Summary
Detta protokoll fokuserar på att skada zebrafiskens okulära yta genom nötning för att bedöma den efterföljande sårförslutningen på cellulär nivå. Detta tillvägagångssätt utnyttjar en okulär burr för att delvis avlägsna hornhinnans epitel och använder svepelektronmikroskopi för att spåra förändringar i cellmorfologi under sårförslutning.
Abstract
Som ögats genomskinliga yta är hornhinnan avgörande för klar syn. På grund av sin plats är denna vävnad benägen för miljöförolämpningar. Faktum är att de ögonskador som oftast uppstår kliniskt är de till hornhinnan. Medan hornhinnans sårläkning har studerats i stor utsträckning hos små däggdjur (dvs. möss, råttor och kaniner), har hornhinnefysiologiska studier försummat andra arter, inklusive zebrafisk, trots att zebrafisk är en klassisk forskningsmodell.
Denna rapport beskriver en metod för att utföra en hornhinnnötning på zebrafisk. Såret utförs in vivo på sövd fisk med användning av en okulär burr. Denna metod möjliggör ett reproducerbart epitelsår och lämnar resten av ögat intakt. Efter nötning övervakas sårförslutning under 3 timmar, varefter såret reepitelialiseras. Genom att använda svepelektronmikroskopi, följt av bildbehandling, kan epitelcellformen och apikala utsprång undersökas för att studera de olika stegen under hornhinnans epitelsårstängning.
Egenskaperna hos zebrafiskmodellen möjliggör studier av epitelvävnadsfysiologin och epitelcellernas kollektiva beteende när vävnaden utmanas. Dessutom kan användningen av en modell som berövas tårfilmens inflytande ge nya svar om hornhinnans svar på stress. Slutligen tillåter denna modell också avgränsningen av de cellulära och molekylära händelserna som är involverade i någon epitelvävnad som utsätts för ett fysiskt sår. Denna metod kan tillämpas på utvärdering av läkemedelseffektivitet vid preklinisk testning.
Introduction
Eftersom de flesta epitelerna är i kontakt med den yttre miljön är de benägna att skadas fysiskt, vilket gör dem väl lämpade för studier av sårläkningsprocesser. Bland de välstuderade vävnaderna är hornhinnan en extremt användbar modell vid undersökningen av de cellulära och molekylära aspekterna av sårläkning. Som en transparent yttre yta ger den fysiskt skydd för ögat och är det första elementet som fokuserar ljuset på näthinnan. Medan näthinnans struktur och cellsammansättning skiljer sig åt mellan arter1, är dessa element i hornhinnan i allmänhet lika i alla kameratypsögon, oavsett art.
Hornhinnan består av tre huvudlager2. Det första och yttersta lagret är epitelet, som ständigt förnyas för att säkerställa dess transparens. Det andra skiktet är stroma, som innehåller spridda celler, kallade keratocyter, inom ett tjockt lager av strikt organiserade kollagenfibrer. Det tredje och innersta skiktet är endotelet, vilket möjliggör närings- och vätskediffusion från den främre kammaren till de yttre skikten. Epitel- och stromacellerna interagerar via tillväxtfaktorer och cytokiner3. Denna interaktion framhävs av den snabba apoptosen och efterföljande proliferation av keratocyter efter epitelskada 4,5. Vid ett djupare sår, såsom en punktering, tar keratocyter en aktiv roll i läkningsprocessen6.
Att vara i kontakt med den yttre miljön är fysiska skador på hornhinnan vanliga. Många av dem orsakas av små främmande föremål7, såsom sand eller damm. Reflexen av ögongnuggning kan leda till omfattande epitelnötning och hornhinneremodellering8. Enligt sårstorlek och djup är dessa fysiska skador smärtsamma och tar flera dagar att läka9. De optimala sårläkningsegenskaperna hos en modell underlättar förståelsen av de cellulära och molekylära aspekterna av sårförslutning. Dessutom har sådana modeller också visat sig vara användbara för att testa nya molekyler med potential att påskynda hornhinneläkning, vilket tidigare visat 10,11.
Protokollet som beskrivs här syftar till att använda zebrafisk som en relevant modell för att studera fysisk skada på hornhinnan. Denna modell är mycket lämplig för farmakologiska screeningstudier eftersom den gör det möjligt att tillsätta molekyler direkt till tankvattnet och därför komma i kontakt med en helande hornhinna. Detaljerna som tillhandahålls här kommer att hjälpa forskare att utföra sina studier på zebrafiskmodellen. In vivo-skadan utförs med en tråkig okulär burr. Påverkan på epitelceller som gränsar till eller på avstånd från den kan analyseras genom att specifikt avlägsna det centrala hornhinneepitelet. Under de senaste åren har många rapporter fokuserat på en sådan metod på gnagare hornhinna 12,13,14,15,16,17; Hittills har dock endast en enda rapport tillämpat denna metod på zebrafisk18.
På grund av sin enkelhet är det fysiska såret användbart för att avgränsa epitelcellernas roll i sårförslutning. En annan väletablerad modell av hornhinneskada är den kemiska bränningen, särskilt alkaliförbränningen 19,20,21. Ett sådant tillvägagångssätt skadar emellertid indirekt hela ögonytan, inklusive perifer hornhinna och hornhinnan stroma19. Faktum är att alkalibrännskador potentiellt inducerar hornhinnesår, perforeringar, epitelial opacifiering och snabb neovaskularisering22, och det okontrollerbara resultatet av alkalibrännskador diskvalificerar det tillvägagångssättet för allmänna sårläkningsstudier. Många andra metoder används också för att undersöka sårläkning av hornhinnan enligt den aktuella studiens särskilda fokus (t.ex. fullständig epiteldebridering23, kombinationen av kemisk och mekanisk skada för partiell tjocklek sår24, excimerlaserablation för sår som sträcker sig till stroma25). Användningen av en okulär burr begränsar brännpunkten till epitelsvaret på såret och ger ett mycket reproducerbart sår.
Som med varje metod för sårföring har användningen av en okulär burr fördelar och nackdelar. Den största nackdelen är att svaret mestadels är epitelialt, det återspeglar inte perfekt de nötningar som ses i den kliniska miljön. Denna metod har emellertid många fördelar, inklusive den lätthet med vilken den kan ställas in och utföras, dess precision, dess reproducerbarhet och det faktum att den är icke-invasiv, vilket gör den till en metod som tolereras väl av djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försök godkändes av Djurförsöksnämnden.
1. Förberedelser
- Förbered trikainsemilösningen som används för anestesi26 i förväg (0,4% stamlösning som används i detta protokoll). Använd handskar och förvara materialen i en dragskåpa när det är möjligt.
- För 50 ml av en 0,4% lösning, väg 200 mg trikainpulver i ett 50 ml rör. Lös upp pulvret i cirka 45 ml dubbeldestillerat vatten.
- Justera trikainsallösningens pH till 7 med 1 M Tris (pH 8,8, ~1,25 ml). Tillsätt Tris-lösningen till trikainbuljongen i alikvoter, blanda buljongen noggrant efter varje alikvot och kontrollera pH efter varje tillsats av Tris.
- Före experimentet, förbered en 0,02% arbetslösning av trikain.
- Tina 2 ml 0,4% stamlösning och tillsätt till 40 ml systemvatten (slutlig koncentration 0,02%). Placera lösningen i en liten behållare.
- Före experimentet, förbered återhämtningsvattnet som innehåller smärtstillande medel. Använd handskar och förvara materialen i draghuven när det är möjligt.
- För en liter återvinningsvatten, väg 2,5 mg lidokainhydrokloridpulver och lös upp det i färskt systemvatten. Kontrollera pH och justera till 7 vid behov.
- Före experimentet bereda fixeringslösningen (2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natriumfosfat (Na-PO4) lösning vid pH 7,4). Använd handskar och förvara materialen i en dragskåpa.
- För 10 ml av fixeringslösningen pipetterar 5 ml 0,2 M Na-PO4 i ett rör. Tillsätt 0,5 ml 50% glutaraldehyd och tillsätt dubbeldestillerat vatten för att erhålla den slutliga volymen på 10 ml. Skydda lösningen från ljus och förvara den på is eller i kylen före användning.
OBS: Om prover måste samlas in i flera timmar efter sårning, förbered fixeringslösningen strax före användning.
- För 10 ml av fixeringslösningen pipetterar 5 ml 0,2 M Na-PO4 i ett rör. Tillsätt 0,5 ml 50% glutaraldehyd och tillsätt dubbeldestillerat vatten för att erhålla den slutliga volymen på 10 ml. Skydda lösningen från ljus och förvara den på is eller i kylen före användning.
- Förbered utrustningen för sårning (Figur 1).
- Fyll återvinningstankarna eller mindre behållare med systemvatten.
- Ha den oftalmiska burren redo. Kontrollera att burrspetsen är ren. Om det behövs, ta bort cellskrot med en fuktig bomullspinne.
- Gör ett snitt på sidan av en mjuk svamp och fukta svampen med systemvatten. Placera svampen på basen / scenen i ett dissekerande mikroskop. Se till att det finns tillräckligt med arbetsutrymme för att använda burren och tillräckligt med belysning från sidorna och / eller ovanför för att se ögonytan ordentligt.
2. Anestesi
- Överför en fisk från tanken till 0,02% trikainlösningen med ett nät så försiktigt som möjligt.
- Övervaka anestesin, kontrollera om det inte finns något svar på lätt mekanisk stimulans.
OBS: För konsekvent anestesi används en 2 minuters exponering för trikain före nötning med vuxna vilda AB-fiskar. Med fisk med annan genetisk bakgrund kan en annan varaktighet behövas.
3. Nötning
- Placera försiktigt den bedövade fisken med en sked i snittet på svampen, huvudet sticker ut från svampytan.
- Slå på burren och fokusera mikroskopvyn på ögonytan.
- Närma dig försiktigt ögonytan med burrspetsen. När du rör vid ögonytan börjar du flytta burrspetsen på ögonytan med cirkulär rörelse. Undvik plötslig rörelse, eftersom det kan leda till att ögat lutar i uttaget och att burrspetsen glider.
- När nötningen är klar, placera försiktigt fisken i systemvatten som innehåller smärtstillande medel för återhämtning.
- Rengör burren direkt efter användning med en fuktig bomullspinne.
4. Samla in prover
- Vid önskad tidpunkt, plocka upp fisken med ett nät och placera den i 0,02% trikainlösning. Håll djuret i lösningen tills den operkulära rörelsen har upphört helt och fisken reagerar inte på beröring.
- Lägg fisken på en petriskål med en sked och håll den med pincett. Halshugg fisken med dissekerande sax. Undvik att göra repor på ögonytan när du hanterar provet.
- Sätt vävnaden i ett provrör innehållande 0,1 M Na-PO4.
- Skölj vävnaden genom att ersätta 0,1 M Na-PO4 med ren buffert så att inget blod finns kvar i lösningen.
5. Provbehandling för elektronmikroskopi
- Fixera vävnaden i 2,5% glutaraldehyd / 0,1 MNa-PO4 (pH 7,4) i ~ 24 timmar vid +4 ° C. Förvara provet på en roterande/skakande provhållare för att säkerställa korrekt fixering.
- Ta bort fixeringslösningen och skölj provet flera gånger med 0,1 M Na-PO4.
- Dissekera provet vid denna tidpunkt.
- Placera provet på en droppe på 0,1 M Na-PO4 på en dissekeringsplatta. Om båda ögonen från samma fisk måste avbildas, skär huvudprovet i två med fin dissekerande sax.
- Alternativt kan du samla ögonen bara genom att försiktigt placera spetsarna på en fin pincett i ögonhålan från sidan av ögat, var extra försiktig så att du inte repar ögonytan. Dra sedan ut ögat från uttaget.
- Överför det dissekerade provet till ett rör innehållande 0,1 M Na-PO4. Se till att det inte finns någon extra vävnad i provröret, eftersom det kan fästa på toppen av ögat under provbehandling.
- Förvara provet i 0,1 M Na-PO4 (högst en vecka) vid +4 °C.
- Bearbeta proverna för elektronmikroskopiavbildning.
- Postfixera proverna i 2% osmiumtetroxid i 0,1 M Na-PO4 buffert i 1 timme vid rumstemperatur (RT).
- Tvätta proverna 3 gånger i 5 minuter varje tvätt i 0,1 M Na-PO4 vid RT.
- Dehydrera proverna successivt i 30%, 50% och 70% etanol i 1 timme i varje lösning vid RT.
- Sänk ner proverna i 96% etanol i 2-3 timmar vid RT.
- Därefter inkubera proverna två gånger i 100% etanol, först i 1 timme och sedan i färsk 100% etanol över natten vid +4 ° C.
- Utsätt proverna för 30 cykler i en automatiserad kritisk punkttork.
- Bädda in och platina-belägga proverna.
- Placera en självhäftande flik på ett fäste. Om provet måste markeras ovanpå fästet, lämna en bit flikpapper på fliken och skriv prov-ID på papperet.
- Placera fästet med fliken på basen av ett dissekerande mikroskop.
- Placera försiktigt vävnadsprovet på fästet med fin pincett, hornhinnan uppåt.
- Belägg provet med platina med lämplig anordning. Efter beläggning, förvara proverna vid rumstemperatur tills avbildning.
6. Avbildning (figur 2)
- Använd enheterna enligt råden i användarhandboken och av bildexperter.
- Skaffa bilder av önskad förstoring och använd 2 000-2 500x bilder för analys.
- Justera ljusstyrkan och kontrasten så att det inte finns några överexponerade områden i bilden, och cellgränser och mikroridge ses så tydligt som möjligt.
OBS: Vävnadens position och vinkel påverkar inställningarna för ljusstyrka och kontrast. De kan behöva justeras från prov till prov och mellan olika regioner i vävnaden.
7. Mätning av cellform, storlek och mikrohönsmönster
- Öppna TIFF-bilden i Fiji ImageJ 1.5327. Ställ in skalan med hjälp av bildens skalfält: skapa en linje som är lika stor som skalningsfältet med verktyget Linje . Välj Analysera | Ställ in skala och skriv in det kända avståndet. Öppna ROI-hanteraren från | Menyn Verktyg .
- För cellstorlek och rundhet väljer du Analysera | Ställ in mätningar | Formbeskrivningar. Använd förstoringsglasverktyget för att se cellerna under förstoring. Markera celler med Polygon-verktyget och lägg till varje val i ROI-hanteraren. Slutligen mäter du de valda cellerna och sparar mätningen.
- Mikroridgeanalys (figur 3 och figur 4)
- Kontrollera att bilden är i 8-bitarsformat från | Skriv menyn.
- Markera en cell med Polygon-verktyget och rensa bakgrunden från Redigera | Rensa utanför.
- Jämna ut bilden en till tre gånger genom att välja Process | Jämna ut och justera ljusstyrkan och kontrasten från Bild | Justera | Ljusstyrka/kontrast så att mikrokylskåpen sticker ut så tydligt som möjligt.
- Sammanfoga bilden från Process | Filtrerar | Convolve, förvandlas till binär från Process | Binär | Gör binär och skelettisera den svartvita bilden genom att välja Process | Binär | Skelettisera.
- Använd funktionen Analysera skelett i | Skelettmeny för att mäta mikroridgeparametrarna och spara värdena.
OBS: I SEM kan enskilda bilder skilja sig åt i ljusstyrka och kontrast. Således kan stegen i analysen behöva justeras från bild till bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna studie beskriver en metod som använder en oftalmisk burr i zebrafisk hornhinnans sårläkningsexperiment. Metoden är modifierad från tidigare studier på möss, där burren visade sig ta bort epitelcellskikten effektivt13. Utmaningarna i zebrafisk hornhinnesår inkluderar den relativt lilla storleken på ögat, och i fallet med tidskrävande experiment, behovet av att upprätthålla ett konstant vattenflöde genom gälarna (som beskrivs av Xu och kollegor28). De främsta fördelarna med denna metod är dess enkelhet och hastighet. Ett standarddissekerande mikroskop används för kontrollerad användning av burren (Figur 1). Eftersom proceduren är av kort varaktighet (cirka 3 minuter från anestesins början) återhämtar sig fisken väl från hanteringen, och ingen extra utrustning behövs för underhåll av anestesi och syretillförsel.
Det finns flera sätt att visualisera hornhinnsåret. Detta protokoll använder svepelektronmikroskopi (SEM, figur 2), som har en lång historia av användning i hornhinnestudier29,30. Även om detta tillvägagångssätt inte tillåter en bedömning av epitelets nedre lager, ger det en enkel metod för att uppskatta sårläkningshastigheten och jämföra hornhinnorna i olika regioner i ögat. Vid 3 h efter sår, medan sårområdet är stängt (figur 2), förblir platsen där sårgränserna förenas synliga (figur 2).
De ytliga cellerna på zebrafiskhinnan innehåller uttalademikroridges 31. Nyligen rapporterade en studie dessa strukturer som förlorade i långsträckta celler intill sår på zebrafiskhud32. De presenterade resultaten visar emellertid att på slipat hornhinneepitele kan mikroridge observeras i vissa långsträckta celler bredvid sårstället (figur 4B). I vissa perifera regioner förloras mikroridgena från mitten av cellen (figur 4C,D). För en mer detaljerad analys kvantifieras apikal cellarea och rundhet, förutom mikrohönsmängd och medellängd i BildJ27 (figur 3 och figur 4E-H).
Mikroridgeanalysen görs med hjälp av skelettfunktionen (modifierad från van Loon och kollegor33). En jämförelse mellan de två perifera regionerna (figur 4A (regionerna C och D), figur 4C och figur 4D) avslöjar att cellerna i figur 4D är mer långsträckta (vilket indikerar cellomläggningar som en reaktion på sår) och har kortare genomsnittliga mikroridge än celler i figur 4C. Detta resultat tyder på att förändringen i cellform korrelerar med mikroridgemodifieringen och betonar heterogeniteten inom hornhinnans epitel i sårrespons.
Att mäta apikalt cellområde och rundhet på SEM-bilder är ett enkelt och reproducerbart sätt att få kvantitativa data om cellutseende i olika regioner i hornhinnan. Även om det är begränsat till 2D, hjälper detta tillvägagångssätt till att få en övergripande förståelse för dynamiken och hastigheten hos cellomläggningar under sårförslutning. SEM-bilderna används för att analysera mikroridgemönstren på den apikala cellytan. Bildbehandlingen som beskrivs här ger en approximation av förändringarna i mikroridgeparametrarna, vilket skulle vara tråkigt att mäta för hand.
Figur 1: Inställningen för hornhinnenötning. (A) Ett dissekerande mikroskop är nödvändigt för den kontrollerade nötningen på det lilla zebrafiskögat. (B) Svampen hjälper till att stabilisera den bedövade fisken under proceduren. (C) Fisken bedövas på en petriskål och det bedövade djuret överförs till svampen med en liten sked. En okulär burr med en 0,5 mm spets används för att abrade hornhinnan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Visualisering av den sårade hornhinnan med svepelektronmikroskopi. Översikten över den slipade hornhinnan som samlats in vid 0, 1, 2 eller 3 h efter sår (HPW). Den streckade konturen indikerar sårgränsen. Skalstänger = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Ett exempel på bildmodifieringen före mikroridgemätning. Även om det inte är en exakt kopia av den ursprungliga cellytan, fångar det slutliga skelettiserade mönstret skillnaderna mellan cellcentret och periferin. Skalstång = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: En jämförelse av apikala cellarea, rundhet och mikroridgevärden mellan två perifera regioner efter hornhinnans nötning. (A) En översikt över det sårade ögat. Rutorna anger platsen för de högre förstoringsbilderna (i B, C och D). (C, D) Celler som valts för formbeskrivningsanalys markeras med en grön kontur. (E, F) Apikala cellarea (E) och rundhetsvärden (F) för valda celler. (G, H) Microridge total längd (G) och medellängd (H) av samma celler. Grupperna jämfördes statistiskt med ett tvåstjärtat t-test (*p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01) Skalstänger = 500 μm i A, 50 μm i B, C och D. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hornhinneskador är den vanligaste orsaken till oftalmologiska patientbesök på sjukhuset. Därför är det viktigt att fastställa relevanta modeller för studier av olika aspekter av hornhinnans patofysiologi. Hittills är musen den vanligaste modellen för studier av hornhinnans sårläkning. Att lägga till ögondroppar på murina sårade ögon för att validera effekten av specifika läkemedel på hornhinnans sårläkning kan dock vara svårt. I detta avseende är zebrafiskmodellen särskilt användbar för farmakologisk screening av molekyler som påverkar sårläkning av hornhinnan. Metoden som beskrivs här är mycket lik den som beskrivs för mus13.
Två specifika skillnadspunkter måste dock hållas i åtanke. För det första kräver användningen av en oftalmisk burr övning för att säkerställa sårreproducerbarhet, särskilt med avseende på det tryck som utövas på ögat, vilket är avgörande för korrekt nötning. Dessutom bör slipspetsen ändras när epitelet inte längre avlägsnas effektivt. För det andra, medan zebrafiskhinnans struktur och morfologi liknar andra hornhinnor31, har detta djur regenerativa förmågor som saknar motstycke hos däggdjursorganismer 34,35,36. Medan sårförslutning i mus varar i 48-72 h 11,14,37, rapporteras en tidslinje på 3 timmar för zebrafisk. På grund av strukturella och molekylära likheter är det cellulära beteendet som induceras av ett fysiskt sår i hornhinnan förmodligen likartat hos de flesta ryggradsdjur. Det snabba svaret hos zebrafisk styrs dock förmodligen av en avancerad regenerativ mekanism som är specifik för det djuret.
Det beskrivna protokollet använder SEM för att spåra sårförslutning. Många andra studier har använt fluorescensmikroskopi istället för att spåra denna process 15,17,38. Användningen av SEM underlättar emellertid analysen av cellformmodifiering efter epitelnötning. Nackdelen med den tekniken är att stratifieringsstegen inte kan spåras, eftersom SEM endast tillåter avbildning av det mest yttre lagret. För att studera epitelet i 3D under full hornhinneläkning bör fluorescerande modeller, såsom Zebrabow39, eller immunmärkning användas.
Användningen av zebrafisk som en hornhinnesårläkningsmodell ökar undersökningsområdet eftersom det möjliggör tillämpning av många tillgängliga molekylära verktyg, såsom genetiskt modifierade fisklinjer, morfolinos och kemisk screening, för att avsevärt utöka det möjliga utbudet av hornhinnans sårläkningsstudier. Dessutom möjliggör zebrafiskögonens storlek utvecklingen av nya avbildningsstrategier för att studera epitelcelldynamiken i större detalj än vad som kan göras med murina ögon.
Huvudsyftet med denna rapport är inte bara att anpassa den fysiska hornhinnesåret till zebrafiskmodellen utan också att visa att användningen av nya modeller gör det möjligt att ställa och besvara nya frågor och pekar på nya sätt att undersöka grundläggande biologiska fenomen. Dessa fördelar kommer i slutändan att vara till nytta för patienterna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Pertti Panula för tillgången till zebrafiskenheten och Henri Koivula för vägledningen och hjälpen med zebrafiskexperimenten. Forskningen stöddes av Finlands Akademi, Jane och Aatos Erkkos Stiftelse, Finska kulturfonden och ATIP-Avenir-programmet. Avbildningen utfördes vid elektronmikroskopienheten och ljusmikroskopienheten, Institutet för bioteknik, med stöd av HiLIFE och Biocenter Finland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 | in-house | Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2 HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2 PO4 ). | |
| 0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 | in-house | Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2 HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2 PO4 ). | |
| 0.5mm burr tips | Alger Equipment Company | BU-5S | |
| 1M Tris, pH 8.8 | in-house | ||
| adhesive tabs | Agar Scientific | G3347N | |
| Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
| Cotton swaps | Heinz Herenz Hamburg | 1030128 | |
| Dissecting plate | in-house | ||
| Dissecting tools | Fine Science Tools | ||
| double-distilled water | in-house | ||
| Eppedorf tubes, 2ml | any provider | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | Caution: causes irritation. |
| Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I | Sigma | G7651 | Caution: toxic. |
| Lidocaine hydrochloride | Sigma | L5647 | Caution: toxic. |
| mounts | Agar Scientific | G301P | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| pH indicator strips | Macherey-Nagel | 92110 | |
| Plastic spoons | any provider | ||
| Plastic tubes, 15 ml | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Plastic tubes, 50 ml | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Scanning electron microscope | FEI | Quanta 250 FEG | |
| Soft sponge | any provider | ||
| Sputter coater | Quorum Technologies | GQ150TS | |
| Stereomicroscope | Leica |
References
- Baden, T., Euler, T., Berens, P. Understanding the retinal basis of vision across species. Nature Reviews.Neuroscience. 21 (1), 5-20 (2020).
- Nishida, T., Saika, S., Morishige, N. Cornea and sclera: Anatomy and physiology. Cornea: Fundamentals, diagnosis and management, 4th ed. Manis, M. J., Holland, E. J. , Elsevier. 1-22 (2017).
- Wilson, S. E., Liu, J. J., Mohan, R. R. Stromal-epithelial interactions in the cornea. Progress in Retinal and Eye Research. 18 (3), 293-309 (1999).
- Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
- Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
- West-Mays, J. A., Dwivedi, D. J. The keratocyte: corneal stromal cell with variable repair phenotypes. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 38 (10), 1625-1631 (2006).
- Ahmed, F., House, R. J., Feldman, B. H. Corneal abrasions and corneal foreign bodies. Primary Care. 42 (3), 363-375 (2015).
- Ben-Eli, H., Erdinest, N., Solomon, A. Pathogenesis and complications of chronic eye rubbing in ocular allergy. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 19 (5), 526-534 (2019).
- Wilson, S. A., Last, A. Management of corneal abrasions. American Family Physician. 70 (1), 123-128 (2004).
- Nagata, M., et al. JBP485 promotes corneal epithelial wound healing. Scientific Reports. 5, 14776 (2015).
- Wang, X., et al. MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress. Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).
- Li, F. J., et al. Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit. Experimental Eye Research. 147, 1-11 (2016).
- Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. Corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (137), e58071 (2018).
- Kalha, S., et al. Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing. Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).
- Park, M., et al. Visualizing the contribution of keratin-14(+) limbal epithelial precursors in corneal wound healing. Stem Cell Reports. 12 (1), 14-28 (2019).
- Kuony, A., et al. Ectodysplasin-A signaling is a key integrator in the lacrimal gland-cornea feedback loop. Development. 146 (14), (2019).
- Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).
- Ikkala, K., Michon, F., Stratoulias, V. Unilateral Zebrafish corneal injury induces bilateral cell plasticity supporting wound closure. Scientific Reports. , (2021).
- Ormerod, L. D., Abelson, M. B., Kenyon, K. R. Standard models of corneal injury using alkali-immersed filter discs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (10), 2148-2153 (1989).
- Anderson, C., Zhou, Q., Wang, S. An alkali-burn injury model of corneal neovascularization in the mouse. Journal of visualized experiments: JoVE. (86), e51159 (2014).
- Choi, H., et al. Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye. Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).
- Singh, P., Tyagi, M., Kumar, Y., Gupta, K. K., Sharma, P. D. Ocular chemical injuries and their management. Oman Journal of Ophthalmology. 6 (2), 83-86 (2013).
- Pal-Ghosh, S. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
- Chen, J. J., Tseng, S. C. Abnormal corneal epithelial wound healing in partial-thickness removal of limbal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (8), 2219-2233 (1991).
- Xeroudaki, M., Peebo, B., Germundsson, J., Fagerholm, P., Lagali, N. RGTA in corneal wound healing after transepithelial laser ablation in a rabbit model: a randomized, blinded, placebo-controlled study. Acta Ophthalmologica. 94 (7), 685-691 (2016).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio. , Available from: https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html (2000).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
- Crosson, C. E., Klyce, S. D., Beuerman, R. W. Epithelial wound closure in the rabbit cornea. A biphasic process. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (4), 464-473 (1986).
- Parlanti, P., et al. Axonal debris accumulates in corneal epithelial cells after intraepithelial corneal nerves are damaged: A focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) study. Experimental Eye Research. 194, 107998 (2020).
- Zhao, X. C., et al. The zebrafish cornea: structure and development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (10), 4341-4348 (2006).
- Richardson, R., et al. Re-epithelialization of cutaneous wounds in adult zebrafish combines mechanisms of wound closure in embryonic and adult mammals. Development. 143 (12), 2077-2088 (2016).
- van Loon, A. P., Erofeev, I. S., Maryshev, I. V., Goryachev, A. B., Sagasti, A. Cortical contraction drives the 3D patterning of epithelial cell surfaces. The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).
- Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. Journal of Neurobiology. 44 (3), 289-307 (2000).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
- Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. The Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
- Hu, X., et al. Sirt6 deficiency impairs corneal epithelial wound healing. Aging. 10 (8), 1932-1946 (2018).
- Ksander, B. R., et al. ABCB5 is a limbal stem cell gene required for corneal development and repair. Nature. 511 (7509), 353-357 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).
