Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ריפוי פצעים בקרנית דגי זברה: משחיקה לניתוח הדמיה לסגירת פצעים

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63605
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Institute of Biotechnology, HiLIFE, University of Helsinki, 2Institute for Neurosciences of Montpellier, Univ Montpellier

Summary

פרוטוקול זה מתמקד בפגיעה במשטח העין של דגי הזברה באמצעות שחיקה כדי להעריך את סגירת הפצעים הבאים ברמה התאית. גישה זו מנצלת בר עיני כדי להסיר חלקית את אפיתל הקרנית ומשתמשת במיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת כדי לעקוב אחר שינויים במורפולוגיה של התא במהלך סגירת הפצע.

Abstract

כמשטח השקוף של העין, הקרנית היא אינסטרומנטלית לראייה ברורה. בשל מיקומו, רקמה זו נוטה עלבונות סביבתיים. ואכן, פציעות העיניים הנתקלות לעתים קרובות ביותר מבחינה קלינית הן אלה לקרנית. בעוד שריפוי פצעי קרנית נחקר בהרחבה ביונקים קטנים (כלומר, עכברים, חולדות וארנבות), מחקרים בפיזיולוגיה של הקרנית הזניחו מינים אחרים, כולל דגי זברה, למרות שדגי זברה הם מודל מחקר קלאסי.

דו"ח זה מתאר שיטה לביצוע שחיקה בקרנית על דגי זברה. הפצע מבוצע ב vivo על דגים מרדימים באמצעות בר עינית. שיטה זו מאפשרת פצע אפיתל לשחזור, משאיר את שאר העין ללא פגע. לאחר שחיקה, סגירת הפצע מנוטרת במהלך 3 שעות, ולאחר מכן הפצע הוא reepithelialized. באמצעות סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים, ואחריו עיבוד תמונה, צורת תא האפיתל, בליטות apical ניתן לחקור כדי לחקור את השלבים השונים במהלך סגירת פצע אפיתל הקרנית.

המאפיינים של מודל דגי הזברה מאפשרים לחקור את הפיזיולוגיה של רקמת האפיתל ואת ההתנהגות הקולקטיבית של תאי האפיתל כאשר הרקמה מאותגרת. יתר על כן, השימוש במודל שנמנע מהשפעת סרט הדמעות יכול לייצר תשובות חדשות לגבי תגובת הקרנית ללחץ. לבסוף, מודל זה מאפשר גם את התיחום של האירועים התאיים והמולקולריים המעורבים בכל רקמת אפיתל הנתונה לפצע פיזי. שיטה זו יכולה להיות מיושמת להערכה של יעילות התרופה בבדיקות פרה קליניות.

Introduction

כמו רוב האפיתליה נמצאים במגע עם הסביבה החיצונית, הם נוטים לפגיעה גופנית, מה שהופך אותם מתאימים היטב לחקר תהליכי ריפוי הפצע. בין הרקמות הנחקרות היטב, הקרנית היא מודל שימושי ביותר בחקירת ההיבטים התאיים והמולקולריים של ריפוי פצעים. כמשטח חיצוני שקוף, הוא מספק הגנה פיזית לעין והוא האלמנט הראשון שממקד את האור ברשתית. בעוד המבנה והרכב התאים של הרשתית שונים בין מינים1, יסודות אלה של הקרנית דומים בדרך כלל בכל העיניים מסוג המצלמה, ללא קשר למינים.

הקרנית מורכבת משלוש שכבות עיקריות2. השכבה הראשונה והחיצונית ביותר היא האפיתל, המתחדש כל הזמן כדי להבטיח את שקיפותו. השכבה השנייה היא הסטרומה, המכילה תאים מפוזרים, הנקראים קרטוציטים, בתוך שכבה עבה של סיבי קולגן מאורגנים בקפדנות. השכבה השלישית והפנימית ביותר היא האנדותל, המאפשרת דיפוזיה תזונתית ונוזלית מהתא הקדמי לשכבות החיצוניות. תאי האפיתל והסטרומליים מתקשרים באמצעות גורמי גדילה וציטוקינים3. אינטראקציה זו מודגשת על ידי אפופטוזיס מהירה והתפשטות עוקבת של קרטוציטים לאחר פגיעה אפיתל 4,5. במקרה של פצע עמוק יותר, כגון ניקוב, קרטוציטים לוקחים חלק פעיל בתהליך הריפוי6.

להיות במגע עם הסביבה החיצונית, פציעות פיזיות הקרנית שכיחות. רבים מהם נגרמים על ידי חפצים זרים קטנים7, כגון חול או אבק. הרפלקס של שפשוף העיניים יכול להוביל לשריטות אפיתל נרחבות ושיפוץ הקרנית8. על פי גודל הפצע ועומקו, פציעות פיזיות אלה כואבות ולוקח כמה ימים לרפא9. מאפייני ריפוי הפצע האופטימליים של מודל מקלים על הבנת ההיבטים התאיים והמולקולריים של סגירת הפצע. יתר על כן, מודלים כאלה הוכיחו גם שימושי לבדיקת מולקולות חדשות עם פוטנציאל להאיץ את ריפוי הקרנית, כפי שהוכח בעבר10,11.

הפרוטוקול המתואר כאן נועד להשתמש בדגי זברה כמודל רלוונטי לחקר פגיעה גופנית בקרנית. מודל זה נוח מאוד למחקרי סינון פרמקולוגיים שכן הוא מאפשר להוסיף מולקולות ישירות למי הטנק, ולכן, לבוא במגע עם קרנית מרפאת. הפרטים המפורטים כאן יסייעו למדענים לבצע את מחקריהם על מודל דגי הזברה. הפציעה in vivo מבוצעת עם בר עיני קהה. ניתן לנתח את ההשפעה על תאי האפיתל הסמוכים או במרחק ממנו על ידי הסרה ספציפית של אפיתל הקרנית המרכזי. בשנים האחרונות, דיווחים רבים התמקדו בשיטה כזו על קרנית מכרסמים 12,13,14,15,16,17; עם זאת, עד כה, רק דו"ח אחד יישם שיטה זו על דגי זברה18.

בגלל הפשטות שלה, הפצע הפיזי שימושי בתיחום התפקיד של תאי אפיתל בסגירת הפצע. מודל מבוסס נוסף של פגיעה בקרנית הוא הכוויה הכימית, במיוחד לשרוף אלקלי 19,20,21. עם זאת, גישה כזו פוגעת בעקיפין בכל פני השטח של העין, כולל הקרנית ההיקפית וסטרומה הקרנית19. ואכן, כוויות אלקלי עלולות לגרום לכיבים בקרנית, ניקובים, אטימות אפיתל וניאווסקולריזציה מהירה22, והתוצאה הבלתי נשלטת של כוויות אלקליות פוסלת גישה זו למחקרי ריפוי פצעים כלליים. שיטות רבות אחרות משמשות גם כדי לחקור ריפוי פצעי קרנית על פי המוקד המסוים של המחקר המדובר (למשל, פסולת אפיתל מלאה23, שילוב של פגיעה כימית ומכאנית עבור פצעבעובי חלקי 24, אבלציה לייזר excimer עבור פצעים המשתרעים על סטרומה25). השימוש בבר עיני מגביל את המוקד לתגובת האפיתל לפצע ומספק פצע רב לשחזור.

כמו בכל שיטה של גרימת פצע, השימוש בר עינית יש יתרונות וחסרונות. החיסרון העיקרי הוא כי התגובה להיות בעיקר אפיתל, זה לא משקף באופן מושלם את השריטות לראות בסביבה הקלינית. עם זאת, לשיטה זו יש יתרונות רבים, כולל הקלות שבה ניתן להגדיר ולבצע אותה, הדיוק שלה, הרבייה שלה, והעובדה שהיא לא פולשנית, מה שהופך אותה לשיטה נסבלת היטב על ידי בעלי חיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי המועצה הלאומית לניסויים בבעלי חיים.

1. הכנות

  1. הכן את פתרון מניית tricaine המשמש להרדמה26 מראש (פתרון מלאי 0.4% המשמש בפרוטוקול זה). השתמש כפפות ולשמור את החומרים בברדס אדים במידת האפשר.
    1. עבור 50 מ"ל של פתרון 0.4%, לשקול 200 מ"ג של אבקת tricaine לתוך צינור 50 מ"ל. ממיסים את האבקה בכ-45 מ"ל של מים מזוקקים כפולה.
    2. התאם את ה- pH של פתרון מלאי הטרייקאין ל- 7 עם 1 M Tris (pH 8.8, ~ 1.25 מ"ל). הוסף את הפתרון Tris למניות tricaine ב aliquots, לערבב את המניה ביסודיות לאחר כל aliquot, ולבדוק את ה- pH לאחר כל תוספת של טריס.
  2. לפני הניסוי, להכין פתרון עבודה 0.02% של tricaine.
    1. להפשיר 2 מ"ל של 0.4% פתרון מלאי ולהוסיף 40 מ"ל של מי מערכת (ריכוז סופי 0.02%). מקם את הפתרון במיכל קטן.
  3. לפני הניסוי, הכינו את מי ההתאוששות המכילים משככי כאבים. השתמש בכפפות ולשמור את החומרים בברדס אדים במידת האפשר.
    1. עבור ליטר אחד של מי התאוששות, לשקול 2.5 מ"ג של אבקת הידרוכלוריד לידוקאין ולהמיס אותו במי מערכת מתוקים. בדוק את ה- pH והסתגל ל- 7 במידת הצורך.
  4. לפני הניסוי, להכין את פתרון התיקון (2.5% glutaraldehyde ב 0.1 M נתרן פוספט (Na-PO4) פתרון ב pH 7.4). השתמש בכפפות ולשמור את החומרים בברדס אדים.
    1. עבור 10 מ"ל של פתרון התיקון, פיפטה 5 מ"ל של 0.2 M Na-PO4 לתוך צינור. הוסיפו 0.5 מ"ל של 50% גלוטרדהיד, והוסיפו מים מזוקקים כפולים כדי להשיג את הנפח הסופי של 10 מ"ל. יש להגן על התמיסה מפני אור, ולשמור אותה על קרח או במקרר לפני השימוש.
      הערה: אם יש לאסוף דגימות במשך מספר שעות לאחר הפציעה, הכן את פתרון התיקון ממש לפני השימוש.
  5. הכינו את הציוד לפציעה (איור 1).
    1. מלא את מיכלי ההתאוששות או מיכלים קטנים יותר במי מערכת.
    2. תכין את בר העיניים. תבדוק שקצה הבר נקי. במידת הצורך, להסיר פסולת תאים עם צמר גפן לח.
    3. לעשות חתך לצד של ספוג רך, ולהרטיב את הספוג עם מי מערכת. מניחים את הספוג על הבסיס / השלב של מיקרוסקופ מנתח. ודאו מספיק מרחב עבודה לשימוש בבר ומספיק תאורה מהצדדים ו/או מלמעלה כדי לראות את פני השטח של העין כראוי.

2. הרדמה

  1. מעבירים דג מהמיכל לתמיסת הטרייקאין של 0.02% עם רשת בעדינות רבה ככל האפשר.
  2. לפקח על ההרדמה, בדיקת חוסר תגובה לגירוי מכני אור.
    הערה: להרדמה עקבית, נעשה שימוש בחשיפה של 2 דקות לטריקאין לפני שחיקה עם דגי AB בוגרים מסוג בר. עם דגים בעלי רקע גנטי אחר, ייתכן שיהיה צורך במשך זמן שונה.

3. שחיקה

  1. מניחים בעדינות את הדגים המרדים עם כף לתוך החתך על הספוג, ראש בולט מפני השטח ספוג.
  2. הפעל את הבר, ומקד את תצוגת המיקרוסקופ על פני השטח של העין.
  3. בזהירות להתקרב לפני השטח של העין עם קצה הבר. בעת נגיעה במשטח העין, התחל להזיז את קצה הבר על פני השטח של העין בתנועה מעגלית. הימנע תנועה פתאומית, כפי שהוא עלול להוביל את העין הטיה בשקע ואת קצה בר להחליק.
  4. כאשר השחיקה נעשית, בזהירות למקם את הדגים במי מערכת המכילים את משכך הכאבים להתאוששות.
  5. יש לנקות את הבר מיד לאחר השימוש עם צמר גפן לח.

4. איסוף דגימות

  1. בנקודת הזמן הרצויה, להרים את הדג עם רשת ולהניח אותו בתמיסת tricaine 0.02%. שמור על החיה בתמיסה עד שהתנועה האורקולרית תיפסק לחלוטין, והדגים לא יגיבו למגע.
  2. מניחים את הדג על צלחת פטרי עם כפית, ומחזיקים אותו עם פינצטה. לערוף את ראשם של הדגים עם מספריים מנתחים. הימנע ביצוע שריטות על פני השטח של העין בעת טיפול במדגם.
  3. שים את הרקמה לתוך צינור מדגם המכיל 0.1 M Na-PO4.
    1. לשטוף את הרקמה על ידי החלפת 0.1 M Na-PO4 עם חיץ נקי, כך שאין דם נשאר בתמיסה.

5. עיבוד מדגם למיקרוסקופיה אלקטרונית

  1. תקן את הרקמה ב 2.5% glutaraldehyde / 0.1 M Na-PO4 (pH 7.4) עבור ~ 24 שעות ב +4 °C (4 °F). שמור את המדגם על מחזיק מדגם מסתובב / רועד כדי להבטיח קיבעון נאות.
  2. הסר את פתרון התיקון ולשטוף את המדגם מספר פעמים עם 0.1 M Na-PO4.
  3. לנתח את המדגם בשלב זה.
    1. מניחים את הדגימה על טיפה של 0.1 M Na-PO4 על צלחת ניתוח. אם שתי העיניים מאותו דג חייבות להיות בתמונה, לחתוך את דגימת הראש לשניים עם מספריים מנתחים עדינים.
    2. לחלופין, לאסוף את העיניים רק על ידי הצבת בזהירות את קצות פינצטה בסדר לתוך ארובת העין מצד העין, תוך הקפדה נוספת לא לגרד את פני השטח של העין. לאחר מכן, למשוך את העין מהשקע.
    3. העבר את המדגם המנותח לתוך צינור המכיל 0.1 M Na-PO4. ודא שאין רקמה נוספת בצינור המדגם, כפי שהוא עשוי לדבוק בחלק העליון של העין במהלך עיבוד מדגם.
  4. אחסן את הדגימה ב- 0.1 M Na-PO4 (מקסימום שבוע אחד) בטמפרטורה של +4 °C (65 °F).
  5. לעבד את הדגימות להדמיית מיקרוסקופיה אלקטרונית.
    1. Postfix את הדגימות ב 2% אוסמיום tetroxide ב 0.1 M Na-PO4 חוצץ במשך 1 שעות בטמפרטורת החדר (RT).
    2. לשטוף את הדגימות 3 פעמים במשך 5 דקות כל לשטוף ב 0.1 M Na-PO4 ב RT.
    3. לייבש את הדגימות ברציפות ב 30%, 50%, ו 70% אתנול עבור 1 h בכל פתרון ב RT.
    4. לטבול את הדגימות ב 96% אתנול עבור 2-3 שעות ב RT.
    5. לאחר מכן, לדגור על הדגימות פעמיים ב 100% אתנול, תחילה עבור 1 h ולאחר מכן טרי 100% אתנול לילה ב +4 °C (60 °F).
    6. לחשוף את הדגימות ל 30 מחזורים במייבש אוטומטי נקודה קריטית.
  6. הטמע וציפוי פלטינה של הדגימות.
    1. מקם כרטיסיית דבק על תושבה. אם יש לסמן את הדגימה מעל הטעינה, השאר פיסת נייר שער של כרטיסיה בכרטיסיה וכתוב את המזהה לדוגמה על הנייר.
    2. מקם את הטעינה עם הכרטיסייה בבסיס מיקרוסקופ מנתח.
    3. מניחים בעדינות את דגימת הרקמה על ההר עם פינצטה עדינה, קרנית פונה כלפי מעלה.
    4. מצופה את הדגימה בפלטינה באמצעות המכשיר המתאים. לאחר הציפוי, יש לאחסן את הדגימות בטמפרטורת החדר עד להדמיה.

6. הדמיה (איור 2)

  1. הפעל את המכשירים כפי שמומלץ במדריך למשתמש ועל ידי מומחי הדמיה.
  2. רכשו תמונות של ההגדלה הרצויה והשתמשו בתמונות בגודל 2,000-2,500x לניתוח.
  3. התאם את הבהירות והניגודיות כך שלא יהיו אזורים עם חשיפת יתר בתמונה, וגבולות תאים ומיקרו-רידג'ים נראים בצורה ברורה ככל האפשר.
    הערה: המיקום והזווית של הרקמה משפיעים על הגדרות הבהירות והניגודיות. ייתכן שיהיה צורך להתאים אותם מדגם לדגימה ובין אזורים שונים של הרקמה.

7. מדידת צורת התא, גודל ותבנית המיקרורידג'

  1. פתח את תמונת TIFF בפיג'י ImageJ 1.5327. קבעו את קנה המידה באמצעות סרגל קנה המידה של התמונה: צרו קו בגודלו לסרגל קנה המידה בעזרת הכלי קו . בחר נתח | הגדר קנה מידה והקלד במרחק הידוע. פתיחת מנהל ההחזר על ההשקעה מתוך | הניתוח תפריט כלים .
  2. עבור גודל התא והעגלות, בחר נתח | הגדרת מידות | מתארי צורות. השתמשו בכלי זכוכית מגדלת כדי לראות את התאים תחת הגדלה. בחרו תאים בעזרת הכלי מצולע והוסיפו כל בחירה למנהל ההחזר על ההשקעה. לבסוף, מדוד את התאים שנבחרו ושמור את המדידה.
  3. ניתוח מיקרורידג' (איור 3 ואיור 4)
    1. ודא שהתמונה היא בתבנית של 8 סיביות | תמונה תפריט סוג .
    2. בחרו תא בעזרת הכלי מצולע , ונקו את הרקע מ'עריכה' | נקה בחוץ.
    3. החלקת התמונה פעם עד שלוש פעמים על-ידי בחירה באפשרות 'תהליך | החלק ולהתאים את הבהירות והניגודיות מ-Image | התאם | בהירות/ניגודיות כך שהמיקרורכסים יבלטו בצורה ברורה ככל האפשר.
    4. סובב את התמונה מתוך תהליך | מסננים | סובב, הפוך לקובץ בינארי מתהליך | | בינארי הפוך לקובץ בינארי והפוך את התמונה בשחור-לבן לשלד על-ידי בחירה באפשרות 'תהליך | | בינארי שלד.
    5. שימוש בפונקציה 'ניתוח שלד ' | 'ניתוח' תפריט שלד כדי למדוד את הפרמטרים microridge ולשמור את הערכים.
      הערה: ב-SEM, תמונות בודדות עשויות להיות שונות בבהירות ובנכדיות. לפיכך, השלבים בניתוח עשויים להזדקק להתאמות מתמונה לתמונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מחקר זה מתאר שיטה באמצעות בר עיניים בניסויי ריפוי פצעי קרנית דגי זברה. השיטה משתנה ממחקרים קודמים על עכברים, שם הוכח כי הבר מסיר את שכבות תאי האפיתל ביעילות13. האתגרים בפציעת קרנית דגי הזברה כוללים את גודלה הקטן יחסית של העין, ובמקרה של ניסויים הגוזלים זמן רב, הצורך לשמור על זרימת מים מתמדת דרך הזימים (כפי שתואר על ידי שו ועמיתיו28). היתרונות העיקריים של שיטה זו הם הפשטות והמהירות שלה. מיקרוסקופ ניתוח סטנדרטי משמש לשימוש מבוקר בבר (איור 1). מכיוון שההליך הוא של משך זמן קצר (כ -3 דקות מתחילת ההרדמה), הדגים להתאושש היטב מן הטיפול, ואין צורך בציוד נוסף לשמירה על הרדמה ואספקת חמצן.

ישנן מספר דרכים לדמיין את הפצע בקרנית. פרוטוקול זה משתמש במיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת (SEM, איור 2), שיש לה היסטוריה ארוכה של שימוש במחקרי קרנית29,30. למרות שגישה זו אינה מאפשרת הערכה של השכבות התחתונות של האפיתל, היא מספקת שיטה קלה להערכת מהירות ריפוי הפצע והשוואת משטחי הקרנית של אזורים שונים של העין. ב-3 שעות לאחר הפציעה, בזמן שאזור הפצע סגור (איור 2), האתר שבו מחוברים גבולות הפצע נותר גלוי (איור 2).

התאים השטחיים על קרנית דגי הזברה מכילים מיקרורידג'ים בולטים31. לאחרונה, מחקר דיווח על מבנים אלה שאבדו בתאים מוארכים הסמוכים לפצעים על עור דגי זברה32. עם זאת, התוצאות המוצגות מראות כי על אפיתל קרנית משופשף, מיקרורידג'ים ניתן לראות בכמה תאים מוארכים ליד אתר הפצע (איור 4B). באזורים פריפריאליים מסוימים, המיקרורידג'ים הולכים לאיבוד ממרכז התא (איור 4C,D). לניתוח מפורט יותר, אזור התא האפילי והעגלות מכמתים, בנוסף לכמות המיקרורידג' והאורך הממוצע ב-ImageJ27 (איור 3 ואיור 4E-H).

ניתוח המיקרורידג' נעשה באמצעות פונקציית השלד (שונה מוואן לון ועמיתיו33). השוואה בין שני האזורים ההיקפיים (איור 4A (אזורים C ו-D), איור 4C ואיור 4D) מגלה שהתאים באיור 4D מוארכים יותר (מה שמצביע על סידור מחדש של תאים כתגובה לפציעה) ויש להם מיקרורכסים ממוצעים קצרים יותר מאשר תאים באיור 4C. תוצאה זו מצביעה על כך שהשינוי בצורת התא מתואם עם שינוי המיקרורידג 'ומדגיש את ההטרוגניות בתוך אפיתל הקרנית בתגובת הפצע.

מדידת אזור התא האפילי והעגלות בתמונות SEM היא דרך פשוטה וניתנת לשחזור לקבלת נתונים כמותיים על מראה התא באזורים שונים של הקרנית. למרות שהיא מוגבלת לדו-ממד, גישה זו מסייעת להשיג הבנה כוללת של הדינמיקה והמהירות של סידור מחדש של תאים במהלך סגירת פצעים. תמונות ה- SEM משמשות לניתוח דפוסי המיקרורידג ' על פני התא האפילי. עיבוד התמונה המתואר כאן נותן קירוב של השינויים בפרמטרים microridge, אשר יהיה מייגע למדוד ביד.

Figure 1
איור 1: ההתקנה לשחיקה בקרנית. (A) מיקרוסקופ ניתוח נחוץ לשחיקה מבוקרת בעין דגי הזברה הקטנה. (B) הספוג מסייע לייצב את הדגים המרדים במהלך ההליך. (ג) הדג מורדם על צלחת פטרי, והחיה המרדים מועברת לספוג עם כף קטנה. בר עיני עם קצה 0.5 מ"מ משמש לשחיקה של הקרנית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הדמיה של הקרנית הפצועה באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת. הסקירה של הקרנית המשופשפת שנאספה ב 0, 1, 2, או 3 שעות לאחר הפצע (HPW). קו המתאר המקווקו מציין את גבול הפצע. סרגלי קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: דוגמה לשינוי התמונה לפני מדידת מיקרורידג'. למרות שלא העתק מדויק של משטח התא המקורי, תבנית השלד הסופית לוכדת את ההבדלים בין מרכז התא לפריפריה. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: השוואה בין ערכי אזור התא האפי, העגולות והמיקרורידג' בין שני אזורים היקפיים לאחר שחיקה בקרנית. (A) סקירה כללית של העין הפצועה. התיבות מציינות את המיקום של תמונות ההגדלה הגבוהות יותר (ב - B, C ו - D). (ג, ד) תאים שנבחרו לניתוח מתאר צורה מסומנים בחלוקה לרמות ירוקה. (ה, נ) ערכי אזור תא אפי (E) ועגלות (F) של תאים נבחרים. (ז, ח) האורך הכולל של Microridge (G) והאורך הממוצע (H) של אותם תאים. קבוצות הושוו סטטיסטית עם מבחן t דו-זנבי (*p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01) סרגלי קנה מידה = 500 מיקרומטר ב - A, 50 מיקרומטר ב - B, C ו - D. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פציעות גופניות בקרנית הן הגורם הנפוץ ביותר לביקורי חולי עיניים בבית החולים. לכן, חשוב להקים מודלים רלוונטיים לחקר היבטים שונים של פתולוגיה הקרנית. עד כה, העכבר הוא המודל הנפוץ ביותר לחקר ריפוי פצעי הקרנית. עם זאת, הוספת טיפות עיניים על עיניים פגועות מורין כדי לאמת את ההשפעה של תרופות ספציפיות על ריפוי פצע הקרנית יכול להיות קשה. מבחינה זו, מודל דגי הזברה שימושי במיוחד להקרנה פרמקולוגית של מולקולות המשפיעות על ריפוי פצעי הקרנית. השיטה המתוארת כאן דומה מאוד לזו המתוארת בעכבר13.

עם זאת, יש לזכור שתי נקודות שונות ספציפיות. ראשית, השימוש בבר עיניים דורש תרגול כדי להבטיח רבייה של הפצע, במיוחד ביחס ללחץ המופעל על העין, שהוא קריטי לשחיקה נכונה. בנוסף, יש לשנות את הקצה השחוק כאשר האפיתל כבר לא מוסר ביעילות. שנית, בעוד המבנה והמורפולוגיה של קרנית דגי הזברה דומים לקרניות אחרות31, בעל חיים זה בעל יכולות התחדשות שאין כמותן באורגניזמים יונקים 34,35,36. בעוד סגירת הפצע בעכבר נמשכת 48-72 שעות 11,14,37, ציר זמן של 3 שעות מדווח עבור דגי זברה. בשל דמיון מבני ומולקולרי, ההתנהגות התאית הנגרמת על ידי פצע פיזי בקרנית דומה כנראה ברוב בעלי החוליות. עם זאת, התגובה המהירה בדגי זברה מונחית ככל הנראה על ידי מנגנון התחדשות מתקדם הספציפי לאותו בעל חיים.

הפרוטוקול המתואר משתמש ב- SEM כדי לעקוב אחר סגירת הפצע. מחקרים רבים אחרים השתמשו מיקרוסקופיה פלואורסצנטית במקום כדי לעקוב אחר תהליך זה 15,17,38. עם זאת, השימוש ב- SEM מקל על ניתוח שינוי צורת התא בעקבות שחיקה אפיתל. החיסרון של טכנולוגיה זו הוא כי לא ניתן לעקוב אחר שלבי הריבוד, שכן SEM מאפשר רק הדמיה של השכבה החיצונית ביותר. כדי לחקור את האפיתל בתלת-ממד במהלך ריפוי מלא בקרנית, יש להשתמש במודלים פלואורסצנטיים, כגון זברבו39, או אימונובליבלינג.

השימוש בדגי זברה כמודל לריפוי פצעי קרנית משפר את היקף החקירה מכיוון שהוא מאפשר ליישום של כלים מולקולריים רבים הזמינים, כגון קווי דגים מהונדסים גנטית, מורפולינוס וסינון כימי, כדי להרחיב באופן משמעותי את הטווח האפשרי של מחקרי ריפוי פצעי קרנית. יתר על כן, גודל העיניים של דגי הזברה מאפשר פיתוח של אסטרטגיות הדמיה חדשות לחקר הדינמיקה של תאי האפיתל בפירוט רב יותר ממה שניתן לעשות עם עיני מורין.

המטרה העיקרית של דו"ח זה היא לא רק להתאים את הגישה הפיזית של פגיעה בקרנית למודל דגי הזברה, אלא גם להוכיח שהשימוש במודלים חדשים מאפשר לשאול שאלות חדשות ולענות עליהן ומצביע על דרכים חדשות לחקור תופעות ביולוגיות בסיסיות. יתרונות אלה בסופו של דבר יועילו למטופלים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים לפרטי פנולה על הגישה ליחידת דגי הזברה ולהנרי קויבולה על ההדרכה והעזרה בניסויי דגי הזברה. מחקר זה נתמך על ידי האקדמיה של פינלנד, קרן ג'יין ואטוס ארקו, קרן התרבות הפינית ותוכנית ATIP-Avenir. ההדמיה בוצעה ביחידת מיקרוסקופיית האלקטרונים וביחידת מיקרוסקופיית האור, המכון לביוטכנולוגיה, בתמיכת HiLIFE וביו סנטר פינלנד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 in-house Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2 HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2 PO4 ).
0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 in-house Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2 HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2 PO4 ).
0.5mm burr tips Alger Equipment Company BU-5S
1M Tris, pH 8.8 in-house
adhesive tabs Agar Scientific G3347N
Algerbrush burr, Complete instrument Alger Equipment Company BR2-5
Cotton swaps Heinz Herenz Hamburg 1030128
Dissecting plate in-house
Dissecting tools Fine Science Tools
double-distilled water in-house
Eppedorf tubes, 2ml any provider
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma A5040 Caution: causes irritation.
Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I Sigma G7651 Caution: toxic.
Lidocaine hydrochloride Sigma L5647 Caution: toxic.
mounts Agar Scientific G301P
Petri dish Thermo Scientific 101VR20
pH indicator strips Macherey-Nagel 92110
Plastic spoons any provider
Plastic tubes, 15 ml Greiner Bio-One 188271
Plastic tubes, 50 ml Greiner Bio-One 227261
Scanning electron microscope FEI Quanta 250 FEG
Soft sponge any provider
Sputter coater Quorum Technologies GQ150TS
Stereomicroscope Leica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baden, T., Euler, T., Berens, P. Understanding the retinal basis of vision across species. Nature Reviews.Neuroscience. 21 (1), 5-20 (2020).
  2. Nishida, T., Saika, S., Morishige, N. Cornea and sclera: Anatomy and physiology. Cornea: Fundamentals, diagnosis and management, 4th ed. Manis, M. J., Holland, E. J. , Elsevier. 1-22 (2017).
  3. Wilson, S. E., Liu, J. J., Mohan, R. R. Stromal-epithelial interactions in the cornea. Progress in Retinal and Eye Research. 18 (3), 293-309 (1999).
  4. Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
  5. Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  6. West-Mays, J. A., Dwivedi, D. J. The keratocyte: corneal stromal cell with variable repair phenotypes. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 38 (10), 1625-1631 (2006).
  7. Ahmed, F., House, R. J., Feldman, B. H. Corneal abrasions and corneal foreign bodies. Primary Care. 42 (3), 363-375 (2015).
  8. Ben-Eli, H., Erdinest, N., Solomon, A. Pathogenesis and complications of chronic eye rubbing in ocular allergy. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 19 (5), 526-534 (2019).
  9. Wilson, S. A., Last, A. Management of corneal abrasions. American Family Physician. 70 (1), 123-128 (2004).
  10. Nagata, M., et al. JBP485 promotes corneal epithelial wound healing. Scientific Reports. 5, 14776 (2015).
  11. Wang, X., et al. MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress. Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).
  12. Li, F. J., et al. Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit. Experimental Eye Research. 147, 1-11 (2016).
  13. Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. Corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (137), e58071 (2018).
  14. Kalha, S., et al. Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing. Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).
  15. Park, M., et al. Visualizing the contribution of keratin-14(+) limbal epithelial precursors in corneal wound healing. Stem Cell Reports. 12 (1), 14-28 (2019).
  16. Kuony, A., et al. Ectodysplasin-A signaling is a key integrator in the lacrimal gland-cornea feedback loop. Development. 146 (14), (2019).
  17. Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).
  18. Ikkala, K., Michon, F., Stratoulias, V. Unilateral Zebrafish corneal injury induces bilateral cell plasticity supporting wound closure. Scientific Reports. , (2021).
  19. Ormerod, L. D., Abelson, M. B., Kenyon, K. R. Standard models of corneal injury using alkali-immersed filter discs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (10), 2148-2153 (1989).
  20. Anderson, C., Zhou, Q., Wang, S. An alkali-burn injury model of corneal neovascularization in the mouse. Journal of visualized experiments: JoVE. (86), e51159 (2014).
  21. Choi, H., et al. Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye. Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).
  22. Singh, P., Tyagi, M., Kumar, Y., Gupta, K. K., Sharma, P. D. Ocular chemical injuries and their management. Oman Journal of Ophthalmology. 6 (2), 83-86 (2013).
  23. Pal-Ghosh, S. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  24. Chen, J. J., Tseng, S. C. Abnormal corneal epithelial wound healing in partial-thickness removal of limbal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (8), 2219-2233 (1991).
  25. Xeroudaki, M., Peebo, B., Germundsson, J., Fagerholm, P., Lagali, N. RGTA in corneal wound healing after transepithelial laser ablation in a rabbit model: a randomized, blinded, placebo-controlled study. Acta Ophthalmologica. 94 (7), 685-691 (2016).
  26. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio. , Available from: https://zfinorg/zf_info/zfbook/zfbk.html (2000).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
  29. Crosson, C. E., Klyce, S. D., Beuerman, R. W. Epithelial wound closure in the rabbit cornea. A biphasic process. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (4), 464-473 (1986).
  30. Parlanti, P., et al. Axonal debris accumulates in corneal epithelial cells after intraepithelial corneal nerves are damaged: A focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) study. Experimental Eye Research. 194, 107998 (2020).
  31. Zhao, X. C., et al. The zebrafish cornea: structure and development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (10), 4341-4348 (2006).
  32. Richardson, R., et al. Re-epithelialization of cutaneous wounds in adult zebrafish combines mechanisms of wound closure in embryonic and adult mammals. Development. 143 (12), 2077-2088 (2016).
  33. van Loon, A. P., Erofeev, I. S., Maryshev, I. V., Goryachev, A. B., Sagasti, A. Cortical contraction drives the 3D patterning of epithelial cell surfaces. The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).
  34. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. Journal of Neurobiology. 44 (3), 289-307 (2000).
  35. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  36. Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. The Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
  37. Hu, X., et al. Sirt6 deficiency impairs corneal epithelial wound healing. Aging. 10 (8), 1932-1946 (2018).
  38. Ksander, B. R., et al. ABCB5 is a limbal stem cell gene required for corneal development and repair. Nature. 511 (7509), 353-357 (2014).
  39. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).

Tags

ביולוגיה גיליון 181 קרנית אפיתל שחיקה בר עינית סגירת פצעים SEM דגי זברה.
ריפוי פצעים בקרנית דגי זברה: משחיקה לניתוח הדמיה לסגירת פצעים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ikkala, K., Raatikainen, S., Michon, … More

Ikkala, K., Raatikainen, S., Michon, F. Zebrafish Corneal Wound Healing: From Abrasion to Wound Closure Imaging Analysis. J. Vis. Exp. (181), e63605, doi:10.3791/63605 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter