Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحديد كمي على المستوى العالمي لتعديلات ما بعد الترجمة Histone في نموذج زراعة الخلايا 3D للأنسجة الكبدية

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63606
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry, Albert Einstein College of Medicine

Summary

يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام نظام زراعة الخلايا ثلاثي الأبعاد لنمذجة ومعالجة وتحليل تعديلات الكروماتين في حالة شبه فسيولوجية.

Abstract

تعتبر المزارع المسطحة لخلايا الثدييات نهجا يستخدم على نطاق واسع في المختبر لفهم فسيولوجيا الخلية ، ولكن هذا النظام محدود في نمذجة الأنسجة الصلبة بسبب تكاثر الخلايا السريع بشكل غير طبيعي. هذا أمر صعب بشكل خاص عند نمذجة الكروماتين الناضج ، حيث أن الخلايا سريعة التكرار تشارك في كثير من الأحيان في تكرار الحمض النووي ولها مجموعة متعددة الصبغيات غير متجانسة. فيما يلي سير عمل لنمذجة ومعالجة وتحليل تعديلات الكروماتين الهادئة باستخدام نظام زراعة الخلايا ثلاثي الأبعاد (3D). باستخدام هذا البروتوكول ، تزرع خطوط خلايا سرطان الخلايا الكبدية ككرويات 3D قابلة للتكرار في حاضنة توفر انتشارا نشطا للمغذيات وقوى قص منخفضة. أدى العلاج ببوتيرات الصوديوم وسكسينات الصوديوم إلى زيادة في أسيتيلات الهيستون والسكسينيلات، على التوالي. ترتبط الزيادات في مستويات أسيتيلات الهيستون والسكسينيال بحالة كروماتين أكثر انفتاحا. ثم يتم جمع الكرويات لعزل نوى الخلايا، والتي يتم استخراج بروتينات الهيستون منها لتحليل تعديلاتها بعد الانتقالية. يتم إجراء تحليل Histone عبر الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي الترادف عبر الإنترنت ، يليه خط أنابيب حسابي داخلي. وأخيرا ، يتم عرض أمثلة على تمثيل البيانات للتحقيق في تواتر وحدوث علامات الهستون التوافقية.

Introduction

منذ أواخرالقرن 19 ، تم استخدام أنظمة زراعة الخلايا كنموذج لدراسة نمو وتطور الخلايا خارج جسم الإنسان 1,2. كما تم توسيع استخدامها لدراسة كيفية عمل الأنسجة والأعضاء في كل من السياقات الصحية والمريضة 1,3. تنمو الخلايا المعلقة (مثل خلايا الدم) في أطباق بتري أو قوارير بسلاسة وتبادل لأنها لا تتجمع في هياكل ثلاثية الأبعاد (3D) في الجسم الحي. يمكن أن تنمو الخلايا المشتقة من الأعضاء الصلبة إما في أنظمة ثقافة ثنائية الأبعاد (2D) أو 3D. في ثقافة 2D ، تزرع الخلايا في طبقة أحادية تلتصق بسطح مستو 2,4. تتميز أنظمة زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد بالنمو الأسي ووقت المضاعفة السريع ، وعادة ما يكون 24 ساعة إلى بضعة أيام5. تنمو الخلايا في أنظمة 3D لتشكيل تفاعلات معقدة بين الخلايا الخلوية ونمذجة التكتلات الشبيهة بالأنسجة بشكل أوثق ، وتتميز بقدرتها على الوصول إلى توازن ديناميكي حيث يمكن أن يصل وقت مضاعفتها إلى 1 شهر أو أكثر5.

تقدم في هذه الورقة منهجية مبتكرة لزراعة كرويات ثلاثية الأبعاد في أنظمة زراعة الخلايا الدوارة التي تحاكي انخفاض الجاذبية6. هذا هو مشتق مبسط من نظام زراعة الخلايا التي قدمتها ناسا في 1990s7. يقلل هذا النهج من قوى القص ، التي تحدث في الطرق الحالية مثل قوارير الغزل ، ويزيد من قابلية التكاثر الكروي6. بالإضافة إلى ذلك ، يزيد المفاعل الحيوي الدوار من انتشار المغذيات النشط ، مما يقلل من تكوين الميت الذي يحدث في أنظمة مثل زراعة الخلايا المتساقطة المعلقة حيث يكون تبادل الوسائط غير عملي6. بهذه الطريقة ، تنمو الخلايا في الغالب دون عائق ، مما يسمح بتكوين الخصائص الهيكلية والفسيولوجية المرتبطة بالخلايا التي تنمو في الأنسجة. خلايا الكبد C3A (HepG2 / C3A) المستزرعة بهذه الطريقة لم يكن لديها عضيات فوق هيكلية فحسب ، بل أنتجت أيضا كميات من ATP و adenylate kinase و urea و cholesterol مماثلة للمستويات التي لوحظت في الجسم الحي 1,2. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر الخلايا المزروعة في أنظمة زراعة الخلايا 2D مقابل .3D أنماط مختلفة للتعبير الجيني8. أظهر تحليل التعبير الجيني لخلايا الكبد C3A المزروعة على شكل كرويات ثلاثية الأبعاد أن هذه الخلايا عبرت عن مجموعة واسعة من البروتينات الخاصة بالكبد ، بالإضافة إلى الجينات المشاركة في المسارات الرئيسية التي تنظم وظائف الكبد8. أظهرت المنشورات السابقة الاختلافات بين بروتينات الخلايا التي تنمو بشكل كبير في ثقافة 2D مقابل الخلايا في التوازن الديناميكي في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد5. وتشمل هذه الاختلافات التمثيل الغذائي الخلوي ، والذي بدوره يؤثر على بنية ووظيفة وفسيولوجيا الخلية5. كان بروتين الخلايا المزروعة في ثقافة 2D أكثر ثراء في البروتينات المشاركة في تكرار الخلايا ، في حين أن بروتينات الكرويات ثلاثية الأبعاد كانت أكثر ثراء في وظائف الكبد5.

معدل النسخ المتماثل الأبطأ للخلايا المزروعة ككرويات 3D نماذج أكثر دقة لظواهر محددة مرتبطة بحالة الكروماتين والتعديلات (على سبيل المثال قص هيستون9). قص هيستون هو تعديل هيستون ما بعد الترجمة (PTM) لا رجعة فيه يسبب انقساما بروتينيا لجزء من ذيل هيستون N-terminal. في حين أن وظيفته البيولوجية لا تزال قيد المناقشة10،11،12،13 ، فمن الواضح أن وجوده في الخلايا الأولية وأنسجة الكبد تم تصميمه بواسطة خلايا HepG2 / C3A التي تنمو كروية ، ولكن ليس كخلايا مسطحة9. هذا أمر بالغ الأهمية ، حيث أن حالة الكروماتين والتعديلات تنظم قراءة الحمض النووي في الغالب عن طريق تعديل إمكانية الوصول إلى الجينات وبالتالي التعبير عنها14. تؤثر PTMs الهيستون إما على حالة الكروماتين بشكل مباشر من خلال التأثير على الشحنة الصافية للنيوكليوسومات حيث يتم تجميع الهيستونات ، أو بشكل غير مباشر عن طريق تجنيد كتاب الكروماتين والقراء والممحاة14. تم تحديد المئات من PTMs هيستون حتى الآن15 ، مما يعزز الفرضية القائلة بأن الكروماتين يستضيف "رمز هيستون" تستخدمه الخلية لتفسير الحمض النووي16. ومع ذلك ، فإن تحديد عدد لا يحصى من مجموعات PTM15 ، واكتشاف أن مجموعات من PTMs هيستون غالبا ما يكون لها وظائف بيولوجية مختلفة عن PTMs الموجودة في عزلة (مثل Fischle ، et al.17) ، يسلط الضوء على أن هناك حاجة إلى مزيد من العمل لفك تشفير "شفرة هيستون".

في الوقت الحالي ، يعتمد تحليل PTM للهيستون إما على تقنيات تستخدم الأجسام المضادة (على سبيل المثال ، البقع الغربية ، أو التألق المناعي ، أو الترسيب المناعي للكروماتين متبوعا بالتسلسل [ChIP-seq]) أو قياس الطيف الكتلي (MS). تتمتع التقنيات القائمة على الأجسام المضادة بحساسية عالية ويمكن أن توفر معلومات مفصلة حول توطين علامات الهستون على نطاق الجينوم ولكنها غالبا ما تكون محدودة في دراسة PTMs النادرة أو PTMs الموجودة في مجموعات18،19،20. التصلب المتعدد هو أكثر ملاءمة لتحديد وقياس تعديلات البروتين المفردة والمتعايشة ذات الإنتاجية العالية وغير المتحيزة ، وخاصة بروتينات الهيستون18،19،20. لهذه الأسباب ، قام هذا المختبرات والعديد من المختبرات الأخرى بتحسين خط أنابيب MS لتحليل ببتيدات الهيستون (MS من أسفل إلى أعلى) ، وذيول الهيستون السليمة (MS من منتصف إلى أسفل) ، وبروتينات الهيستون كاملة الطول (MS من أعلى إلى أسفل) 21،22،23.

فيما يلي سير عمل لزراعة الكرويات HepG2 / C3A وإعدادها لتحليل ببتيد الهيستون (MS من أسفل إلى أعلى) عبر كروماتوغرافيا نانو سائلة ، مقترنة عبر الإنترنت بقياس الطيف الكتلي الترادف (NLC-MS / MS). نمت زراعة خلايا ثنائية الأبعاد وتم حصاد الخلايا ونقلها إلى مفاعل حيوي حيث ستبدأ في تكوين كرويات (الشكل 1). بعد 18 يوما في الثقافة، عولجت الكرويات ببوتيرات الصوديوم أو سكسينات الصوديوم لزيادة الوفرة النسبية لأسيتيلات الهيستون والسكسينيلات. والجدير بالذكر أن الثقافات 3D يمكن معالجتها بالمركبات السامة للوراثة تماما وكذلك نظيراتها من الثقافة المسطحة. في الواقع ، تسلط المنشورات الحديثة الضوء على أن استجابة علم السموم للخلايا في ثقافة 3D تشبه الأنسجة الأولية أكثر من تلك الموجودة في الثقافة المسطحة ثنائية الأبعاد24,25. ثم تم جمع الخلايا في نقاط زمنية محددة وتم إجراء العزل النووي. ثم تم استخراج الهيستونات واشتقاقها بأنهيدريد البروبيونيك قبل وبعد هضم التربسين وفقا لبروتوكول طوره غارسيا وآخرون لأول مرة.26. يولد هذا الإجراء ببتيدات ذات حجم مناسب للفصل عبر الإنترنت باستخدام كروماتوغرافيا الطور المعكوس (C18) والكشف عنها باستخدام MS. وأخيرا، تم تحديد ببتيدات الهيستون وتحديدها كميا، وتم تمثيل البيانات التي تم إنشاؤها بطرق متعددة من أجل تفسير بيولوجي أكثر اكتمالا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد المخازن المؤقتة والكواشف

  1. وسائط نمو الخلايا (لخلايا HepG2 / C3A): أضف مصل البقر الجنيني (FBS) (10٪ v / v) ، والأحماض الأمينية غير الأساسية (1٪ v / v) ، وملحق L-glutamine (1٪ v / v) والبنسلين / الستربتومايسين (0.5٪ v / v) إلى Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM ، الذي يحتوي على 4.5 جم / لتر من الجلوكوز). يتم تخزين وسائط النمو في 4 درجات مئوية لمدة أقصاها 2 أسابيع.
  2. محلول بوتيرات الصوديوم (NaBut) 200 mM: لإعداد 10 مل ، أعد تعليق 220.18 ملغ من Nabut في 10 مل من ddH2O. قم بتخزين 1 مل من الأليكوتات عند -20 درجة مئوية. قبل معالجة الخلايا ، قم بتصفية المحلول باستخدام مرشح حقنة 0.45 مم وأضف 1 مل من المحلول المصفى إلى 9 مل من وسائط نمو الخلايا للحصول على تركيز عمل يبلغ 20 ملليمتر.
  3. محلول سكسينات الصوديوم 100 mM (NaSuc): لإعداد 10 مل ، أعد تعليق 162.05 ملغ من NaSuc في 10 مل من ddH2O. قم بتخزين 1 مل من الأليكوتات عند -20 درجة مئوية. قبل معالجة الخلايا ، قم بتصفية المحلول باستخدام مرشح حقنة 0.45 مم وأضف 1 مل من المحلول المصفى إلى 9 مل من وسائط نمو الخلايا للحصول على تركيز عمل يبلغ 10 ملليمتر.
  4. بارد 0.2 م H 2 SO4: لتحضير 1 لتر ، أضف 10 مل من H2SO المركز4 إلى 990 مل من الماء HPLC الصف. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  5. الأسيتون البارد + 0.1٪ حمض الهيدروكلوريك (HCl): أضف HCl المركز (0.1٪ v / v) إلى الأسيتون. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  6. محلول 100 mM NH 4HCO 3 ، الرقم الهيدروجيني 8.0: لإعداد 1 لتر ، أعد تعليق 7.91 جم من NH4HCO3 في 1 لتر من الماء HPLC الصف. تخزين 50 مل من الأليكوت في -20 درجة مئوية.
  7. محلول حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) بنسبة 0.1٪: أضف TFA المركز (0.1٪ v / v) إلى الماء HPLC الصف. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  8. 60٪ الأسيتونيتريل / 0.1٪ حل TFA: أضف الأسيتونيتريل من الدرجة HPLC (60٪ v / v) إلى الماء HPLC الصف. ثم أضف TFA مركزا (0.1٪ v / v) إلى هذا الحل. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  9. 2٪ أسيتونيتريل من الدرجة HPLC + 0.1٪ حمض الفورميك: أضف الأسيتونيتريل من الدرجة HPLC (2٪ v / v) إلى الماء HPLC-grade. ثم أضف حمض الفورميك المركز (0.1٪ v / v) إلى هذا المحلول.
  10. 80٪ أسيتونيتريل من الدرجة HPLC + 0.1٪ حمض الفورميك: أضف الأسيتونيتريل من الدرجة HPLC (80٪ v / v) إلى الماء HPLC-grade. ثم أضف حمض الفورميك المركز (0.1٪ v / v) إلى هذا المحلول.

2. إعداد نظام الثقافة ثلاثية الأبعاد

ملاحظة: الخلايا المختلفة، الأولية أو الخالدة، لها خصائص استزراع مختلفة، لذلك قد يختلف تكوين الكرويات بين أنواع الخلايا. تم إنشاء هذا البروتوكول لتشكيل كروية HepG2 / C3A باستخدام المفاعلات الحيوية ونظام مبتكر لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد.

  1. باستخدام وسائط النمو القياسية ، تنمو الخلايا كطبقة أحادية حتى تلتقي بنسبة 80٪.
  2. اغسل الخلايا باستخدام HBSS (5 مل لقارورة 75 سم 2) واحتضن الخلايا ب 5 مل من 0.05٪ من التربسين-EDTA المخفف في HBSS (تخفيف 1: 2) لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئويةمع 5٪ CO2.
  3. تحقق من انفصال الخلايا تحت المجهر وقم بتحييد التربسين عن طريق إضافة 3 مل من مصل البقر الجنيني (FBS) أو وسائط النمو (التي تحتوي على 5٪ -10٪ FBS).
  4. عد عدد الخلايا وقم بتخفيف تعليق الخلية للحصول على 1 × 106 خلايا في حجم أقصى يبلغ 1.5 مل.
  5. قم بموازنة لوحة سفلية مستديرة ذات 24 بئرا منخفضة للغاية (تحتوي على آبار صغيرة متعددة لكل بئر) عن طريق غسل الآبار ب 0.5 مل من وسائط النمو. قم بطرد مركزي للصفيحة لمدة 5 دقائق عند 3000 × g لإزالة فقاعات الهواء من سطح البئر.
  6. انقل تعليق الخلية إلى اللوحة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 120 × جم.
  7. احتضن اللوحة لمدة 24 ساعة عند 37 درجةمئوية مع 5٪ CO2 لتشكيل كروية. وفي الوقت نفسه ، قم بموازنة المفاعل الحيوي عن طريق ملء غرفة الرطوبة ب 25 مل من الماء المعقم وغرفة الخلية ب 9 مل من وسائط النمو.
  8. احتضان المفاعل الحيوي ، بالتناوب في حاضنة clinostat ، لمدة 24 ساعة عند 37 درجةمئوية مع 5٪ CO2.

3. نمو الكرويات في المفاعلات الحيوية

ملاحظة: للحفاظ على بنية الكرويات ، يتم استخدام نصائح تجويف واسعة للتعامل مع هياكل 3D.

  1. افصل الكرويات عن لوحة المرفقات المنخفضة للغاية عن طريق السحب بلطف لأعلى ولأسفل باستخدام أطراف تجويف عريضة 1 مل ونقلها إلى طبق معالج بزراعة الأنسجة.
  2. اغسل الطبق ب 0.5 مل من وسائط النمو المسخنة مسبقا وانقلها إلى نفس الطبق.
  3. تقييم جودة الكرويات عن طريق الفحص المجهري واختيار الكرويات المشكلة بما فيه الكفاية. الكرويات ذات النوعية الجيدة لها حجم موحد ، والاكتناز ، والاستدارة.
  4. نقل الكرويات إلى مفاعلات حيوية متوازنة مليئة ب 5 مل من وسائط النمو الجديدة. بعد نقل الكرويات ، املأ المفاعل الحيوي بالكامل بوسائط نمو جديدة.
  5. ضع المفاعل الحيوي في حاضنة الكلينوستات واضبط سرعة الدوران إلى 10-11 دورة في الدقيقة.
  6. تبادل وسائط النمو كل 2-3 أيام عن طريق إزالة 10 مل من الوسائط القديمة واستبدالها ب 10 مل من الوسائط الجديدة.
  7. اضبط سرعة الدوران وفقا للنمو الكروي ، ويزداد مع نمو الكرويات في الحجم والعدد.
  8. بعد 18 يوما في الثقافة ، تكون الكرويات جاهزة للعلاج و / أو الجمع

4. العلاج الكروي وجمع

ملاحظة: في هذا البروتوكول ، يتم التعامل مع الكرويات HepG2 / C3A مع بوتيرات الصوديوم (NaBut) وسكسينات الصوديوم (NaSuc) لتقييم مستويات علامات الهيستون التي تحتوي على الأسيتيلات والسكسينيلات، على التوالي.

  1. قم بإعداد وسائط النمو بتركيز العمل المناسب للمركب (على سبيل المثال ، 20 mM من Nabut أو 10 mM NaSuc). تبادل الوسائط في المفاعل الحيوي مع الوسائط المعالجة.
    ملاحظة: لإنشاء حالة ضابطة، إما جمع ما يكفي من الكرويات للتجارب قبل إضافة العلاج أو تعيين مفاعل حيوي للكرويات غير المعالجة.
  2. جمع الكرويات للتحليل البروتيني بعد وقت العلاج الكافي (على سبيل المثال ، 48 ساعة إلى 1 أسبوع لعلاج NaSuc أو 48-72 ساعة لعلاج Nabut).
    ملاحظة: لاستخراج الهستون باستخدام هذا البروتوكول ، تم جمع ستة إلى ثمانية كرويات تحتوي على ما يقرب من 1 × 106 خلايا.
    1. قم بإزالة 3-5 مل من الوسائط من المفاعل الحيوي من خلال المنفذ العلوي.
    2. افتح المنفذ الأمامي واستخدم طرف تجويف عريض 1 مل لإزالة الكرويات ووضعها في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة.
    3. الطرد المركزي للكرويات في 100 × غرام لمدة 5 دقائق وتجاهل الوسائط.
      ملاحظة: يمكن تغيير الوسائط الموجودة في المفاعل الحيوي ويمكن إعادة المفاعل الحيوي إلى الحاضنة للحصول على وقت إضافي للعلاج أو التعافي.
    4. اغسل الكرويات ب 200 ميكرولتر من HBSS لإزالة FBS. جهاز طرد مركزي عند 100 × جم لمدة 5 دقائق وإزالة السوبرناتانت.
      ملاحظة: يمكن تخزين الكرويات عند -80 درجةمئوية حتى المعالجة.

5. استخراج هيستون

ملاحظة: تسمح العديد من بقايا الأحماض الأمينية الأساسية الموجودة في الهيستونات بالتفاعل عن كثب مع الحمض النووي ، الذي يحتوي على العمود الفقري لحمض الفوسفوريك. نظرا لأن الهيستونات هي بعض البروتينات الأساسية في النواة ، عندما يتم استخراجها باستخدام حمض الكبريتيك البارد (0.2 M H2SO4) ، يكون هناك الحد الأدنى من التلوث. سوف تترسب البروتينات غير الهيستون في حمض قوي. يستخدم حمض ثلاثي كلورو أسيتيك عالي التركيز (TCA) المخفف إلى تركيز نهائي بنسبة 33٪ بعد ذلك لتعجيل الهيستونات من حمض الكبريتيك. احتفظ بجميع العينات والأنابيب والكواشف على الجليد لاستخراج الهستون بالكامل.

  1. أضف خمسة مجلدات (~ 100 ميكرولتر) من البرد 0.2 M H2SO4 إلى حبيبات الخلية (~ 10-20 ميكرولتر) ، وماصة لأعلى ولأسفل لتعطيل الكريات وإطلاق هيستونات.
  2. أنابيب حضانة لمدة تصل إلى 4 ساعات عند الدوران المستمر أو الاهتزاز عند 4 درجاتمئوية.
    ملاحظة: بالنسبة للعينات المعاد تعليقها التي يزيد حجمها عن 500 ميكرولتر، تكون حضانة 2 ساعة كافية لاستخراج الهيستونات (قد تؤدي الحضانة الأطول إلى استخراج بروتينات نووية أساسية أخرى). بالنسبة للعينات المعاد تعليقها بحجم أقل من 200 ميكرولتر ، يلزم حضانة لمدة 4 ساعات للحصول على عائد أفضل.
  3. جهاز طرد مركزي عند 3400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. جمع supernatant في أنبوب جديد والتخلص من بيليه في وقت لاحق.
  4. أضف TCA المركز البارد بحيث يشكل 25٪ -33٪ v/v النهائي (على سبيل المثال ، 40-60 ميكرولتر من TCA البارد: 120 ميكرولتر من supernatant) واخلطه عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات.
  5. احتضان الأنابيب لمدة 1 ساعة على الأقل عند الدوران المستمر أو الاهتزاز عند 4 درجاتمئوية.
    ملاحظة: بالنسبة لأحجام حبيبات البدء الأصغر حجما ، يوصى بحضانة بين عشية وضحاها.
  6. جهاز طرد مركزي عند 3400 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجاتمئوية. شفط supernatant بعناية. لا تلمس جوانب الأنبوب أو الكرية.
    ملاحظة: ترسب Histones على جانبي وأسفل الأنبوب. تحتوي الكريات البيضاء غير القابلة للذوبان التي تشكلت في الجزء السفلي من الأنبوب على بروتينات غير هيستون وجزيئات حيوية أخرى في الغالب.
  7. اغسل الأنبوب (الجدران والحبيبات) بالأسيتون البارد + 0.1٪ HCl باستخدام ماصة باستور زجاجية (~ 500 ميكرولتر / أنبوب).
  8. جهاز طرد مركزي عند 3400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجاتمئوية.
  9. اغسل الأنبوب (الجدران والكريات) باستخدام الأسيتون البارد بنسبة 100٪ باستخدام ماصة باستور زجاجية (~ 500 ميكرولتر / أنبوب). جهاز طرد مركزي عند 3,400 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجاتمئوية.
  10. تخلص من supernatant عن طريق قلب الأنبوب وماصة من الأسيتون المتبقي. افتح الغطاء وجفف العينة على المقعد في الهواء لمدة 20 دقيقة تقريبا.
  11. انتقل إلى البروبيونيل أو تخزين العينات في -80 درجةمئوية حتى الاستخدام.

6. الجولة الأولى من الاشتقاق

ملاحظة: يؤدي استخدام التربسين لهضم بروتينات الهيستون إلى ببتيدات صغيرة للغاية يصعب تحديدها باستخدام إعدادات البروتينات التقليدية. لهذا السبب ، يستخدم أنهيدريد البروبيونيك لاشتقاق المجموعات الأمينية ɛ كيميائيا من بقايا ليسين غير المعدلة والأحادية الميثيل. هذا يقيد انحلال البروتيوسين التربسين إلى بقايا أرجينين C-terminal. وبالنسبة للعينات الموجودة في ألواح البئر ال 96، يوصى باستخدام ماصات وخزانات متعددة القنوات لالتقاط الكواشف (الشكل 2 ألف). يتم إجراء الاشتقاق أيضا بعد الهضم لتسمية N-termini الحر للببتيدات مما يزيد من كره الببتيد للماء وبالتالي الاحتفاظ الكروماتوغرافي في الطور المعكوس.

  1. إعادة تعليق العينات في 20 ميكرولتر من 15٪ -20٪ الأسيتونيتريل في 100 مللي متر بيكربونات الأمونيوم (الرقم الهيدروجيني 8.0). دوامة لمدة 15 ثانية ، ثم تدور لأسفل عند 1000 × g لمدة 30 ثانية.
  2. إذا كانت هناك ثماني عينات أو أكثر، فانقل كل عينة معاد تعليقها إلى صفيحة من 96 بئرا.
    ملاحظة: إذا لم يتم نقل العينات إلى صفيحة 96 بئرا، يمكن استخدام ماصة أحادية القناة في الخطوات 6.3-6.7 و7.1-7.5 و8.1-8.5.
  3. تحت غطاء المحرك ، أضف 2 ميكرولتر من أنهيدريد البروبيونيك باستخدام ماصة متعددة القنوات. امزج عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 5x.
  4. أضف بسرعة 10 ميكرولتر من هيدروكسيد الأمونيوم باستخدام ماصة متعددة القنوات. امزج عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 5x.
    ملاحظة: حمض البروبيونيك هو نتاج التفاعل بين أنهيدريد البروبيونيك والأمينات الحرة من الببتيدات ويمكن أن يقلل من درجة الحموضة في العينة. يمكن إعادة تحديد الرقم الهيدروجيني 8 عن طريق إضافة هيدروكسيد الأمونيوم إلى العينة بنسبة 1:5 (v / v).
  5. تأكد من أن الرقم الهيدروجيني هو 8 باستخدام ورقة اختبار الرقم الهيدروجيني. إذا كان الرقم الهيدروجيني < 8 ، فاضبط بإضافة 1 ميكرولتر من هيدروكسيد الأمونيوم. إذا كان الرقم الهيدروجيني > 8 ، فاضبط بإضافة 1 ميكرولتر من الفورميك أو حمض الخليك. عندما > الرقم الهيدروجيني 10 ، يمكن وضع علامات على بقايا الأحماض الأمينية الأخرى مع pKa أعلى.
  6. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  7. كرر الخطوات 6.3-6.6. تضمن الجولة المزدوجة من بروبيونيل الهيستون كفاءة تفاعل كاملة تقريبا.
  8. جفف اللوحة في فراغ السرعة حتى تجف جميع الآبار تماما (~ 9 ساعات).
  9. انتقل إلى هضم التربسين أو تخزين العينات عند -80 درجةمئوية حتى الاستخدام.

7. هضم هيستون

ملاحظة: يتم هضم الهيستون إلى ببتيدات باستخدام التربسين ، الذي يقطع جانب الكربوكسيل من بقايا الأرجينين والليسين. ومع ذلك ، نظرا لأن البروبيونيل يعدل بقايا الليسين ، فإن بقايا الأرجينين فقط هي المشقوقة (الشكل 2B).

  1. تحضير محلول التربسين (25 نانوغرام / ميكرولتر في 50 mM NH4HCO3 ، الرقم الهيدروجيني 8.0). أضف 20 ميكرولتر من التربسين (500 نانوغرام) إلى كل عينة.
    1. لإعداد محلول 50 mM NH 4 HCO 3 ، قم بتخفيف محلول 100 mM NH4HCO3 1: 1 v / v بماء HPLC الصف.
  2. تأكد من أن الرقم الهيدروجيني هو 8 باستخدام ورقة اختبار الأس الهيدروجيني. إذا كان الرقم الهيدروجيني < 8 ، فاضبط بإضافة 1 ميكرولتر من هيدروكسيد الأمونيوم. إذا كان الرقم الهيدروجيني > 8 ، فاضبط بإضافة 1 ميكرولتر من حمض الفورميك أو حمض الخليك.
  3. هضم في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها أو احتضان في 37 درجةمئوية لمدة 6-8 ساعات.
  4. إذا كان ذلك ممكنا ، تحقق من درجة الحموضة بعد ~ 3 ساعات من الهضم ، لأنها قد تكون انخفضت. إذا كان الرقم الهيدروجيني < 8 ، فاضبط بإضافة 1 ميكرولتر من هيدروكسيد الأمونيوم.
  5. أضف 5 ميكرولتر إضافية من محلول التربسين 50 نانوغرام / ميكرولتر (250 نانوغرام) واستمر في الهضم.
  6. انتقل إلى الجولة الثانية من البروبيونيل أو قم بتخزين العينات عند -80 درجةمئوية حتى الاستخدام.

8. اشتقاق الببتيد N-termini

ملاحظة: يحسن البروبيونيل لببتيدات الهيستون في المحطة N الاحتفاظ بأقصر الببتيدات عن طريق كروماتوغرافيا سائلة معكوسة الطور (على سبيل المثال ، الأحماض الأمينية 3-8 من هيستون H3) ، حيث تزيد مجموعة البروبيونيل من كره الببتيد للماء.

  1. تحت غطاء المحرك ، أضف 2 ميكرولتر من أنهيدريد البروبيونيك باستخدام ماصة متعددة القنوات. امزج عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 5x.
  2. أضف بسرعة 10 ميكرولتر من هيدروكسيد الأمونيوم باستخدام ماصة متعددة القنوات. امزج عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 5x.
    ملاحظة: حمض البروبيونيك هو نتاج التفاعل بين أنهيدريد البروبيونيك والأمينات الحرة من الببتيدات ، ويمكن أن يقلل من درجة الحموضة في العينة. يمكن إعادة تحديد الرقم الهيدروجيني 8 عن طريق إضافة هيدروكسيد الأمونيوم إلى العينة بنسبة 1:5 (v / v).
  3. تأكد من أن الرقم الهيدروجيني هو 8 باستخدام ورقة اختبار الرقم الهيدروجيني. إذا كان الرقم الهيدروجيني < 8 ، فاضبط بإضافة 1 ميكرولتر من هيدروكسيد الأمونيوم. إذا كان الرقم الهيدروجيني > 8 ، فاضبط بإضافة 1 ميكرولتر من الفورميك أو حمض الخليك. عندما > الرقم الهيدروجيني 10 ، يمكن وضع علامات على بقايا الأحماض الأمينية الأخرى مع pKa أعلى.
  4. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  5. كرر الخطوات 8.1-8.4. تضمن الجولة المزدوجة من بروبيونيل الهيستون كفاءة تفاعل كاملة تقريبا.
  6. جفف اللوحة في فراغ السرعة حتى تجف جميع الآبار تماما (~ 9 ساعات).
  7. انتقل إلى خطوة تحلية المياه أو قم بتخزين العينات عند -80 درجةمئوية حتى الاستخدام.

9. تحلية المياه وتنظيف العينات

ملاحظة: تتداخل الأملاح الموجودة في العينة مع تحليل مطياف الكتلة. كما يتم تأين الأملاح أثناء الرش الكهربائي ويمكن أن تمنع الإشارات من الببتيدات. يمكن أن تشكل الأملاح قنوات أيونية على الببتيدات ، مما يتسبب في أن يكون للببتيد المقرب كتلة مختلفة. هذا يقلل من كثافة إشارة الببتيد ويمنع التحديد السليم والكمية. ويوضح الشكل 2 جيم الإعداد لتحلية المياه.

  1. ابدأ في خلط راتنج HLB (50 مجم / مل في 100٪ acetonitrile) على لوحة تحريك مغناطيسية.
  2. تأكد من وجود لوحة تجميع 96 بئرا موضوعة أسفل لوحة مرشح البولي بروبيلين المكونة من 96 بئرا لجمع التدفق.
  3. أضف 70 ميكرولتر من تعليق HLB لكل بئر إلى لوحة المرشح. قم بتشغيل الفراغ برفق لمنع الرش. تجاهل التدفق من خلال.
  4. اغسل الراتنج ب 100 ميكرولتر من 0.1٪ TFA. قم بتشغيل الفراغ برفق لمنع الرش. تجاهل التدفق من خلال.
  5. أعد تعليق كل عينة في 100 ميكرولتر من 0.1٪ TFA. تحقق من درجة الحموضة. يجب أن يكون ~ 2-3.
  6. قم بتحميل كل عينة في كل بئر. قم بتشغيل المكنسة الكهربائية بلطف لمنع الرش. تجاهل التدفق من خلال.
  7. يغسل مع 100 ميكرولتر 0.1٪ TFA. قم بتشغيل المكنسة الكهربائية بلطف لمنع الرش. تجاهل التدفق من خلال.
  8. استبدل لوحة التجميع بلوحة تجميع جديدة بسعة 96 بئرا.
  9. أضف 60 ميكرولتر من 60٪ أسيتونيتريل / 0.1٪ TFA لكل بئر. قم بتشغيل المكنسة الكهربائية بلطف لمنع الرش. جمع التدفق من خلال وتجف في فراغ السرعة.
  10. انتقل إلى LC-MS / MS أو قم بتخزينالعينات عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

10. تحليل الببتيد هيستون عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي

  1. قم بإعداد المراحل المتنقلة لتشغيلها على الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC). المرحلة المتنقلة A (MPA): 2٪ أسيتونيتريل من الدرجة HPLC + 0.1٪ حمض الفورميك. المرحلة المتنقلة B (MPB): 80٪ أسيتونيتريل من الدرجة HPLC + 0.1٪ حمض الفورميك.
  2. برمجة طريقة HPLC على النحو التالي: (1) 4٪ -34٪ MPB على مدى 30 دقيقة. (2) 34٪ -90٪ MPB أكثر من 5 دقائق ؛ و (3) متساوي الأيزوقراط 90٪ MPB لمدة 5 دقائق. استخدم خصائص العمود الموصى بها التالية: C18 3 ميكرومتر مواد التعبئة ، 75 ميكرومتر القطر الداخلي ، 20-25 سم طول. اضبط معدل التدفق على 250-300 nL / min لأعمدة nano ذات القطر الداخلي 75 ميكرومتر.
    1. في حالة عدم برمجة HPLC لأتمتة توازن العمود قبل تحميل العينة ، قم بتضمين (4) 90٪ -4٪ MPB على مدى دقيقة واحدة و (5) متساوي الأيزوقراطي 4٪ MPB على مدى 10 دقائق.
  3. برمجة طريقة اكتساب MS.
    1. تأكد من أن الجهاز يقوم بإجراء فحص كامل واحد للتصلب المتعدد في بداية كل دورة عمل. يوصى باستخدام أجهزة عالية الدقة (مثل أجهزة تحليل المدار أو وقت الطيران) ، نظرا لدقة الكتلة التي يمكن استخدامها أثناء استخراج الإشارة. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام الأجهزة منخفضة الدقة كما هو موضح سابقا27,28.
    2. تأكد من أن فحص MS الكامل يتبعه 16 حدثا لفحص MS/MS، لكل منها عرض عزل يبلغ 50 m/z، ويمتد نطاق m/z من 300 إلى 1100. على سبيل المثال ، يجب أن يعزل الفحص الأول الإشارات عند 300-350 m / z ، والثاني عند 350-400 m / z ، إلخ. إذا كان ذلك ممكنا ، احصل على فحوصات MS / MS بدقة عالية أيضا ، ولكن الدقة المنخفضة مقارنة بفحص MS الكامل كافية (بسبب الكتل الأصغر من أيونات الشظايا مقارنة بالأيونات السليمة).
    3. ستقوم طريقة HPLC بإنشاء إشارات كروماتوغرافية بعرض ذروة يبلغ ~ 3-40 ثانية ؛ لضمان التحديد الكمي السليم للإشارة، تأكد من أن مقياس الطيف الكتلي يؤدي ما لا يقل عن 10 دورات عمل لكل ذروة كروماتوغرافية (أي دورة عمل مدتها 3 ثوان أو أسرع).
    4. في حالة استخدام محلل كتلة على غرار الملائمة (orbitrap ، مصيدة الأيونات) ، تأكد من تعيين الحد الزمني لحقن الأيونات على <200 مللي ثانية ؛ بالنسبة لأجهزة التحليل الأخرى (رباعية ، وقت الطيران) ، هذه ليست مشكلة بسبب وقت المسح الضوئي الأسرع. قد تكون هناك حاجة إلى اختبار أولي.
      ملاحظة: يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول طرق MS لتحليل ببتيد الهيستون في المراجع التالية 27،28،29.
  4. إعادة تعليق العينة في 10 ميكرولتر من MPA ، والتي تتوافق مع ~ 1 ميكروغرام / ميكرولتر من عينة هيستون المهضومة. كمية التحميل الدقيقة ليست حرجة (أيضا ليست تافهة للتقييم) إذا تم تحميل جميع العينات في الدفعة باستخدام تخفيفات وأحجام مماثلة.
  5. قم بتحميل 1 ميكرولتر من العينة على عمود HPLC.
  6. قم بتشغيل أسلوب LC-MS/MS المبرمج في الخطوات من 10.1 إلى 10.3.

11. تحليل البيانات

  1. استيراد ملفات البيانات الخام MS إلى برنامج مصمم لتنفيذ تكامل منطقة الذروة.
    ملاحظة: يستخدم EpiProfile 30,31 في الدراسة الحالية ويوصى به بشكل عام ، حيث تم تحسينه لاستخراج منطقة الذروة الموثوقة من ببتيدات هيستون المعروفة. ومع ذلك ، فإن البرامج الأخرى المتاحة مجانا لكروماتوغرافيا الأيونات المستخرجة مثل Skyline32,33 مناسبة.
  2. احسب الوفرة النسبية لببتيد معين (غير معدل) كمساحة ببتيد واحد مقسوما على المساحة الكلية للببتيد بجميع أشكاله المعدلة. تحتوي برامج مثل EpiProfile30,31 بالفعل على مكتبات من الببتيدات لاستخراج الإشارة. خلاف ذلك ، قم بإنشاء مكتبة من الببتيدات ذات الأهمية إما يدويا أو عن طريق تحديد الببتيد باستخدام خطوط أنابيب البروتينات الروتينية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذا البروتوكول ، عولجت الكرويات HepG2 / C3A ب 20 mM Nabut و 10 mM NaSuc ، وكلاهما أثر على المستويات العالمية من PTMs الهيستون (الشكل 3A). ثم تم تحديد وقياس هيستون PTMs كميا على مستوى البقايا المفردة عن طريق اقتناء MS / MS (الشكل 3B).

عندما يتم تشغيل العينات في نسخ متماثلة ، يمكن إجراء تحليل إحصائي لتقييم إثراء تغيير الطية ل PTM بين العينات ، وكذلك قابلية تكرار الملاحظة. تظهر البيانات المعروضة أن الببتيدات المعدلة باستخدام الأسيتيلاتيون يتم إثراؤها في الكرويات المعالجة باستخدام Nabut مقابل التحكم (الشكل 3C) ، في حين أن العينات المعالجة باستخدام NaSuc لها وفرة نسبية أعلى من ببتيدات الهيستون المعدلة باستخدام سكسينيال ليسين (الشكل 3D). تم إجراء هذه الحسابات في برنامج جدول بيانات كما هو مفصل في منشور منفصل34. يمكن تمثيل الزيادة الإجمالية لتعديل هيستون معين بشكل أفضل في مخططات الرادار ، حيث تصبح مراقبة وفرة عالمية أعلى لتعديل معين أكثر بديهية ، حتى مع الحفاظ على معلومات مفصلة حول مواقع التعديل التي تم تحليلها (الشكل 3E ، F).

يولد هذا البروتوكول ببتيد من بقايا الأحماض الأمينية هيستون H3 9-17 ، والتي تشمل المخلفات المعدلة بشكل متكرر K9 و S10 و K14. تشير البيانات المعروضة إلى أن العلاج باستخدام Nabut يزيد من مستويات H3K14ac ، ولكن فقط على الهيستونات المعدلة بشكل مشترك مع H3K9me2 وليس H3K9me3 (الشكل 4A). يمكن تمثيل تردد التعايش بين تعديلين بشكل أكثر حدسية كرسم بياني حلقي ، حيث تمثل العقد التعديلات الفردية بينما يمثل سمك خطوط الموصل تردد التعايش بين PTMs (الشكل 4B). في بعض الأحيان ، لا يتأثر تردد التعايش ، لكن البيانات الممثلة كمؤامرات شريطية قد تكون مضللة. على سبيل المثال ، تشير البيانات الممثلة في الشكل 4A إلى أن التركيبة H3K9me2K14ac أكثر وفرة في علاج Nabut منها في السيطرة. هذا صحيح ، ولكن هذا المزيج المعطى هو الأكثر شيوعا بغض النظر عن العلاج. يوضح الشكل 4B بوضوح أن H3K9me2K14ac و H3K9me3K14ac هما أكثر الأنماط التوافقية شيوعا بغض النظر عن العلاج (سمك الخط) ، ولكن المستويات العالمية ل H3K14ac (العقدة) هي ما يتغير حقا في التجربة.

يولد هذا البروتوكول ببتيد من بقايا هيستون H4 4-17 ، والتي تشمل بقايا قابلة للتعديل في المواقع K5 و K8 و K12 و K16 (معظمها عن طريق الأسيتيلات). عند مقارنة التحكم ومعالجة Nabut ، من الممكن ملاحظة زيادة في مجموعات الأسيتيلاتيون من خلال تمثيل البيانات ، على سبيل المثال ، سحب الكلمات (الشكل 4C). يسلط هذا التمثيل الضوء بوضوح على أن النسخة غير المعدلة من هيستون H4 هي الأكثر وفرة في عينة التحكم ، في حين يتم إثراء الكرويات المعالجة ب Nabut في أشكال بدائية هيستون H4 مضاعفة وثلاثية ورباعية. ومع ذلك ، فإن سحب الكلمات محدودة في عرض القيم الدقيقة. يجب إزالة الوفرة النسبية لرمز هيستون من حجم النص ، والذي قد يتم تقديره بشكل غير دقيق. لذلك ، يمكن استخدام مخططات Venn أو ما يعادلها الأكثر حداثة مثل تمثيل UpSetR35 لإظهار القياس الكمي الدقيق ل PTMs الهيستون المتعايشة (الشكل 4D ، E). تسلط البيانات المعروضة الضوء مرة أخرى على أن مجموعات مختارة من الأسيتيلاتيون على هيستون H4 أكثر وفرة نسبيا في علاج Nabut مقارنة بالتحكم.

Figure 1
الشكل 1: سير العمل لتحليل الببتيد هيستون من الكرويات 3D. تزرع خلايا HepG2 / C3A لأول مرة في ثقافة ثنائية الأبعاد حتى تصل إلى 80٪ من الالتقاء. ثم يتم نقل الخلايا إلى مفاعل حيوي متوازن ووضعها داخل حاضنة clinostat حيث تدور عند 10-11 دورة في الدقيقة لتشكيل كرويات. بعد 18 يوما ، يتم التعامل مع الكرويات إما ب 20 mM Nabut أو 10 mM NaSuc ويتم حصادها بعد نقاطها الزمنية المقابلة. يتم عزل النوى من الخلايا ويتم استخراج الهيستون باستخدام 0.2 M H2SO4. ثم يتم إجراء اشتقاق هيستون مع أنهيدريد البروبيونيك قبل وبعد هضم التربسين لضمان الاحتفاظ بالببتيدات القصيرة الناتجة عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة. يتم تحلية العينات ثم تشغيلها باستخدام أسلوب LC-MS/MS المذكور في الخطوة 10، ويتم تحليل البيانات الناتجة كما هو موضح في الخطوة 11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إعداد لخطوات البروبيونيل وتحلية المياه . (أ) يتم إجراء البروبيونيل في غطاء الدخان ويتم وضع جميع المكونات بحيث يمكن تنفيذ الخطوات في تتابع سريع. (ب) مخطط الجولة الأولى من البروبيونيل، وهضم التربسين، والجولة الثانية من البروبيونيل على ذيل هيستون H3.1. (ج) يتم إجراء إزالة الملح على المقعد باستخدام مشعب فراغ 96 بئرا ولوحة مرشح من البولي بروبيلين بسعة 96 بئرا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تمثيل تعديلات الهيستون الفردية. (أ) الرسم البياني الشريطي يوضح الوفرة النسبية لتعديلات الهيستون العالمية الشائعة في التحكم والمعالجة (20 mM Nabut أو 10 mM NaSuc) HepG2 / C3A كروية. (ب) رسم بياني شريطي يبين وفرة الهيستون المنفرد PTMs التي تحدث على بقايا 9-17 من ببتيد هيستون H3 (KSTGGKAPR) في السيطرة والمعالجة (20 mM Nabut أو 10 mM NaSuc) HepG2 / C3A كروية. (ج، د) مخططات البركان التي تظهر تغير الطية وأهمية التعبير التفاضلي ل PTMs ببتيد هيستون بعد المعالجة ب 20 mM Nabut (C) أو 10 mM NaSuc (D). تمثل النقاط الزرقاء والخضراء المميزة بقايا الأسيتيلات والسكسينيلات، على التوالي. (E,F) مخططات الرادار التي تظهر وفرة أسيتيلات ببتيد هيستون المفردة (E) أو السكسينيال (F) بعد المعالجة ب 20 mM Nabut أو 10 mM NaSuc على التوالي مقارنة بالتحكم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تمثيل تعديلات الهيستون المتعايشة . (أ) رسم بياني شريطي يوضح وفرة الهيستون التوافقي PTMs التي تحدث على بقايا 9-17 من هيستون H3 (KSTGGKAPR) في السيطرة والمعالجة (20 mM Nabut أو 10 mM NaSuc) HepG2 / C3A كروية. (ب) رسوم بيانية حلقية تبين العلاقة بين الهيستون التوافقي PTMs على المخلفات 9-17 من هيستون H3 (KSTGGKAPR) في السيطرة والمعالجة (20 mM NaBut) HepG2 / C3A كروية. تتوافق شدة لون العقدة مع وفرة PTM واحد داخل مجموعة المعالجة الخاصة به ، في حين أن سمك الخط يتوافق مع تواتر حدوث PTM المشترك. (ج) سحب الكلمات التي تبين تواتر الهيستون التوافقي PTMs على بقايا هيستون H4 في السيطرة والمعالجة (20 mM NaBut) HepG2 / C3A كروية. يتوافق حجم النص مع وفرة PTM التوافقية المحددة. (دال، هاء) مخطط فين يمثل تواتر التعديلات المتعايشة على بقايا ببتيد هيستون H4 4-17 في السيطرة و 20 mM Nabut العينات المعالجة. يتم عرض البيانات باستخدام ShinyApp UpSetR35. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول التكميلي 1: قائمة الببتيدات المكتشفة باستخدام هذا البروتوكول. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يختلف تحليل PTMs الهيستون اختلافا جوهريا عن خط أنابيب تحليل البروتينات النموذجي. معظم PTMs هيستون لا يزال لها وظائف بيولوجية غامضة. ونتيجة لذلك، لا تتوفر التعليقات التوضيحية مثل أنطولوجيا الجينات أو قواعد بيانات المسارات. توجد العديد من الموارد التي تربط تعديلات الهيستون بالإنزيم المسؤول عن تحفيزها أو البروتينات التي تحتوي على مجالات تربط هذه PTMs (على سبيل المثال ، HISTome36). كذلك ، من الممكن التكهن بالحالة العامة للكروماتين عندما يتم تنظيم المستويات العالمية من PTMs الهيستون. على سبيل المثال ، عادة ما ترتبط الزيادة الإجمالية في أسيتيلات الهيستون أو غيرها من الأسيلات مثل السكسينيال بإزالة التكثيف من الكروماتين37,38.

يوفر تحليل التصلب المتعدد معلومات أكثر تفصيلا حول هذه التعديلات، مثل توطينها الدقيق على تسلسل الأحماض الأمينية. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام اكتساب MS / MS لتحديد وقياس PTMs هيستون ، والتي يمكن أن تكون حاسمة للتفسير البيولوجي. على سبيل المثال ، يتم إثراء trimethylation على ليسين 4 من هيستون H3 (H3K4me3) على المروجين للجينات المنسوخة بنشاط39 ، في حين أن نفس التعديل على ليسين 9 (H3K9me3) المعايير التأسيسية غير المتجانسة40. وتستخدم حاليا تعديلات هيستون كمؤشرات حيوية في أمراض محددة؛ على هذا النحو ، يمكن استخدام تحليل الهيستون لدراسة أمراض الأمراض بالإضافة إلى الاستجابة للعلاج (على سبيل المثال ، مع الأدوية اللاجينية)41,42.

من الصعب تمثيل التفاعلات بصريا بين PTMs متعددة بدلا من PTMs الفردية. في حين أن المخططات الحالية مثل الرسوم البيانية الحلقية يمكن أن تظهر تردد التعايش لاثنين من PTMs ، فإنها لا يمكن أن تمثل تردد التعايش بين أكثر من اثنين من PTMs في وقت واحد ، لأن هذا يتطلب تمثيلا ثلاثي الأبعاد للشبكة. لهذا السبب ، قد تكون التمثيلات الأخرى أكثر ملاءمة لتسليط الضوء على التغييرات في رموز هيستون عند النظر في ثلاثة أو أكثر من PTMs. بشكل عام ، يوفر تنويع تمثيل البيانات فرصا أكبر لمراقبة التغييرات الكبيرة بين العينات. يقدم هذا البروتوكول أمثلة على الرسوم التوضيحية المختلفة لعرض لوائح PTMs هيستون و PTMs المتعايشة.

على الرغم من أن هذا البروتوكول يولد ببتيدات هيستون صغيرة نسبيا بسبب هضم التربسين (حوالي 4-20 من الأحماض الأمينية) ، إلا أن الببتيدات المختارة تحتوي على بقايا متعددة قابلة للتعديل. يسمح تحليل هذه الببتيدات بالتحديد الكمي لترددات التعايش ل PTMs ، والتي يمكن أن تكشف عن معلومات مهمة حول علامات الهستون التوافقية التي يتم تنظيمها في مجموعة بيانات معينة. والجدير بالذكر أنه لا توجد خطوات أثناء إعداد العينات حيث يتم إجراء تحديد كمي للهيستونات. هناك أربعة أسباب لذلك: (1) التربسين لديه مجموعة واسعة من الأنشطة ويمكن استخدامه في مجموعة واسعة من نسب الإنزيم إلى العينة (1:10-1:200). حتى عندما يختلف العائد التجريبي للهيستونات المستخرجة عن العائد المتوقع ، لم تتم مواجهة مشكلات في الهضم باستخدام هذا البروتوكول. (2) هذا البروتوكول مخصص لكميات دقيقة من المواد، حيث قد يكون من الصعب إجراء تحديد كمية الهيستون بسبب نقص الحساسية. (3) باستخدام تركيز ثابت من التربسين بغض النظر عن كمية مادة الهيستون ، يمكننا استخدام الببتيدات التربتيكية (مثل التريبسين autolyzes) لقياس أداء الكروماتوغرافيا. سيتم تطبيع الاختلافات الطفيفة في إنتاجية العينات بواسطة برنامج تحليل البيانات (الخطوة 11) ، والذي يستخدم جميع الإشارات المعدلة (غير المعدلة) لببتيد معين كقاسم أثناء عملية التطبيع. (4) وأخيرا، فإن التقليل الدراماتيكي من كمية المواد الأولية قد يخلق مشاكل في التحميل الزائد على العمود الكروماتوغرافي nanoLC. ومع ذلك، فإن تنفيذ خطوة تحلية المياه كما هو موضح في هذا البروتوكول يمنع حدوث هذه المشكلة. في حالة وجود كميات زائدة من المواد الأولية (على سبيل المثال >100 ميكروغرام) ، سيتم تجاوز الحد الأقصى لسعة راتنج التحلية ، وسيتم غسل أي عينة زائدة أثناء خطوة التحميل.

ومن المهم ملاحظة أنه لم يتم تسليط الضوء على جميع الببتيدات التي اكتشفها هذا التحليل في الشكل 3 والشكل 4. كذلك، ليست كل تعديلات الهيستون قابلة للكشف باستخدام طرق إعداد العينات المحددة واقتنائها. ويرد الجدول التكميلي 1 لسرد جميع إشارات الببتيد التي يتم استخراجها باستخدام خط الأنابيب الموصوف. لم يتم سرد بعض التعديلات المعروفة في الجدول ، لأن إعداد العينة الموصوفة غير مناسب لاكتشافها. ومن الأمثلة البارزة على ذلك الببتيدات المنتشرة في كل مكان من هيستون H2A و H2B ، وفسفرة هيستون H2A. X (علامة عامة على تلف الحمض النووي). وذلك لأن البروبيونيل للببتيدات المرتبطة بهذه PTMs يؤدي إلى ببتيدات طويلة بشكل مفرط ، والتي لا تناسب كروماتوغرافيا C18 وطريقة الكشف عن MS الموصوفة. التعديلات الأخرى الموجودة في الأدبيات ولكنها غير موجودة في الجدول التكميلي 1 هي تعديلات منخفضة الوفرة للغاية (لا يمكن اكتشافها حاليا إلا باستخدام MS بعد استراتيجيات التخصيب مثل الترسيب المناعي أو العلاج الخلوي المحدد) ، مثل اللاكتيل43 أو السيروتونيل44. كما لا يتم النظر في تعديلات هيستون مع تحولات كتلة لا يمكن التنبؤ بها الناجمة عن البلمرة أو الارتباط التساهمي غير المتجانس لتسلسل هيستون (على سبيل المثال ، poly-ADP-ribosylation45 و glycation46). بالإضافة إلى ذلك ، يستخدم هذا البروتوكول NaSuc و Nabut لعلاج الكرويات HepG2 / C3A ، ولكن يمكن تعديله للاستخدام مع الأدوية الأخرى / المعدلات اللاجينية وأنواع زراعة الخلايا 2D / 3D.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

يعترف مختبر Sidoli بامتنان بمؤسسة أبحاث سرطان الدم (منحة Hollis Brownstein New Investigator Research Grant) ، و AFAR (جائزة Sagol Network GerOmics) ، و Deerfield (جائزة Xseed ) ، و Relay Therapeutics ، و Merck ، ومكتب مدير المعاهد الوطنية للصحة (1S10OD030286-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% trypsin-EDTA solution Gibco 25300054
0.5-20 µL pipet tips BRAND 13-889-172 (Fisher Scientific)
1.5 mL microcentrifuge tubes Bio-Rad 2239480
10 µL multi-channel pipette BRAND BR7059000 (Millipore Sigma)
10 mL syringe Henke Sass Wolf 14-817-31 (Fisher Scientific) Luer lock tip, graduated to 12 mL
10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettes Eppendorf 14-285-904 (Fisher Scientific)
1000 µL pipet tips Rainin 30389164
18 G syringe needle Air-Tite 14-817-100 (Fisher Scientific) 3" length, 0.05" diameter
200 µL multi-channel pipette Corning 4082
2-200 µL pipet tips BRAND Z740118 (Millipore Sigma)
24-well ultra-low attachment microplate Corning 07-200-602
75 cm2  U-shaped cell culture flask Corning 461464U Untreated, with vent cap
96-well skirted plate Axygen PCR-96-FS-C (Corning)
Acetone Fisher Scientific A949-1 Acetone should be used cold
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) Sigma-Aldrich A6141-25G
Ammonium hydroxide solution Fisher Scientific AC423300250
Cell culture grade water Corning 25-055-CV
ClinoReactor CelVivo 10004-12 Bioreactor for 3D cell culture
ClinoStar CelVivo N/A Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture
Control unit CelVivo N/A Tablet for ClinoStar settings
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Corning 17-205-CV 1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35-010-CV
Formic acid Thermo Scientific 28905
Fume hood Mott N/A Model 7121000
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-8B 9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile
Glutagro supplement Corning 25-015-CI 200 mM L-ananyl-L-glutamine
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Corning 21-022-CV 1X solution without calcium, magnesium, and phenol red
HPLC grade acetonitrile Fisher Scientific A955-4
HPLC grade water Fisher Scientific W6-1
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A481-212
Ice N/A N/A
MEM non-essential amino acids Corning 25-025-CI 100X solution
Oasis HLB resin Waters 186007549 Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer Thermo Fisher Scientific IQLAAEGAAPFADBMBHQ High resolution mass spectrometer
Oro-Flex I polypropylene filter plate Orochem OF1100 96-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI 100X solution
pH paper Hydrion Z111848 (Sigma-Aldrich) 0-13 pH test paper
Pipette gun Eppendorf Z666467 (Millipore Sigma)
Polymicro capillary Molex 50-110-7740 (Fisher Scientific) Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD
Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile Fisher Scientific 1367549
Propionic anhydride Sigma-Aldrich 240311-50G
Refrigerated centrifuge Thermo Scientific 75-217-420
Reprosil-Pur resin MSWIL R13.AQ.0003 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size
Rotator Clay Adams 25477 (American Laboratory Trading) Nutator Mixer 1105
Sequencing grade modified trypsin Promega V5111
Sodium butyrate Thermo Scientific A11079
Sodium succinate dibasic Sigma-Aldrich 14160-100G
SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes) Savant 20249 (American Laboratory Trading)
SpeedVac vacuum concentrator (96-well) Thermo Scientific 15308325 Savant SPD1010
Sterile hood Thermo Scientific 1375 Class II, Type A2
Sulfuric acid (H2SO4) Fisher Scientific 02-004-375 Baker Analyzed ACS reagent
Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish Fisher Scientific 08-772-23
Trichloroacetic acid (TCA) Thermo Scientific AC421451000 Resuspend 100% w/v in HPLC grade water
Trifluoroacetic acid (TFA) Fisher Scientific PI28904 Sequencing grade
Vacuum manifold 96-well Millipore MAVM0960R
Vortex Sigma-Aldrich Z258415
Water bath Fisher Scientific FSGPD10
Wide bore pipet tips 1000 µL Axygen 14-222-703 (Fisher Scientific)
Wide bore pipet tips 200 µL Axygen 14-222-730 (Fisher Scientific)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  2. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  3. Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
  4. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology (Bethesda). 32 (4), 266-277 (2017).
  5. Wrzesinski, K., et al. The cultural divide: exponential growth in classical 2D and metabolic equilibrium in 3D environments. PLoS One. 9 (9), 106973 (2014).
  6. Wrzesinski, K., Fey, S. J. Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors. Bioengineering (Basel). 5 (1), 22 (2018).
  7. Gonda, S. R., et al. Three-dimensional transgenic cell model to quantify genotoxic effects of space environment. Advances in Space Research. 27 (2), 421-430 (2001).
  8. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  9. Tvardovskiy, A., et al. Top-down and middle-down protein analysis reveals that intact and clipped human histones differ in post-translational modification patterns. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (12), 3142-3153 (2015).
  10. Azad, G. K., et al. Modifying chromatin by histone tail clipping. Journal of Molecular Biology. 430 (18), 3051-3067 (2018).
  11. Kragesteen, B. K., Amit, I. Heads or tails: histone tail clipping regulates macrophage activity. Nature Immunology. 22 (6), 678-680 (2021).
  12. Dhaenens, M. Histone clipping: the punctuation in the histone code. EMBO Reports. 22 (8), 53440 (2021).
  13. Anderson, L. C., et al. Analyses of histone proteoforms using front-end electron transfer dissociation-enabled orbitrap instruments. Molecular and Cellular Proteomics. 15 (3), 975-988 (2016).
  14. Morgan, M. A. J., Shilatifard, A. Reevaluating the roles of histone-modifying enzymes and their associated chromatin modifications in transcriptional regulation. Nature Genetics. 52 (12), 1271-1281 (2020).
  15. Chan, J. C., Maze, I. Nothing is yet set in (hi)stone: novel post-translational modifications regulating chromatin function. Trends in Biochemical Sciences. 45 (10), 829-844 (2020).
  16. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
  17. Fischle, W., et al. Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains. Genes and Development. 17 (15), 1870-1881 (2003).
  18. Onder, O., et al. Progress in epigenetic histone modification analysis by mass spectrometry for clinical investigations. Expert Review of Proteomics. 12 (5), 499-517 (2015).
  19. Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. Journal of Proteomics. 75 (12), 3419-3433 (2012).
  20. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural and Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
  21. Moradian, A., et al. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
  22. Zheng, Y., Huang, X., Kelleher, N. L. Epiproteomics: quantitative analysis of histone marks and codes by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 142-150 (2016).
  23. Sidoli, S., Garcia, B. A. Middle-down proteomics: a still unexploited resource for chromatin biology. Expert Review of Proteomics. 14 (7), 617-626 (2017).
  24. Stampar, M., et al. Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals. Science of the Total Environment. 755, 143255 (2021).
  25. Calitz, C., et al. Toxicity and anti-prolific properties of Xysmalobium undulatum water extract during short-term exposure to two-dimensional and three-dimensional spheroid cell cultures. Toxicology Mechanisms and Methods. 28 (9), 641-652 (2018).
  26. Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
  27. Sidoli, S., et al. Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra (SWATH) analysis for characterization and quantification of histone post-translational modifications. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (9), 2420-2428 (2015).
  28. Sidoli, S., et al. Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications. Analytical Chemistry. 87 (22), 11448-11454 (2015).
  29. Karch, K. R., Sidoli, S., Garcia, B. A. Identification and quantification of histone PTMs using high-resolution mass spectrometry. Methods in Enzymology. 574, 3-29 (2016).
  30. Yuan, Z. F., et al. EpiProfile quantifies histone peptides with modifications by extracting retention time and intensity in high-resolution mass spectra. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (6), 1696-1707 (2015).
  31. Yuan, Z. F., et al. EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2533-2541 (2018).
  32. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
  33. Pino, L. K., et al. The Skyline ecosystem: Informatics for quantitative mass spectrometry proteomics. Mass Spectrometry Reviews. 39 (3), 229-244 (2020).
  34. Aguilan, J. T., Kulej, K., Sidoli, S. Guide for protein fold change and p-value calculation for non-experts in proteomics. Molecular Omics. 16 (6), 573-582 (2020).
  35. Lex, A., et al. UpSet: Visualization of intersecting sets. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 20 (12), 1983-1992 (2014).
  36. Shah, S. G., et al. HISTome2: a database of histone proteins, modifiers for multiple organisms and epidrugs. Epigenetics and Chromatin. 13 (1), 31 (2020).
  37. Xie, Z., et al. Lysine succinylation and lysine malonylation in histones. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (5), 100-107 (2012).
  38. Liu, J., et al. Histone succinylation and its function on the nucleosome. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (15), 7101-7109 (2021).
  39. Howe, F. S., et al. Is H3K4me3 instructive for transcription activation. Bioessays. 39 (1), 1-12 (2017).
  40. Nicetto, D., Zaret, K. S. Role of H3K9me3 heterochromatin in cell identity establishment and maintenance. Current Opinion in Genetics and Development. 55, 1-10 (2019).
  41. Wojcik, J. B., et al. Histone H3K27 dimethyl loss is highly specific for malignant peripheral nerve sheath tumor and distinguishes true PRC2 loss from isolated H3K27 trimethyl loss. Modern Pathology. 32 (10), 1434-1446 (2019).
  42. Sellers, W. R., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
  43. Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
  44. Farrelly, L. A., et al. Histone serotonylation is a permissive modification that enhances TFIID binding to H3K4me3. Nature. 567 (7749), 535-539 (2019).
  45. Chen, Q., et al. ADP-ribosylation of histone variant H2AX promotes base excision repair. The EMBO Journal. 40 (2), 104542 (2021).
  46. Zheng, Q., et al. Reversible histone glycation is associated with disease-related changes in chromatin architecture. Nature Communications. 10 (1), 1289 (2019).

Tags

علم الأحياء ، العدد 183 ، ثقافة 3D ، histones ، قياس الطيف الكتلي ، الحقن المباشر ، تعديلات ما بعد الترجمة
تحديد كمي على المستوى العالمي لتعديلات ما بعد الترجمة Histone في نموذج زراعة الخلايا 3D للأنسجة الكبدية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Joseph-Chowdhury, J. S. N.,… More

Joseph-Chowdhury, J. S. N., Stransky, S., Graff, S., Cutler, R., Young, D., Kim, J. S., Madrid-Aliste, C., Aguilan, J. T., Nieves, E., Sun, Y., Yoo, E. J., Sidoli, S. Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue. J. Vis. Exp. (183), e63606, doi:10.3791/63606 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter