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Biology

Sistema de cultura tridimensional e livre de soro para células-tronco da glândula lacrimal

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63585
Automatic Translation
1, 1, 1
1MOE Key Laboratory of Gene Function and Regulation, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University

Summary

O método de cultura tridimensional e livre de soro para células-tronco da glândula lacrimal adulta (LG) está bem estabelecido para a indução da formação organoide LG e diferenciação em células acinar ou ductais.

Abstract

A terapia à base de células-tronco (LG) é uma estratégia promissora para doenças lacrimais da glândula. No entanto, a falta de um método de cultura confiável e livre de soro para obter um número suficiente de células-tronco LG (LGSCs) é um obstáculo para novas pesquisas e aplicação. O método de cultura tridimensional (3D), sem soro para LGSCs de mouse adulto é bem estabelecido e mostrado aqui. Os LGSCs poderiam ser continuamente transicionados e induzidos a diferenciar-se para células acinar ou ductais.

Para a cultura primária lgsc, os LGs de camundongos de 6-8 semanas de idade foram digeridos com despase, colagenase I, e trypsin-EDTA. Um total de 1 × 104 células individuais foram semeadas em 80 μL de matriz de células-tronco de glândula gel-lacrimal (LGSCM) em cada poço de uma placa de 24 poços, pré-revestida com 20 μL de matriz de gel-LGSCM matriz. A mistura foi solidificada após a incubação por 20 min a 37 °C, e 600 μL de LGSCM adicionado.

Para a manutenção lgsc, os LGSCs cultivados por 7 dias foram desagregados em células únicas por despase e trippsin-EDTA. As células únicas foram implantadas e cultivadas de acordo com o método utilizado na cultura primária lgsc. Os LGSCs poderiam ser passagens mais de 40 vezes e expressar continuamente marcadores de células-tronco/progenitor Krt14, Krt5, P63 e nestin. Os LGSCs cultivados no LGSCM têm capacidade de auto-renovação e podem se diferenciar em células acinar ou ductais in vitro e in vivo.

Introduction

As células-tronco da glândula lacrimal (LGSCs) mantêm a renovação celular da glândula lacrimal (LG) e são a fonte de células acinar e ductais. Portanto, o transplante LGSC é considerado uma abordagem alternativa para o tratamento de danos inflamatórios graves e doença ocular seca deficiente aquosa (ADDED)1,2,3. Vários métodos de cultura foram aplicados para enriquecer lgscs. Tiwari et al. células LG primárias separadas e cultivadas usando colágeno I e gel de matriz complementados com vários fatores de crescimento; no entanto, as células LG não poderiam ser continuamente cultivadas4. Usando cultura bidimensional (2D), as células-tronco derivadas do MOUSE LG foram isoladas por You et al.5 e Ackermann et al. 6, encontrado para expressar os genes marcadores de células-tronco/progenitor, Oct4, Sox2, Nanog e nestin, e poderia ser subcultado. No entanto, não há indicação clara de que essas células possam se diferenciar em células acinar ou ductais, e não há experimento de transplante para verificar o potencial de diferenciação in vivo.

Recentemente, as células c-kit+ dim/EpCAM+/Sca1-/CD34-/CD45- foram isoladas dos LGs do mouse por citometria de fluxo, encontradas para expressar marcadores celulares progenitores LG, como Pax6 e Runx1, e diferenciadas em dutos e acini in vitro. Em camundongos com ADICIONADO, a injeção ortotópica com essas células poderia reparar LGs danificados e restaurar a função secretary dos LGs2. No entanto, o número de células-tronco isoladas por este método foi pequeno, e não há condições de cultura adequadas para a expansão dos LGSCs isolados. Em resumo, é necessário estabelecer um sistema de cultura adequado para isolar e cultivar efetivamente LGSCs adultos com expansão estável e contínua para o estudo de LGSCs no tratamento de ADDED.

Organoides derivados de células-tronco ou células-tronco pluripotentes são um grupo de células que são histologicamente semelhantes aos órgãos relacionados e podem manter sua própria renovação. Depois que o organoide do intestino do camundongo foi cultivado com sucesso por Sato et al. em 20097, organoides de outros órgãos foram cultivados em sucessão, com base no sistema cultural de Sato, como vesículabiliar 8, fígado9, pâncreas10, estômago11, mama12, pulmão13, próstata14 e glândula salivar15 . Devido à alta proporção de células-tronco adultas antes da diferenciação celular na cultura organoide, o método de cultura organoide tridimensional (3D) é considerado ideal para o isolamento e cultura das células-tronco adultas da LG.

Um sistema de cultura LGSC de camundongos adultos foi estabelecido no presente estudo pela otimização do método de cultura 3D, livre de soro. É comprovado que os LGSCs cultivados tanto a partir de camundongos normais quanto adicionados apresentaram uma capacidade estável de autoconexão e proliferação. Após o transplante nos LGs do mouse adicionado, os LGSCs colonizaram os LGs prejudicados e melhoraram a produção de lágrimas. Além disso, os LGSCs fluorescentes vermelhos foram isolados de camundongos ROSA26mT/mG e cultivados. Este trabalho fornece uma referência confiável para o enriquecimento LGSC in vitro e autoenxerto LGSC na aplicação clínica para terapia adicional.

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Protocol

Todos os experimentos neste protocolo seguiram as diretrizes de cuidados com animais do Comitê Ético sobre Julgamento Animal da Universidade Sun Yat-sen. Todas as operações relacionadas à célula devem ser realizadas na bancada ultracleana na sala de operação da célula. Todas as operações usando xileno devem ser realizadas em capas de fumaça.

1. Cultura primária lgsc

  1. Isolamento LG
    1. Obtenha um rato macho BALB/c de 6-8 semanas de idade, e corte a pele atrás da orelha para expor o LG e o tecido conjuntivo ao seu redor. Retire o tecido conjuntivo por dissecção contundente com a ajuda de pinças e remova o LG.
    2. Enxágüe os LGs duas vezes com 4 mL de solução estéril de 10 mM PBS para remover sangue em um prato de 6 cm. Mergulhe os LGs em um prato de 6 cm com 4 mL de 75% de etanol para 10 s e enxágue com 10 mM PBS duas vezes imediatamente.
  2. Obtenha células únicas de LG
    1. Use a solução tampão HEPES (50 mM HEPES/KOH, pH 7.4; 150 mM NaCl em água ultrauso) para preparar 25 dispase U/mL. Prepare a solução de colagem I de 0,1% com água ultrapura.
    2. Corte os LGs em pequenos fragmentos (cerca de 1 mm3), transfira-os para um tubo de centrífuga de 15 mL estéril de 15 mL e trate os tecidos com 500 μL de 25 dáspase U/mL e 500 μL de colagem de 0,1% I por 1 h a 37 °C.
    3. Use 10 mM PBS para preparar a solução trypsin-EDTA (0,05 g/L trypsin, 0,04 g/L EDTA). Trate os fragmentos LG da etapa 1.2.2 com 1 mL de 0,05% de trypsin-EDTA por 10 minutos a 37 °C e dissocia os fragmentos em células únicas por pipetar repetidamente.
    4. Filtre a suspensão através de um filtro de 70 μm, colete o filtrado em um tubo de centrífuga estéril de 15 mL e centrífuga a 150 × g por 5 min.
    5. Após a centrifugação, remova o supernasce, adicione 10 mL de PBS de 10 mM para lavar a pelota celular e centrifugar a suspensão.
    6. Repita o passo 1.2.5, remova o supernasce e adicione 1 mL de DMEM/F12 (mistura 1:1 do meio modificado da Águia de Dulbecco e F-12 de Ham) para resuspensar as pelotas da célula.
  3. Cultura primária lgsc
    1. Prepare o meio de célula-tronco da glândula lacrimal (LGSCM) contendo DMEM/F12, suplemento 1x N2, suplemento 1x B27, 2 mM substituto de glutamina, 0,1 mM NEAAs (aminoácidos não essenciais), 50 ng/mL fator de crescimento epidérmico murina (EGF), 100 ng/mL fator de crescimento do fibroblasto 10 (FGF10), 10 ng/mL Wnt3A e 10 μM Y-27632 (inibidor de ROCHA).
    2. Adicione 20 μL de matriz gel-LGSCM (gel de matriz: LGSCM = 1:1) no centro do poço de uma placa de 24 poços. Use uma ponta de pipeta para expandi-la para um círculo (6-8 mm de diâmetro) e incubar a mistura por 20 min a 37 °C para pré-revestimento do poço.
    3. Use um contador de células para determinar o número da célula e adicione 40 μL de LGSCM com um total de 1 ×10 4 células em 40 μL do gel de matriz. Misture-os suavemente com uma pipeta para obter uma mistura de gel-LGSCM matricial (gel de matriz: LGSCM= 1:1).
    4. Use uma pipeta para soltar cuidadosamente 80 μL da mistura sobre a área pré-revestida em cada poço da placa de 24 poços na etapa 1.3.2.
    5. Incubar a mistura por 20 min a 37 °C e adicionar 600 μL de LGSCM.
    6. Mude o meio de cultura em cada poço uma vez a cada dois dias. Após 7 dias de cultura, procure por esferas LGSC de 100-300 μm de diâmetro sob o microscópio invertido (ocular: 10x, objetivo: 4x).
      NOTA: Os LGSCs podem ser cultivados por mais de 14 dias no total.
  4. Isolar e cultivar LGSCs primários de camundongos ROSA26mT/mG e camundongos DED (NOD/ShiLtJ) seguindo os passos descritos acima.

2. Manutenção e passagem lgsc

  1. Remova bem o meio cultural da cultura da esfera.
  2. Desagregar as esferas LGSC cultivadas por 7 dias por incubação em 20 μL de dispase U/mL e 100 μL de 10 mM PBS por 30 min a 37 °C.
  3. Transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 15 mL e centrífuga a 150 × g por 4 min. Remova o supernatante.
  4. Trate as esferas com 1 mL de 0,05% trypsin-EDTA por 5 min a 37 °C. Adicione 1 mL de inibidor de trippsina (TI) e pipeta repetidamente para neutralizar a trippsina e dissociar as esferas em células únicas.
  5. Centrifugar a 150 × g por 5 min e remover o supernante para obter LGSCs na pelota. Adicione 1 mL de LGSCM para resuspensar a pelota LGSC.
  6. Emplaque as células únicas conforme descrito nas etapas 1.3.1 a 1.3.6.

3. Diferenciação LGSC

  1. Procedimento 1: Estender o tempo de cultura dos LGSCs de 7 para 14 dias com o sistema de cultura LGSC para diferenciação aleatória.
  2. Procedimento 2: Alterar a proporção da mistura matriz gel-LGSCM de 1:1 para 1:2 no início da cultura LGSC para a diferenciação das células ductais. Semente os LGSCs na matriz para indução por 14 dias (consulte a etapa 1.3).
  3. Procedimento 3: Após a passagem, substitua o LGSCM pela mistura lgscm-10% de soro bovino fetal (FBS) para a diferenciação de células acinar. Induzir diferenciação por 14 dias.

4. Desidratação do tecido LG

  1. Obtenha tecidos LG (passo 1.1.1) e enxágue os LGs com 4 mL de solução PBS estéril de 10 mM em um prato de 6 cm por 2 min. Mova os tecidos para solução de formalina de 10% para fixação por 24 h.
  2. Enxágüe os tecidos fixos com PBS de 10 mM por 2 minutos para remover a formalina e transfira o tecido para uma caixa de incorporação de tecido. Coloque a caixa de incorporação no desidratador automático.
  3. Use o desidratador automático para desidratar os tecidos da seguinte forma: 70% etanol, 2h; 80% etanol, 2h; 90% etanol, 30 min; 95% de etanol, 30 min; etanol absoluto, 30min; etanol absoluto, 2h; etanol absoluto: 100% xileno (1: 1) mistura, 30 min; 100% xileno, 30 min; 100% xileno, 2h; 100% xileno: parafina (1: 1) mistura, 30 min; parafina, 2 h; parafina, 3 h.

5. Desidratação organoide/esfera LG

  1. Obtenha organoides/esferas LG (etapas 2.1-2.3) em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e enxágue os organoides/esferas LG com 1 mL de solução PBS estéril de 10 mM por 2 min.
  2. Centrifugar a 100 × g por 1 min e remover o supernatante.
  3. Prepare a solução de paraformaldeído de 4% (PFA) da seguinte forma: adicione 20 g de PFA a uma mistura de 400 mL de PBS de 10 mM e 40 μL de 1 M NaOH, agite bem a solução e aqueça-a em um banho de água de 65 °C por 2h até que o PFA esteja completamente dissolvido. Depois de esfriar até a temperatura ambiente, use PBS de 10 mM para compensar o volume a 500 mL e armazená-lo a 4 °C.
  4. Adicione 1 mL de 4% de PFA no tubo de microcentrífuga com a pelota organoide/esfera e coloque o tubo em uma geladeira de 4 °C por pelo menos 24 h para fixação.
  5. Após a fixação, centrífuga a 100 × g por 1 min e remova o supernaspe. Adicione 1 mL de PBS de 10 mM no tubo de microcentrifutura com a pelota organoide/esfera e misture suavemente por pipetação por 2 minutos para enxaguar o PFA. Repita este passo duas vezes.
  6. Centrifugar a 100 × g por 1 min e remover o supernaspe.
  7. O hidrogel de incorporação de calor para dissolver e adicionar 50-60 μL de hidrogel de incorporação à pelota organoide/esfera e misturar. Pipete a mistura sobre o parafilme na forma de uma gota e espere 5 min para que ela se solidifique à temperatura ambiente.
  8. Desidratar o gel com os organoides/esferas em um novo tubo de microcentrifutura de 1,5 mL da seguinte forma.
    1. Adicione 1 mL de 50% de etanol ao tubo, espere 30 min à temperatura ambiente e retire o líquido do tubo por tubulação. Repita esse passo alterando a concentração de etanol para 70%, 80%, 90%, 95% sucessivamente.
    2. Adicione 1 mL de etanol absoluto ao tubo, espere 30 min em temperatura ambiente e remova o líquido do tubo por tubulação. Repita este passo.
    3. Adicione 1 mL de uma mistura de 0,5 mL de etanol absoluto e 0,5 mL de 100% xileno ao tubo, espere 30 min à temperatura ambiente e remova o líquido do tubo por pipetação.
    4. Adicione 1 mL de 100% xileno ao tubo, espere 30 min à temperatura ambiente e remova o líquido do tubo por pipetação. Repita este passo.
      NOTA: As etapas 5.8.5-5.8.6 devem ser realizadas em um banho de metal a 65 °C.
    5. Adicione 1 mL de uma mistura de 0,5 mL de parafina e 0,5 mL de 100% xileno ao tubo, espere 30 min a 65 °C e remova o líquido do tubo por pipetação.
    6. Adicione 1 mL de parafina ao tubo, espere 30 min a 65 °C e retire o líquido do tubo por pipetação. Repita esta etapa e amplie o tempo de processamento para 1h.

6. Incorporação e secção de parafina

  1. Incorporação de parafina
    1. Antes de incorporar, ligue a máquina de incorporação e pré-aqueça-a para derreter a cera de parafina no tanque de parafina.
    2. Coloque o tecido desidratado ou o gel organoide/esfera na ranhura da caixa de ferro de incorporação e coloque a caixa de ferro na parafina da máquina de incorporação.
    3. Retire a tampa plástica e coloque a caixa de incorporação de plástico na caixa de ferro para cobri-la. Mova a caixa de ferro de incorporação para uma mesa de resfriamento.
    4. Depois que a parafina tiver condensado em blocos na caixa de incorporação, remova-a da caixa de ferro e corte-a diretamente ou armazene-a temporariamente em uma geladeira de 4 °C.
  2. Secção de parafina
    1. Antes de cortar a parafina, pré-monte o cortador de parafina e adicione água destilada à pia do cortador para pré-aquecimento. Comece a cortar quando a temperatura da água subir para 42 °C.
    2. Fixar a amostra no slot amostral do cortador de parafina. Ajuste a espessura da seção para 5 μm durante o corte.
    3. Se se sectionia a amostra continuamente. Fixar a seção totalmente ladrilho no slide antislip no tanque do cortador.
    4. Após a secção, coloque os slides afixados com tecido amostral em uma incubadora bioquímica a 37 °C para secagem por 24 h. Armazene temporariamente os slides em uma geladeira a 4 °C.

7. Mancha de hematoxilina e eosina

  1. Derreta as seções de parafina a 60 °C por 30 minutos, mergulhe as seções em 100% xileno por 15 minutos e repita.
  2. Trate as seções com etanol absoluto em um agitador por 5 minutos.
  3. Trate os trechos com 90% de etanol, 80% etanol e 70% de etanol em um agitador, cada um por 3 min.
  4. Trate as seções com água deionizada em um agitador por 5 minutos e 2 min sucessivamente.
  5. Manche as seções em uma caixa molhada por 5 minutos com solução de hematoxilina de 4 mg/mL. Enxágüe as seções em água corrente por 10 minutos.
  6. Agitar as seções em um agitador primeiro com água deionizada por 2 min e depois com eosina de 0,5%-1% por 1 min.
  7. Agitar os trechos com 70% de etanol, 80% de etanol e 90% de etanol em um agitador por 3 min (cada) sucessivamente. Agitar as seções com etanol absoluto em um agitador por 5 minutos.
  8. Mergulhe as seções em 100% xileno por 15 minutos e repita a imersão.
  9. Use uma pipeta ou caixa de vendatel para adicionar 3-4 gotas de bálsamo neutro ao slide e cubra-o lentamente com um slide de cobertura. Seque as lâminas à temperatura ambiente.

8. Coloração imunohistoquímica (IHC)

  1. Derreta as seções de parafina a 60 °C por 30 minutos, mergulhe as seções em 100% xileno por 10 minutos e repita esta etapa duas vezes.
  2. Agitar os trechos em um shaker primeiro com etanol absoluto, 90% etanol e 80% etanol por 2 min (cada), sucessivamente, e depois com água deionizada por 3 min. Repita a agitação com água desionizada duas vezes.
  3. Agitar as seções em um shaker primeiro com uma mistura de 20 mL de 30% H2O2 e 180 mL de metanol por 10 min e depois água deionizada por 5 min. Repita este passo três vezes.
  4. Transfira as seções para o tampão de ácido cítrico pré-cozido (1 L água deionizada com3g de Na 3 C6H5O7.2H 2O e 0,4 g C6H8O7, pH 6.0), micro-ondas por 10 minutos para mantê-los em ponto de ebulição subcrítica, e esfriar à temperatura ambiente por 30 minutos. Agitar as seções com água deionizada em um agitador por 5 minutos. Repita este passo três vezes.
  5. Agitar as seções com PBS de 10 mM em um shaker por 5 minutos, e repetir esta etapa três vezes. Inclua a área de tecido na caixa molhada com um marcador repelente de água, adicione uma gota de soro de cabra não imune pronto para uso para cobrir as amostras e coloque-as em temperatura ambiente por 1h.
  6. Retire o soro, adicione o anticorpo primário às amostras (veja a Tabela de Materiais) e incuba-os durante a noite a 4 °C. Remova o anticorpo primário, agitar as seções com PBS de 10 mM em um agitador por 5 minutos, e repita esta etapa de agitação com 10 mM PBS três vezes.
  7. Adicione anticorpos secundários (veja a Tabela de Materiais) para cobrir as amostras e incuba-las em uma caixa molhada por 30 minutos à temperatura ambiente. Agitar as seções com PBS de 10 mM em um shaker por 5 minutos, e repetir o passo de agitação três vezes.
  8. Adicione a solução recém-preparada 0,03-0,05% 3,3'-diaminobenzidina (DAB) para cobrir as amostras na caixa molhada e mancha para 30-90 s. Enxágüe as seções com água corrente por 10 minutos.
    NOTA: Controle o tempo de coloração observando sob um microscópio leve até que a cor amarela apareça.
  9. Adicione 4 mg/mL solução de hematoxilina para cobrir as amostras, manche por 5 minutos em uma caixa molhada e enxágue as seções com água corrente por 10 minutos.
  10. Agitar as seções em um agitador com 80% de etanol, 90% de etanol e etanol absoluto por 2 min cada, sucessivamente, e absorver as seções em 100% xileno por 30 min.
  11. Use uma pipeta ou caixa de vendatel para adicionar 3-4 gotas de bálsamo neutro ao slide e cubra-o lentamente com um slide de cobertura. Seque as lâminas à temperatura ambiente.

9. Coloração global de imunofluorescência de organoides/esferas

NOTA: Colete os organoides/esferas fixas com solução PFA de 4% em um tubo de microcentrifus de 1,5 mL (ver passos 5,1 a 5,4). Realize a rotulagem de fluorescência da seguinte forma.

  1. Desidrate os organoides/esferas adicionando 1 mL de solução de sacarose de 30% ao tubo e incuba-o durante a noite em uma geladeira a 4 °C.
  2. Adicione 100 μL de solução PBST (solução PBS de 10 mM com 0,1% Triton X-100) ao tubo para enxaguar os organoides/esferas por 5 min, centrifugar o tubo a 100 × g por 1 min, e coletar a pelota. Repita este passo três vezes.
  3. Adicione 0,5-1 mL de soro de cabra não imune pronto para uso ao tubo e sele-o à temperatura ambiente por 1h. Centrifugar o tubo a 100 × g por 1 min e recolher a pelota.
  4. Adicione várias gotas de anticorpo primário diluído para cobrir apenas a pelota e incubar em uma geladeira a 4 °C por 48 h. Centrifugar o tubo a 100 × g por 1 min e recolher a pelota.
  5. Repita o passo 9.2.
  6. Adicione várias gotas de um anticorpo secundário fluorescente e 4',6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI) solução ao tubo para apenas cobrir a pelota e incubar em uma geladeira a 4 °C por 24 horas, evitando a luz.
  7. Repita o passo 9.2, evitando a luz.
  8. Adicione 100 μL de solução PBST ao tubo e armazene-o temporariamente em uma geladeira de 4 °C, longe da luz. Observe e fotografe os organoides/esferas usando o microscópio de varredura de folhas de luz.

10. Transfecção LGSC pLX-mCherry

NOTA: A produção de partículas lentivirais deve ser realizada em um armário de biossegurança e em um banco limpo no nível de biossegurança BSL2.

  1. Cultura a célula de embalagem lentivírus 293T em uma placa de 6 poços com DMEM + 10% FBS a 37 °C, 5% CO2 por 3-5 dias para atingir 80% de confluência celular.
  2. Transfeito o vetor de lentivírus pLX-mCherry em LGSCs.
    NOTA: A preparação do reagente é indicada para um poço de uma placa de 6 poços.
    1. Prepare dois tubos de centrífugas estéreis de 1,5 mL e adicione 250 μL de DMEM/F12 a cada tubo.
    2. Adicione 7,5 μL de reagente de transfecção a um tubo e misture o reagente completamente por pipetação.
    3. Adicione 2 μg de plasmídeo pLX-mCherry sem endotoxina e plasmid de embalagem de lentivírus correspondente em outro tubo, e adicione o reagente de transfecção (2 μL/μg de plasmídeo).
    4. Misture o líquido em ambos os tubos de centrífuga e deixe as misturas ficarem por 5 minutos à temperatura ambiente.
    5. Remova o meio de cultura das células 293T e adicione a mistura da etapa 10.2.4 às células 293T. Mude o DMEM médio de cultura para DMEM fresco + 10% FBS após 8h.
    6. Após 48 h, colete o supernante do vírus pela primeira vez e filtre-o através de um filtro de 0,45 μm. Depois de 72 h, colete o vírus supernante pela segunda vez e filtre-o através de um filtro de 0,45 μm novamente.
      NOTA: Armazene ambos os supernacantes filtrados no gelo até a transdução do lentivírus.
  3. Obtenha os LGSCs de ratos DED (NOD/ShiLtJ) (ver passo 1).
  4. Adicione 1 mL do supernatante de lentivírus pLX-mCherry pré-coletado para resuspencar as células.
  5. Coloque o tubo de centrífuga em um agitador na incubadora de CO2 a 37 °C. Agite a 100 rpm para maximizar o contato entre o lentivírus e as células. Depois de 8h, centrifugar a mistura a 250 × g por 4 min e remover o sobrenante.
  6. Adicione 1 mL de DMEM/F12 para resuspensar a pelota da célula. Use um contador de células para determinar o número celular e a semente um total de 1 ×10 4 células em 100 μL de matriz gel-LGSCM (gel de matriz: LGSCM = 1:1) em cada poço de uma placa de 24 poços pré-requesada com 20 μL de matriz gel-LGSCM (ver passo 1.3.2).
  7. Após 7 dias de cultura (ver passo 1), selecione esferas que exibem fluorescência vermelha sob um microscópio de fluorescência para expandir a cultura.

11. Transplante ortotópico LGSC

NOTA: Todas as operações cirúrgicas são realizadas em sala de cirurgia da SPF, e todos os instrumentos cirúrgicos são esterilizados.

  1. Obtenha as esferas LGSC de camundongos ROSA26mT/mG com fluorescência vermelha (td-Tomate) ou transfecção mCherry cultivada por 7 dias (ver passo 1).
  2. Esfrie um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL contendo uma mistura de 1:1 de gel de matriz e DMEM/F12 no gelo antes de usar. Digerir as esferas LGSC em células únicas e resuspensar as células a uma densidade de 2 × 106 células/mL no tubo.
  3. Anestesiar os camundongos NOD/ShiLtJ por injeção intraperitoneal de sódio pentobarbital (50 mg/kg).
    NOTA: O rato NOD/ShiLtJ é um modelo ideal com sintomas adicionais idiopáticos, incluindo secreção lacrimal reduzida, infiltração inflamatória e ulceração orbital.
  4. Após a anestesia, use soro fisiológico ou pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento e, em seguida, use uma tesoura oftálmica para fazer um corte de 5-8 mm na pele atrás da orelha (perto do olho) dos ratos anestésicos para expor os LGs.
    NOTA: O Iodophor deve ser estritamente utilizado para desinfecção em torno da incisão.
  5. Injete 2 × 104 células no lado esquerdo lg e injete a mistura sem células (ver passo 11.2) no lado direito LG como o controle.
  6. Após a injeção, restaure os LGs em suas posições originais com fórceps oftálmicos e sutura a ferida. Alimente os camundongos por 2 meses e observe o efeito do tratamento.
    NOTA: O material da almofada da gaiola também deve ser estritamente esterilizado após o funcionamento, e o material da almofada deve ser substituído uma vez por dia. Após a sutura da ferida, tramadol pode ser seletivamente injetado na veia traseira de camundongos na dose padrão de 2,5 mg/kg para alcançar analgesia.
  7. Anestesiar esses camundongos 2 meses após o experimento (ver passo 11.3). Filme os sintomas da região ocular.
    1. Durante a anestesia, procure os seguintes sintomas: relaxamento muscular do pescoço e dos membros; respiração profunda, lenta e constante; estreitamento pupilar; desaparecimento reflexo corneal.
    2. Durante a anestesia e operação, mantenha a temperatura corporal dos ratos a 37 °C. Após a cirurgia, adicione antibióticos apropriados à água potável para camundongos para reduzir o risco de infecção por feridas. Não deixe os camundongos sozinhos até que tenham recuperado a consciência suficiente para manter a recumbência severa. Não devolva os camundongos que passaram por cirurgia para a companhia de outros camundongos até que esteja totalmente recuperado.
    3. Depois de filmar os sintomas da região ocular, abra o software ImageJ, clique em Arquivo | | Seleções à mão livre, segure o botão esquerdo do mouse e selecione a área de ulceração orbital na imagem. Clique em Analisar | Medida para obter a área relativa de ulceração.
  8. Coloque o fio de algodão vermelho fenol no canthus lateral de ratos anestésicos por 10 s; medir e registrar o comprimento da parte descolorida do fio de algodão. Eutanize os camundongos por luxação de vértebra cervical após a medição da lágrima.
  9. Disseque os camundongos e obtenha os LGs para análise de IHC.

12. Isolamento do RNA

NOTA: Antes do experimento, pré-cure a centrífuga até 4 °C e garanta que todos os reagentes e consumíveis estejam livres da contaminação rnase.

  1. Colete fragmentos LGSCs ou LG em um tubo de microcentrifuuge. Adicione 1 mL de tampão de lise celular elise totalmente as células ou tecidos por oscilação de vórtice.
  2. Adicione 0,2 mL de clorofórmio, e deixe-o em temperatura ambiente por 10 minutos após a oscilação do vórtice por 1 min. Centrifugar por 15 min a 4 °C, 12.000 × g.
    NOTA: Após a centrifugação, o líquido é dividido em três camadas, e o RNA está na fase aquosa mais transparente.
  3. Pipete cuidadosamente a fase aquosa mais transparente e transfira-a para um novo tubo de centrífuga sem RNAse de 1,5 mL.
  4. Adicione um volume igual de álcool isopropílico e misture delicadamente. Deixe a mistura ficar em temperatura ambiente por 10 minutos e depois centrífuga por 15 min a 4 °C, 12.000 × g.
  5. Retire o supernascente e adicione 1 mL de 75% de etanol. Inverta o tubo para lavar a pelota e centrífuga por 5 min a 4 °C, 7.500 × g. Repita este passo.
  6. Retire o supernatante cuidadosamente e coloque o tubo de centrífuga na bancada ultracleana para secá-lo por cerca de 20 minutos.
    NOTA: Prossiga para o próximo passo quando a pelota branca se tornar translúcida. Realizar todas as operações no gelo.
  7. Adicione 20 μL de água livre de RNAse para dissolver completamente a pelota. Meça a concentração de RNA usando um espectrofotômetro (veja a Tabela de Materiais) e armazene a solução RNA a -80 °C.

13. PCR

  1. Reação de transcrição reversa
    1. Adicione 1 μg de RNA total (calcule o volume da solução RNA adicionada de acordo com a concentração da solução RNA) no tubo de reação PCR e incubar a 65 °C por 5 min para desnaturação.
    2. Coloque-o no gelo por 1 min e, em seguida, adicione água sem enzimas até que o volume total atinja 12 μL. Adicione 4 μL de 4x DNA Master Mix e incuba-o a 37 °C por 5 min.
    3. Coloque o tubo no gelo, adicione 4 μL de 5x RT Master Mix e misture-o suavemente. Defina as seguintes configurações de PCR: 37 °C para 15 min, 50 °C para 5 min, 98 °C para 5 min, 4 °C para 1 min.
    4. Armazene-o a -20 °C ou prossiga para a próxima etapa após a conclusão da reação de transcrição reversa.
  2. Reação do PCR
    1. Prepare a reação do PCR no tubo PCR da seguinte forma: 14,1 μL de água sem enzimas, 2 μL de dNTP, 2 μL de Buffer 10x, 0,8 μL de Primer (10 μM, 0,4 μL de Primer Dianteiro e 0,4 μL de Primer Reverso, consulte a Tabela de Materiais), 1 μL de transcrição reversa cDNA (consulte a etapa 13.1) e 0,1 μL de enzima Taq.
    2. Coloque a reação PCR preparada no aparelho PCR para PCR. Consulte as instruções do kit de enzimas Taq para o procedimento PCR (consulte a Tabela de Materiais).
  3. Eletroforese de gel agarose
    1. Use um equilíbrio analítico para pesar 242 g de Tris e 37,2 g de Na2EDTA·2H 2O e adicione-os a um béquer de 1 L. Adicione ~800 mL de água deionizada e 57,1 mL de ácido acético glacial ao béquer, misture bem, adicione água deionizada a 1 L para obter 50x de tampão TAE e armazene-o à temperatura ambiente.
      NOTA: Diluir 50x tampão TAE com água desionizada antes de usar.
    2. Use um equilíbrio analítico para pesar 1,2 g de agarose e adicione-o a um frasco cônico contendo 80 mL de tampão TAE 1x. Aqueça-o repetidamente no forno de micro-ondas até dissolver completamente.
    3. Esfrie o frasco em água da torneira corrente até que a temperatura da solução caia para 60 °C. Adicione 8 μL de mancha de ácido nucleico, despeje a solução no tanque de gelatinização depois de misturar bem, coloque o pente e deixe-o em temperatura ambiente por 30 minutos.
    4. Retire o pente e carregue os produtos PCR no gel de agarose preparado. Realize eletroforese a 120 V por 30 min.
    5. Coloque o gel no sistema de imagem ECL Gel e fotografe.

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Representative Results

Estabelecer sistema de cultura 3D e sem soro
Neste estudo, lgscm contendo EGF, Wnt3A, FGF10 e Y-27632 para LGSCs de mouse foi desenvolvido, e LGSCs foram isolados com sucesso e cultivados por um método de cultura 3D (Figura 1A). Um sistema de cultura 3D e sem soro de LGSCs de camundongos C57BL/6, ratos NOD/ShiLtJ, ratos BALB/c e camundongos ROSA26mT/mG foi estabelecido usando este método16. Para um rato macho, 1,5-2 × 106 células foram obtidas de dois LGs por dissociação. Após uma semana de cultura, 30-60 esferas foram formadas ao semear 1 × 104 células LG no início da cultura. Além disso, as células cultivadas por este método expressaram Epcam, Krt5, Krt14, P63, nestin, e outros marcadores de células-tronco16, indicando que as células obtidas tinham as propriedades dos LGSCs. Krt14 e Ki67 foram expressas em todas as esferas formadas por LGSCs cultivadas por 7 dias (Figura 1B), indicando que os LGSCs tiveram auto-renovação.

Durante uma cultura de 7 dias, as esferas lgscs atingiram um diâmetro de 100 μm. A coloração de hematoxilina e eosina (H&E) mostrou celularidade no dia 7 (Figura 1C e Figura 1F). Os fatores de enriquecimento das LGSCs obtidos após 7 dias de cultura primária e subcultura indicaram que os LGSCs enriquecidos por este método tinham forte capacidade de proliferação (Figura 1D). Neste sistema, os LGSCs poderiam ser ultrapassados mais de 40 vezes, e ainda mantinham características de células-tronco (Figura 1E e Figura 1G). Em conclusão, este artigo descreve um protocolo para estabelecer um sistema de cultura 3D e sem soro para LGSCs in vitro. As células cultivadas por este protocolo têm capacidade proliferativa contínua e estável.

Induzir diferenciação in vitro
Analisou-se a capacidade de diferenciação dos LGSCs in vitro. Quando cultivados por mais de 7 dias, os LGSCs gradualmente perderam a capacidade de crescimento, e a expressão de AQP5, Ltf, Krt19 e outros marcadores associados à diferenciação aumentou, enquanto a expressão de Krt14 gradualmente diminuiu16. Os LGSCs foram induzidos a formar mais botões pela FBS e uma baixa proporção de gel matricial (Figura 2A,B). Além disso, a coloração da H&E indicou que a FBS poderia induzir as esferas a produzir mais estruturas cavitadoras (Figura 2C).

O trabalho anterior sugeriu que a diminuição da dureza matricial promoveu a diferenciação dos LGSCs em organoides ductais. As células de camada basal mantiveram as características das células-tronco expressando Krt14, enquanto as células da camada superior basal se diferenciaram em estruturas semelhantes a dutos com cavidades e expressaram Krt19. Além disso, a adição de FBS poderia induzir a diferenciação de LGSCs em organoides semelhantes a acinar, que mantiveram as características das células-tronco com alta relação nuclear/citoplasmica. Algumas células diferenciadas semelhantes a acinar expressaram altos níveis de AQP5 com baixa relação nuclear/citoplasmica16.

 Reparar LGSCs  in vivo
Com base nos experimentos acima, a capacidade dos LGSCs de reparar LGs danificados foi explorada por injeção ortotópica. Após a injeção ortotópica de ROSA-LGSCs em camundongos NOD/ShiLtJ, novos lobules lacrimais foram formados adjacentes aos LGs (Figura 3A-C). A maioria dos lobules eram compostos de células acinar maduras com alta expressão de AQP5, e havia formação de duto intralobular com baixa expressão AQP5 (Figura 3D-F). Após a injeção de ROSA-LGSCs por 8 semanas, a decadência em torno da órbita dos receptores foi medida. As medidas indicaram que a injeção de LGSCs reduziu a área de decomposição em ~60% (Figura 3G, H). A dissecção mostrou que o volume lg aumentou após a injeção por 10 semanas (Figura 3I). A quantidade de secreção lacrimal no lado de injeção ROSA-LGSCs foi maior do que no lado de controle, mas menor do que em ratos do tipo selvagem (Figura 3J). Esses resultados indicam que as células colhidas por este sistema de cultura têm as características dos LGSCs e podem ser usadas para terapia com células-tronco em camundongos com ADICION e xerophthalmia.

Figure 1
Figura 1: Isolamento e caracterização dos LGSCs. (A) A estratégia da cultura de passagem primária e contínua lgsc. (B) Coloração de imunofluorescência de LGSCs no dia 7. Os LGSCs expressam marcador epitelial celular E-cadherin (vermelho), marcador de células-tronco Krt14 (vermelho), marcador de células proliferativas Ki67 (vermelho). Contra-mancha, DAPI (azul). (C) A morfologia dos LGSCs na cultura por 1, 3, 5 e 7 dias. (D) Fator de enriquecimento relativo da cultura LGSC na cultura primária e subcultura. Fator de enriquecimento relativo é a razão do número total de células obtidas após 7 dias de cultura para o número de células semeadas na cultura. P < 0,01. (E) Transcrição de marcadores celulares adultos/progenitores do mouse LG e LGSCs de passagem diferentes (P1, P10, P20 e P40). (F) A morfologia (esquerda) e a coloração de H&E (direita) dos LGSCs na cultura primária no dia 7. (G) LGSCs cultivados em diferentes passagens (P1, P10, P20 e P40). Barras de escala = 50 μm (B, F, G), 100 μm (C). Abreviaturas: LG = glândula lacrimal; LGSCs = Células-tronco LG; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenildole;; NC = controle negativo; TE = trypsin-EDTA; H&E = hematoxilina e eosina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Diferenciação de LGSCs in vitro. (A,B) Morfologia de LGSCs cultivadas em meio normal ou meio de diferenciação. (A) LGSCs cultivados por 10 dias em P10 (esquerda: médio normal, direita: meio contendo FBS). (B) LGSCs cultivados por 14 dias em P31 (esquerda: médio normal, direita: médio com 1/3rd gel de matriz). (C) Mancha H&E dos LGSCs cultivados por 14 dias (superior: médio normal, inferior: meio contendo FBS). Barras de escala = 100 μm (A), 200 μm (B), 50 μm (C). Abreviaturas: LG = glândula lacrimal; LGSCs = Células-tronco LG; H&E = hematoxilina e eosina; FBS = soro bovino fetal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Engraftment of LGSCs allotransplantation and relief of ADDED symptoms. (A-F) IHC staining of NOD/ShiLtJ LG transplantado com culturas de 7 dias de ROSA-LGSCs após 8 semanas. Use os lados esquerdo e direito do mesmo mouse que o grupo experimental e o grupo controle. (A-C) Coloração do IHC com anticorpo anti-td-tomate; (D-F) Coloração do IHC com anticorpo anti-AQP5; (A, D) LG injetou com veículo (mistura 1:1 de gel de matriz e DMEM/F12), (B, E) LG injetado com ROSA-LGSCs, (C, F) as imagens ampliadas dos quadrados pretos em B, E (seta vermelha, ducto intralobular). (G, H) A condição da órbita do olho do mouse NOD/ShiLtJ após a injeção de ROSA-LGSCs em 8 semanas. A injeção de LGSCs alivia significativamente a decadência ao redor da órbita dos olhos. (I) LGs do mouse NOD/ShiLtJ em 10 semanas (esquerda: LG do lado injetado por célula, direita: LG do lado de controle). (J) Volume de lágrimas de camundongos do tipo selvagem e NOD/ShiLtJ transplantados com culturas de 7 dias de ROSA-LGSCs após 8 semanas. O volume de rasgos de LGs injetados em ROSA-LGSC é maior do que o dos LGs de controle, mas significativamente menor que o dos LGs WT. n = 3; Ratos NOD/ShiLtJ, n = 4; P < 0,01; *P < 0,05. Barras de escala = 50 μm (A-F). Abreviaturas: LG = glândula lacrimal; LGSCs = Células-tronco LG; IHC = imunohistoquímico; WT = tipo selvagem; ADICIONADO = doença ocular seca aquosa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Existem métodos bem estabelecidos para o isolamento e cultura in vitro de células-tronco lacrimais para a cultura de células-tronco lacrimais e reparação de lesões LG. Shatos et al.17 e Ackermannet al. 6 células-tronco lacrimal cultivadas e subculturadas com sucesso de ratos e camundongos por métodos de cultura 2D, respectivamente, possibilitando o transplante de células-tronco lacrimais para o tratamento de ADDED. Estudos sobre células-tronco18 e células-tronco mesenquimais 19,20 de LGs cultivados em 2D mostraram que o transplante dessas células poderia aliviar os sintomas de ADICIONADO até certo ponto. Por fluorescência ativada classificação celular, Gromovaet al. 2 células-tronco selecionadas expressando marcadores celulares progenitores LG dos LGs do mouse e as diferenciaram em dutos e acini in vitro, percebendo com sucesso a diferenciação de células-tronco adultas em células funcionais de LGs. Também foi demonstrado que o transplante de um número suficiente de células-tronco poderia aliviar os sintomas adicionais em camundongos.

Para atender às necessidades de enriquecimento de células-tronco e eliminar a dependência de soro nos métodos de cultura de células-tronco lacrimais existentes, o sistema de cultura livre de soro de células-tronco lacrimais neste protocolo foi estabelecido com base em pesquisas publicadas anteriormente e tecnologia de cultura 3D organoide21. Assim, espera-se que este sistema promova pesquisas clínicas sobre células-tronco lacrimais. Neste protocolo, as etapas críticas incluem cultura primária, subcultura e expansão de LGSCs, e transplante in situ de LGSCs em LGs feridos em camundongos.

A cultura primária é a base para a obtenção de LGSCs. É necessário manter condições estéreis durante a cultura primária. O poço é pré-revestido com matriz-gel para evitar o crescimento aderente de células na parte inferior da cultura celular bem. Ao usar matrix-gel, é necessário seguir as instruções do fabricante, e mantê-lo sempre no estado líquido antes da adição ao poço para evitar a perda de matriz-gel durante o experimento e o desigual matricial-gel na cultura.

O número de células semeadas na cultura primária é de 10.000 células/bem. Na prática, o número de células semeadas pode ser aumentado se o espaço de crescimento adequado e o fornecimento de nutrientes das células forem assegurados. A subcultura é um passo importante para purificar e enriquecer as células-tronco. Após a passagem, os LGSCs na geração P1 formaram mais esferas, e havia mais células de geração P1 do que a geração P0. Isso indica que os LGSCs com capacidade proliferativa foram enriquecidos neste sistema.

Quando os LGSCs foram cultivados neste sistema 3D ao longo de 10 dias, 0,05% de trippsina-EDTA às vezes não era suficiente para digerir totalmente os organoides em células únicas durante a passagem. Este problema foi resolvido estendendo o tempo de digestão adequadamente. A terapia de injeção in situ é um procedimento necessário para verificar o valor clínico dos LGSCs. Devido ao pequeno tamanho e aos tecidos finos e soltos dos LGs em camundongos, as células são sempre perdidas do local da injeção se a suspensão celular for preparada em soro fisiológico normal ou 10 mM PBS para injeção. Portanto, recomenda-se misturar a suspensão celular com o gel matricial para injeção. Como o gel de matriz usado neste sistema se solidifica a temperaturas acima de 10 °C, as células podem colonizar prontamente quando injetadas nos LGs. A mistura de células e matricial-gel deve ser sempre mantida no gelo antes da injeção, e a injeção realizada rapidamente.

Além de isolar LGSCs de ratos normais, os LGSCs adultos de ratos adicionados foram isolados com sucesso e cultivados pela primeira vez usando este protocolo16. No entanto, esse sistema ainda tem deficiências e problemas não resolvidos. Primeiro, o gel matricial utilizado é derivado de camundongos22,23, o que pode causar reações de rejeição no corpo humano e, portanto, tem aplicabilidade clínica limitada. É necessário melhorar o sistema de cultura encontrando géis sintéticos apropriados para substituir o gel de matriz.

Em segundo lugar, a estratégia de diferenciação neste protocolo precisa ser melhorada. Em vez de estender o tempo de cultura para diferenciação21 ou adicionar soro no meio da cultura, a adição de fatores específicos de crescimento e mudanças nas condições ambientais específicas para indução direcional devem dar os resultados desejados. É necessário explorar ainda mais o mecanismo de manutenção e diferenciação dos LGSCs, elucidando as vias de sinalização causando diferenciação. Além disso, estudos anteriores descobriram que células mioepitheliais cultivadas in vitro também expressam genes de células-tronco, como Nestin, Musashi e Pax6, indicando que as células mioepitheliais também têm características de células-tronco17.

Este estudo não deu atenção às células mioepitheliais e, portanto, não verificou se as células mioepitheliais existem nos organoides LG, identificando marcadores de expressão específicos das células mioepitheliais. Devido à limitação das condições culturais, as células mioepiteliais não podiam ser induzidas ou que seu número era muito pequeno para ser observado. O tempo de cultura pode ser estendido para observar se os organoides se diferenciam ainda mais nas células mioepitheliais, ou se concentram nas células mioepitheliais em estudos futuros de diferenciação de indução e melhoria do sistema.

Em conclusão, este protocolo fornece um método para estudar LGSCs para o desenvolvimento, reparo e regeneração de LGs. A diferenciação dos LGSCs in vitro pode ser a base da futura regeneração in vitro dos LGs, enquanto o isolamento e a cultura dos LGSCs podem resolver o problema da rejeição na aotransplantação de células-tronco. Este método fornece uma base importante para o tratamento individualizado clínico da xerophthalmia com LGSCs.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (nº 31871413) e dois Programas de Ciência e Tecnologia de Guangdong (2017B020230002 e 2016B030231001). Somos verdadeiramente gratos aos pesquisadores que nos ajudaram durante o estudo e aos funcionários que trabalham no centro animal por seu apoio no cuidado com os animais.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal(Mouse)
Bal B/C Model Animal Research Center of Nanjing University
C57 BL/6J Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University
NOD/ShiLtJ Model Animal Research Center of Nanjing University
ROSA26mT/mG Model Animal Research Center of Nanjing University
Equipment
Analytical balance Sartorius
Automatic dehydrator Thermo
Blood counting chamber BLAU
Cell Counter CountStar
CO2 constant temperature incubator Thermo
ECL Gel imaging system GE healthcare
Electric bath for water bath Yiheng Technology
Electrophoresis apparatus BioRad
Fluorescence quantitative PCR instrument Roche
Frozen tissue slicer Lecia
Horizontal centrifuge CENCE
Inverted fluorescence microscope Nikon
Inverted microscope Olympus
Laser lamellar scanning micrograph Carl Zeiss
Liquid nitrogen container Thermo
Low temperature high speed centrifuge Eppendorf
Micropipettor Gilson
Microwave oven Panasonic
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer Thermo measure RNA concentration
Paraffin slicing machine Thermo
PCR Amplifier Eppendorf
pH value tester Sartorius
4 °C Refrigerator Haier
Thermostatic culture oscillator ZHICHENG
Tissue paraffin embedding instrument Thermo
 -80°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
 -20°C Ultra-low temperature refrigerator Thermo
Ultra pure water purification system ELGA
Reagent
Animal Experiment
HCG Sigma 9002-61-3
PMSG Sigma 14158-65-7
Pentobarbital Sodium Sigma 57-33-0
Cell Culture
B27 Gibco 17504044
Collagenase I Gibco 17018029
Dispase BD 354235
DMEM Sigma D6429
DMEM/F12 Sigma D0697
DMSO Sigma 67-68-5
EDTA Sangon Biotech A500895
Foetal Bovine Serum Gibco 04-001-1ACS
GlutaMax Gibco 35050087
Human FGF10 PeproTech 100-26
Matrigel (Matrix gel) BD 356231
Murine Noggin PeproTech 250-38
Murine Wnt3A PeproTech 315-20
Murine EGF PeproTech 315-09
NEAA Gibco 11140050
N2 Gibco 17502048
R-spondin 1 PeproTech 120-38
Trypsin Inhibitor (TI) Sigma T6522 Derived from Glycine max; can inhibit trypsin, chymotrypsin, and plasminase to a lesser extent. One mg will inhibit 1.0-3.0 mg of trypsin.
Trypsin Sigma  T4799
Y-27632 Selleck S1049
HE staining & Immunostaining
Alexa Fluor 488 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-21202 Used dilution: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0.2 μg/mL
Alexa Fluor 488 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-21206 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Mouse IgG Thermo A-10037 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Rabbit IgG Thermo A-10042 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL
Anti-AQP5 rabbit antibody Abcam ab104751 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0.1 μg/mL
Anti-E-cadherin Rat antibody Abcam ab11512 Used dilution: (IF)  5 μg/mL
Anti-Keratin14 rabbit antibody Abcam ab181595 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-Ki67 rabbit antibody Abcam ab15580 Used dilution: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL
Anti-mCherry mouse antibody Abcam ab125096 Used dilution: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-mCherry rabbit antibody Abcam ab167453 Used dilution: (IF)  2 μg/mL
C6H8O7 Sangon Biotech A501702-0500
Citric Acid Sangon Biotech 201-069-1
DAB Kit (20x) CWBIO CW0125
DAPI Thermo 62248
Eosin BASO 68115
Fluorescent Mounting Medium Dako S3023
Formalin Sangon Biotech A501912-0500
Goat anti-Mouse IgG antibody (HRP) Abcam ab6789 Used dilution: 2 μg/mL
Goat anti-Rabbit IgG antibody(HRP) Abcam ab6721 Used dilution: 2 μg/mL
Hematoxylin BASO 517-28-2
Histogel (Embedding hydrogel) Thermo HG-400-012
30% H2O2 Guangzhou Chemistry KD10
30% Hydrogen Peroxide Solution Guangzhou Chemistry 7722-84-1
Methanol Guangzhou Chemistry 67-56-1
Na3C6H5O7.2H2O Sangon Biotech A501293-0500
Neutral balsam SHANGHAI YIYANG YY-Neutral balsam
Non-immunized Goat Serum BOSTER AR0009
Paraffin Sangon Biotech A601891-0500
Paraformaldehyde DAMAO 200-001-8
Saccharose Guangzhou Chemistry 57-50-1
Sodium citrate tribasic dihydrate Sangon Biotech 200-675-3
Sucrose Guangzhou Chemistry IB11-AR-500G
Tissue-Tek O.T.C. Compound SAKURA SAKURA.4583
Triton X-100 DINGGUO 9002-93-1
Xylene Guangzhou Chemistry 128686-03-3
RT-PCR & qRT-PCR
Agarose Sigma 9012-36-6
Alcohol Guangzhou Chemistry 64-17-5
Chloroform Guangzhou Chemistry 865-49-6
Ethidium Bromide Sangon Biotech 214-984-6
Isopropyl Alcohol Guangzhou Chemistry 67-63-0
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix Roche 488735200H
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix TOYOBO -
Taq DNA Polymerase TAKARA R10T1
Goldview (nucleic acid stain) BioSharp BS357A
TRIzol Magen R4801-02
Vector Construction & Cell Transfection
Agar OXID -
Ampicillin Sigma 69-52-3
Chloramphenicol Sigma 56-75-7
Endotoxin-free Plasmid Extraction Kit Thermo A36227
Kanamycin Sigma 25389-94-0
Lipo3000 Plasmid Transfection Kit Thermo L3000015
LR Reaction Kit Thermo 11791019
Plasmid Extraction Kit TIANGEN DP103
Trans5α Chemically Competent Cell TRANSGEN CD201-01
Trytone OXID -
Yeast Extract OXID -
Primers and Sequence Company
Primer: AQP5
Sequence:
F: CATGAACCCAGCCCGATCTT
R: CTTCTGCTCCCATCCCATCC		 Synbio Tech
Primer: β-actin
Sequence:
F: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT
R: AGATCAAGATCATTGCTCCTCCT		 Synbio Tech
Primer: Epcam
Sequence:
F: CATTTGCTCCAAACTGGCGT
R: TGTCCTTGTCGGTTCTTCGG		 Synbio Tech
Primer: Krt5
Sequence:
F: AGCAATGGCGTTCTGGAGG
R: GCTGAAGGTCAGGTAGAGCC		 Synbio Tech
Primer: Krt14
Sequence:
F: CGGACCAAGTTTGAGACGGA
R: GCCACCTCCTCGTGGTTC		 Synbio Tech
Primer: Krt19
Sequence:
F: TCTTTGAAAAACACTGAACCCTG
R: TGGCTCCTCAGGGCAGTAAT		 Synbio Tech
Primer: Ltf
Sequence:
F: CACATGCTGTCGTATCCCGA
R: CGATGCCCTGATGGACGA		 Synbio Tech
Primer: Nestin
Sequence:
F: GGGGCTACAGGAGTGGAAAC
R: GACCTCTAGGGTTCCCGTCT		 Synbio Tech
Primer: P63
Sequence:
F: TCCTATCACGGGAAGGCAGA
R: GTACCATCGCCGTTCTTTGC		 Synbio Tech
Vector
pLX302 lentivirus no-load vector Addgene
pENRTY-mCherry Xiaofeng Qin laboratory, Sun Yat-sen University

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologia Edição 184
Sistema de cultura tridimensional e livre de soro para células-tronco da glândula lacrimal
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Chen, H., Huang, P., Zhang, Y.… More

Chen, H., Huang, P., Zhang, Y. Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (184), e63585, doi:10.3791/63585 (2022).

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