Summary

Un enfoque no secuenciador para la detección rápida de la edición de ARN

Published: April 21, 2022
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Summary

La detección rápida y la cuantificación confiable de los eventos de edición de ARN a escala genómica siguen siendo un desafío y actualmente dependen de métodos de secuenciación directa de ARN. El protocolo descrito aquí utiliza la electroforesis en gel de gradiente de microtemperatura (μTGGE) como un método simple, rápido y portátil para detectar la edición de ARN.

Abstract

La edición de ARN es un proceso que conduce a alteraciones de la secuencia posttranscripcional en los ARN. La detección y cuantificación de la edición de ARN se basa principalmente en la secuenciación de Sanger y las técnicas de secuenciación de ARN. Sin embargo, estos métodos pueden ser costosos y llevar mucho tiempo. En este protocolo, se utiliza un sistema portátil de electroforesis en gel de gradiente de microtemperatura (μTGGE) como un enfoque no secuenciador para la detección rápida de la edición de ARN. El proceso se basa en el principio de electroforesis, que utiliza altas temperaturas para desnaturalizar muestras de ácido nucleico a medida que se mueven a través de un gel de poliacrilamida. A través de un rango de temperaturas, un fragmento de ADN forma un gradiente de ADN de doble cadena a hebras parcialmente separadas y luego a ADN de cadena simple completamente separado. Los sitios editados por ARN con distintas bases de nucleótidos producen diferentes perfiles de fusión en los análisis de μTGGE. Utilizamos el enfoque basado en μTGGE para caracterizar las diferencias entre los perfiles de fusión de cuatro fragmentos de ARN editados y sus correspondientes fragmentos no editados (tipo salvaje). Las puntuaciones de similitud de patrones (PaSS) se calcularon comparando los patrones de banda producidos por los ARN editados y no editados y se utilizaron para evaluar la reproducibilidad del método. En general, la plataforma descrita aquí permite la detección de mutaciones incluso de base única en ARN de una manera directa, simple y rentable. Se prevé que esta herramienta de análisis ayudará a nuevos hallazgos de biología molecular.

Introduction

Las variantes de nucleótido único (SNV) en el ARN genómico, incluidas las variantes de A a I, C a U y U a C, pueden indicar eventos de edición de ARN. Sin embargo, la detección de SNVs en el ARN sigue siendo una tarea técnicamente desafiante. Convencionalmente, la proporción de ARN editado a no editado se determina mediante secuenciación directa, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real específica del alelo o cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) de desnaturalización 1,2,3,4,5,6. Sin embargo, estos enfoques no son particularmente efectivos en tiempo o costo, y sus bajas precisiones, causadas por altos niveles de ruido, plantean cuellos de botella tecnológicos para la detección de SNV basada en ARN 7,8. Aquí, describimos un protocolo basado en la electroforesis en gel de gradiente de temperatura (TGGE) para identificar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) como un método alternativo que elimina la necesidad de enfoques de secuenciación directa de ARN para los análisis de edición de ARN.

La electroforesis es un método preferido para la separación y el análisis de biomoléculas en laboratorios de ciencias de la vida. TGGE permite la separación de fragmentos de ADN de doble cadena que son del mismo tamaño pero tienen diferentes secuencias. La técnica se basa en las diferencias relacionadas con la secuencia en las temperaturas de fusión de los fragmentos de ADN y los cambios posteriores en sus movilidades en geles porosos con un gradiente de temperatura lineal 9,10. La fusión de fragmentos de ADN genera perfiles de fusión específicos. Una vez que el dominio con la temperatura de fusión más baja alcanza la temperatura correspondiente en una posición particular en el gel, se produce la transición de una estructura helicoidal a una estructura parcialmente fundida, y la migración de la molécula prácticamente se detendrá. Por lo tanto, TGGE utiliza tanto la movilidad (información de tamaño) como las transiciones estructurales inducidas por la temperatura de los fragmentos de ADN (información dependiente de la secuencia), lo que lo convierte en un enfoque poderoso para la caracterización de fragmentos de ADN. Los puntos característicos en un patrón de fusión TGGE, que corresponden a tres transiciones estructurales de la molécula de ADN, son el punto de disociación inicial de la hebra, el punto de disociación media de la hebra y el punto de disociación final de la hebra (Figura 1). Las variaciones de secuencia dentro de los dominios, incluso las diferencias de una sola base, afectan la temperatura de fusión, por lo tanto, las moléculas con diferentes secuencias mostrarán patrones discretos de fusión (desnaturalización) en los análisis TGGE. Por lo tanto, TGGE se puede utilizar para analizar SNV en ARN genómico y puede ser un método invaluable de alto rendimiento para detectar la edición de ARN. Esta ganancia de alto rendimiento se pierde cuando se utiliza TGGE tradicional basado en electroforesis en gel. Sin embargo, una versión miniaturizada de TGGE, llamada microTGGE (μTGGE), se puede utilizar para acortar el tiempo electroforético del gel y acelerar el análisis con un aumento de 100 veces en la productividad11. La simplicidad y la compacidad del método μTGGE se han mejorado con la introducción de PalmPAGE12, un sistema de electroforesis en gel aplicable en el campo, portátil y asequible.

Aquí, se utiliza un nuevo protocolo basado en TGGE para examinar tres tipos de sitios de edición de ARN (A-to-I, C-to-U y U-to-C) en cuatro genes, incluidos dos de tejidos de Arabidopsis thaliana y dos expresados en células HEK293 de mamíferos (Figura 1A). El protocolo integra el uso de PalmPAGE (hardware), un sistema portátil para la detección rápida de la edición de ARN, y uMelt (software)13. Con un tiempo de ejecución promedio de 15-30 min, este protocolo permite una identificación rápida, confiable y fácil de la edición de ARN sin la necesidad de enfoques de secuenciación directa de ARN.

Protocol

1. Optimización del fragmento objetivo NOTA: Se utilizaron cuatro genes editados en el desarrollo de este protocolo, incluidos dos genes nucleares (AT2G16586 y AT5G02670) de A. thaliana, y los genes que codifican la proteína fluorescente azul (BFP) y la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) expresadas en células HEK293. Para identificar fragmentos de genes con diferentes perfiles de fusión, que representan regiones editadas versus no editadas, gen…

Representative Results

Uso de μTGGE para identificar cambios en la base de un solo nucleótido en eventos de edición de ARNPara este protocolo se utilizaron cuatro genes editados (Tabla 1), incluyendo el gen BFP producido en células HEK293 (con edición de ARN C-to-U por las enzimas desaminasas del complejo enzimático de edición de ARNm de apolipoproteína B; APOBEC115), el gen EGFP que contiene el codón de parada ocre (TAA) producido en células HEK293 (con edición de ARN A-…

Discussion

La edición de ARN juega un papel importante en la biología; sin embargo, los métodos actuales de detección de edición de ARN, como la cromatografía y la secuenciación, presentan varios desafíos debido a su alto costo, requisitos de tiempo excesivos y complejidad. El protocolo descrito aquí es un método simple, rápido y rentable para detectar la edición de ARN que utiliza un sistema portátil, de tamaño micrométrico y basado en TGGE. Este sistema se puede utilizar para diferenciar entre genes editados y no e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por una subvención para la investigación científica de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (17H02204 y 18K19288). Ruchika fue apoyada financieramente por el gobierno japonés (beca MEXT). Agradecemos a la Sra. Radhika Biyani (Laboratorio Takagi, JAIST) y al Dr. Kirti Sharma (BioSeeds Corporation) por su ayuda con los experimentos relacionados con la electroforesis.

Materials

2U ExoI Takara 2650A Exonuclease I
40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) Thermo fisher AM9022
Ammonium persulfate (APS) Thermo Fisher 17874
Centrifuge Mini spin eppendorf 5452000034
Digital dry bath/ block heater Thermo fisher NA
Gold Taq Polymerase Master mixture Promega M7122
LATaq DNA polymerase TAKARA RR002A Taq Polymerase
micro-TGGE  cassette holder BioSeeds Corp. BS-GE-CH
micro-TGGE apparatus Lifetech Corp. TG
micro-TGGE gel cassette BioSeeds Corp. BS-TGGE-C
NanoDrop 1000 Thermo fisher ND-1000 Spectrophotometer
Plant Rneasy Mini kit Qiagen 74904
ReverTra Ace Master Mix TOYOBO TRT101 M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase
Rneasy Mini kit Qiagen 74104
Shrimp Alkaline Phosphatase Takara 2660B
SYBR Gold nucleic acid gel stain Thermo fisher S11494
TBE buffer Thermo fisher B52
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Nacalai tesque 33401-72
Urea, Nuclease and protease tested Nacalai tesque 35940-65

References

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Cite This Article
, R., Tshukahara, T., Biyani, M. A Nonsequencing Approach for the Rapid Detection of RNA Editing. J. Vis. Exp. (182), e63591, doi:10.3791/63591 (2022).

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