oven Panasonic
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer Thermo measure RNA concentration
Paraffin slicing machine Thermo
PCR Amplifier Eppendorf
pH value tester Sartorius
4 °C Refrigerator Haier
Thermostatic culture oscillator ZHICHENG
Tissue paraffin embedding instrument Thermo
 -80°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
 -20°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
Ultra pure water purification system ELGA
Reagent
Animal Experiment
HCG Sigma 9002-61-3
PMSG Sigma 14158-65-7
Pentobarbital Sodium Sigma 57-33-0
Cell Culture
B27 Gibco 17504044
Collagenase I Gibco 17018029
Dispase BD 354235
DMEM Sigma D6429
DMEM/F12 Sigma D0697
DMSO Sigma 67-68-5
EDTA Sangon Biotech A500895
Foetal Bovine Serum Gibco 04-001-1ACS
GlutaMax Gibco 35050087
Human FGF10 PeproTech 100-26
Matrigel (Matrix gel) BD 356231
Murine Noggin PeproTech 250-38
Murine Wnt3A PeproTech 315-20
Murine EGF PeproTech 315-09
NEAA Gibco 11140050
N2 Gibco 17502048
R-spondin 1 PeproTech 120-38
Trypsin Inhibitor (TI) Sigma T6522 Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin.
Trypsin Sigma  T4799
Y-27632 Selleck S1049
HE staining & Immunostaining
Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-21202 Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL
Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-21206 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-10037 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-10042 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL
Anti-AQP5 rabbit antibody Abcam ab104751 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL
Anti-E-cadherin Rat antibody Abcam ab11512 Used dilution: (IF)  5 μg/mL
Anti-Keratin14 rabbit antibody Abcam ab181595 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-Ki67 rabbit antibody Abcam ab15580 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL
Anti-mCherry mouse antibody Abcam ab125096 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-mCherry rabbit antibody Abcam ab167453 Used dilution: (IF)  2 μg/mL
C6H8O7 Sangon Biotech A501702-0500
Citric Acid Sangon Biotech 201-069-1
DAB Kit (20x) CWBIO CW0125
DAPI Thermo 62248
Eosin BASO 68115
Fluorescent Mounting Medium Dako S3023
Formalin Sangon Biotech A501912-0500
Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP) Abcam ab6789 Used dilution: 2 μg/mL
Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP) Abcam ab6721 Used dilution: 2 μg/mL
Hematoxylin BASO 517-28-2
Histogel (Embedding hydrogel) Thermo HG-400-012
30% H2O2 Guangzhou Chemistry KD10
30% Hydrogen Peroxide Solution Guangzhou Chemistry 7722-84-1
Methanol Guangzhou Chemistry 67-56-1
Na3C6H5O7.2H2O Sangon Biotech A501293-0500
Neutral balsam SHANGHAI YIYANG YY-Neutral balsam
Non-immunized Goat Serum BOSTER AR0009
Paraffin Sangon Biotech A601891-0500
Paraformaldehyde DAMAO 200-001-8
Saccharose Guangzhou Chemistry 57-50-1
Sodium citrate tribasic dihydrate Sangon Biotech 200-675-3
Sucrose Guangzhou Chemistry IB11-AR-500G
Tissue-Tek O.T.C. Compound SAKURA SAKURA.4583
Triton X-100 DINGGUO 9002-93-1
Xylene Guangzhou Chemistry 128686-03-3
RT-PCR & qRT-PCR
Agarose Sigma 9012-36-6
Alcohol Guangzhou Chemistry 64-17-5
Chloroform Guangzhou Chemistry 865-49-6
Ethidium Bromide Sangon Biotech 214-984-6
Isopropyl Alcohol Guangzhou Chemistry 67-63-0
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix Roche 488735200H
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix TOYOBO -
Taq DNA Polymerase TAKARA R10T1
Goldview (nucleic acid stain) BioSharp BS357A
TRIzol Magen R4801-02
Vector Construction & Cell Transfection
Agar OXID -
Ampicillin Sigma 69-52-3
Chloramphenicol Sigma 56-75-7
Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit Thermo A36227
Kanamycin Sigma 25389-94-0
Lipo3000 Plasmid Transfection Kit Thermo L3000015
LR Reaction Kit Thermo 11791019
Plasmid Extraction Kit TIANGEN DP103
Trans5α Chemically Competent Cell TRANSGEN CD201-01
Trytone OXID -
Yeast Extract OXID -
Primers and Sequence Company
Primer: AQP5
Sequence:
F: CATGAACCCAGCCCGATCTT
R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC		 Synbio Tech
Primer: β-actin
Sequence:
F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT
R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT		 Synbio Tech
Primer: Epcam
Sequence:
F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT
R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG		 Synbio Tech
Primer: Krt5
Sequence:
F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG
R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC		 Synbio Tech
Primer: Krt14
Sequence:
F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA
R: GCCACCTCCTCGTGGTTC		 Synbio Tech
Primer: Krt19
Sequence:
F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG
R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT		 Synbio Tech
Primer: Ltf
Sequence:
F: CACATGCTGTCGTATCCCGA
R: CGATGCCCTGATGGACGA		 Synbio Tech
Primer: Nestin
Sequence:
F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC
R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT		 Synbio Tech
Primer: P63
Sequence:
F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA
R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC		 Synbio Tech
Vector
pLX302 lentivirus no-load vector Addgene
pENRTY-mCherry Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
  2. Gromova, A., et al. Lacrimal gland repair using progenitor cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).
  3. Buzhor, E., et al. Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases. Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).
  4. Tiwari, S., et al. Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function. PLoS One. 7 (1), 29458 (2012).
  5. You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).
  6. Ackermann, P., et al. Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Lugli, N., et al. R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders. EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).
  9. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1), 299-312 (2015).
  10. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1), 324-338 (2015).
  11. Barker, N., et al. Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  12. Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
  13. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  14. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).
  15. Maimets, M., et al. Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
  16. Xiao, S., Zhang, Y. Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20 (2020).
  17. Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
  18. Mishima, K., et al. Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin. Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).
  19. Aluri, H. S., et al. Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren's syndrome. Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).
  20. Dietrich, J., Schrader, S. Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches. Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).
  21. Sato, T., Clevers, H. SnapShot: growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700 (2015).
  22. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
  23. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).

Tags

Biologie Nummer 184
Driedimensionaal, serumvrij kweeksysteem voor traanklierstamcellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, H., Huang, P., Zhang, Y.… More

Chen, H., Huang, P., Zhang, Y. Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (184), e63585, doi:10.3791/63585 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter