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Biology

हेपेटिक ऊतक के 3 डी सेल संस्कृति मॉडल में हिस्टोन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों का वैश्विक स्तर का परिमाणीकरण

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63606
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry, Albert Einstein College of Medicine

Summary

यह प्रोटोकॉल रेखांकित करता है कि कैसे एक त्रि-आयामी सेल संस्कृति प्रणाली का उपयोग निकट-शारीरिक स्थिति में क्रोमैटिन संशोधनों को मॉडल, इलाज और विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

स्तनधारी कोशिकाओं की फ्लैट संस्कृतियां सेल फिजियोलॉजी को समझने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली इन विट्रो दृष्टिकोण हैं, लेकिन यह प्रणाली अप्राकृतिक रूप से तेजी से सेल प्रतिकृति के कारण ठोस ऊतकों को मॉडलिंग में सीमित है। परिपक्व क्रोमैटिन मॉडलिंग करते समय यह विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण होता है, क्योंकि तेजी से प्रतिकृति कोशिकाएं अक्सर डीएनए प्रतिकृति में शामिल होती हैं और एक विषम पॉलीप्लॉइड आबादी होती हैं। नीचे प्रस्तुत मॉडलिंग, उपचार, और एक तीन आयामी (3 डी) सेल संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर quiescent क्रोमैटिन संशोधनों का विश्लेषण करने के लिए एक वर्कफ़्लो है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा सेल लाइनों को एक इनक्यूबेटर में पुनरुत्पादक 3 डी गोलाकार के रूप में उगाया जाता है जो सक्रिय पोषक तत्व प्रसार और कम कर्तन बल प्रदान करता है। सोडियम ब्यूटिरेट और सोडियम सक्सिनेट के साथ उपचार ने क्रमशः हिस्टोन एसिटिलेशन और सक्सिनिलेशन में वृद्धि को प्रेरित किया। हिस्टोन एसिटिलेशन और सक्सिनिलेशन के स्तर में वृद्धि एक अधिक खुले क्रोमैटिन राज्य से जुड़ी हुई है। गोलाकार तब कोशिका नाभिक के अलगाव के लिए एकत्र किए जाते हैं, जिसमें से हिस्टोन प्रोटीन को उनके पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों के विश्लेषण के लिए निकाला जाता है। हिस्टोन विश्लेषण तरल क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से किया जाता है जो अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ ऑनलाइन युग्मित होता है, इसके बाद एक इन-हाउस कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन होती है। अंत में, संयुक्त हिस्टोन चिह्नों की आवृत्ति और घटना की जांच करने के लिए डेटा प्रतिनिधित्व के उदाहरण दिखाए गए हैं।

Introduction

19वीं शताब्दी के उत्तरार्ध से, सेल संस्कृति प्रणालियों का उपयोग मानव शरीर के बाहर कोशिकाओं के विकास और विकास का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में किया गयाहै 1,2। उनके उपयोग को यह अध्ययन करने के लिए भी बढ़ाया गया है कि ऊतक और अंग स्वस्थ और रोगग्रस्त दोनों संदर्भों में कैसे कार्य करते हैं 1,3। निलंबन कोशिकाएं (उदाहरण के लिए, रक्त कोशिकाएं) पेट्री डिश या फ्लास्क में मूल रूप से और परस्पर विकसित होती हैं क्योंकि वे विवो में तीन आयामी (3 डी) संरचनाओं में इकट्ठा नहीं होती हैं। ठोस अंगों से प्राप्त कोशिकाएं या तो दो-आयामी (2 डी) या 3 डी संस्कृति प्रणालियों में बढ़ सकती हैं। 2 डी संस्कृति में, कोशिकाओं को एक मोनोलेयर में उगाया जाता है जो एक सपाट सतह 2,4 का पालन करता है। 2 डी सेल संस्कृति प्रणालियों को घातीय विकास और तेजी से दोहरीकरण समय की विशेषता है, आमतौर पर 24 घंटे से कुछ दिनोंतक 5। 3 डी सिस्टम में कोशिकाएं जटिल सेल-सेल इंटरैक्शन मॉडलिंग ऊतक-जैसे समूहों को अधिक बारीकी से बनाने के लिए बढ़ती हैं, और उन्हें एक गतिशील संतुलन तक पहुंचने की उनकी क्षमता की विशेषता होती है जहां उनका दोहरीकरण समय 1 महीने या उससे अधिक समय तक पहुंच सकताहै।

इस पेपर में प्रस्तुत एक अभिनव पद्धति है जो घूर्णन सेल संस्कृति प्रणालियों में 3 डी गोलाकार विकसित करने के लिए है जो कम गुरुत्वाकर्षण 6 का अनुकरण करतीहै। यह 1990 के दशक में नासा द्वारा पेश की गई एक सेल संस्कृति प्रणाली का एक सरलीकृत व्युत्पन्नहै। यह दृष्टिकोण कर्तन बलों को कम करता है, जो कताई फ्लास्क जैसे मौजूदा तरीकों में होता है, और गोलाकार पुनरुत्पादनक्षमता 6 को बढ़ाता है। इसके अलावा, घूर्णन बायोरिएक्टर सक्रिय पोषक तत्व प्रसार को बढ़ाता है, जो नेक्रोटिक गठन को कम करता है जो कि हैंगिंग ड्रॉप सेल संस्कृति जैसी प्रणालियों में होता है जहां मीडिया विनिमय अव्यावहारिक है। इस तरह, कोशिकाएं ज्यादातर अबाधित रूप से बढ़ती हैं, जिससे ऊतक में बढ़ने वाली कोशिकाओं से जुड़ी संरचनात्मक और शारीरिक विशेषताओं के गठन की अनुमति मिलती है। C3A हेपेटोसाइट्स (HepG2 / C3A) इस तरह से सुसंस्कृत न केवल ultrastructural ऑर्गेनेल था, बल्कि एटीपी, adenylate kinase, यूरिया, और कोलेस्ट्रॉल की मात्रा का उत्पादन भी विवो 1,2 में देखे गए स्तरों के बराबर था। इसके अलावा, 2 डी बनाम.3D सेल संस्कृति प्रणालियों में उगाई गई कोशिकाएं विभिन्न जीन अभिव्यक्ति पैटर्न 8 प्रदर्शित करतीहैं। 3 डी गोलाकार के रूप में उगाए गए सी 3 ए हेपेटोसाइट्स के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण से पता चला है कि इन कोशिकाओं ने यकृत-विशिष्ट प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला व्यक्त की, साथ ही साथ जिगर समारोह8 को विनियमित करने वाले प्रमुख मार्गों में शामिल जीन भी। पूर्व प्रकाशनों ने 3 डीगोलाकार संस्कृतियों में गतिशील संतुलन पर 2 डी संस्कृति बनाम कोशिकाओं में तेजी से बढ़ती कोशिकाओं के प्रोटिओम के बीच अंतर का प्रदर्शन किया। इन अंतरों में सेलुलर चयापचय शामिल है, जो बदले में कोशिका 5 की संरचना, कार्य और शरीर विज्ञान को प्रभावित करताहै। 2 डी संस्कृति में उगाई गई कोशिकाओं का प्रोटिओम सेल प्रतिकृति में शामिल प्रोटीन में अधिक समृद्ध था, जबकि 3 डी गोलाकार का प्रोटिओम यकृत कार्यक्षमता5 में अधिक समृद्ध था।

3 डी गोलाकार के रूप में उगाई गई कोशिकाओं की धीमी प्रतिकृति दर अधिक सटीक रूप से क्रोमैटिन राज्य और संशोधनों (जैसे हिस्टोन क्लिपिंग9) से जुड़ी विशिष्ट घटनाओं को मॉडल करती है। हिस्टोन क्लिपिंग एक अपरिवर्तनीय हिस्टोन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) है जो हिस्टोन एन-टर्मिनल पूंछ के हिस्से के प्रोटियोलिटिक दरार का कारण बनता है। जबकि इसका जैविक कार्य अभी भी चर्चा के तहत है 10,11,12,13, यह स्पष्ट है कि प्राथमिक कोशिकाओं और यकृत ऊतकों में इसकी उपस्थिति हेपजी 2 / सी 3 ए कोशिकाओं द्वारा मॉडलिंग की जाती है जो गोलाकार के रूप में उगाई जाती हैं, लेकिन फ्लैट कोशिकाओं के रूप में नहीं। यह महत्वपूर्ण है, क्योंकि क्रोमैटिन राज्य और संशोधन डीएनए रीडआउट को विनियमित करते हैं जो ज्यादातर जीन तक पहुंच को संशोधित करके और इस प्रकार उनकी अभिव्यक्ति14 है। हिस्टोन पीटीएम या तो क्रोमैटिन राज्य को सीधे न्यूक्लियोसोम के शुद्ध चार्ज को प्रभावित करके प्रभावित करते हैं जहां हिस्टोन इकट्ठा किए जाते हैं, या अप्रत्यक्ष रूप से क्रोमैटिन लेखकों, पाठकों और इरेज़र14 की भर्ती करके। सैकड़ों हिस्टोन पीटीएम की पहचान15 तारीख तक की गई है, जो इस परिकल्पना को मजबूत करती है कि क्रोमैटिन डीएनए16 की व्याख्या करने के लिए सेल द्वारा उपयोग किए जाने वाले "हिस्टोन कोड" को होस्ट करता है। हालांकि, पीटीएमसंयोजनों के असंख्य की पहचान 15, और यह खोज कि हिस्टोन पीटीएम के संयोजनों में अक्सर अलगाव में मौजूद पीटीएम से अलग-अलग जैविक कार्य होते हैं (उदाहरण के लिए फिशल, एट अल.17), इस बात पर प्रकाश डाला गया है कि "हिस्टोन कोड" को डिक्रिप्ट करने के लिए अधिक काम की आवश्यकता है।

वर्तमान में, हिस्टोन पीटीएम विश्लेषण या तो एंटीबॉडी का उपयोग करने वाली तकनीकों पर आधारित है (उदाहरण के लिए, पश्चिमी धब्बे, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, या क्रोमैटिन इम्यूनोप्रिसिपिटेशन अनुक्रमण [CHIP-seq]) या मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के बाद। एंटीबॉडी-आधारित तकनीकों में उच्च संवेदनशीलता होती है और हिस्टोन के निशान के जीनोम-वाइड स्थानीयकरण के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान कर सकते हैं, लेकिन अक्सर 18,19,20 के संयोजन में मौजूद दुर्लभ पीटीएम या पीटीएम का अध्ययन करने में सीमित होते हैं। एमएस उच्च-थ्रूपुट और निष्पक्ष पहचान और एकल और सह-मौजूदा प्रोटीन संशोधनों के परिमाणीकरण के लिए अधिक उपयुक्त है, विशेष रूप से हिस्टोन प्रोटीन 18,19,20 में। इन कारणों से, इस और कई अन्य प्रयोगशालाओं ने हिस्टोन पेप्टाइड्स (बॉटम-अप एमएस), बरकरार हिस्टोन पूंछ (मध्य-डाउन एमएस), और पूर्ण लंबाई हिस्टोन प्रोटीन (टॉप-डाउन एमएस) 21,22,23 के विश्लेषण के लिए एमएस पाइपलाइन को अनुकूलित किया है।

नीचे विस्तृत HepG2 / C3A गोलाकार बढ़ने के लिए एक वर्कफ़्लो है और उन्हें नैनो-तरल क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से हिस्टोन पेप्टाइड विश्लेषण (नीचे-ऊपर एमएस) के लिए तैयार करना, अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एनएलसी-एमएस / एमएस ) के साथ ऑनलाइन युग्मित है। एक 2 डी सेल संस्कृति विकसित की गई थी और कोशिकाओं को काटा गया था और एक बायोरिएक्टर में स्थानांतरित कर दिया गया था जहां वे गोलाकार बनाना शुरू कर देंगे (चित्रा 1)। संस्कृति में 18 दिनों के बाद, गोलाकार को सोडियम ब्यूटिरेट या सोडियम सक्सिनेट के साथ इलाज किया गया था ताकि हिस्टोन एसिटिलेशन और सक्सिनिलेशन के सापेक्ष बहुतायत को बढ़ाया जा सके। विशेष रूप से, 3 डी संस्कृतियों को जीनोटॉक्सिक यौगिकों के साथ-साथ उनके फ्लैट संस्कृति समकक्षों के साथ इलाज किया जा सकता है; वास्तव में, हाल के प्रकाशनों पर प्रकाश डाला गया है कि 3 डी संस्कृति में कोशिकाओं की विष विज्ञान प्रतिक्रिया24,25 डी फ्लैट संस्कृति में उन लोगों की तुलना में प्राथमिक ऊतकों के समान है। तब कोशिकाओं को निर्दिष्ट समय बिंदुओं पर एकत्र किया गया था और परमाणु अलगाव किया गया था। फिर, हिस्टोन को गार्सिया एट अल.26 द्वारा विकसित प्रोटोकॉल के अनुसार ट्रिप्सिन पाचन से पहले और बाद में प्रोपियोनिक एनहाइड्राइड के साथ निकाला और व्युत्पन्न किया गया था। यह प्रक्रिया रिवर्स-फेज क्रोमैटोग्राफी (सी18) और एमएस के साथ पता लगाने के साथ ऑनलाइन अलगाव के लिए एक उपयुक्त आकार के पेप्टाइड्स उत्पन्न करती है। अंत में, हिस्टोन पेप्टाइड्स की पहचान की गई और मात्रा निर्धारित की गई, और उत्पन्न डेटा को अधिक पूर्ण जैविक व्याख्या के लिए कई तरीकों से दर्शाया गया था।

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Protocol

1. बफर और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. सेल विकास मीडिया (हेपजी 2 / सी 3 ए कोशिकाओं के लिए): भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) (10% वी / वी), गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (1% वी / वी), एल-ग्लूटामाइन पूरक (1% वी / वी) और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (0.5% वी / वी) को डुलबेको के संशोधित ईगल के माध्यम (डीएमईएम, जिसमें 4.5 ग्राम / एल ग्लूकोज होता है) जोड़ें। विकास मीडिया अधिकतम 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।
  2. 200 mM सोडियम ब्यूटिरेट (NaBut) समाधान: 10 mL तैयार करने के लिए, DDH 2 O के 10 mL में NaBut के 220.18 mg को पुन: निलंबितकरें। सेल उपचार से पहले, 0.45 मिमी सिरिंज फिल्टर का उपयोग करके समाधान को फ़िल्टर करें और 20 mM की कार्यशील एकाग्रता के लिए सेल विकास मीडिया के 9 mL में फ़िल्टर किए गए समाधान का 1 mL जोड़ें।
  3. 100 mM सोडियम succinate (NaSuc) समाधान: 10 mL तैयार करने के लिए,DDH 2O के 10 mL में NaSuc के 162.05 mg को पुन: निलंबित करें। सेल उपचार से पहले, 0.45 मिमी सिरिंज फिल्टर का उपयोग करके समाधान को फ़िल्टर करें और 10 mM की कार्यशील एकाग्रता के लिए सेल विकास मीडिया के 9 mL में फ़िल्टर किए गए समाधान का 1 mL जोड़ें।
  4. ठंडा 0.2 M H2SO4: 1 L तैयार करने के लिए, HPLC ग्रेड पानी के 990 mL केंद्रित H2SO4 के 10 mL जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. कोल्ड एसीटोन + 0.1% हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल): एसीटोन में केंद्रित एचसीएल (0.1% वी / वी) जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. 100 mM NH4HCO3 समाधान, pH 8.0: 1 L तैयार करने के लिए, NH4HCO3 के 7.91 g को HPLC ग्रेड पानी के 1 L में पुन: निलंबित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 50 एमएल ऐलीकोट स्टोर करें।
  7. 0.1% Trifluoroacetic एसिड (TFA) समाधान: HPLC ग्रेड पानी के लिए केंद्रित TFA (0.1% v / v) जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  8. 60% एसिटोनिट्राइल / 0.1% टीएफए समाधान: एचपीएलसी ग्रेड पानी के लिए एचपीएलसी ग्रेड एसिटोनिट्राइल (60% वी / वी) जोड़ें। फिर, इस समाधान में केंद्रित टीएफए (0.1% v / v) जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  9. 2% HPLC-ग्रेड एसिटोनिट्राइल + 0.1% फॉर्मिक एसिड: HPLC-ग्रेड एसिटोनिट्राइल (2% v / v) को HPLC-ग्रेड पानी में जोड़ें। फिर, इस समाधान में केंद्रित फॉर्मिक एसिड (0.1% v / v) जोड़ें।
  10. 80% HPLC-ग्रेड एसिटोनिट्राइल + 0.1% फॉर्मिक एसिड: HPLC-ग्रेड एसिटोनिट्राइल (80% v / v) को HPLC-ग्रेड पानी में जोड़ें। फिर, इस समाधान में केंद्रित फॉर्मिक एसिड (0.1% v / v) जोड़ें।

2. 3 डी संस्कृति प्रणाली की तैयारी

नोट: विभिन्न कोशिकाओं, प्राथमिक या अमर, अलग-अलग संस्कृति गुण हैं, इसलिए गोलाकार का गठन सेल प्रकारों के बीच भिन्न हो सकता है। यह प्रोटोकॉल बायोरिएक्टर और एक अभिनव 3 डी सेल संस्कृति प्रणाली का उपयोग करके हेपजी 2 / सी 3 ए गोलाकार गठन के लिए स्थापित किया गया है।

  1. मानक विकास मीडिया का उपयोग करते हुए, कोशिकाओं को मोनोलेयर के रूप में विकसित करें जब तक कि वे 80% confluent न हों।
  2. HBSS (75 सेमी2 फ्लास्क के लिए 5 mL) के साथ कोशिकाओं को धोएं और 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 5 mL के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, जो HBSS (1: 2 कमजोर पड़ने) में 5 मिनट के लिए 5% CO 2 के साथ 37 oC परपतला हो जाता है।
  3. माइक्रोस्कोप के तहत सेल टुकड़ी की जांच करें और भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) या विकास मीडिया (5% -10% एफबीएस युक्त) के 3 मिलीलीटर जोड़कर ट्रिप्सिन को बेअसर करें।
  4. कोशिकाओं की संख्या की गणना करें और 1.5 mL की अधिकतम मात्रा में 1 x 106 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए सेल निलंबन को पतला करें।
  5. एक अल्ट्रा-कम अनुलग्नक 24-अच्छी तरह से गोल नीचे प्लेट (जिसमें प्रति अच्छी तरह से कई माइक्रो-वेल्स होते हैं) को 0.5 मिलीलीटर विकास मीडिया के साथ कुओं को धोकर संतुलित करें। कुएं की सतह से हवा के बुलबुले को हटाने के लिए 3,000 x g पर 5 मिनट के लिए प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. सेल निलंबन को प्लेट में स्थानांतरित करें और 120 x g पर 3 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. गोलाकार गठन के लिए 5% CO 2 के साथ 37 oC पर24 घंटे के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें। इस बीच, 25 मिलीलीटर बाँझ पानी के साथ आर्द्रता कक्ष और 9 मिलीलीटर विकास मीडिया के साथ सेल कक्ष को भरकर बायोरिएक्टर को संतुलित करें।
  8. बायोरिएक्टर को इनक्यूबेट करें, क्लिनोस्टैट इनक्यूबेटर में घूर्णन करते हुए, 5% सीओ 2 के साथ 37 ओसी पर24 घंटे के लिए।

3. बायोरिएक्टर में गोलाकार की वृद्धि

नोट: गोलाकार की संरचना को संरक्षित करने के लिए, 3 डी संरचनाओं को संभालने के लिए चौड़े बोर युक्तियों का उपयोग किया जाता है।

  1. अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेट से गोलाकार को अलग करें, धीरे से 1 एमएल चौड़े बोर युक्तियों के साथ ऊपर और नीचे पिपेटिंग करके और ऊतक संस्कृति-उपचारित पकवान में स्थानांतरित करें।
  2. प्लेट को 0.5 मिलीलीटर पूर्व-गर्म विकास मीडिया के साथ धोएं और एक ही पकवान में स्थानांतरित करें।
  3. माइक्रोस्कोपी द्वारा गोलाकार की गुणवत्ता का मूल्यांकन करें और पर्याप्त रूप से गठित गोलाकार का चयन करें। अच्छी गुणवत्ता वाले गोलाकार में एक समान आकार, कॉम्पैक्टनेस और गोलाई होती है।
  4. ताजा विकास मीडिया के 5 मिलीलीटर से भरे संतुलित बायोरिएक्टर में गोलाकार स्थानांतरण। गोलाकार को स्थानांतरित करने के बाद, पूरी तरह से ताजा विकास मीडिया के साथ बायोरिएक्टर को भरें।
  5. Clinostat इनक्यूबेटर में बायोरिएक्टर रखें और रोटेशन की गति को 10-11 आरपीएम पर समायोजित करें।
  6. पुराने मीडिया के 10 मिलीलीटर को हटाकर और इसे 10 मिलीलीटर ताजा मीडिया के साथ बदलकर हर 2-3 दिनों में मीडिया का आदान-प्रदान करें।
  7. गोलाकार विकास के अनुसार रोटेशन गति को समायोजित करें, आकार और संख्या में गोलाकार बढ़ने के साथ बढ़ रहा है।
  8. संस्कृति में 18 दिनों के बाद, गोलाकार उपचार और / या संग्रह के लिए तैयार हैं

4. गोलाकार उपचार और संग्रह

नोट: इस प्रोटोकॉल में, HepG2 / C3A गोलाकार सोडियम butyrate (NaBut) और सोडियम succinate (NaSuc) के साथ इलाज कर रहे हैं एसिटिलेशन और succinylation युक्त हिस्टोन चिह्नों के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए, क्रमशः.

  1. यौगिक की उपयुक्त कार्य एकाग्रता के साथ विकास मीडिया तैयार करें (उदाहरण के लिए, NaBut के 20 mM या 10 mM NaSuc)। इलाज मीडिया के साथ बायोरिएक्टर में मीडिया का आदान-प्रदान करें।
    नोट: एक नियंत्रण स्थिति स्थापित करने के लिए, या तो उपचार जोड़ने से पहले प्रयोगों के लिए पर्याप्त गोलाकार एकत्र करें या अनुपचारित गोलाकार के लिए बायोरिएक्टर नामित करें।
  2. पर्याप्त उपचार समय के बाद प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए गोलाकार एकत्र करें (उदाहरण के लिए, NaSuc उपचार के लिए 48 घंटे से 1 सप्ताह या NaBut उपचार के लिए 48-72 घंटे)।
    नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके हिस्टोन निष्कर्षण के लिए, लगभग 1 x 106 कोशिकाओं वाले छह से आठ गोलाकार एकत्र किए गए थे।
    1. शीर्ष बंदरगाह के माध्यम से बायोरिएक्टर से मीडिया के 3-5 मिलीलीटर निकालें।
    2. सामने बंदरगाह खोलें और गोलाकार को हटाने के लिए एक 1 एमएल चौड़े बोर टिप का उपयोग करें और उन्हें माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में रखें।
    3. 5 मिनट के लिए 100 x g पर गोलाकार को सेंट्रीफ्यूज करें और मीडिया को छोड़ दें।
      नोट: बायोरिएक्टर में मीडिया को बदला जा सकता है और बायोरिएक्टर को अतिरिक्त उपचार समय या पुनर्प्राप्ति के लिए इनक्यूबेटर में वापस किया जा सकता है।
    4. FBS को हटाने के लिए HBSS के 200 μL के साथ गोलाकार धोएं। 5 मिनट के लिए 100 x g पर सेंट्रीफ्यूज और supernatant को हटाने।
      नोट: गोलाकार प्रसंस्करण तक -80 ओसी पर संग्रहीत किया जा सकता है।

5. हिस्टोन निष्कर्षण

नोट: हिस्टोन में मौजूद कई बुनियादी अमीनो एसिड अवशेष उन्हें डीएनए के साथ निकटता से बातचीत करने की अनुमति देते हैं, जिसमें फॉस्फोरिक एसिड बैकबोन होता है। क्योंकि हिस्टोन नाभिक में सबसे बुनियादी प्रोटीनों में से कुछ हैं, जब उन्हें बर्फ-ठंडे सल्फ्यूरिक एसिड (0.2 एम एच2एसओ4) के साथ निकाला जाता है, तो न्यूनतम संदूषण होता है। गैर-हिस्टोन प्रोटीन मजबूत एसिड में अवक्षेपित होंगे। अत्यधिक केंद्रित ट्राइक्लोरोएसिटिक एसिड (टीसीए) 33% की अंतिम एकाग्रता के लिए पतला बाद में सल्फ्यूरिक एसिड से हिस्टोन को अवक्षेपित करने के लिए उपयोग किया जाता है। पूरे हिस्टोन निष्कर्षण के लिए बर्फ पर सभी नमूने, ट्यूब और अभिकर्मक रखें।

  1. सेल गोली (~ 10-20 μL) के लिए ठंडा 0.2 M H2SO4 के पांच संस्करणों (~ 100 μL) जोड़ें, और गोली को बाधित करने और हिस्टोन जारी करने के लिए पिपेट ऊपर और नीचे।
  2. लगातार रोटेशन पर 4 घंटे तक के लिए ट्यूबों को इनक्यूबेट करें या 4 ओसी पर हिलाते हुए।
    नोट: 500 μL से अधिक मात्रा वाले पुन: निलंबित नमूनों के लिए, हिस्टोन को निकालने के लिए 2 घंटे का इनक्यूबेशन पर्याप्त है (लंबे समय तक इनक्यूबेशन परिणामस्वरूप अन्य बुनियादी परमाणु प्रोटीन का निष्कर्षण हो सकता है)। 200 μL से कम मात्रा के साथ पुन: निलंबित नमूनों के लिए, बेहतर उपज के लिए 4 घंटे इनक्यूबेशन की आवश्यकता होती है।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 3,400 x g पर सेंट्रीफ्यूज। एक नई ट्यूब में supernatant ले लीजिए और बाद में गोली को त्याग.
  4. ठंडा केंद्रित टीसीए जोड़ें जैसे कि यह अंतिम 25% -33% v / v (उदाहरण के लिए, ठंडे TCA के 40-60 μL: supernatant के 120 μL) बनाता है और ट्यूब को कुछ बार उलटकर मिश्रण करता है।
  5. निरंतर रोटेशन पर कम से कम 1 घंटे के लिए ट्यूबों को इनक्यूबेट करें या 4 ओसी पर मिलाते हुए।
    नोट: छोटे शुरुआती छर्रे आकारों के लिए, एक रात भर इनक्यूबेशन की सिफारिश की जाती है।
  6. 3,400 x g पर 4 oC पर 5 मिनट के लिए centrifuge. pipetting द्वारा supernatant त्यागें. सावधानी से supernatant aspirate; ट्यूब या गोली के किनारों को स्पर्श न करें।
    नोट: हिस्टोन दोनों पक्षों और ट्यूब के नीचे जमा. ट्यूब के बहुत नीचे गठित सफेद अघुलनशील गोली में ज्यादातर गैर-हिस्टोन प्रोटीन और अन्य बायोमोलेक्यूल्स होते हैं।
  7. ट्यूब (दीवारों और गोली) को ठंडे एसीटोन + 0.1% HCl के साथ एक ग्लास पाश्चर पिपेट (~ 500 μL / ट्यूब) का उपयोग करके धोएं।
  8. 3,400 x g पर 4 oC पर 5 मिनट के लिए centrifuge. ट्यूब flipping द्वारा supernatant त्यागें.
  9. एक ग्लास पाश्चर पिपेट (~ 500 μL / ट्यूब) का उपयोग करके 100% ठंडे एसीटोन के साथ ट्यूब (दीवारों और गोली) को धोएं। 4 oC पर 5 मिनट के लिए 3,400 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  10. ट्यूब flipping और शेष एसीटोन बाहर पिपेट द्वारा supernatant त्याग. ढक्कन खोलें और ~ 20 मिनट के लिए बेंच पर नमूने को हवा से सुखाएं।
  11. प्रोपियोनिलेशन के लिए आगे बढ़ें या उपयोग करने तक -80 ओसी में नमूनों को स्टोर करें।

6. व्युत्पादन का पहला दौर

नोट: हिस्टोन प्रोटीन को पचाने के लिए ट्रिप्सिन का उपयोग अत्यधिक छोटे पेप्टाइड्स की ओर जाता है जो पारंपरिक प्रोटिओमिक्स सेटअप का उपयोग करके पहचानना मुश्किल होता है। इस कारण से, प्रोपियोनिक एनहाइड्राइड का उपयोग रासायनिक रूप से असंशोधित और मोनोमिथाइल लाइसिन अवशेषों के एमिनो समूहों को व्युत्पन्न करने के लिए किया जाता है। यह ट्रिप्सिन प्रोटिओलिसिस को सी-टर्मिनल आर्जिनिन अवशेषों तक सीमित करता है। 96-अच्छी तरह से प्लेटों में नमूनों के लिए, अभिकर्मक लेने के लिए मल्टी-चैनल पिपेट और जलाशयों के उपयोग की सिफारिश की जाती है (चित्रा 2 ए)। पेप्टाइड हाइड्रोफोबिकिटी को बढ़ाने वाले पेप्टाइड्स के मुक्त एन-टर्मिनी को लेबल करने के लिए पाचन के बाद भी व्युत्पादन किया जाता है और इस प्रकार रिवर्स-फेज क्रोमैटोग्राफिक प्रतिधारण।

  1. 100 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट (पीएच 8.0) में 15% -20% एसिटोनिट्राइल के 20 μL में पुन: निलंबित नमूने। 15 सेकंड के लिए भंवर, और फिर 30 सेकंड के लिए 1,000 एक्स जी पर नीचे स्पिन करें।
  2. यदि आठ या अधिक नमूने हैं, तो प्रत्येक पुन: निलंबित नमूने को 96-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें।
    नोट:: यदि नमूने एक 96-अच्छी तरह से प्लेट के लिए स्थानांतरित नहीं किया गया है, तो एक एकल चैनल पिपेट चरण 6.3-6.7, 7.1-7.5, और 8.1-8.5 में उपयोग किया जा सकता है।
  3. हुड के तहत, एक multichannel पिपेट का उपयोग कर प्रोपियोनिक एनहाइड्राइड के 2 μL जोड़ें। ऊपर और नीचे 5x pipetting द्वारा मिश्रण.
  4. जल्दी से एक multichannel पिपेट का उपयोग कर अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के 10 μL जोड़ें. ऊपर और नीचे 5x pipetting द्वारा मिश्रण.
    नोट: प्रोपियोनिक एसिड पेप्टाइड्स से प्रोपियोनिक एनहाइड्राइड और मुक्त एमाइन्स के बीच प्रतिक्रिया का एक उत्पाद है और नमूना पीएच को कम कर सकता है। पीएच 8 को 1: 5 (वी / वी) के अनुपात में नमूने में अमोनियम हाइड्रॉक्साइड जोड़कर फिर से स्थापित किया जा सकता है।
  5. सुनिश्चित करें कि पीएच परीक्षण पेपर का उपयोग करके पीएच 8 है। यदि पीएच 8 <, तो अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के 1 μL को जोड़कर समायोजित करें। यदि पीएच 8 >, तो 1 μL फॉर्मिक या एसिटिक एसिड जोड़कर समायोजित करें। जब पीएच 10 >, तो उच्च पीकेए के साथ अन्य अमीनो एसिड अवशेषों का लेबलिंग संभव है।
  6. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  7. चरण 6.3-6.6 दोहराएँ। हिस्टोन प्रोपियोनिलेशन का एक डबल राउंड लगभग पूर्ण प्रतिक्रिया दक्षता सुनिश्चित करता है।
  8. गति वैक्यूम में सूखी प्लेट जब तक कि सभी कुओं को पूरी तरह से सूख नहीं दिया जाता है (~ 9 ज)।
  9. ट्रिप्सिन पाचन के लिए आगे बढ़ें या उपयोग तक -80 ओसी पर नमूनों को स्टोर करें।

7. हिस्टोन पाचन

नोट: हिस्टोन को ट्रिप्सिन का उपयोग करके पेप्टाइड्स में पचाया जाता है, जो आर्जिनिन और लाइसिन अवशेषों के कार्बोक्सिल पक्ष में कटौती करता है। हालांकि, चूंकि प्रोपियोनिलेशन लाइसिन अवशेषों को संशोधित करता है, इसलिए केवल आर्जिनिन अवशेषों को क्लीव किया जाता है (चित्रा 2 बी)।

  1. ट्रिप्सिन समाधान तैयार करें (50 mM NH4HCO3, pH 8.0 में 25 ng/ प्रत्येक नमूने के लिए ट्रिप्सिन (500 एनजी) के 20 μL जोड़ें।
    1. 50 mM NH4HCO3 समाधान तैयार करने के लिए, HPLC ग्रेड पानी के साथ 100 mM NH4HCO3 समाधान 1: 1 v / v पतला करें।
  2. सुनिश्चित करें कि पीएच परीक्षण पेपर का उपयोग करके पीएच 8 है। यदि पीएच 8 <, तो अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के 1 μL को जोड़कर समायोजित करें। यदि पीएच 8 >, तो फॉर्मिक या एसिटिक एसिड के 1 μL को जोड़कर समायोजित करें।
  3. रात भर कमरे के तापमान पर पचाने या 6-8 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियसपर इनक्यूबेट करें।
  4. यदि संभव हो, तो पाचन के ~ 3 घंटे के बाद पीएच की जांच करें, क्योंकि यह कम हो सकता है। यदि पीएच 8 <, तो अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के 1 μL को जोड़कर समायोजित करें।
  5. 50 ng/ μL ट्रिप्सिन समाधान (250 ng) का एक अतिरिक्त 5 μL जोड़ें और पाचन जारी रखें।
  6. प्रोपियोनिलेशन के दूसरे दौर के लिए आगे बढ़ें या उपयोग तक -80 ओसी पर नमूनों को स्टोर करें।

8. पेप्टाइड एन-टर्मिनी का व्युत्पन्नीकरण

नोट: उनके एन-टर्मिनस पर हिस्टोन पेप्टाइड्स का प्रोपियोनिलेशन रिवर्स-फेज तरल क्रोमैटोग्राफी (उदाहरण के लिए, हिस्टोन एच 3 के अमीनो एसिड 3-8) द्वारा सबसे छोटे पेप्टाइड्स के प्रतिधारण में सुधार करता है, क्योंकि प्रोपियोनिल समूह पेप्टाइड हाइड्रोफोबिकिटी को बढ़ाता है।

  1. हुड के नीचे, मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके प्रोपियोनिक एनहाइड्राइड के 2 μL जोड़ें। ऊपर और नीचे 5x pipetting द्वारा मिश्रण.
  2. जल्दी से multichannel पिपेट का उपयोग कर अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के 10 μL जोड़ें. ऊपर और नीचे 5x pipetting द्वारा मिश्रण.
    नोट: प्रोपियोनिक एसिड पेप्टाइड्स से प्रोपियोनिक एनहाइड्राइड और मुक्त एमाइन्स के बीच प्रतिक्रिया का एक उत्पाद है, और नमूना पीएच को कम कर सकता है। पीएच 8 को 1: 5 (वी / वी) के अनुपात में नमूने में अमोनियम हाइड्रॉक्साइड जोड़कर फिर से स्थापित किया जा सकता है।
  3. सुनिश्चित करें कि पीएच परीक्षण पेपर का उपयोग करके पीएच 8 है। यदि पीएच 8 <, तो अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के 1 μL को जोड़कर समायोजित करें। यदि पीएच 8 >, तो 1 μL फॉर्मिक या एसिटिक एसिड जोड़कर समायोजित करें। जब पीएच 10 >, तो उच्च पीकेए के साथ अन्य अमीनो एसिड अवशेषों का लेबलिंग संभव है।
  4. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  5. चरण 8.1-8.4 को दोहराएँ। हिस्टोन प्रोपियोनिलेशन का एक डबल राउंड लगभग पूर्ण प्रतिक्रिया दक्षता सुनिश्चित करता है।
  6. गति वैक्यूम में सूखी प्लेट जब तक कि सभी कुओं को पूरी तरह से सूख नहीं दिया जाता है (~ 9 ज)।
  7. desalting चरण के लिए आगे बढ़ें या उपयोग करने तक -80 oC पर नमूने स्टोर करें।

9. Desalting और नमूना सफाई

नोट: नमूने में मौजूद लवण मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप करते हैं। लवण भी electrospray के दौरान ionized कर रहे हैं और पेप्टाइड्स से संकेतों को दबा सकते हैं. लवण पेप्टाइड्स पर आयनिक adducts बना सकते हैं, जो adducted पेप्टाइड को एक अलग द्रव्यमान होने का कारण बनता है। यह पेप्टाइड की सिग्नल तीव्रता को कम करता है और उचित पहचान और परिमाणीकरण को रोकता है। desalting के लिए सेटअप चित्र 2C में सचित्र है।

  1. एक चुंबकीय हलचल प्लेट पर एचएलबी राल (100% एसिटोनिट्राइल में 50 मिलीग्राम / एमएल) का मिश्रण शुरू करें।
  2. सुनिश्चित करें कि प्रवाह-थ्रू को इकट्ठा करने के लिए 96-अच्छी तरह से पॉलीप्रोपाइलीन फ़िल्टर प्लेट के नीचे एक 96-अच्छी तरह से संग्रह प्लेट रखी गई है।
  3. फ़िल्टर प्लेट के लिए अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से HLB निलंबन के 70 μL जोड़ें। स्प्लैशिंग को रोकने के लिए धीरे से वैक्यूम को चालू करें। प्रवाह-थ्रू को छोड़ दें.
  4. 0.1% TFA के 100 μL के साथ राल धोएं। स्प्लैशिंग को रोकने के लिए धीरे से वैक्यूम को चालू करें। प्रवाह-थ्रू को छोड़ दें.
  5. 0.1% TFA के 100 μL में प्रत्येक नमूने को पुन: निलंबित करें। पीएच की जाँच करें; यह ~ 2-3 होना चाहिए।
  6. प्रत्येक नमूने को प्रत्येक कुएं में लोड करें। splashing को रोकने के लिए वैक्यूम को धीरे से चालू करें। प्रवाह-थ्रू को छोड़ दें.
  7. 100 μL 0.1% TFA के साथ धोएं। splashing को रोकने के लिए वैक्यूम को धीरे से चालू करें। प्रवाह-थ्रू को छोड़ दें.
  8. संग्रह प्लेट को एक नई 96-अच्छी तरह से संग्रह प्लेट के साथ बदलें।
  9. 60% एसिटोनिट्राइल / 0.1% टीएफए प्रति अच्छी तरह से 60 μL जोड़ें। splashing को रोकने के लिए वैक्यूम को धीरे से चालू करें। एक गति वैक्यूम में प्रवाह के माध्यम से और सूखी ले लीजिए।
  10. एलसी-एमएस / एमएस के लिए आगे बढ़ें या उपयोग करने तक -80 ओसी पर नमूने स्टोर करें।

10. हिस्टोन पेप्टाइड विश्लेषण तरल क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ युग्मित

  1. उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) पर चलाने के लिए मोबाइल चरणों को तैयार करें। मोबाइल चरण ए (एमपीए): 2% एचपीएलसी-ग्रेड एसिटोनिट्राइल + 0.1% फॉर्मिक एसिड। मोबाइल चरण बी (एमपीबी): 80% एचपीएलसी-ग्रेड एसिटोनिट्राइल + 0.1% फॉर्मिक एसिड।
  2. HPLC विधि को निम्नानुसार प्रोग्राम करें: (1) 4% -34% MPB 30 मिनट से अधिक; (2) 5 मिनट से अधिक 34%-90% एमपीबी; और (3) 5 मिनट के लिए आइसोक्रेटिक 90% एमपीबी। निम्नलिखित अनुशंसित स्तंभ गुणों का उपयोग करें: C18 3 μm पैकिंग सामग्री, 75 μm आंतरिक व्यास, 20-25 सेमी लंबाई। 75 μm आंतरिक व्यास के साथ नैनो-कॉलम के लिए प्रवाह दर को 250-300 nL / मिनट पर सेट करें।
    1. इस मामले में कि HPLC नमूना लोडिंग से पहले स्तंभ संतुलन को स्वचालित करने के लिए प्रोग्राम नहीं किया गया है, इसमें (4) 90% -4% एमपीबी 1 मिनट से अधिक और (5) 10 मिनट से अधिक आइसोक्रेटिक 4% एमपीबी शामिल हैं।
  3. एमएस अधिग्रहण विधि प्रोग्राम करें।
    1. सुनिश्चित करें कि उपकरण प्रत्येक कर्तव्य चक्र की शुरुआत में एक पूर्ण एमएस स्कैन करता है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन इंस्ट्रूमेंटेशन (उदाहरण के लिए, ऑर्बिटरैप या टाइम-ऑफ-फ्लाइट विश्लेषकों) की सिफारिश की जाती है, बड़े पैमाने पर सटीकता के कारण जो सिग्नल निष्कर्षण के दौरान उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, कम रिज़ॉल्यूशन इंस्ट्रूमेंटेशन का उपयोग पहले27,28 के रूप में भी किया जा सकता है।
    2. सुनिश्चित करें कि पूर्ण एमएस स्कैन के बाद 16 एमएस / एमएस स्कैन ईवेंट होते हैं, जिनमें से प्रत्येक 50 मीटर / जेड की अलगाव चौड़ाई के साथ होता है, जो 300-1100 की एम / जेड रेंज में फैला होता है। उदाहरण के लिए, पहले स्कैन को 300-350 मीटर / जेड पर संकेतों को अलग करना चाहिए, दूसरा 350-400 मीटर / जेड पर, आदि। यदि संभव हो, तो उच्च रिज़ॉल्यूशन में एमएस / एमएस स्कैन प्राप्त करें, लेकिन पूर्ण एमएस स्कैन की तुलना में कम रिज़ॉल्यूशन पर्याप्त है (बरकरार आयनों की तुलना में टुकड़ा आयनों के छोटे द्रव्यमान के कारण)।
    3. HPLC विधि ~ 3-40 s की चोटी चौड़ाई के साथ क्रोमैटोग्राफिक संकेत उत्पन्न करेगा; उचित संकेत परिमाणीकरण सुनिश्चित करने के लिए, सुनिश्चित करें कि द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर प्रति क्रोमैटोग्राफिक शिखर (यानी, 3 एस या उससे तेज का एक शुल्क चक्र) कम से कम 10 शुल्क चक्र करता है।
    4. यदि एक ट्रैपिंग-शैली द्रव्यमान विश्लेषक (ऑर्बिटरैप, आयन ट्रैप) का उपयोग कर रहे हैं, तो सुनिश्चित करें कि आयन इंजेक्शन समय सीमा <200 एमएस पर सेट है; अन्य विश्लेषकों (चतुर्भुज, उड़ान के समय) के लिए, यह उनके तेजी से स्कैन समय के कारण एक मुद्दा नहीं है। एक प्रारंभिक परीक्षण की आवश्यकता हो सकती है।
      नोट:: हिस्टोन पेप्टाइड विश्लेषण के लिए MS विधियों पर अधिक विवरण निम्न संदर्भ27,28,29 में पाया जा सकता है।
  4. एमपीए के 10 μL में पुन: निलंबित नमूना, जो पचा हिस्टोन नमूने के ~ 1 μg / μL से मेल खाती है। सटीक लोडिंग राशि महत्वपूर्ण नहीं है (यह भी आकलन करने के लिए तुच्छ नहीं है) यदि बैच में सभी नमूने समान dilutions और वॉल्यूम का उपयोग करके लोड किए गए हैं।
  5. HPLC स्तंभ पर नमूने के 1 μL लोड करें।
  6. चरण 10.1-10.3 में क्रमादेशित LC-MS/MS विधि चलाएँ।

11. डेटा विश्लेषण

  1. MS कच्ची डेटा फ़ाइलों को पीक क्षेत्र एकीकरण करने के लिए डिज़ाइन किए गए सॉफ़्टवेयर में आयात करें.
    नोट: EpiProfile 30,31 वर्तमान अध्ययन में उपयोग किया जाता है और आम तौर पर अनुशंसित है, क्योंकि यह ज्ञात हिस्टोन पेप्टाइड्स के विश्वसनीय पीक क्षेत्र निष्कर्षण के लिए अनुकूलित है। हालांकि, निकाले गए आयन क्रोमैटोग्राफी जैसे स्काईलाइन32,33 के लिए अन्य स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर उपयुक्त हैं।
  2. एक दिए गए (संयुक्त राष्ट्र) संशोधित पेप्टाइड की सापेक्ष बहुतायत की गणना एक एकल पेप्टाइड के क्षेत्र के रूप में करें जो इसके सभी संशोधित रूपों में पेप्टाइड के कुल क्षेत्र से विभाजित है। EpiProfile30,31 जैसे सॉफ़्टवेयर में पहले से ही सिग्नल निष्कर्षण के लिए पेप्टाइड्स के पुस्तकालय शामिल हैं। अन्यथा, नियमित प्रोटिओमिक्स पाइपलाइनों का उपयोग करके मैन्युअल रूप से या पेप्टाइड पहचान के माध्यम से ब्याज के पेप्टाइड्स की एक लाइब्रेरी उत्पन्न करें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में, HepG2 / C3A गोलाकार को 20 mM NaBut और 10 mM NaSuc के साथ इलाज किया गया था, जिनमें से दोनों हिस्टोन पीटीएम (चित्रा 3 ए) के वैश्विक स्तर को प्रभावित करते थे। हिस्टोन पीटीएम को तब एमएस / एमएस अधिग्रहण (चित्रा 3 बी) के माध्यम से एकल अवशेष स्तर पर पहचाना और परिमाणित किया गया था।

जब नमूनों को प्रतिकृति में चलाया जाता है, तो नमूनों के बीच एक पीटीएम के गुना परिवर्तन संवर्धन का आकलन करने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण किया जा सकता है, साथ ही अवलोकन की पुनरुत्पादकता भी। दिखाए गए डेटा से पता चलता है कि एसिटिलेशन के साथ संशोधित पेप्टाइड्स को NaBut बनाम नियंत्रण (चित्रा 3 C) के साथ इलाज किए गए गोलाकार में समृद्ध किया जाता है, जबकि NaSuc के साथ इलाज किए गए नमूनों में लाइसिन सक्सिनिलेशन (चित्रा 3 डी) के साथ संशोधित हिस्टोन पेप्टाइड्स की एक उच्च सापेक्ष बहुतायत होती है। ये गणना एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम में की गई थी जैसा कि एक अलग प्रकाशन34 में विस्तृत है। किसी दिए गए हिस्टोन संशोधन की समग्र वृद्धि को रडार भूखंडों में बेहतर ढंग से दर्शाया जा सकता है, जहां एक निश्चित संशोधन की उच्च वैश्विक बहुतायत का अवलोकन करना अधिक सहज हो जाता है, यहां तक कि विश्लेषण किए गए संशोधन साइटों के बारे में विस्तृत जानकारी बनाए रखते हुए भी (चित्रा 3 ई, एफ)।

यह प्रोटोकॉल हिस्टोन एच 3 अमीनो एसिड अवशेषों 9-17 से एक पेप्टाइड उत्पन्न करता है, जिसमें अक्सर संशोधित अवशेष K9, S10 और K14 शामिल होते हैं। दिखाए गए डेटा से संकेत मिलता है कि NaBut के साथ उपचार H3K14ac के स्तर को बढ़ाता है, लेकिन केवल हिस्टोन पर H3K9me2 के साथ सह-संशोधित होता है और H3K9me3 (चित्रा 4A) नहीं। दो संशोधनों के बीच सह-अस्तित्व आवृत्ति को एक रिंग ग्राफ के रूप में अधिक सहजता से दर्शाया जा सकता है, जहां नोड्स व्यक्तिगत संशोधनों का प्रतिनिधित्व करते हैं जबकि कनेक्टर लाइनों की मोटाई दो पीटीएम (चित्रा 4 बी) के बीच सह-अस्तित्व आवृत्ति का प्रतिनिधित्व करती है। कभी-कभी, सह-अस्तित्व आवृत्ति अप्रभावित होती है, लेकिन बार प्लॉट के रूप में प्रतिनिधित्व किया गया डेटा भ्रामक हो सकता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 4A में दर्शाए गए डेटा से संकेत मिलता है कि संयोजन H3K9me2K14ac नियंत्रण की तुलना में NaBut उपचार में अधिक प्रचुर मात्रा में है। यह सही है, लेकिन यह दिया गया संयोजन उपचार की परवाह किए बिना सबसे अधिक बार होता है। चित्रा 4B स्पष्ट रूप से दिखाता है कि H3K9me2K14ac और H3K9me3K14ac उपचार (लाइन मोटाई) की परवाह किए बिना सबसे लगातार संयुक्त पैटर्न हैं, लेकिन H3K14ac (नोड) के वैश्विक स्तर वास्तव में प्रयोग में बदल रहे हैं।

यह प्रोटोकॉल हिस्टोन एच 4 अवशेषों 4-17 से एक पेप्टाइड उत्पन्न करता है, जिसमें K5, K8, K12, और K16 पदों पर परिवर्तनीय अवशेष शामिल हैं (ज्यादातर एसिटिलेशन द्वारा)। नियंत्रण और NaBut उपचार की तुलना करते समय, डेटा का प्रतिनिधित्व करके एसिटिलेशन के संयोजन में वृद्धि का निरीक्षण करना संभव है, उदाहरण के लिए, शब्द बादल (चित्रा 4 सी)। यह प्रतिनिधित्व स्पष्ट रूप से इस बात पर प्रकाश डालता है कि हिस्टोन एच 4 का असंशोधित संस्करण नियंत्रण नमूने में सबसे प्रचुर मात्रा में है, जबकि NaBut के साथ इलाज किए गए गोलाकार दोगुने, ट्रिपली और चौगुनी एसिटाइलेटेड हिस्टोन एच 4 प्रोटिओफॉर्म में समृद्ध होते हैं। हालांकि, सटीक मूल्यों को प्रदर्शित करने में शब्द बादल सीमित हैं; हिस्टोन कोड की सापेक्ष बहुतायत को पाठ के आकार से डी-जटिल किया जाना चाहिए, जिसका गलत अनुमान लगाया जा सकता है। इसलिए, वेन आरेख या अधिक आधुनिक समकक्ष जैसे UpSetR प्रतिनिधित्व35 का उपयोग सह-मौजूदा हिस्टोन पीटीएम (चित्रा 4 डी, ई) के सटीक परिमाणीकरण को दिखाने के लिए किया जा सकता है। डेटा एक बार फिर से हाइलाइट किया गया है कि हिस्टोन एच 4 पर एसिटिलेशन के चयनित संयोजन नियंत्रण की तुलना में NaBut उपचार में अपेक्षाकृत अधिक प्रचुर मात्रा में हैं।

Figure 1
चित्रा 1: 3 डी गोलाकार के हिस्टोन पेप्टाइड विश्लेषण के लिए वर्कफ़्लो। HepG2 / C3A कोशिकाओं को पहली बार 2 डी संस्कृति में उगाया जाता है जब तक कि वे 80% confluency तक नहीं पहुंच जाते। कोशिकाओं को तब एक संतुलित बायोरिएक्टर में स्थानांतरित कर दिया जाता है और क्लिनोस्टेट इनक्यूबेटर के भीतर रखा जाता है जहां वे गोलाकार बनाने के लिए 10-11 आरपीएम पर घूमेंगे। 18 दिनों के बाद, गोलाकार को या तो 20 mM NaBut या 10 mM NaSuc के साथ इलाज किया जाता है और उनके संबंधित समय बिंदुओं के बाद काटा जाता है। नाभिक को कोशिकाओं से अलग किया जाता है और हिस्टोन निष्कर्षण 0.2एम एच 2एसओ4 के साथ किया जाता है। हिस्टोन व्युत्पादन तब ट्रिप्सिन पाचन से पहले और बाद में प्रोपियोनिक एनहाइड्राइड के साथ किया जाता है ताकि तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा परिणामी छोटे पेप्टाइड्स के प्रतिधारण को सुनिश्चित किया जा सके। नमूने desalted हैं और उसके बाद चरण 10 में उल्लिखित LC-MS/MS विधि का उपयोग कर चलाएँ, और परिणामस्वरूप डेटा चरण 11 में वर्णित के रूप में विश्लेषण किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्रोपियोनिलेशन और डिसाल्टिंग चरणों के लिए सेटअप। (ए) प्रोपियोनिलेशन एक धुएं के हुड में किया जाता है और सभी घटकों को रखा जाता है ताकि चरणों को त्वरित उत्तराधिकार में निष्पादित किया जा सके। (बी) प्रोपियोनिलेशन के पहले दौर की योजनाबद्ध, ट्रिप्सिन पाचन, और हिस्टोन एच 3.1 पूंछ पर प्रोपियोनिलेशन का दूसरा दौर। (सी) डिसाल्टिंग 96-वेल वैक्यूम मैनिफोल्ड और 96-वेल पॉलीप्रोपाइलीन फिल्टर प्लेट का उपयोग करके बेंच पर किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: व्यक्तिगत हिस्टोन संशोधनों का प्रतिनिधित्व। (ए) बार ग्राफ नियंत्रण में सामान्य वैश्विक हिस्टोन संशोधनों की सापेक्ष बहुतायत को दर्शाता है और इलाज किया जाता है (20 mM NaBut या 10 mM NaSuc) HepG2 / C3A गोलाकार। (बी) नियंत्रण में हिस्टोन एच 3 पेप्टाइड (केएसटीजीजीकेएपीआर) के अवशेषों 9-17 पर होने वाले एकल हिस्टोन पीटीएम की बहुतायत को दर्शाने वाला बार ग्राफ और उपचारित (20 एमएम NaBut या 10 mM NaSuc) HepG2 / C3A गोलाकार। (C,D) ज्वालामुखी भूखंडों गुना परिवर्तन और हिस्टोन पेप्टाइड पीटीएम के विभेदक अभिव्यक्ति के महत्व को दिखाने के बाद 20 mM NaBut (सी) या 10 mM NaSuc (डी) के साथ उपचार के बाद. हाइलाइट किए गए नीले और हरे रंग के बिंदु क्रमशः एसिटाइलेटेड और सकिनिलेटेड अवशेषों का प्रतिनिधित्व करते हैं। (E,F) नियंत्रण की तुलना में क्रमशः 20 mM NaBut या 10 mM NaSuc के साथ उपचार के बाद एकल हिस्टोन पेप्टाइड एसिटिलेशन (ई) या succinylation (एफ) की बहुतायत दिखाने वाले रडार भूखंड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: सह-मौजूदा हिस्टोन संशोधनों का प्रतिनिधित्व। (ए) बार ग्राफ हिस्टोन एच 3 (KSTGGKAPR) के अवशेषों पर होने वाले मिश्रित हिस्टोन पीटीएम की बहुतायत को दर्शाता है नियंत्रण में और इलाज किया गया (20 mM NaBut या 10 mM NaSuc) HepG2 / C3A गोलाकार। (बी) नियंत्रण में हिस्टोन एच 3 (केएसटीजीजीकेएपीआर) के अवशेषों 9-17 पर मिश्रित हिस्टोन पीटीएम के बीच संबंध को दर्शाने वाले रिंग ग्राफ (20 एमएम NaBut) हेपजी 2 / सी 3 ए गोलाकार। नोड रंग की तीव्रता अपने उपचार समूह के भीतर एक एकल पीटीएम की बहुतायत से मेल खाती है, जबकि लाइन की मोटाई पीटीएम सह-घटना की आवृत्ति से मेल खाती है। (सी) नियंत्रण में हिस्टोन एच 4 अवशेषों पर मिश्रित हिस्टोन पीटीएम की आवृत्ति दिखाने वाले शब्द बादल और उपचारित (20 mM NaBut) HepG2 / C3A गोलाकार। पाठ का आकार निर्दिष्ट संयोजी PTM की बहुतायत के साथ मेल खाता है। (D,E) हिस्टोन H4 पेप्टाइड अवशेषों पर सह-मौजूदा संशोधनों की आवृत्ति का प्रतिनिधित्व करने वाला वेन आरेख नियंत्रण में 4-17 और 20 mM NaBut उपचारित नमूनों का प्रतिनिधित्व करता है। डेटा ShinyApp UpSetR35 का उपयोग करके प्रदर्शित किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 1: इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके पता लगाए गए पेप्टाइड्स की सूची। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हिस्टोन पीटीएम का विश्लेषण मूल रूप से विशिष्ट प्रोटिओमिक्स विश्लेषण पाइपलाइन से अलग है। अधिकांश हिस्टोन पीटीएम में अभी भी रहस्यमय जैविक कार्य हैं; नतीजतन, जीन ओंटोलॉजी या पाथवे डेटाबेस जैसे एनोटेशन उपलब्ध नहीं हैं। कई संसाधन मौजूद हैं जो हिस्टोन संशोधनों को उनके उत्प्रेरण या प्रोटीन युक्त डोमेन के लिए जिम्मेदार एंजाइम के साथ जोड़ते हैं जो इन पीटीएम को बांधते हैं (उदाहरण के लिए, HISTome36)। साथ ही, क्रोमैटिन की समग्र स्थिति पर अनुमान लगाना संभव है जब हिस्टोन पीटीएम के वैश्विक स्तर को विनियमित किया जाता है। उदाहरण के लिए, हिस्टोन एसिटिलेशन या अन्य एसिलेशन जैसे सक्सिनिलेशन की समग्र वृद्धि आमतौर पर क्रोमैटिन डी-संक्षेपण37,38 से जुड़ी होती है।

एमएस विश्लेषण इन संशोधनों के बारे में अधिक विस्तृत जानकारी प्रदान करता है, जैसे कि अमीनो एसिड अनुक्रम पर उनका सटीक स्थानीयकरण। इस प्रोटोकॉल में, एमएस / एमएस अधिग्रहण का उपयोग हिस्टोन पीटीएम की पहचान करने और मापने के लिए किया जाता है, जो जैविक व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है। उदाहरण के लिए, हिस्टोन H3 (H3K4me3) के लाइसिन 4 पर ट्राइमिथाइलेशन को सक्रिय रूप से ट्रांसक्रिप्टेड जीन39 के प्रवर्तकों पर समृद्ध किया जाता है, जबकि लाइसिन 9 (H3K9me3) बेंचमार्क पर एक ही संशोधन हेटरोक्रोमैटिन40 का गठन करता है। हिस्टोन संशोधनों का उपयोग वर्तमान में विशिष्ट बीमारियों में बायोमार्कर के रूप में किया जा रहा है; इस प्रकार, हिस्टोन विश्लेषण का उपयोग उपचार की प्रतिक्रिया के अलावा रोग विकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, एपिजेनेटिक दवाओं के साथ)41,42।

एकल पीटीएम के विपरीत कई पीटीएम के बीच बातचीत का नेत्रहीन रूप से प्रतिनिधित्व करना अधिक चुनौतीपूर्ण है। जबकि रिंग ग्राफ़ जैसे मौजूदा चार्ट दो पीटीएम की सह-अस्तित्व आवृत्ति दिखा सकते हैं, वे एक समय में दो से अधिक पीटीएम के बीच सह-अस्तित्व आवृत्ति का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं, क्योंकि इसके लिए नेटवर्क के तीन-आयामी प्रतिनिधित्व की आवश्यकता होगी। इस कारण से, अन्य अभ्यावेदन हिस्टोन कोड में परिवर्तन को उजागर करने के लिए अधिक उपयुक्त हो सकते हैं जब तीन या अधिक पीटीएम पर विचार किया जाता है। सामान्य तौर पर, डेटा प्रतिनिधित्व में विविधता लाने से नमूनों के बीच महत्वपूर्ण परिवर्तनों का निरीक्षण करने की उच्च संभावनाएं मिलती हैं। यह प्रोटोकॉल हिस्टोन पीटीएम और सह-मौजूदा पीटीएम के नियमों को प्रदर्शित करने के लिए विभिन्न चित्रों के उदाहरण प्रस्तुत करता है।

यद्यपि यह प्रोटोकॉल ट्रिप्सिन पाचन (लगभग 4-20 अमीनो एसिड) के कारण अपेक्षाकृत छोटे हिस्टोन पेप्टाइड्स उत्पन्न करता है, चयनित पेप्टाइड्स में कई परिवर्तनीय अवशेष होते हैं। इन पेप्टाइड्स का विश्लेषण पीटीएम की सह-अस्तित्व आवृत्तियों के परिमाणीकरण के लिए अनुमति देता है, जो किसी दिए गए डेटासेट में किस संयोजन हिस्टोन चिह्नों को विनियमित किया जाता है, इसके बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रकट कर सकता है। विशेष रूप से, नमूना तैयारी के दौरान कोई कदम नहीं हैं जहां हिस्टोन का परिमाणीकरण किया जाता है। इसके चार कारण हैं: (1) ट्रिप्सिन में गतिविधियों की एक विस्तृत श्रृंखला है और इसका उपयोग नमूना अनुपात (1: 10-1: 200) के लिए एंजाइम की एक विस्तृत श्रृंखला में किया जा सकता है। यहां तक कि जब निकाले गए हिस्टोन की प्रयोगात्मक उपज अपेक्षित से भिन्न होती है, तो इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके पाचन के साथ मुद्दों का सामना नहीं किया गया है। (2) यह प्रोटोकॉल सामग्री की मिनट मात्रा के लिए अभिप्रेत है, जहां हिस्टोन परिमाणीकरण संवेदनशीलता की कमी के कारण प्रदर्शन करना मुश्किल हो सकता है। (3) हिस्टोन सामग्री की मात्रा की परवाह किए बिना एक निरंतर ट्रिप्सिन एकाग्रता का उपयोग करके, हम क्रोमैटोग्राफी प्रदर्शन को बेंचमार्क करने के लिए ट्रिप्टिक पेप्टाइड्स (ट्रिप्सिन ऑटोलाइज़ के रूप में) का उपयोग कर सकते हैं। नमूना उपज में मामूली बदलाव डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर (चरण 11) द्वारा सामान्यीकृत किया जाएगा, जो सामान्यीकरण प्रक्रिया के दौरान हर के रूप में किसी दिए गए पेप्टाइड के लिए सभी (संयुक्त राष्ट्र) संशोधित संकेतों का उपयोग करता है। (4) अंत में, शुरुआती सामग्री की मात्रा का नाटकीय रूप से कम करके आंका जाना नैनोएलसी क्रोमैटोग्राफिक कॉलम को ओवरलोड करने की समस्याएं पैदा कर सकता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल में इंगित के रूप में desalting चरण निष्पादित करने से इस समस्या को होने से रोकता है। प्रारंभिक सामग्री की अत्यधिक मात्रा के मामले में (जैसे >100 μg), desalting राल की क्षमता की सीमा पार हो जाएगी, और लोडिंग चरण के दौरान किसी भी अतिरिक्त नमूने को धोया जाएगा।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस विश्लेषण द्वारा पता लगाए गए सभी पेप्टाइड्स को चित्र 3 और चित्रा 4 में हाइलाइट नहीं किया गया है। साथ ही, इन विशिष्ट नमूना तैयारी और अधिग्रहण विधियों का उपयोग करके सभी हिस्टोन संशोधनों का पता लगाने योग्य नहीं हैं। अनुपूरक तालिका 1 उन सभी पेप्टाइड संकेतों को सूचीबद्ध करने के लिए प्रदान की जाती है जो वर्णित पाइपलाइन का उपयोग करके निकाले जाते हैं। कुछ प्रसिद्ध संशोधनों को तालिका में सूचीबद्ध नहीं किया गया है, क्योंकि वर्णित नमूना तैयारी उनकी पहचान के लिए उपयुक्त नहीं है। उल्लेखनीय उदाहरण हिस्टोन H2A और H2B से ubiquitinylated पेप्टाइड्स हैं, और हिस्टोन H2A के फॉस्फोराइलेशन। एक्स (डीएनए क्षति का एक सामान्य मार्कर)। ऐसा इसलिए है क्योंकि इन पीटीएम से जुड़े पेप्टाइड्स का प्रोपियोनिलेशन अत्यधिक लंबे पेप्टाइड्स की ओर जाता है, जो सी 18 क्रोमैटोग्राफी और वर्णित एमएस डिटेक्शन विधि के लिए उपयुक्त नहीं हैं। अन्य संशोधन जो साहित्य में मौजूद हैं लेकिन पूरक तालिका 1 में मौजूद नहीं हैं, वे बहुत कम बहुतायत संशोधन हैं (वर्तमान में केवल संवर्धन रणनीतियों जैसे कि इम्यूनोप्रिसिपिटेशन या विशिष्ट सेल उपचार के बाद एमएस का उपयोग करके पता लगाने योग्य है), जैसे लैक्टिलेशन43 या सेरोटोनिलेशन44। पोलीमराइजेशन या हिस्टोन अनुक्रम के लिए विषम सहसंयोजक बंधन के कारण अप्रत्याशित द्रव्यमान बदलावों के साथ हिस्टोन संशोधनों पर भी विचार नहीं किया जाता है (उदाहरण के लिए, पॉली-एडीपी-राइबोसाइलेशन45 और ग्लाइकेशन46)। इसके अतिरिक्त, यह प्रोटोकॉल HepG2 / C3A गोलाकार के इलाज के लिए NaSuc और NaBut का उपयोग करता है, लेकिन इसे अन्य दवाओं / एपिजेनेटिक संशोधक और 2 D / 3 D सेल संस्कृति प्रकारों के साथ उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

सिडोली प्रयोगशाला कृतज्ञतापूर्वक ल्यूकेमिया रिसर्च फाउंडेशन (Hollis Brownstein नए अन्वेषक अनुसंधान अनुदान), AFAR (Sagol नेटवर्क GerOmics पुरस्कार), Deerfield (Xseed पुरस्कार), रिले Therapeutics, मर्क, और निदेशक के एनआईएच कार्यालय (1S10OD030286-01) को स्वीकार करती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% trypsin-EDTA solution Gibco 25300054
0.5-20 µL pipet tips BRAND 13-889-172 (Fisher Scientific)
1.5 mL microcentrifuge tubes Bio-Rad 2239480
10 µL multi-channel pipette BRAND BR7059000 (Millipore Sigma)
10 mL syringe Henke Sass Wolf 14-817-31 (Fisher Scientific) Luer lock tip, graduated to 12 mL
10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettes Eppendorf 14-285-904 (Fisher Scientific)
1000 µL pipet tips Rainin 30389164
18 G syringe needle Air-Tite 14-817-100 (Fisher Scientific) 3" length, 0.05" diameter
200 µL multi-channel pipette Corning 4082
2-200 µL pipet tips BRAND Z740118 (Millipore Sigma)
24-well ultra-low attachment microplate Corning 07-200-602
75 cm2  U-shaped cell culture flask Corning 461464U Untreated, with vent cap
96-well skirted plate Axygen PCR-96-FS-C (Corning)
Acetone Fisher Scientific A949-1 Acetone should be used cold
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) Sigma-Aldrich A6141-25G
Ammonium hydroxide solution Fisher Scientific AC423300250
Cell culture grade water Corning 25-055-CV
ClinoReactor CelVivo 10004-12 Bioreactor for 3D cell culture
ClinoStar CelVivo N/A Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture
Control unit CelVivo N/A Tablet for ClinoStar settings
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Corning 17-205-CV 1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35-010-CV
Formic acid Thermo Scientific 28905
Fume hood Mott N/A Model 7121000
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-8B 9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile
Glutagro supplement Corning 25-015-CI 200 mM L-ananyl-L-glutamine
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Corning 21-022-CV 1X solution without calcium, magnesium, and phenol red
HPLC grade acetonitrile Fisher Scientific A955-4
HPLC grade water Fisher Scientific W6-1
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A481-212
Ice N/A N/A
MEM non-essential amino acids Corning 25-025-CI 100X solution
Oasis HLB resin Waters 186007549 Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer Thermo Fisher Scientific IQLAAEGAAPFADBMBHQ High resolution mass spectrometer
Oro-Flex I polypropylene filter plate Orochem OF1100 96-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI 100X solution
pH paper Hydrion Z111848 (Sigma-Aldrich) 0-13 pH test paper
Pipette gun Eppendorf Z666467 (Millipore Sigma)
Polymicro capillary Molex 50-110-7740 (Fisher Scientific) Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD
Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile Fisher Scientific 1367549
Propionic anhydride Sigma-Aldrich 240311-50G
Refrigerated centrifuge Thermo Scientific 75-217-420
Reprosil-Pur resin MSWIL R13.AQ.0003 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size
Rotator Clay Adams 25477 (American Laboratory Trading) Nutator Mixer 1105
Sequencing grade modified trypsin Promega V5111
Sodium butyrate Thermo Scientific A11079
Sodium succinate dibasic Sigma-Aldrich 14160-100G
SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes) Savant 20249 (American Laboratory Trading)
SpeedVac vacuum concentrator (96-well) Thermo Scientific 15308325 Savant SPD1010
Sterile hood Thermo Scientific 1375 Class II, Type A2
Sulfuric acid (H2SO4) Fisher Scientific 02-004-375 Baker Analyzed ACS reagent
Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish Fisher Scientific 08-772-23
Trichloroacetic acid (TCA) Thermo Scientific AC421451000 Resuspend 100% w/v in HPLC grade water
Trifluoroacetic acid (TFA) Fisher Scientific PI28904 Sequencing grade
Vacuum manifold 96-well Millipore MAVM0960R
Vortex Sigma-Aldrich Z258415
Water bath Fisher Scientific FSGPD10
Wide bore pipet tips 1000 µL Axygen 14-222-703 (Fisher Scientific)
Wide bore pipet tips 200 µL Axygen 14-222-730 (Fisher Scientific)

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References

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जीव विज्ञान अंक 183 3 डी संस्कृति हिस्टोन मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रत्यक्ष इंजेक्शन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों
हेपेटिक ऊतक के 3 डी सेल संस्कृति मॉडल में हिस्टोन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों का वैश्विक स्तर का परिमाणीकरण
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