Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Заживление ран роговицы рыбок данио: от истирания до анализа закрытия раны

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63605
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Institute of Biotechnology, HiLIFE, University of Helsinki, 2Institute for Neurosciences of Montpellier, Univ Montpellier

Summary

Этот протокол фокусируется на повреждении глазной поверхности рыбок данио путем истирания для оценки последующего закрытия раны на клеточном уровне. Этот подход использует глазной заусенец для частичного удаления эпителия роговицы и использует сканирующую электронную микроскопию для отслеживания изменений в морфологии клеток во время закрытия раны.

Abstract

Как прозрачная поверхность глаза, роговица играет важную роль в ясном зрении. Благодаря своему расположению эта ткань склонна к экологическим нарушениям. Действительно, травмы глаз, наиболее часто встречающиеся клинически, - это травмы роговицы. В то время как заживление ран роговицы широко изучалось у мелких млекопитающих (то есть мышей, крыс и кроликов), исследования физиологии роговицы пренебрегли другими видами, включая рыбок данио, несмотря на то, что рыбки данио являются классической исследовательской моделью.

В этом отчете описывается метод выполнения истирания роговицы на рыбках данио. Рана выполняется in vivo на обезболенных рыбах с помощью глазного заусенца. Этот метод позволяет воспроизвести эпителиальную рану, оставляя остальную часть глаза нетронутой. После истирания контролируется закрытие раны в течение 3 ч, после чего рана реэпителизируется. С помощью сканирующей электронной микроскопии с последующей обработкой изображений можно исследовать форму эпителиальных клеток и апикальные выступы для изучения различных этапов закрытия эпителиальной раны роговицы.

Характеристики модели рыбок данио позволяют изучать физиологию эпителиальной ткани и коллективное поведение эпителиальных клеток при оспаривании ткани. Кроме того, использование модели, лишенной влияния слезной пленки, может дать новые ответы относительно реакции роговицы на стресс. Наконец, эта модель также позволяет очертить клеточные и молекулярные события, участвующие в любой эпителиальной ткани, подвергшейся физической ране. Этот метод может быть применен для оценки эффективности препарата при доклинических испытаниях.

Introduction

Поскольку большинство эпителиев находятся в контакте с внешней средой, они склонны к физическим травмам, что делает их хорошо подходящими для изучения процессов заживления ран. Среди хорошо изученных тканей роговица является чрезвычайно полезной моделью в исследовании клеточных и молекулярных аспектов заживления ран. Как прозрачная внешняя поверхность, он обеспечивает физическую защиту глаза и является первым элементом, который фокусирует свет на сетчатке. Хотя структура и клеточный состав сетчатки различаются между видами1, эти элементы роговицы, как правило, похожи во всех глазах камерного типа, независимо от вида.

Роговица состоит из трех основных слоев2. Первым и самым внешним слоем является эпителий, который постоянно обновляется для обеспечения его прозрачности. Вторым слоем является строма, которая содержит рассеянные клетки, называемые кератоцитами, в толстом слое строго организованных коллагеновых волокон. Третьим и самым внутренним слоем является эндотелий, который позволяет диффузии питательных веществ и жидкостей из передней камеры во внешние слои. Эпителиальные и стромальные клетки взаимодействуют через факторы роста и цитокины3. Это взаимодействие подчеркивается быстрым апоптозом и последующей пролиферацией кератоцитов после повреждения эпителия 4,5. В случае более глубокой раны, такой как пункция, кератоциты принимают активное участие в процессе заживления6.

Находясь в контакте с внешней средой, распространены физические травмы роговицы. Многие из них вызваны мелкими посторонними предметами7, такими как песок или пыль. Рефлекс трения глаз может привести к обширным эпителиальным ссадинам и ремоделированиюроговицы 8. В зависимости от размера и глубины раны эти физические травмы болезненны и занимают несколько дней, чтобы зажить9. Оптимальные характеристики заживления ран модели облегчают понимание клеточных и молекулярных аспектов закрытия раны. Кроме того, такие модели также оказались полезными для тестирования новых молекул с потенциалом для ускорения заживления роговицы, как ранее было продемонстрировано10,11.

Протокол, описанный здесь, направлен на использование рыбок данио в качестве соответствующей модели для изучения физического повреждения роговицы. Эта модель очень удобна для фармакологических скрининговых исследований, поскольку она позволяет добавлять молекулы непосредственно в воду резервуара и, следовательно, вступать в контакт с целебной роговицей. Подробности, представленные здесь, помогут ученым провести свои исследования на модели рыбок данио. Травма in vivo выполняется с притупленным глазным заусенцем. Воздействие на эпителиальные клетки, прилегающие или находящиеся на расстоянии от него, можно проанализировать путем специфического удаления центрального эпителия роговицы. В последние годы многочисленные доклады были посвящены такому методу на роговице грызунов 12,13,14,15,16,17; однако на сегодняшний день только в одном докладе этот метод применялся к рыбкам данио18.

Из-за своей простоты физическая рана полезна для очерчивания роли эпителиальных клеток в закрытии раны. Другой устоявшейся моделью повреждения роговицы является химический ожог, особенно щелочной ожог 19,20,21. Однако такой подход косвенно повреждает всю поверхность глаза, включая периферическую роговицу и строму роговицы19. Действительно, щелочные ожоги потенциально вызывают язвы роговицы, перфорации, помутнение эпителия и быструю неоваскуляризацию22, а неконтролируемый исход щелочных ожогов дисквалифицирует этот подход для общих исследований заживления ран. Многочисленные другие методы также используются для исследования заживления ран роговицы в соответствии с конкретным направлением рассматриваемого исследования (например, полная эпителиальная санация23, сочетание химического и механического повреждения раны частичной толщины24, эксимерная лазерная абляция для ран, простирающихся до стромы25). Использование глазного заусенца ограничивает фокусную точку эпителиальной реакцией на рану и обеспечивает высокую воспроизводимость раны.

Как и при каждом способе нанесения раны, использование глазного заусенца имеет свои преимущества и недостатки. Основным недостатком является то, что реакция в основном эпителиальная, она не полностью отражает ссадины, наблюдаемые в клинических условиях. Тем не менее, этот метод имеет множество преимуществ, в том числе легкость, с которой он может быть настроен и выполнен, его точность, его воспроизводимость и тот факт, что он неинвазивный, что делает его методом, хорошо переносимым животными.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты были одобрены национальным советом по экспериментам на животных.

1. Препараты

  1. Подготовьте раствор трицина, используемый для анестезии26 заранее (0,4% раствор, используемый в этом протоколе). Используйте перчатки и храните материалы в вытяжном капюшоне, когда это возможно.
    1. На 50 мл 0,4% раствора взвесьте 200 мг порошка трикаина в пробирке объемом 50 мл. Растворите порошок примерно в 45 мл двухдистиллированной воды.
    2. Отрегулируйте рН раствора трицина до 7 с 1 М Трис (рН 8,8, ~1,25 мл). Добавьте раствор Триса в запас трикаина в аликвотах, тщательно перемешайте бульон после каждой аликвоты и проверяйте рН после каждого добавления Триса.
  2. Перед экспериментом готовят 0,02% рабочий раствор трикаина.
    1. Разморозить 2 мл 0,4% раствора и добавить в 40 мл системной воды (конечная концентрация 0,02%). Поместите раствор в небольшую емкость.
  3. Перед экспериментом подготовьте восстановительную воду, содержащую анальгетик. Используйте перчатки и держите материалы в вытяжном капюшоне, когда это возможно.
    1. На один литр восстановительной воды взвесьте 2,5 мг порошка лидокаина гидрохлорида и растворите его в пресной системной воде. Проверьте pH и при необходимости отрегулируйте его до 7.
  4. Перед экспериментом готовят фиксирующий раствор (2,5% глутаровый альдегид в 0,1 М растворе фосфата натрия (Na-РО4) при рН 7,4). Используйте перчатки и храните материалы в вытяжном капюшоне.
    1. На 10 мл фиксирующего раствора пипетку 5 мл 0,2 М Na-PO4 в трубку. Добавьте 0,5 мл 50% глутаральдегида и добавьте двойную дистиллированную воду для получения конечного объема 10 мл. Защитите раствор от света и храните его на льду или в холодильнике перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если образцы необходимо собирать в течение нескольких часов после ранения, подготовьте фиксирующий раствор непосредственно перед использованием.
  5. Подготовьте оборудование к ранению (рисунок 1).
    1. Заполните резервуары для восстановления или меньшие контейнеры системной водой.
    2. Приготовьте офтальмологический заусенец. Убедитесь, что наконечник заусенца чистый. При необходимости удалите остатки клеток влажным ватным тампоном.
    3. Сделайте разрез в сторону мягкой губки и смочите губку системной водой. Поместите губку на основание/ступень рассекающего микроскопа. Обеспечьте достаточное рабочее пространство для использования заусенца и достаточное освещение с боков и / или выше, чтобы правильно видеть поверхность глаза.

2. Анестезия

  1. Перенесите рыбу из аквариума на 0,02% раствор трицина с помощью сетки как можно мягче.
  2. Следите за анестезией, проверяя отсутствие реакции на легкие механические раздражители.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для последовательной анестезии используется 2-минутное воздействие трикаина перед истиранием взрослых рыб дикого типа AB. С рыбами другого генетического происхождения может потребоваться другая продолжительность.

3. Истирание

  1. Аккуратно поместите обезболенную рыбу ложкой в разрез на губке, высунув голову из поверхности губки.
  2. Включите заусенец и сфокусируйте вид микроскопа на поверхности глаза.
  3. Осторожно подойдите к поверхности глаза кончиком заусенца. При прикосновении к поверхности глаза начните движение кончика заусенца по поверхности глаза круговыми движениями. Избегайте резких движений, так как это может привести к наклону глаза в гнезде и проскальзыванию кончика заусенца.
  4. Когда истирание будет сделано, осторожно поместите рыбу в системную воду, содержащую анальгетик для восстановления.
  5. Очистите заусенец сразу после использования влажным ватным тампоном.

4. Сбор образцов

  1. В нужный момент времени подберите рыбу сетью и поместите ее в 0,02% раствор трицена. Держите животное в растворе до тех пор, пока оперкулярное движение полностью не прекратится, и рыба не отреагирует на прикосновения.
  2. Поместите рыбу на чашку Петри ложкой и подержите ее пинцетом. Обезглавить рыбу рассекающими ножницами. Избегайте появления царапин на поверхности глаза при работе с образцом.
  3. Поместите ткань в пробирку, содержащую 0,1 М Na-PO4.
    1. Промыть ткань, заменив 0,1 М Na-PO4 чистым буфером, чтобы в растворе не осталось крови.

5. Обработка образцов для электронной микроскопии

  1. Зафиксируют ткань в 2,5% глутаральдегиде/0,1 М Na-PO4 (рН 7,4) в течение ~24 ч при +4 °C. Держите образец на вращающемся/встряхивающемся держателе образца для обеспечения надлежащей фиксации.
  2. Извлеките фиксирующий раствор и несколько раз промойте образец 0,1 М Na-PO4.
  3. Рассекните образец на этом этапе.
    1. Поместите образец на каплю 0,1 М Na-PO4 на рассекающую пластину. Если необходимо изобразить оба глаза одной и той же рыбы, разрежьте образец головы на две части тонкими рассекающими ножницами.
    2. Кроме того, собирайте глаза только путем осторожного размещения кончиков тонкого пинцета в глазницу со стороны глаза, уделяя особое внимание тому, чтобы не поцарапать поверхность глаза. Затем вытащите глаз из гнезда.
    3. Переложите рассеченный образец в пробирку, содержащую 0,1 М Na-PO4. Убедитесь, что в пробирке для образцов нет лишней ткани, так как она может прилипать к верхней части глаза во время обработки образца.
  4. Хранить образец в 0,1 М Na-PO4 (максимум одну неделю) при температуре +4 °C.
  5. Обработка образцов для электронной микроскопии.
    1. Постфиксируют образцы в 2% тетроксид осмия в буфере 0,1 М Na-PO4 в течение 1 ч при комнатной температуре (RT).
    2. Промывайте образцы 3 раза в течение 5 минут, каждую промывку в 0,1 М Na-PO4 на RT.
    3. Обезвоживать образцы последовательно в 30%, 50% и 70% этаноле в течение 1 ч в каждом растворе на РТ.
    4. Погружайте образцы в 96% этанол в течение 2-3 ч при РТ.
    5. Затем инкубируют образцы два раза в 100% этаноле, сначала в течение 1 ч, а затем в свежем 100% этаноле в течение ночи при +4 °C.
    6. Подвергайте образцы 30 циклам в автоматизированной сушилке критической точки.
  6. Встраивание и платиновое покрытие образцов.
    1. Поместите клейкую вкладку на крепление. Если образец должен быть отмечен на верхней части крепления, оставьте лист бумаги для обложки вкладки на вкладке и напишите идентификатор образца на бумаге.
    2. Поместите крепление с помощью вкладки на основание рассекающего микроскопа.
    3. Аккуратно поместите образец ткани на крепление тонким пинцетом, роговицу вверх.
    4. Покрыть образец платиной с помощью соответствующего устройства. После нанесения покрытия храните образцы при комнатной температуре до получения изображения.

6. Визуализация (рисунок 2)

  1. Работайте с устройствами в соответствии с рекомендациями, приведенными в руководстве пользователя и экспертами по визуализации.
  2. Получите изображения желаемого увеличения и используйте 2 000-2 500x изображений для анализа.
  3. Отрегулируйте яркость и контрастность так, чтобы на изображении не было переэкспонированных областей, а границы ячеек и микрориджи были видны как можно четче.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Положение и угол наклона ткани влияют на настройки яркости и контрастности. Возможно, потребуется отрегулировать их от образца к образцу и между различными областями ткани.

7. Измерение формы, размера и рисунка микрориджа

  1. Откройте изображение TIFF в Fiji ImageJ 1.5327. Задайте масштаб с помощью шкалы масштаба изображения: создайте линию, равную по размеру шкале масштаба с помощью инструмента «Линия ». Выберите Анализ | Задайте масштаб и введите в известном расстоянии. Откройте менеджер окупаемости инвестиций из | анализа Меню Инструменты .
  2. Для параметра Размер ячейки и округлость выберите Анализ | Установка | измерений Дескрипторы фигур. Используйте инструмент «Увеличительное стекло », чтобы увидеть ячейки под увеличением. Выделите ячейки с помощью инструмента «Полигон » и добавьте каждый выделенный фрагмент в диспетчер окупаемости инвестиций. Наконец, измерьте выбранные ячейки и сохраните измерение.
  3. Анализ микрориджа (рисунок 3 и рисунок 4)
    1. Убедитесь, что изображение находится в 8-битном формате из image | Меню ввода .
    2. Выделите ячейку с помощью инструмента « Полигон » и очистите фон в | «Правка». Очистите снаружи.
    3. Сгладьте изображение один-три раза, выбрав Обработать | Сглаживайте и регулируйте яркость и контрастность с помощью image | Отрегулируйте | Яркость/Контрастность , чтобы микрориджи выделялись как можно более четко.
    4. Закрутите изображение из Process | фильтры | Convolve, превратитесь в двоичный из Process | Двоичные | Создайте двоичный файл и скелетируйте черно-белое изображение, выбрав Обработать | Двоичные | Скелетонизация.
    5. Использование функции Анализ скелета в | Анализа Скелетное меню для измерения параметров микрориджа и сохранения значений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В SEM отдельные изображения могут отличаться по яркости и контрастности. Таким образом, этапы анализа могут нуждаться в корректировке от изображения к изображению.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Это исследование описывает метод с использованием офтальмологического заусенца в экспериментах по заживлению ран роговицы рыбок данио. Метод модифицирован по сравнению с предыдущими исследованиями на мышах, где было показано, что заусенец эффективно удаляет эпителиальные клеточные слои13. Проблемы при ранении роговицы рыбок данио включают относительно небольшой размер глаза, а в случае трудоемких экспериментов необходимость поддержания постоянного потока воды через жабры (как описано Сюй и его коллегами28). Основными преимуществами этого метода являются его простота и скорость. Для контролируемого использования заусенца используется стандартный рассекающий микроскоп (рисунок 1). Поскольку процедура имеет короткую продолжительность (примерно 3 минуты от начала анестезии), рыба хорошо восстанавливается после обработки, и для поддержания анестезии и доставки кислорода не требуется дополнительное оборудование.

Существует несколько способов визуализации раны роговицы. Этот протокол использует сканирующую электронную микроскопию (SEM, рисунок 2), которая имеет долгую историю использования в исследованиях роговицы29,30. Хотя такой подход не позволяет оценить нижние слои эпителия, он обеспечивает простой метод оценки скорости заживления ран и сравнения поверхностей роговицы разных областей глаза. Через 3 часа после раны, пока область раны закрыта (рисунок 2), место, где соединяются границы раны, остается видимым (рисунок 2).

Поверхностные клетки на роговице рыбок данио содержат выраженные микрориджи31. Недавно в исследовании сообщалось, что эти структуры теряются в удлиненных клетках, прилегающих к ранам на коже рыбок данио32. Однако представленные результаты показывают, что на истиранном эпителии роговицы микрориджи могут наблюдаться в некоторых вытянутых клетках рядом с местом раны (рисунок 4В). В некоторых периферических областях микрориджи теряются из центра клетки (рисунок 4C,D). Для более детального анализа количественно определяются площадь апикальной ячейки и округлость, в дополнение к количеству микрориджа и средней длине в ImageJ27 (рисунок 3 и рисунок 4E-H).

Анализ микрориджа выполняется с использованием функции Скелета (модифицированной у Ван Луна и его коллег33). Сравнение двух периферических областей (Рисунок 4A (области C и D), Рисунок 4C и Рисунок 4D) показывает, что клетки на Рисунке 4D более вытянуты (что указывает на клеточные перестановки как реакцию на ранение) и имеют более короткие средние микрориджи, чем клетки на Рисунке 4C. Этот результат говорит о том, что изменение формы клеток коррелирует с модификацией микрориджа и подчеркивает гетерогенность в эпителии роговицы в реакции раны.

Измерение площади апикальной клетки и округлости на снимках SEM является простым и воспроизводимым способом получения количественных данных о внешнем виде клеток в разных областях роговицы. Хотя этот подход ограничен 2D, он помогает получить общее понимание динамики и скорости перегруппировки клеток во время закрытия раны. Изображения SEM используются для анализа микрориджей на поверхности апикальной клетки. Описанная здесь обработка изображений дает приближение изменений параметров микрориджа, которые было бы утомительно измерять вручную.

Figure 1
Рисунок 1: Установка для истирания роговицы. (А) Рассекающий микроскоп необходим для контролируемого истирания на маленьком глазу рыбки данио. (B) Губка помогает стабилизировать обезболенных рыб во время процедуры. (C) Рыбу обезболивают на чашке Петри, а обезболенное животное переносят в губку маленькой ложкой. Глазной заусенец с кончиком 0,5 мм используется для истирания роговицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Визуализация раненой роговицы с помощью сканирующей электронной микроскопии. Обзор истираемой роговицы, собранной через 0, 1, 2 или 3 ч после раны (HPW). Пунктирный контур указывает на границу раны. Шкала = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Пример модификации изображения перед измерением микрориджа. Хотя это не точная копия исходной поверхности клетки, окончательный скелетонизированный паттерн фиксирует различия между центром клетки и периферией. Шкала = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Сравнение площади апикальных клеток, округлости и значений микротриджа между двумя периферическими областями после истирания роговицы. (A) Обзор раненого глаза. Поля указывают расположение изображений с более высоким увеличением (в B, C и D). (С, Г) Ячейки, выбранные для анализа дескрипторов фигур, помечаются зеленым контуром. (Е, Ф) Значения площади апикальной ячейки (E) и округлости (F) выбранных ячеек. (Г, Н) Микроридж общая длина (G) и средняя длина (H) одних и тех же клеток. Группы статистически сравнивали с двуххвостым t-тестом (*p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01) Шкала баров = 500 мкм в A, 50 мкм в B, C и D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Физические травмы роговицы являются наиболее распространенной причиной визитов пациентов офтальмологии в больницу. Поэтому важно установить соответствующие модели для изучения различных аспектов патофизиологии роговицы. До сих пор мышь является наиболее часто используемой моделью для изучения заживления ран роговицы. Тем не менее, добавление глазных капель на мышиные раненые глаза для подтверждения влияния конкретных препаратов на заживление ран роговицы может быть затруднено. В этом отношении модель рыбок данио особенно полезна для фармакологического скрининга молекул, влияющих на заживление ран роговицы. Способ, описанный здесь, очень похож на описанный для мыши13.

Однако необходимо иметь в виду два конкретных момента, отличающихся друг от друга. Во-первых, использование офтальмологического заусенца требует практики для обеспечения воспроизводимости раны, особенно в отношении давления, оказываемого на глаз, что имеет решающее значение для правильного истирания. Кроме того, абразивный наконечник должен быть изменен, когда эпителий больше не удаляется эффективно. Во-вторых, хотя структура и морфология роговицы рыбок данио аналогичны другим роговицам31, это животное обладает регенеративными способностями, которые не имеют аналогов в организмах млекопитающих 34,35,36. В то время как закрытие раны у мыши длится в течение 48-72 ч 11,14,37, для рыбок данио сообщается о временной шкале в 3 ч. Из-за структурного и молекулярного сходства клеточное поведение, вызванное физической раной роговицы, вероятно, похоже у большинства позвоночных. Тем не менее, быстрая реакция у рыбок данио, вероятно, управляется передовым регенеративным механизмом, который специфичен для этого животного.

Описанный протокол использует SEM для отслеживания закрытия раны. Многочисленные другие исследования использовали флуоресцентную микроскопию вместо этого для отслеживания этого процесса 15,17,38. Тем не менее, использование SEM облегчает анализ модификации формы клеток после истирания эпителия. Недостатком этой технологии является то, что этапы стратификации не могут быть отслежены, поскольку SEM позволяет только визуализировать самый внешний слой. Для изучения эпителия в 3D во время полного заживления роговицы следует использовать флуоресцентные модели, такие как Zebrabow39, или иммуномаркировку.

Использование рыбок данио в качестве модели заживления ран роговицы расширяет сферу исследований, поскольку позволяет применять многочисленные молекулярные инструменты, такие как генетически модифицированные рыбьи линии, морфолины и химический скрининг, чтобы значительно расширить возможный диапазон исследований заживления ран роговицы. Кроме того, размер глаз рыбок данио позволяет разрабатывать новые стратегии визуализации для изучения динамики эпителиальных клеток более подробно, чем это может быть сделано с мышиными глазами.

Основная цель настоящего доклада состоит не только в том, чтобы адаптировать физический подход к ранению роговицы к модели рыбок данио, но и в том, чтобы продемонстрировать, что использование новых моделей позволяет задавать и отвечать на новые вопросы и указывает на новые способы исследования фундаментальных биологических явлений. Эти преимущества в конечном итоге будут полезны для пациентов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Авторы благодарят Пертти Панулу за доступ к подразделению рыбок данио и Анри Койвулу за руководство и помощь в экспериментах с рыбками данио. Это исследование было поддержано Академией Финляндии, Фондом Джейн и Аатос Эркко, Финским культурным фондом и программой ATIP-Avenir. Визуализация проводилась в отделении электронной микроскопии и в отделении световой микроскопии Института биотехнологии при поддержке HiLIFE и Biocenter Finland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 in-house Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2 HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2 PO4 ).
0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 in-house Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2 HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2 PO4 ).
0.5mm burr tips Alger Equipment Company BU-5S
1M Tris, pH 8.8 in-house
adhesive tabs Agar Scientific G3347N
Algerbrush burr, Complete instrument Alger Equipment Company BR2-5
Cotton swaps Heinz Herenz Hamburg 1030128
Dissecting plate in-house
Dissecting tools Fine Science Tools
double-distilled water in-house
Eppedorf tubes, 2ml any provider
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma A5040 Caution: causes irritation.
Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I Sigma G7651 Caution: toxic.
Lidocaine hydrochloride Sigma L5647 Caution: toxic.
mounts Agar Scientific G301P
Petri dish Thermo Scientific 101VR20
pH indicator strips Macherey-Nagel 92110
Plastic spoons any provider
Plastic tubes, 15 ml Greiner Bio-One 188271
Plastic tubes, 50 ml Greiner Bio-One 227261
Scanning electron microscope FEI Quanta 250 FEG
Soft sponge any provider
Sputter coater Quorum Technologies GQ150TS
Stereomicroscope Leica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baden, T., Euler, T., Berens, P. Understanding the retinal basis of vision across species. Nature Reviews.Neuroscience. 21 (1), 5-20 (2020).
  2. Nishida, T., Saika, S., Morishige, N. Cornea and sclera: Anatomy and physiology. Cornea: Fundamentals, diagnosis and management, 4th ed. Manis, M. J., Holland, E. J. , Elsevier. 1-22 (2017).
  3. Wilson, S. E., Liu, J. J., Mohan, R. R. Stromal-epithelial interactions in the cornea. Progress in Retinal and Eye Research. 18 (3), 293-309 (1999).
  4. Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
  5. Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  6. West-Mays, J. A., Dwivedi, D. J. The keratocyte: corneal stromal cell with variable repair phenotypes. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 38 (10), 1625-1631 (2006).
  7. Ahmed, F., House, R. J., Feldman, B. H. Corneal abrasions and corneal foreign bodies. Primary Care. 42 (3), 363-375 (2015).
  8. Ben-Eli, H., Erdinest, N., Solomon, A. Pathogenesis and complications of chronic eye rubbing in ocular allergy. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 19 (5), 526-534 (2019).
  9. Wilson, S. A., Last, A. Management of corneal abrasions. American Family Physician. 70 (1), 123-128 (2004).
  10. Nagata, M., et al. JBP485 promotes corneal epithelial wound healing. Scientific Reports. 5, 14776 (2015).
  11. Wang, X., et al. MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress. Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).
  12. Li, F. J., et al. Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit. Experimental Eye Research. 147, 1-11 (2016).
  13. Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. Corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (137), e58071 (2018).
  14. Kalha, S., et al. Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing. Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).
  15. Park, M., et al. Visualizing the contribution of keratin-14(+) limbal epithelial precursors in corneal wound healing. Stem Cell Reports. 12 (1), 14-28 (2019).
  16. Kuony, A., et al. Ectodysplasin-A signaling is a key integrator in the lacrimal gland-cornea feedback loop. Development. 146 (14), (2019).
  17. Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).
  18. Ikkala, K., Michon, F., Stratoulias, V. Unilateral Zebrafish corneal injury induces bilateral cell plasticity supporting wound closure. Scientific Reports. , (2021).
  19. Ormerod, L. D., Abelson, M. B., Kenyon, K. R. Standard models of corneal injury using alkali-immersed filter discs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (10), 2148-2153 (1989).
  20. Anderson, C., Zhou, Q., Wang, S. An alkali-burn injury model of corneal neovascularization in the mouse. Journal of visualized experiments: JoVE. (86), e51159 (2014).
  21. Choi, H., et al. Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye. Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).
  22. Singh, P., Tyagi, M., Kumar, Y., Gupta, K. K., Sharma, P. D. Ocular chemical injuries and their management. Oman Journal of Ophthalmology. 6 (2), 83-86 (2013).
  23. Pal-Ghosh, S. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  24. Chen, J. J., Tseng, S. C. Abnormal corneal epithelial wound healing in partial-thickness removal of limbal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (8), 2219-2233 (1991).
  25. Xeroudaki, M., Peebo, B., Germundsson, J., Fagerholm, P., Lagali, N. RGTA in corneal wound healing after transepithelial laser ablation in a rabbit model: a randomized, blinded, placebo-controlled study. Acta Ophthalmologica. 94 (7), 685-691 (2016).
  26. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio. , Available from: https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html (2000).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
  29. Crosson, C. E., Klyce, S. D., Beuerman, R. W. Epithelial wound closure in the rabbit cornea. A biphasic process. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (4), 464-473 (1986).
  30. Parlanti, P., et al. Axonal debris accumulates in corneal epithelial cells after intraepithelial corneal nerves are damaged: A focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) study. Experimental Eye Research. 194, 107998 (2020).
  31. Zhao, X. C., et al. The zebrafish cornea: structure and development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (10), 4341-4348 (2006).
  32. Richardson, R., et al. Re-epithelialization of cutaneous wounds in adult zebrafish combines mechanisms of wound closure in embryonic and adult mammals. Development. 143 (12), 2077-2088 (2016).
  33. van Loon, A. P., Erofeev, I. S., Maryshev, I. V., Goryachev, A. B., Sagasti, A. Cortical contraction drives the 3D patterning of epithelial cell surfaces. The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).
  34. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. Journal of Neurobiology. 44 (3), 289-307 (2000).
  35. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  36. Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. The Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
  37. Hu, X., et al. Sirt6 deficiency impairs corneal epithelial wound healing. Aging. 10 (8), 1932-1946 (2018).
  38. Ksander, B. R., et al. ABCB5 is a limbal stem cell gene required for corneal development and repair. Nature. 511 (7509), 353-357 (2014).
  39. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).

Tags

Биология выпуск 181 Роговица эпителий истирание глазной заусенец закрытие раны SEM рыбка данио.
Заживление ран роговицы рыбок данио: от истирания до анализа закрытия раны
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ikkala, K., Raatikainen, S., Michon, … More

Ikkala, K., Raatikainen, S., Michon, F. Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis. J. Vis. Exp. (181), e63605, doi:10.3791/63605 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter