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Biology

Globale Quantifizierung von posttranslationalen Histonmodifikationen in einem 3D-Zellkulturmodell von Lebergewebe

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63606
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry, Albert Einstein College of Medicine

Summary

Dieses Protokoll beschreibt, wie ein dreidimensionales Zellkultursystem verwendet werden kann, um Chromatinmodifikationen in einem nahezu physiologischen Zustand zu modellieren, zu behandeln und zu analysieren.

Abstract

Flachkulturen von Säugetierzellen sind ein weit verbreiteter In-vitro-Ansatz zum Verständnis der Zellphysiologie, aber dieses System ist bei der Modellierung von festem Gewebe aufgrund der unnatürlich schnellen Zellreplikation begrenzt. Dies ist besonders schwierig bei der Modellierung von reifem Chromatin, da schnell replizierende Zellen häufig an der DNA-Replikation beteiligt sind und eine heterogene polyploide Population aufweisen. Im Folgenden finden Sie einen Workflow zum Modellieren, Behandeln und Analysieren von ruhenden Chromatinmodifikationen mit einem dreidimensionalen (3D) Zellkultursystem. Unter Verwendung dieses Protokolls werden hepatozelluläre Karzinomzelllinien als reproduzierbare 3D-Sphäroide in einem Inkubator gezüchtet, die eine aktive Nährstoffdiffusion und geringe Scherkräfte bieten. Die Behandlung mit Natriumbutyrat und Natriumsuccinat induzierte eine Zunahme der Histonacetylierung bzw. der Succinylierung. Erhöhungen der Histonacetylierung und Succinylierung sind mit einem offeneren Chromatinzustand verbunden. Sphäroide werden dann zur Isolierung von Zellkernen gesammelt, aus denen Histonproteine für die Analyse ihrer posttranslationalen Modifikationen extrahiert werden. Die Histonanalyse wird über die Flüssigkeitschromatographie in Verbindung mit der Tandem-Massenspektrometrie durchgeführt, gefolgt von einer internen Rechenpipeline. Abschließend werden Beispiele für die Datendarstellung zur Untersuchung der Häufigkeit und des Auftretens kombinatorischer Histonspuren gezeigt.

Introduction

Seit dem späten 19. Jahrhundert werden Zellkultursysteme als Modell verwendet, um das Wachstum und die Entwicklung von Zellen außerhalb des menschlichen Körpers zu untersuchen 1,2. Ihre Verwendung wurde auch erweitert, um zu untersuchen, wie Gewebe und Organe sowohl in gesunden als auch in kranken Kontexten funktionieren 1,3. Suspensionszellen (z.B. Blutzellen) wachsen in Petrischalen oder Kolben nahtlos und austauschbar, da sie sich nicht in vivo in dreidimensionalen (3D) Strukturen zusammensetzen. Zellen, die aus festen Organen gewonnen werden, können entweder in zweidimensionalen (2D) oder 3D-Kultursystemen wachsen. In der 2D-Kultur werden Zellen in einer Monoschicht gezüchtet, die an einer flachen Oberflächehaftet 2,4. 2D-Zellkultursysteme zeichnen sich durch exponentielles Wachstum und eine schnelle Verdopplungszeit aus, typischerweise 24 h bis zu einigen Tagen5. Zellen in 3D-Systemen wachsen zu komplizierten Zell-Zell-Interaktionen, die gewebeähnliche Konglomerate genauer modellieren, und sie zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, ein dynamisches Gleichgewicht zu erreichen, in dem ihre Verdopplungszeit 1 Monat oder länger erreichen kann5.

In diesem Artikel wird eine innovative Methodik zur Züchtung von 3D-Sphäroiden in rotierenden Zellkultursystemen vorgestellt, die eine reduzierte Schwerkraft simulieren6. Dies ist ein vereinfachtes Derivat eines Zellkultursystems, das von der NASA in den 1990er Jahren eingeführtwurde 7. Dieser Ansatz minimiert die Scherkräfte, die bei bestehenden Methoden wie Spinnkolben auftreten, und erhöht die Sphäroidreproduzierbarkeit6. Darüber hinaus erhöht der rotierende Bioreaktor die aktive Nährstoffdiffusion und minimiert die nekrotische Bildung, die in Systemen wie der hängenden Tropfenzellkultur auftritt, in der der Medienaustausch unpraktisch ist6. Auf diese Weise wachsen die Zellen weitgehend ungestört, was die Bildung struktureller und physiologischer Eigenschaften ermöglicht, die mit dem Wachstum von Zellen im Gewebe verbunden sind. Auf diese Weise kultivierte C3A-Hepatozyten (HepG2/C3A) hatten nicht nur ultrastrukturelle Organellen, sondern produzierten auch Mengen an ATP, Adenylatkinase, Harnstoff und Cholesterin, die mit den in vivo 1,2 beobachteten Spiegeln vergleichbar waren. Darüber hinaus weisen Zellen, die in 2D.3D im Vergleich zu Zellkultursystemen gezüchtet wurden, unterschiedliche Genexpressionsmusterauf 8. Die Genexpressionsanalyse von C3A-Hepatozyten, die als 3D-Sphäroide gezüchtet wurden, zeigte, dass diese Zellen eine breite Palette von leberspezifischen Proteinen sowie Gene exprimierten, die an Schlüsselwegen beteiligt sind, die die Leberfunktion regulieren8. Frühere Veröffentlichungen zeigten die Unterschiede zwischen Proteomen exponentiell wachsender Zellen in 2D-Kultur und Zellen im dynamischen Gleichgewicht in 3D-Sphäroidekulturen5. Zu diesen Unterschieden gehört der Zellstoffwechsel, der wiederum die Struktur, Funktion und Physiologie der Zelle beeinflusst5. Das Proteom von Zellen, die in 2D-Kultur gezüchtet wurden, war stärker mit Proteinen angereichert, die an der Zellreplikation beteiligt waren, während das Proteom von 3D-Sphäroiden in der Leberfunktionalitätangereichert war 5.

Die langsamere Replikationsrate von Zellen, die als 3D-Sphäroide gezüchtet werden, modelliert genauer spezifische Phänomene, die mit dem Chromatinzustand und Modifikationen verbunden sind (z. B. Histon-Clipping9). Histon-Clipping ist eine irreversible Histon-posttranslationale Modifikation (PTM), die eine proteolytische Spaltung eines Teils des Histon-N-terminalen Schweifs verursacht. Während seine biologische Funktion noch diskutiert wird10,11,12,13, ist es klar, dass seine Anwesenheit in Primärzellen und Lebergewebe von HepG2 / C3A-Zellen modelliert wird, die als Sphäroide gezüchtet wurden, aber nicht als flache Zellen9. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da der Chromatinzustand und die Modifikationen die DNA-Auslesung hauptsächlich durch Modulation der Zugänglichkeit zu Genen und damit ihrer Expressionregulieren 14. Histon-PTMs beeinflussen entweder den Chromatinzustand direkt, indem sie die Nettoladung der Nukleosomen beeinflussen, in denen Histone zusammengesetzt sind, oder indirekt durch die Rekrutierung von Chromatin-Schreibern, Lesern und Radiergummis14. Hunderte von Histon-PTMs wurden bis heute15 identifiziert, was die Hypothese verstärkt, dass Chromatin einen "Histon-Code" beherbergt, der von der Zelle zur Interpretation von DNA16 verwendet wird. Die Identifizierung einer Vielzahl von PTM-Kombinationen15 und die Entdeckung, dass Kombinationen von Histon-PTMs häufig andere biologische Funktionen haben als PTMs, die isoliert vorliegen (z. B. Fischle, et al.17), zeigen jedoch, dass mehr Arbeit erforderlich ist, um den "Histoncode" zu entschlüsseln.

Derzeit basiert die Histon-PTM-Analyse entweder auf Techniken, die Antikörper verwenden (z. B. westliche Flecken, Immunfluoreszenz oder Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von Sequenzierung [ChIP-seq]) oder Massenspektrometrie (MS). Antikörper-basierte Techniken haben eine hohe Sensitivität und können detaillierte Informationen über die genomweite Lokalisierung von Histonmarkierungen liefern, sind jedoch häufig bei der Untersuchung seltener PTMs oder PTMs in Kombinationenbegrenzt 18,19,20. MS eignet sich besser für den Hochdurchsatz und die unvoreingenommene Identifizierung und Quantifizierung einzelner und koexistierender Proteinmodifikationen, insbesondere Histonproteine18,19,20. Aus diesen Gründen haben dieses und mehrere andere Labore die MS-Pipeline für die Analyse von Histonpeptiden (Bottom-up-MS), intakten Histonschwänzen (Middle-Down-MS) und Histonproteinen in voller Länge (Top-Down-MS) optimiert21,22,23.

Im Folgenden finden Sie einen Workflow für die Züchtung von HepG2/C3A-Sphäroiden und deren Vorbereitung für die Histonpeptidanalyse (Bottom-up-MS) mittels Nano-Flüssigkeitschromatographie, gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (nLC-MS/MS). Eine 2D-Zellkultur wurde gezüchtet und die Zellen wurden geerntet und in einen Bioreaktor gebracht, wo sie Sphäroide bilden würden (Abbildung 1). Nach 18 Tagen in Kultur wurden Sphäroide mit Natriumbutyrat oder Natriumsuccinat behandelt, um die relative Häufigkeit von Histonacetylierung und Succinylierung zu erhöhen. Insbesondere können 3D-Kulturen mit genotoxischen Verbindungen genauso gut behandelt werden wie ihre flachen Kulturäquivalente; Tatsächlich heben neuere Veröffentlichungen hervor, dass die toxikologische Reaktion von Zellen in 3D-Kultur dem Primärgewebe ähnlicher ist als die in 2D-Flachkultur24,25. Zellen wurden dann zu bestimmten Zeitpunkten gesammelt und eine nukleare Isolierung durchgeführt. Dann wurden Histone extrahiert und mit Propionanhydrid vor und nach der Trypsinverdauung nach einem Protokoll abgeleitet, das zuerst von Garcia et al.26 entwickelt wurde. Dieses Verfahren erzeugt Peptide in geeigneter Größe für die Online-Trennung mit Umkehrphasenchromatographie (C18) und den Nachweis mit MS. Schließlich wurden Histonpeptide identifiziert und quantifiziert, und die generierten Daten wurden auf vielfältige Weise für eine vollständigere biologische Interpretation dargestellt.

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Protocol

1. Herstellung von Puffern und Reagenzien

  1. Zellwachstumsmedien (für HepG2/C3A-Zellen): Fügen Sie fötales Rinderserum (FBS) (10% v/v), nicht-essentielle Aminosäuren (1% v/v), L-Glutamin-Ergänzung (1% v/v) und Penicillin/Streptomycin (0,5% v/v) zu Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM, mit 4,5 g/L Glukose) hinzu. Wachstumsmedien werden bei 4 °C für maximal 2 Wochen gelagert.
  2. 200 mM Natriumbutyrat (NaBut)-Lösung: Zur Herstellung von 10 ml werden 220,18 mg NaBut in 10 ml ddH2O resuspendiert. 1 ml Aliquots bei -20 °C lagern. Vor der Zellbehandlung die Lösung mit einem 0,45-mm-Spritzenfilter filtrieren und 1 ml der gefilterten Lösung in 9 ml Zellwachstumsmedien für eine Arbeitskonzentration von 20 mM geben.
  3. 100 mM Natriumsuccinat (NaSuc)-Lösung: Zur Herstellung von 10 ml werden 162,05 mg NaSuc in 10 ml ddH2O resuspendiert. 1 mL Aliquots bei -20 °C lagern. Vor der Zellbehandlung wird die Lösung mit einem 0,45-mm-Spritzenfilter filtriert und 1 ml der filtrierten Lösung in 9 ml Zellwachstumsmedien für eine Arbeitskonzentration von 10 mM gegeben.
  4. Kalt 0,2 m H2SO 4: Um 1 L vorzubereiten, fügen Sie 10 ml konzentriertesH2 SO4 bis 990 ml HPLC-Wasser hinzu. Bei 4 °C lagern.
  5. Kaltes Aceton + 0,1% Salzsäure (HCl): Aceton wird konzentriertes HCl (0,1% v/v) zugesetzt. Bei 4 °C lagern.
  6. 100 mM NH 4 HCO3-Lösung, pH 8,0: Zur Herstellung von 1 L werden 7,91 g NH4HCO3 in 1 LHPLC-Wasser resuspendiert. Lagern Sie 50 ml Aliquots bei -20 °C.
  7. 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) Lösung: Fügen Sie konzentriertes TFA (0,1% v / v) zu HPLC-Wasser hinzu. Bei 4 °C lagern.
  8. 60% Acetonitril / 0,1% TFA-Lösung: Fügen Sie HPLC-Acetonitril (60% v / v) zu HPLC-Wasser hinzu. Dann fügen Sie dieser Lösung konzentriertes TFA (0,1% v/v) hinzu. Bei 4 °C lagern.
  9. 2% HPLC-Acetonitril + 0,1% Ameisensäure: Fügen Sie HPLC-Acetonitril (2% v / v) zu HPLC-Wasser hinzu. Dann fügen Sie dieser Lösung konzentrierte Ameisensäure (0,1% v/v) hinzu.
  10. 80% Acetonitril in HPLC-Qualität + 0,1% Ameisensäure: Fügen Sie HPLC-Acetonitril (80% v / v) zu HPLC-Wasser hinzu. Dann fügen Sie dieser Lösung konzentrierte Ameisensäure (0,1% v/v) hinzu.

2. Vorbereitung des 3D-Kultursystems

HINWEIS: Verschiedene Zellen, primäre oder immortalisierte, haben unterschiedliche Kultureigenschaften, so dass die Bildung von Sphäroiden zwischen den Zelltypen unterschiedlich sein kann. Dieses Protokoll wurde für die HepG2/C3A-Sphäroidbildung unter Verwendung von Bioreaktoren und einem innovativen 3D-Zellkultursystem etabliert.

  1. Züchten Sie Zellen mit Standard-Wachstumsmedien als Monolayer, bis sie zu 80% konfluent sind.
  2. Waschen Sie Zellen mit HBSS (5 ml für einen 75 cm 2 Kolben) und inkubieren Sie Zellen mit 5 ml 0,05% Trypsin-EDTA, verdünnt in HBSS (1:2 Verdünnung) für 5 min bei 37 oC mit 5% CO2.
  3. Überprüfen Sie die Zellablösung unter einem Mikroskop und neutralisieren Sie Trypsin durch Zugabe von 3 ml fetalem Rinderserum (FBS) oder Wachstumsmedien (mit 5% -10% FBS).
  4. Zählen Sie die Anzahl der Zellen und verdünnen Sie die Zellsuspension, um 1 x 106 Zellen in einem maximalen Volumen von 1,5 ml zu erhalten.
  5. Gleichen Sie eine extrem niedrige 24-Well-Rundbodenplatte (die mehrere Mikrovertiefungen pro Vertiefung enthält) aus, indem Sie die Vertiefungen mit 0,5 ml Wachstumsmedien waschen. Zentrifen Sie die Platte für 5 min bei 3.000 x g, um Luftblasen von der Oberfläche des Bohrlochs zu entfernen.
  6. Die Zellsuspension für 3 min bei 120 x g in die Platte und Zentrifuge geben.
  7. Inkubieren Sie die Platte für 24 h bei 37 °C mit 5% CO2 zur Sphäroidbildung. In der Zwischenzeit gleichen Sie den Bioreaktor aus, indem Sie die Feuchtekammer mit 25 ml sterilem Wasser und die Zellkammer mit 9 ml Wachstumsmedien füllen.
  8. Inkubieren Sie den Bioreaktor, rotierend im Clinostat-Inkubator, für 24 h bei 37 °C mit 5% CO2.

3. Wachstum von Sphäroiden in Bioreaktoren

HINWEIS: Um die Struktur von Sphäroiden zu erhalten, werden breite Bohrungsspitzen für die Handhabung der 3D-Strukturen verwendet.

  1. Lösen Sie die Sphäroide von der extrem niedrigen Befestigungsplatte, indem Sie sie vorsichtig mit 1 ml breiten Bohrungsspitzen auf und ab pipettieren und in eine mit Gewebekultur behandelte Schale geben.
  2. Waschen Sie den Teller mit 0,5 ml vorgewärmten Wachstumsmedien und geben Sie ihn in dieselbe Schale.
  3. Bewerten Sie die Qualität von Sphäroiden durch Mikroskopie und wählen Sie ausreichend ausgebildete Sphäroide aus. Gute Qualität Sphäroide haben eine gleichmäßige Größe, Kompaktheit und Rundheit.
  4. Übertragen Sie Sphäroide in äquilibrierte Bioreaktoren, die mit 5 ml frischem Wachstumsmedium gefüllt sind. Nach dem Transfer der Sphäroide den Bioreaktor vollständig mit frischen Wachstumsmedien füllen.
  5. Platzieren Sie den Bioreaktor im Clinostat-Inkubator und stellen Sie die Drehzahl auf 10-11 U / min ein.
  6. Tauschen Sie Wachstumsmedien alle 2-3 Tage aus, indem Sie 10 ml alte Medien entfernen und durch 10 ml neue Medien ersetzen.
  7. Passen Sie die Rotationsgeschwindigkeit entsprechend dem Sphäroidwachstum an und nehmen Sie zu, wenn die Sphäroide an Größe und Anzahl zunehmen.
  8. Nach 18 Tagen in Kultur sind die Sphäroide bereit für die Behandlung und/oder Sammlung

4. Sphäroide Behandlung und Sammlung

HINWEIS: In diesem Protokoll werden HepG2 / C3A-Sphäroide mit Natriumbutyrat (NaBut) und Natriumsuccinat (NaSuc) behandelt, um die Konzentrationen von Histonmarkierungen zu bewerten, die Acetylierung bzw. Succinylierung enthalten.

  1. Bereiten Sie Wachstumsmedien mit der entsprechenden Arbeitskonzentration der Verbindung vor (z. B. 20 mM NaBut oder 10 mM NaSuc). Tauschen Sie die Medien im Bioreaktor mit den behandelten Medien aus.
    HINWEIS: Um eine Kontrollbedingung zu schaffen, sammeln Sie entweder genügend Sphäroide für Experimente, bevor Sie die Behandlung hinzufügen, oder bestimmen Sie einen Bioreaktor für unbehandelte Sphäroide.
  2. Sammeln Sie Sphäroide für die Proteomanalyse nach ausreichender Behandlungszeit (z. B. 48 h bis 1 Woche für die NaSuc-Behandlung oder 48-72 h für die NaSbut-Behandlung).
    HINWEIS: Für die Histonextraktion mit diesem Protokoll wurden sechs bis acht Sphäroide mit etwa 1 x 106 Zellen gesammelt.
    1. Entfernen Sie 3-5 ml Medien aus dem Bioreaktor durch den oberen Anschluss.
    2. Öffnen Sie den Frontanschluss und verwenden Sie eine 1 ml breite Bohrungsspitze, um Sphäroide zu entfernen und in Mikrozentrifugenröhrchen zu legen.
    3. Zentrifugieren Sie die Sphäroide bei 100 x g für 5 min und entsorgen Sie Medien.
      HINWEIS: Das Medium im Bioreaktor kann gewechselt werden und der Bioreaktor kann für zusätzliche Behandlungszeit oder Erholung in den Inkubator zurückgebracht werden.
    4. Waschen Sie Sphäroide mit 200 μL HBSS, um das FBS zu entfernen. 5 min bei 100 x g zentrifugieren und den Überstand entfernen.
      HINWEIS: Sphäroide können bis zur Verarbeitung bei -80 °C gelagert werden.

5. Histon-Extraktion

HINWEIS: Die vielen basischen Aminosäurereste, die in Histonen vorhanden sind, ermöglichen es ihnen, eng mit der DNA zu interagieren, die ein Phosphorsäure-Rückgrat hat. Da Histone zu den grundlegendsten Proteinen im Zellkern gehören, kommt es bei der Extraktion mit eiskalter Schwefelsäure (0,2 MH2SO 4) zu einer minimalen Kontamination. Die Nicht-Histon-Proteine fallen in starker Säure aus. Hochkonzentrierte Trichloressigsäure (TCA), die auf eine Endkonzentration von 33% verdünnt wird, wird anschließend verwendet, um die Histone aus der Schwefelsäure auszufällen. Bewahren Sie alle Proben, Röhrchen und Reagenzien während der gesamten Histonextraktion auf Eis auf.

  1. Fügen Sie fünf Volumina (~ 100 μL) kalte 0,2 M H2SO4 zum Zellpellet (~ 10-20 μL) hinzu und pipettieren Sie es auf und ab, um das Pellet zu stören und Histone freizusetzen.
  2. Inkubationsschläuche für bis zu 4 h bei konstanter Drehung oder Schütteln bei 4 °C.
    HINWEIS: Für resuspendierte Proben mit einem Volumen von mehr als 500 μL reicht eine Inkubation von 2 h aus, um Histone zu extrahieren (eine längere Inkubation kann zur Extraktion anderer basischer Kernproteine führen). Für resuspendierte Proben mit einem Volumen von weniger als 200 μL ist für eine bessere Ausbeute eine 4-stündige Inkubation erforderlich.
  3. Zentrifuge bei 3.400 x g für 5 min bei 4 °C. Sammeln Sie den Überstand in einer neuen Tube und entsorgen Sie das Pellet später.
  4. Fügen Sie kaltes konzentriertes TCA hinzu, so dass es ein letztes 25% -33% v / v (z. B. 40-60 μL kaltes TCA: 120 μL Überstand) ausmacht und mischen Sie, indem Sie das Rohr einige Male umkehren.
  5. Inkubationsschläuche für mindestens 1 h bei konstanter Rotation oder Schütteln bei 4 °C.
    HINWEIS: Für kleinere Startpelletgrößen wird eine Inkubation über Nacht empfohlen.
  6. Zentrifuge bei 3.400 x g für 5 min bei 4 °C. Überstände durch Pipettieren verwerfen. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab; Berühren Sie nicht die Seiten des Rohres oder des Pellets.
    HINWEIS: Histone lagern sich sowohl an den Seiten als auch am Boden des Rohres ab. Das weiße, unlösliche Pellet, das ganz unten im Rohr gebildet wird, enthält hauptsächlich Nicht-Histon-Proteine und andere Biomoleküle.
  7. Waschen Sie das Rohr (Wände und Pellets) mit kaltem Aceton + 0,1% HCl mit einer Pasteur-Pipette aus Glas (~ 500 μL / Röhrchen).
  8. Zentrifuge bei 3.400 x g für 5 min bei 4 °C. Überstand verwerfen, indem Sie das Röhrchen umdrehen.
  9. Waschen Sie das Rohr (Wände und Pellet) mit 100% kaltem Aceton mit einer Pasteur-Pipette aus Glas (~ 500 μL / Röhrchen). Zentrifuge bei 3.400 x g für 5 min bei 4 °C.
  10. Verwerfen Sie den Überstand, indem Sie die Röhre umdrehen und das verbleibende Aceton pipettieren. Öffnen Sie den Deckel und trocknen Sie die Probe auf der Bank für ~ 20 Minuten an der Luft.
  11. Fahren Sie mit der Propionylierung fort oder lagern Sie die Proben bis zur Verwendung in -80 °C.

6. Erste Runde der Derivatisierung

HINWEIS: Die Verwendung von Trypsin zur Verdauung von Histonproteinen führt zu übermäßig kleinen Peptiden, die mit herkömmlichen Proteomik-Setups schwer zu identifizieren sind. Aus diesem Grund wird Propionsäureanhydrid verwendet, um die ɛ-Aminogruppen von unmodifizierten und Monomethyllysinresten chemisch zu derivatisieren. Dies beschränkt die Trypsin-Proteolyse auf C-terminale Argininreste. Für Proben in 96-Well-Platten wird die Verwendung von Mehrkanalpipetten und Reservoirs für die Reagenzaufnahme empfohlen (Abbildung 2A). Die Derivatisierung wird auch nach der Verdauung durchgeführt, um die freien N-Termini der Peptide zu markieren, wodurch die Peptidhydrophobie und damit die chromatographische Retention der Umkehrphase erhöht wird.

  1. Resuspendieren Sie Proben in 20 μL von 15% -20% Acetonitril in 100 mM Ammoniumbicarbonat (pH 8,0). Wirbeln Sie für 15 s und drehen Sie sich dann bei 1.000 x g für 30 s nach unten.
  2. Wenn es acht oder mehr Proben gibt, übertragen Sie jede resuspendierte Probe in eine 96-Well-Platte.
    HINWEIS: Wenn die Proben nicht auf eine 96-Well-Platte übertragen wurden, kann eine Einkanalpipette in den Schritten 6.3-6.7, 7.1-7.5 und 8.1-8.5 verwendet werden.
  3. Unter der Haube 2 μL Propionanhydrid mit einer Mehrkanalpipette hinzufügen. Mischen Sie, indem Sie 5x nach oben und unten pipettieren.
  4. Fügen Sie schnell 10 μL Ammoniumhydroxid mit einer Mehrkanalpipette hinzu. Mischen Sie, indem Sie 5x nach oben und unten pipettieren.
    HINWEIS: Propionsäure ist ein Produkt der Reaktion zwischen Propionanhydrid und freien Aminen aus Peptiden und kann den pH-Wert der Probe senken. pH 8 kann durch Zugabe von Ammoniumhydroxid zur Probe in einem Verhältnis von 1:5 (v/v) wiederhergestellt werden.
  5. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert 8 beträgt, indem Sie pH-Testpapier verwenden. Wenn der pH-Wert 8 <, stellen Sie ihn durch Zugabe von 1 μL Ammoniumhydroxid ein. Wenn der pH-Wert 8 >, wird durch Zugabe von 1 μL Ameisen- oder Essigsäure eingestellt. Bei pH-> 10 ist die Markierung anderer Aminosäurereste mit höherem pKa möglich.
  6. Bei Raumtemperatur 10 min inkubieren.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 6.3 bis 6.6. Eine doppelte Runde Histonpropionylierung gewährleistet eine nahezu vollständige Reaktionseffizienz.
  8. Trocknen Sie die Platte im Geschwindigkeitsvakuum, bis alle Vertiefungen vollständig getrocknet sind (~ 9 h).
  9. Fahren Sie mit dem Trypsinaufschluss fort oder lagern Sie die Proben bis zur Verwendung bei -80 °C.

7. Histon-Verdauung

HINWEIS: Histone werden mit Trypsin, das an der Carboxylseite von Arginin- und Lysinresten schneidet, zu Peptiden verdaut. Da die Propionylierung jedoch Lysinreste modifiziert, werden nur Argininreste gespalten (Abbildung 2B).

  1. Es wird eine Trypsinlösung (25 ng/μL in 50 mM NH 4 HCO3, pH 8,0)hergestellt. 20 μL Trypsin (500 ng) zu jeder Probe geben.
    1. Zur Herstellung einer 50 mM NH 4HCO 3-Lösung verdünnen Sie 100 mM NH4HCO 3-Lösung1:1 v/v mit Wasser inHPLC-Qualität.
  2. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert 8 beträgt, indem Sie pH-Testpapier verwenden. Wenn der pH-Wert 8 <, stellen Sie ihn durch Zugabe von 1 μL Ammoniumhydroxid ein. Wenn der pH-Wert 8 >, wird durch Zugabe von 1 μL Ameisen- oder Essigsäure eingestellt.
  3. Bei Raumtemperatur über Nacht auflaufen lassen oder bei 37 °Cfür 6-8 h inkubieren.
  4. Wenn möglich, überprüfen Sie den pH-Wert nach ~ 3 h der Verdauung, da er möglicherweise abgenommen hat. Wenn der pH-Wert 8 <, stellen Sie ihn durch Zugabe von 1 μL Ammoniumhydroxid ein.
  5. Fügen Sie weitere 5 μL 50 ng/μL Trypsinlösung (250 ng) hinzu und setzen Sie die Verdauung fort.
  6. Fahren Sie mit der zweiten Runde der Propionylierung fort oder lagern Sie die Proben bei -80 °C bis zur Verwendung.

8. Derivatisierung von Peptid-N-Termini

HINWEIS: Die Propionylierung von Histonpeptiden an ihrem N-Terminus verbessert die Retention der kürzesten Peptide durch Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie (z. B. Aminosäuren 3-8 von Histon H3), da die Propionylgruppe die Peptidhydrophobie erhöht.

  1. Unter der Haube 2 μL Propionanhydrid mit der Mehrkanalpipette hinzufügen. Mischen Sie, indem Sie 5x nach oben und unten pipettieren.
  2. Fügen Sie schnell 10 μL Ammoniumhydroxid mit der Mehrkanalpipette hinzu. Mischen Sie, indem Sie 5x nach oben und unten pipettieren.
    HINWEIS: Propionsäure ist ein Produkt der Reaktion zwischen Propionanhydrid und freien Aminen aus Peptiden und kann den pH-Wert der Probe senken. pH 8 kann durch Zugabe von Ammoniumhydroxid zur Probe in einem Verhältnis von 1:5 (v/v) wiederhergestellt werden.
  3. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert 8 beträgt, indem Sie pH-Testpapier verwenden. Wenn der pH-Wert 8 <, stellen Sie ihn durch Zugabe von 1 μL Ammoniumhydroxid ein. Wenn der pH-Wert 8 >, wird durch Zugabe von 1 μL Ameisen- oder Essigsäure eingestellt. Bei pH-> 10 ist die Markierung anderer Aminosäurereste mit höherem pKa möglich.
  4. Bei Raumtemperatur 10 min inkubieren.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 8.1 bis 8.4. Eine doppelte Runde Histonpropionylierung gewährleistet eine nahezu vollständige Reaktionseffizienz.
  6. Trocknen Sie die Platte im Geschwindigkeitsvakuum, bis alle Vertiefungen vollständig getrocknet sind (~ 9 h).
  7. Fahren Sie mit dem Entsalzungsschritt fort oder lagern Sie die Proben bei -80 °C bis zur Verwendung.

9. Entsalzen und Probenreinigung

HINWEIS: Salze, die in der Probe vorhanden sind, stören die massenspektrometrische Analyse. Salze werden auch während des Elektrosprays ionisiert und können Signale von Peptiden unterdrücken. Salze können ionische Addukte auf Peptiden bilden, die dazu führen, dass das adduktierte Peptid eine andere Masse hat. Dies reduziert die Signalintensität des Peptids und verhindert eine ordnungsgemäße Identifizierung und Quantifizierung. Der Aufbau für die Entsalzung ist in Abbildung 2C dargestellt.

  1. Beginnen Sie mit dem Mischen des HLB-Harzes (50 mg / ml in 100% Acetonitril) auf einer magnetischen Rührplatte.
  2. Stellen Sie sicher, dass sich unter der 96-Well-Polypropylen-Filterplatte eine 96-Well-Auffangplatte befindet, um den Durchfluss zu erfassen.
  3. Geben Sie 70 μL HLB-Suspension pro Vertiefung auf die Filterplatte. Schalten Sie das Vakuum vorsichtig ein, um ein Spritzen zu verhindern. Verwerfen Sie den Flow-Through.
  4. Waschen Sie das Harz mit 100 μL 0,1% TFA. Schalten Sie das Vakuum vorsichtig ein, um ein Spritzen zu verhindern. Verwerfen Sie den Flow-Through.
  5. Resuspendiert jede Probe in 100 μL von 0,1% TFA. Überprüfen Sie den pH-Wert; es sollte ~ 2-3 sein.
  6. Laden Sie jede Probe in jede Vertiefung. Schalten Sie den Staubsauger vorsichtig ein, um ein Spritzen zu verhindern. Verwerfen Sie den Flow-Through.
  7. Mit 100 μL 0,1% TFA waschen. Schalten Sie den Staubsauger vorsichtig ein, um ein Spritzen zu verhindern. Verwerfen Sie den Flow-Through.
  8. Ersetzen Sie die Sammelplatte durch eine neue Sammelplatte mit 96 Wells.
  9. Fügen Sie 60 μL 60% Acetonitril / 0,1% TFA pro Vertiefung hinzu. Schalten Sie den Staubsauger vorsichtig ein, um ein Spritzen zu verhindern. Sammeln Sie den Durchfluss und trocknen Sie ihn in einem Geschwindigkeitsvakuum.
  10. Fahren Sie mit LC-MS/MS fort oder lagern Sie die Proben bei -80 °C bis zur Verwendung.

10. Histonpeptidanalyse mittels Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie

  1. Bereiten Sie die mobilen Phasen für die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) vor. Mobile Phase A (MPA): 2% HPLC-Acetonitril + 0,1% Ameisensäure. Mobile Phase B (MPB): 80% HPLC-Acetonitril + 0,1% Ameisensäure.
  2. Programmieren Sie die HPLC-Methode wie folgt: (1) 4%-34% MPB über 30 min; (2) 34%-90% MPB über 5 min; und (3) isokratische 90% MPB für 5 min. Verwenden Sie die folgenden empfohlenen Säuleneigenschaften: C18 3 μm Packmaterial, 75 μm Innendurchmesser, 20-25 cm Länge. Stellen Sie die Durchflussrate für Nanosäulen mit einem Innendurchmesser von 75 μm auf 250-300 nL/min ein.
    1. Für den Fall, dass die HPLC nicht so programmiert ist, dass sie die Säulengleichsetzung vor dem Laden der Proben automatisiert, schließen Sie (4) 90% -4% MPB über 1 min und (5) isokratische 4% MPB über 10 min ein.
  3. Programmieren Sie die MS-Akquisitionsmethode.
    1. Stellen Sie sicher, dass das Gerät zu Beginn jedes Tastzyklus einen vollständigen MS-Scan durchführt. Hochauflösende Instrumente (z. B. Orbitrap- oder Time-of-Flight-Analysatoren) werden aufgrund der Massengenauigkeit, die bei der Signalextraktion verwendet werden kann, empfohlen. Instrumentierung mit niedriger Auflösung kann jedoch auch wie zuvor beschriebenverwendet werden 27,28.
    2. Stellen Sie sicher, dass auf den vollständigen MS-Scan 16 MS/MS-Scanereignisse mit einer Isolationsbreite von jeweils 50 m/z folgen, die den m/z-Bereich von 300-1100 abdecken. Zum Beispiel sollte der erste Scan Signale bei 300-350 m/z isolieren, der zweite bei 350-400 m/z usw. Wenn möglich, erfassen Sie MS/MS-Scans auch in hoher Auflösung, aber eine geringere Auflösung im Vergleich zum vollständigen MS-Scan ist ausreichend (aufgrund der geringeren Massen von Fragmentionen im Vergleich zu intakten Ionen).
    3. Die HPLC-Methode erzeugt chromatographische Signale mit Spitzenbreiten von ~3-40 s; Um eine ordnungsgemäße Signalquantifizierung zu gewährleisten, stellen Sie sicher, dass das Massenspektrometer mindestens 10 Tastzyklen pro chromatographischem Peak ausführt (d. h. ein Tastverhältnis von 3 s oder schneller).
    4. Wenn Sie einen Massenanalysator im Übernahmestil (Orbitrap, Ionenfalle) verwenden, stellen Sie sicher, dass die Ioneninjektionszeitgrenze auf <200 ms eingestellt ist. Bei anderen Analysatoren (Quadrupol, Time-of-Flight) ist dies aufgrund ihrer schnelleren Scanzeit kein Problem. Möglicherweise ist ein Vortest erforderlich.
      HINWEIS: Weitere Einzelheiten zu MS-Methoden zur Histonpeptidanalyse finden Sie in den folgenden Referenzen27,28,29.
  4. Resuspendierte Probe in 10 μL MPA, was ~ 1 μg/μL verdauter Histonprobe entspricht. Die genaue Beladungsmenge ist nicht kritisch (auch nicht trivial zu beurteilen), wenn alle Proben in der Charge mit ähnlichen Verdünnungen und Volumina geladen werden.
  5. Laden Sie 1 μL Probe auf die HPLC-Säule.
  6. Führen Sie die in den Schritten 10.1-10.3 programmierte LC-MS/MS-Methode aus.

11. Datenanalyse

  1. Importieren Sie die MS-Rohdatendateien in eine Software, die für die Integration in Spitzenbereiche entwickelt wurde.
    HINWEIS: EpiProfile30,31 wird in der aktuellen Studie verwendet und wird allgemein empfohlen, da es für eine zuverlässige Peak-Area-Extraktion bekannter Histonpeptide optimiert ist. Es eignen sich jedoch auch andere frei verfügbare Software für die extrahierte Ionenchromatographie wie Skyline32,33.
  2. Berechnen Sie die relative Häufigkeit eines gegebenen (un)modifizierten Peptids als die Fläche eines einzelnen Peptids dividiert durch die Gesamtfläche des Peptids in all seinen modifizierten Formen. Software wie EpiProfile 30,31 enthält bereits Bibliotheken von Peptiden zur Signalextraktion. Andernfalls generieren Sie eine Bibliothek von Peptiden von Interesse, entweder manuell oder über die Peptididentifizierung unter Verwendung von Routine-Proteomik-Pipelines.

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Representative Results

In diesem Protokoll wurden HepG2/C3A-Sphäroide mit 20 mM NaBut und 10 mM NaSuc behandelt, die beide die globalen Konzentrationen von Histon-PTMs beeinflussten (Abbildung 3A). Histon-PTMs wurden dann identifiziert und auf Einzelrückstandsebene mittels MS/MS-Erfassung quantifiziert (Abbildung 3B).

Wenn Stichproben in Replikaten ausgeführt werden, kann eine statistische Analyse durchgeführt werden, um die Anreicherung der Faltenänderung eines PTM zwischen den Proben sowie die Reproduzierbarkeit der Beobachtung zu bewerten. Die gezeigten Daten zeigen, dass mit Acetylierungen modifizierte Peptide in mit NaBut behandelten Sphäroiden gegenüber der Kontrolle angereichert sind (Abbildung 3C), während mit NaSuc behandelte Proben eine höhere relative Häufigkeit von Histonpeptiden aufweisen, die mit Lysinprägnylierung modifiziert sind (Abbildung 3D). Diese Berechnungen wurden in einem Tabellenkalkulationsprogramm durchgeführt, wie in einer separaten Veröffentlichung34 beschrieben. Ein Gesamtanstieg einer gegebenen Histonmodifikation kann besser in Radardiagrammen dargestellt werden, wo die Beobachtung einer höheren globalen Häufigkeit einer bestimmten Modifikation intuitiver wird, selbst wenn detaillierte Informationen über die analysierten Modifikationsstellen beibehalten werden (Abbildung 3E, F).

Dieses Protokoll erzeugt ein Peptid aus Histon-H3-Aminosäureresten 9-17, zu denen die häufig modifizierten Reste K9, S10 und K14 gehören. Die gezeigten Daten deuten darauf hin, dass die Behandlung mit NaBut die H3K14ac-Spiegel erhöht, jedoch nur bei Histonen, die mit H3K9me2 und nicht mit H3K9me3 komodifiziert wurden (Abbildung 4A). Die Koexistenzfrequenz zwischen zwei Modifikationen kann intuitiver als Ringgraph dargestellt werden, wobei die Knoten einzelne Modifikationen darstellen, während die Dicke der Verbindungsleitungen die Koexistenzfrequenz zwischen den beiden PTMs darstellt (Abbildung 4B). Manchmal wird die Koexistenzhäufigkeit nicht beeinflusst, aber Daten, die als Balkendiagramme dargestellt werden, können irreführend sein. Zum Beispiel zeigen die in Abbildung 4A dargestellten Daten, dass die Kombination H3K9me2K14ac bei der NaAber-Behandlung häufiger vorkommt als bei der Kontrolle. Dies ist richtig, aber diese gegebene Kombination ist die häufigste, unabhängig von der Behandlung. Abbildung 4B zeigt deutlich, dass H3K9me2K14ac und H3K9me3K14ac die häufigsten kombinatorischen Muster sind, unabhängig von der Behandlung (Liniendicke), aber dass sich die globalen Konzentrationen von H3K14ac (Knoten) im Experiment wirklich ändern.

Dieses Protokoll erzeugt ein Peptid aus Histon-H4-Resten 4-17, das modifizierbare Reste an den Positionen K5, K8, K12 und K16 (meist durch Acetylierungen) enthält. Beim Vergleich von Kontrolle und NaAber-Behandlung ist es möglich, eine Zunahme der Kombinationen von Acetylierungen zu beobachten, indem Daten wie beispielsweise Wortwolken dargestellt werden (Abbildung 4C). Diese Darstellung unterstreicht deutlich, dass die unmodifizierte Version von Histon H4 in der Kontrollprobe am häufigsten vorkommt, während mit NaBut behandelte Sphäroide mit doppelt-, dreifach- und vierfach acetylierten Histon-H4-Proteoformen angereichert sind. Wortwolken sind jedoch in der Anzeige exakter Werte begrenzt. Die relative Häufigkeit eines Histoncodes sollte durch die Größe des Textes, die möglicherweise falsch geschätzt wird, entfaltet werden. Daher können Venn-Diagramme oder modernere Äquivalente wie UpSetR-Darstellung35 verwendet werden, um die genaue Quantifizierung von koexistierenden Histon-PTMs zu zeigen (Abbildung 4D, E). Die gezeigten Daten unterstreichen einmal mehr, dass ausgewählte Kombinationen von Acetylierungen auf Histon H4 in der NaBut Behandlung im Vergleich zur Kontrolle relativ häufiger vorkommen.

Figure 1
Abbildung 1: Workflow für die Histonpeptidanalyse von 3D-Sphäroiden. HepG2/C3A-Zellen werden zunächst in 2D-Kultur gezüchtet, bis sie eine 80%ige Konfluenz erreichen. Die Zellen werden dann in einen ausgeglichenen Bioreaktor überführt und in den Clinostat-Inkubator gebracht, wo sie sich mit 10-11 U / min drehen, um Sphäroide zu bilden. Nach 18 Tagen werden die Sphäroide entweder mit 20 mM NaBut oder 10 mM NaSuc behandelt und nach den entsprechenden Zeitpunkten geerntet. Aus den Zellen werden Kerne isoliert und die Histonextraktion mit 0,2 MH2SO4 durchgeführt. Die Histonderivatisierung wird dann mit Propionanhydrid vor und nach dem Trypsinaufschluss durchgeführt, um die Retention der resultierenden kurzen Peptide durch Flüssigkeitschromatographie sicherzustellen. Die Proben werden entsalzt und dann mit der in Schritt 10 erwähnten LC-MS/MS-Methode ausgeführt, und die resultierenden Daten werden wie in Schritt 11 beschrieben analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Aufbau für Propionylierungs- und Entsalzungsschritte . (A) Die Propionylierung erfolgt in einem Abzug und alle Komponenten sind so angeordnet, dass die Schritte in schneller Folge durchgeführt werden können. (B) Schematische Darstellung der ersten Runde der Propionylierung, der Trypsin-Verdauung und der zweiten Runde der Propionylierung am Histon-H3.1-Schwanz. (C) Die Entsalzung erfolgt auf der Bank mit einem 96-Well-Vakuumverteiler und einer 96-Well-Polypropylen-Filterplatte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Darstellung der einzelnen Histonmodifikationen . (A) Balkendiagramm, das die relative Häufigkeit gemeinsamer globaler Histonmodifikationen in Kontrolle und behandelten (20 mM NaBut oder 10 mM NaSuc) HepG2/C3A-Sphäroide zeigt. (B) Balkendiagramm, das die Häufigkeit von Einzelhiston-PTMs zeigt, die auf Rückständen von 9-17 Histon-H3-Peptid (KSTGGKAPR) in kontrollierten und behandelten (20 mM NaBut oder 10 mM NaSuc) HepG2/C3A-Sphäroiden vorkommen. (C,D) Vulkandiagramme, die die Faltenänderung und die Bedeutung der differentiellen Expression von Histonpeptid-PTMs nach der Behandlung mit 20 mM NaBut (C) oder 10 mM NaSuc (D) zeigen. Hervorgehobene blaue und grüne Punkte stellen acetylierte bzw. prägnante Reste dar. (E,F) Radardiagramme, die die Häufigkeit der Einzelhistonpeptidacetylierung (E) oder Succinylierung (F) nach der Behandlung mit 20 mM NaBut bzw. 10 mM NaSuc im Vergleich zur Kontrolle zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Darstellung von koexistierenden Histonmodifikationen. (A) Balkendiagramm, das die Häufigkeit kombinatorischer Histon-PTMs zeigt, die auf Rückständen von 9-17 Histon-H3 (KSTGGKAPR) in kontrollierten und behandelten (20 mM NaBut oder 10 mM NaSuc) HepG2/C3A-Sphäroiden vorkommen. (B) Ringgraphen, die die Beziehung zwischen kombinatorischen Histon-PTMs auf Resten 9-17 von Histon H3 (KSTGGKAPR) in der Kontrolle und behandelten (20 mM NaBut) HepG2/C3A-Sphäroiden zeigen. Die Intensität der Knotenfarbe entspricht der Häufigkeit eines einzelnen PTM innerhalb seiner Behandlungsgruppe, während die Liniendicke der Häufigkeit des PTM-Co-Auftretens entspricht. (C) Wortwolken, die die Häufigkeit von kombinatorischen Histon-PTMs auf Histon-H4-Rückständen in kontrollierten und behandelten (20 mM NaBut) HepG2/C3A-Sphäroiden zeigen. Die Größe des Textes entspricht der Häufigkeit des angegebenen kombinatorischen PTM. (D,E) Venn-Diagramm, das die Häufigkeit koexistierender Modifikationen an Histon-H4-Peptidresten 4-17 in kontrollierten und 20 mM NaBut behandelten Proben darstellt. Die Daten werden mit der ShinyApp UpSetR35 angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Tabelle 1: Liste der mit diesem Protokoll nachgewiesenen Peptide. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

Die Analyse von Histon-PTMs unterscheidet sich grundlegend von der typischen Proteomik-Analysepipeline. Die meisten Histon-PTMs haben immer noch rätselhafte biologische Funktionen; Infolgedessen sind Annotationen wie Gene Ontology oder Pathway-Datenbanken nicht verfügbar. Es gibt mehrere Ressourcen, die Histonmodifikationen mit dem Enzym assoziieren, das für ihre Katalyse verantwortlich ist, oder mit Proteinen, die Domänen enthalten, die diese PTMs binden (z. B. HISTome36). Es ist auch möglich, über den Gesamtzustand des Chromatins zu spekulieren, wenn die globalen Histon-PTM-Spiegel reguliert werden. Zum Beispiel ist ein Gesamtanstieg der Histonacetylierung oder anderer Acylierungen wie der Succinylierung normalerweise mit der Chromatin-Dekondensation verbunden37,38.

Die MS-Analyse liefert detailliertere Informationen über diese Modifikationen, wie z.B. ihre genaue Lokalisierung auf der Aminosäuresequenz. In diesem Protokoll wird die MS/MS-Erfassung verwendet, um Histon-PTMs zu identifizieren und zu quantifizieren, was für die biologische Interpretation entscheidend sein kann. Zum Beispiel wird die Trimethylierung an Lysin 4 von Histon H3 (H3K4me3) auf Promotoren von aktiv transkribierten Genen39 angereichert, während die gleiche Modifikation an Lysin 9 (H3K9me3) konstitutives Heterochromatin40 vergleicht. Histon-Modifikationen werden derzeit als Biomarker bei bestimmten Krankheiten eingesetzt; Daher kann die Histonanalyse verwendet werden, um die Krankheitspathologie zusätzlich zum Ansprechen auf die Behandlung (z. B. mit epigenetischen Medikamenten) zu untersuchen41,42.

Es ist schwieriger, Interaktionen zwischen mehreren PTMs im Gegensatz zu einzelnen PTMs visuell darzustellen. Während vorhandene Diagramme wie Ringdiagramme die Koexistenzfrequenz von zwei PTMs anzeigen können, können sie die Koexistenzfrequenz zwischen mehr als zwei PTMs gleichzeitig nicht darstellen, da dies eine dreidimensionale Darstellung des Netzwerks erfordern würde. Aus diesem Grund könnten andere Darstellungen besser geeignet sein, um Änderungen in Histoncodes hervorzuheben, wenn drei oder mehr PTMs berücksichtigt werden. Im Allgemeinen bietet die Diversifizierung der Datendarstellung höhere Chancen, signifikante Veränderungen zwischen Stichproben zu beobachten. Dieses Protokoll enthält Beispiele für verschiedene Illustrationen zur Darstellung von Vorschriften für Histon-PTMs und koexistierende PTMs.

Obwohl dieses Protokoll aufgrund der Trypsin-Verdauung relativ kleine Histonpeptide erzeugt (ca. 4-20 Aminosäuren), enthalten ausgewählte Peptide mehrere modifizierbare Reste. Die Analyse dieser Peptide ermöglicht die Quantifizierung von Koexistenzhäufigkeiten von PTMs, was wichtige Informationen darüber liefern könnte, welche kombinatorischen Histonmarkierungen in einem gegebenen Datensatz reguliert werden. Insbesondere gibt es während der Probenvorbereitung keine Schritte, bei denen eine Quantifizierung der Histone durchgeführt wird. Dafür gibt es vier Gründe: (1) Trypsin hat eine breite Palette von Aktivitäten und kann in einem breiten Spektrum von Enzym-zu-Proben-Verhältnissen (1: 10-1: 200) verwendet werden. Selbst wenn die experimentelle Ausbeute an extrahierten Histonen von der erwarteten abweicht, sind mit diesem Protokoll keine Probleme mit der Verdauung aufgetreten. (2) Dieses Protokoll ist für kleinste Materialmengen bestimmt, bei denen die Histonquantifizierung aufgrund mangelnder Empfindlichkeit schwierig durchzuführen sein könnte. (3) Durch die Verwendung einer konstanten Trypsinkonzentration unabhängig von der Menge an Histonmaterial können wir tryptische Peptide (als Trypsinautolyze) verwenden, um die Chromatographieleistung zu bewerten. Leichte Schwankungen der Probenausbeute werden durch eine Datenanalysesoftware (Schritt 11) normalisiert, die alle (un)modifizierten Signale für ein gegebenes Peptid als Nenner während des Normalisierungsprozesses verwendet. (4) Schließlich könnte eine dramatische Unterschätzung der Menge des Ausgangsmaterials zu Problemen bei der Überlastung der chromatographischen Säule nanoLC führen. Das Ausführen des Entsalzungsschritts, wie in diesem Protokoll angegeben, verhindert jedoch, dass dieses Problem auftritt. Bei übermäßigen Mengen an Ausgangsmaterial (z. B. >100 μg) wird die Kapazitätsgrenze des Entsalzungsharzes überschritten und überschüssige Probe wird während des Ladeschritts weggespült.

Es ist wichtig zu beachten, dass nicht alle durch diese Analyse nachgewiesenen Peptide in Abbildung 3 und Abbildung 4 hervorgehoben wurden. Außerdem sind nicht alle Histonmodifikationen mit diesen spezifischen Methoden zur Probenvorbereitung und -erfassung nachweisbar. Ergänzende Tabelle 1 wird bereitgestellt, um alle Peptidsignale aufzulisten, die mit der beschriebenen Pipeline extrahiert werden. Einige bekannte Modifikationen sind in der Tabelle nicht aufgeführt, da die beschriebene Probenvorbereitung für deren Nachweis nicht geeignet ist. Bemerkenswerte Beispiele sind ubiquitinylierte Peptide aus Histon H2A und H2B und die Phosphorylierung von Histon H2A. X (ein allgemeiner Marker für DNA-Schäden). Denn die Propionylierung der mit diesen PTMs assoziierten Peptide führt zu übermäßig langen Peptiden, die für die C18-Chromatographie und das beschriebene MS-Nachweisverfahren nicht geeignet sind. Andere Modifikationen, die in der Literatur vorhanden sind, aber nicht in der ergänzenden Tabelle 1 vorhanden sind, sind sehr geringe Abundanzmodifikationen (derzeit nur mit MS nach Anreicherungsstrategien wie Immunpräzipitation oder spezifischer Zellbehandlung nachweisbar), wie Laktylierung 43 oder Serotonylierung44. Histonmodifikationen mit unvorhersehbaren Massenverschiebungen, die durch Polymerisation oder heterogene kovalente Bindung an die Histonsequenz verursacht werden, werden ebenfalls nicht berücksichtigt (z. B. Poly-ADP-Ribosylierung45 und Glykation46). Darüber hinaus verwendet dieses Protokoll NaSuc und NaBut zur Behandlung von HepG2 / C3A-Sphäroiden, kann jedoch für die Verwendung mit anderen Medikamenten / epigenetischen Modifikatoren und 2D / 3D-Zellkulturtypen modifiziert werden.

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Disclosures

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

Das Sidoli-Labor dankt der Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics Award), Deerfield (Xseed Award), Relay Therapeutics, Merck und dem NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% trypsin-EDTA solution Gibco 25300054
0.5-20 µL pipet tips BRAND 13-889-172 (Fisher Scientific)
1.5 mL microcentrifuge tubes Bio-Rad 2239480
10 µL multi-channel pipette BRAND BR7059000 (Millipore Sigma)
10 mL syringe Henke Sass Wolf 14-817-31 (Fisher Scientific) Luer lock tip, graduated to 12 mL
10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettes Eppendorf 14-285-904 (Fisher Scientific)
1000 µL pipet tips Rainin 30389164
18 G syringe needle Air-Tite 14-817-100 (Fisher Scientific) 3" length, 0.05" diameter
200 µL multi-channel pipette Corning 4082
2-200 µL pipet tips BRAND Z740118 (Millipore Sigma)
24-well ultra-low attachment microplate Corning 07-200-602
75 cm2  U-shaped cell culture flask Corning 461464U Untreated, with vent cap
96-well skirted plate Axygen PCR-96-FS-C (Corning)
Acetone Fisher Scientific A949-1 Acetone should be used cold
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) Sigma-Aldrich A6141-25G
Ammonium hydroxide solution Fisher Scientific AC423300250
Cell culture grade water Corning 25-055-CV
ClinoReactor CelVivo 10004-12 Bioreactor for 3D cell culture
ClinoStar CelVivo N/A Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture
Control unit CelVivo N/A Tablet for ClinoStar settings
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Corning 17-205-CV 1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35-010-CV
Formic acid Thermo Scientific 28905
Fume hood Mott N/A Model 7121000
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-8B 9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile
Glutagro supplement Corning 25-015-CI 200 mM L-ananyl-L-glutamine
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Corning 21-022-CV 1X solution without calcium, magnesium, and phenol red
HPLC grade acetonitrile Fisher Scientific A955-4
HPLC grade water Fisher Scientific W6-1
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A481-212
Ice N/A N/A
MEM non-essential amino acids Corning 25-025-CI 100X solution
Oasis HLB resin Waters 186007549 Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer Thermo Fisher Scientific IQLAAEGAAPFADBMBHQ High resolution mass spectrometer
Oro-Flex I polypropylene filter plate Orochem OF1100 96-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI 100X solution
pH paper Hydrion Z111848 (Sigma-Aldrich) 0-13 pH test paper
Pipette gun Eppendorf Z666467 (Millipore Sigma)
Polymicro capillary Molex 50-110-7740 (Fisher Scientific) Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD
Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile Fisher Scientific 1367549
Propionic anhydride Sigma-Aldrich 240311-50G
Refrigerated centrifuge Thermo Scientific 75-217-420
Reprosil-Pur resin MSWIL R13.AQ.0003 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size
Rotator Clay Adams 25477 (American Laboratory Trading) Nutator Mixer 1105
Sequencing grade modified trypsin Promega V5111
Sodium butyrate Thermo Scientific A11079
Sodium succinate dibasic Sigma-Aldrich 14160-100G
SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes) Savant 20249 (American Laboratory Trading)
SpeedVac vacuum concentrator (96-well) Thermo Scientific 15308325 Savant SPD1010
Sterile hood Thermo Scientific 1375 Class II, Type A2
Sulfuric acid (H2SO4) Fisher Scientific 02-004-375 Baker Analyzed ACS reagent
Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish Fisher Scientific 08-772-23
Trichloroacetic acid (TCA) Thermo Scientific AC421451000 Resuspend 100% w/v in HPLC grade water
Trifluoroacetic acid (TFA) Fisher Scientific PI28904 Sequencing grade
Vacuum manifold 96-well Millipore MAVM0960R
Vortex Sigma-Aldrich Z258415
Water bath Fisher Scientific FSGPD10
Wide bore pipet tips 1000 µL Axygen 14-222-703 (Fisher Scientific)
Wide bore pipet tips 200 µL Axygen 14-222-730 (Fisher Scientific)

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References

  1. Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  2. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  3. Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
  4. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology (Bethesda). 32 (4), 266-277 (2017).
  5. Wrzesinski, K., et al. The cultural divide: exponential growth in classical 2D and metabolic equilibrium in 3D environments. PLoS One. 9 (9), 106973 (2014).
  6. Wrzesinski, K., Fey, S. J. Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors. Bioengineering (Basel). 5 (1), 22 (2018).
  7. Gonda, S. R., et al. Three-dimensional transgenic cell model to quantify genotoxic effects of space environment. Advances in Space Research. 27 (2), 421-430 (2001).
  8. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  9. Tvardovskiy, A., et al. Top-down and middle-down protein analysis reveals that intact and clipped human histones differ in post-translational modification patterns. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (12), 3142-3153 (2015).
  10. Azad, G. K., et al. Modifying chromatin by histone tail clipping. Journal of Molecular Biology. 430 (18), 3051-3067 (2018).
  11. Kragesteen, B. K., Amit, I. Heads or tails: histone tail clipping regulates macrophage activity. Nature Immunology. 22 (6), 678-680 (2021).
  12. Dhaenens, M. Histone clipping: the punctuation in the histone code. EMBO Reports. 22 (8), 53440 (2021).
  13. Anderson, L. C., et al. Analyses of histone proteoforms using front-end electron transfer dissociation-enabled orbitrap instruments. Molecular and Cellular Proteomics. 15 (3), 975-988 (2016).
  14. Morgan, M. A. J., Shilatifard, A. Reevaluating the roles of histone-modifying enzymes and their associated chromatin modifications in transcriptional regulation. Nature Genetics. 52 (12), 1271-1281 (2020).
  15. Chan, J. C., Maze, I. Nothing is yet set in (hi)stone: novel post-translational modifications regulating chromatin function. Trends in Biochemical Sciences. 45 (10), 829-844 (2020).
  16. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
  17. Fischle, W., et al. Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains. Genes and Development. 17 (15), 1870-1881 (2003).
  18. Onder, O., et al. Progress in epigenetic histone modification analysis by mass spectrometry for clinical investigations. Expert Review of Proteomics. 12 (5), 499-517 (2015).
  19. Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. Journal of Proteomics. 75 (12), 3419-3433 (2012).
  20. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural and Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
  21. Moradian, A., et al. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
  22. Zheng, Y., Huang, X., Kelleher, N. L. Epiproteomics: quantitative analysis of histone marks and codes by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 142-150 (2016).
  23. Sidoli, S., Garcia, B. A. Middle-down proteomics: a still unexploited resource for chromatin biology. Expert Review of Proteomics. 14 (7), 617-626 (2017).
  24. Stampar, M., et al. Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals. Science of the Total Environment. 755, 143255 (2021).
  25. Calitz, C., et al. Toxicity and anti-prolific properties of Xysmalobium undulatum water extract during short-term exposure to two-dimensional and three-dimensional spheroid cell cultures. Toxicology Mechanisms and Methods. 28 (9), 641-652 (2018).
  26. Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
  27. Sidoli, S., et al. Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra (SWATH) analysis for characterization and quantification of histone post-translational modifications. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (9), 2420-2428 (2015).
  28. Sidoli, S., et al. Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications. Analytical Chemistry. 87 (22), 11448-11454 (2015).
  29. Karch, K. R., Sidoli, S., Garcia, B. A. Identification and quantification of histone PTMs using high-resolution mass spectrometry. Methods in Enzymology. 574, 3-29 (2016).
  30. Yuan, Z. F., et al. EpiProfile quantifies histone peptides with modifications by extracting retention time and intensity in high-resolution mass spectra. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (6), 1696-1707 (2015).
  31. Yuan, Z. F., et al. EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2533-2541 (2018).
  32. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
  33. Pino, L. K., et al. The Skyline ecosystem: Informatics for quantitative mass spectrometry proteomics. Mass Spectrometry Reviews. 39 (3), 229-244 (2020).
  34. Aguilan, J. T., Kulej, K., Sidoli, S. Guide for protein fold change and p-value calculation for non-experts in proteomics. Molecular Omics. 16 (6), 573-582 (2020).
  35. Lex, A., et al. UpSet: Visualization of intersecting sets. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 20 (12), 1983-1992 (2014).
  36. Shah, S. G., et al. HISTome2: a database of histone proteins, modifiers for multiple organisms and epidrugs. Epigenetics and Chromatin. 13 (1), 31 (2020).
  37. Xie, Z., et al. Lysine succinylation and lysine malonylation in histones. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (5), 100-107 (2012).
  38. Liu, J., et al. Histone succinylation and its function on the nucleosome. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (15), 7101-7109 (2021).
  39. Howe, F. S., et al. Is H3K4me3 instructive for transcription activation. Bioessays. 39 (1), 1-12 (2017).
  40. Nicetto, D., Zaret, K. S. Role of H3K9me3 heterochromatin in cell identity establishment and maintenance. Current Opinion in Genetics and Development. 55, 1-10 (2019).
  41. Wojcik, J. B., et al. Histone H3K27 dimethyl loss is highly specific for malignant peripheral nerve sheath tumor and distinguishes true PRC2 loss from isolated H3K27 trimethyl loss. Modern Pathology. 32 (10), 1434-1446 (2019).
  42. Sellers, W. R., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
  43. Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
  44. Farrelly, L. A., et al. Histone serotonylation is a permissive modification that enhances TFIID binding to H3K4me3. Nature. 567 (7749), 535-539 (2019).
  45. Chen, Q., et al. ADP-ribosylation of histone variant H2AX promotes base excision repair. The EMBO Journal. 40 (2), 104542 (2021).
  46. Zheng, Q., et al. Reversible histone glycation is associated with disease-related changes in chromatin architecture. Nature Communications. 10 (1), 1289 (2019).

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Biologie Ausgabe 183 3D-Kultur Histone Massenspektrometrie Direktinjektion posttranslationale Modifikationen
Globale Quantifizierung von posttranslationalen Histonmodifikationen in einem 3D-Zellkulturmodell von Lebergewebe
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Joseph-Chowdhury, J. S. N.,… More

Joseph-Chowdhury, J. S. N., Stransky, S., Graff, S., Cutler, R., Young, D., Kim, J. S., Madrid-Aliste, C., Aguilan, J. T., Nieves, E., Sun, Y., Yoo, E. J., Sidoli, S. Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue. J. Vis. Exp. (183), e63606, doi:10.3791/63606 (2022).

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