Summary
Denne protokollen skisserer hvordan et tredimensjonalt cellekultursystem kan brukes til å modellere, behandle og analysere kromatinmodifikasjoner i en nesten fysiologisk tilstand.
Abstract
Flate kulturer av pattedyrceller er en mye brukt in vitro tilnærming for å forstå cellefysiologi, men dette systemet er begrenset i modellering av faste vev på grunn av unaturlig rask cellereplikering. Dette er spesielt utfordrende når modellering av moden kromatin, da raske replikeringsceller ofte er involvert i DNA-replikasjon og har en heterogen polyploid populasjon. Presentert nedenfor er en arbeidsflyt for modellering, behandling og analyse av quiescent kromatin modifikasjoner ved hjelp av en tredimensjonal (3D) cellekultur system. Ved hjelp av denne protokollen vokser hepatocellulære karsinomcellelinjer som reproduserbare 3D-sfæroider i en inkubator som gir aktiv næringsdiffusjon og lave skjærekrefter. Behandling med natrium butyrat og natrium succinate induserte en økning i henholdsvis histonacetylering og kortfattethet. Økning i nivåer av histon acetylering og kortfattethet er forbundet med en mer åpen kromatintilstand. Sfæroider samles deretter inn for isolering av cellekjerner, hvorfra histoneproteiner ekstraheres for analyse av deres postoversettelsesendringer. Histone analyse utføres via flytende kromatografi koblet online med tandem masse spektrometri, etterfulgt av en intern beregningsrørledning. Til slutt vises eksempler på datarepresentasjon for å undersøke frekvensen og forekomsten av kombinatoriske histonemerker.
Introduction
Siden slutten av 1800-tallet har cellekultursystemer blitt brukt som modell for å studere vekst og utvikling av celler utenfor menneskekroppen 1,2. Deres bruk har også blitt utvidet for å studere hvordan vev og organer fungerer i både sunne og syke sammenhenger 1,3. Suspensjonsceller (f.eks. blodceller) vokser i Petri-retter eller kolber sømløst og om hverandre, da de ikke samles i tredimensjonale (3D) strukturer in vivo. Celler avledet fra faste organer kan vokse i enten todimensjonale (2D) eller 3D-kultursystemer. I 2D-kultur dyrkes celler i en monolayer som holder seg til en flat overflate 2,4. 2D-cellekultursystemer er preget av eksponentiell vekst og en rask doblingstid, vanligvis 24 timer til noen dager5. Celler i 3D-systemer vokser for å danne intrikate cellecelleinteraksjoner som modellerer vevlignende konglomerater nærmere, og de er preget av deres evne til å nå en dynamisk likevekt der deres doblingstid kan nå 1 måned eller lenger5.
Presentert i dette dokumentet er en innovativ metodikk for å vokse 3D-sfæroider i roterende cellekultursystemer som simulerer redusert tyngdekraft6. Dette er et forenklet derivat av et cellekultursystem introdusert av NASA på 1990-tallet7. Denne tilnærmingen minimerer skjærekrefter, som forekommer i eksisterende metoder som spinnende kolber, og øker sfæroid reproduserbarhet6. I tillegg øker den roterende bioreaktoren aktiv næringsdiffusjon, og minimerer nekrotisk formasjon som forekommer i systemer som hengende dråpecellekultur der medieutveksling er upraktisk6. På denne måten vokser cellene for det meste uforstyrret, noe som muliggjør dannelse av strukturelle og fysiologiske egenskaper forbundet med celler som vokser i vev. C3A hepatocytter (HepG2/C3A) dyrket på denne måten hadde ikke bare ultrastrukturelle organeller, men produserte også mengder ATP, adenylatkinase, urea og kolesterol som kan sammenlignes med nivåer observert i vivo 1,2. I tillegg viser celler som vokser i 2D vs.3D cellekultursystemer forskjellige genuttrykksmønstre8. Genuttrykksanalyse av C3A-hepatocytter dyrket som 3D-sfæroider viste at disse cellene uttrykte et bredt spekter av leverspesifikke proteiner, samt gener involvert i viktige veier som regulerer leverfunksjonen8. Tidligere publikasjoner viste forskjellene mellom proteomer av eksponentielt voksende celler i 2D-kultur vs. celler ved dynamisk likevekt i 3D-sfæroidkulturer5. Disse forskjellene inkluderer cellulær metabolisme, som igjen påvirker strukturen, funksjonen og fysiologien til cellen5. Proteomet av celler dyrket i 2D-kultur var mer beriket i proteiner involvert i cellereplikering, mens proteomet av 3D-sfæroider var mer beriket i leverfunksjonalitet5.
Den langsommere replikeringshastigheten til celler som vokser som 3D-sfæroider, modellerer mer nøyaktig spesifikke fenomener forbundet med kromatintilstand og modifikasjoner (f.eks. histoneklipping9). Histone klipping er en irreversibel histone post-translasjonell modifikasjon (PTM) som forårsaker proteolytisk spalting av en del av histone N-terminal halen. Mens den biologiske funksjonen fortsatt er under diskusjon 10,11,12,13, er det klart at dens tilstedeværelse i primære celler og levervev er modellert av HepG2 / C3A celler vokst som sfæroider, men ikke som flate celler 9. Dette er kritisk, da kromatintilstand og modifikasjoner regulerer DNA-avlesning hovedsakelig ved å modulere tilgjengelighet til gener og dermed deres uttrykk14. Histone PTMer påvirker enten kromatintilstanden direkte ved å påvirke nettoladningen til nukleosomene der histoner er samlet, eller indirekte ved å rekruttere kromatinforfattere, lesere og viskelær14. Hundrevis av histone PTMer har blitt identifisert til dags dato15, forsterke hypotesen om at kromatin er vert for en "histone kode" som brukes av cellen til å tolke DNA16. Imidlertid er identifiseringen av et utall PTM-kombinasjoner15, og oppdagelsen av at kombinasjoner av histone PTMer ofte har forskjellige biologiske funksjoner fra PTMer tilstede isolert (f.eks. Fischle, et al.17), fremhever at det kreves mer arbeid for å dekryptere "histonekoden".
For tiden er histone PTM-analyse enten basert på teknikker som bruker antistoffer (f.eks. vestlige flekker, immunfluorescens eller kromatinimoprecipitation etterfulgt av sekvensering [ChIP-seq]) eller massespektrometri (MS). Antistoffbaserte teknikker har høy følsomhet og kan gi detaljert informasjon om genom-bred lokalisering av histone merker, men er ofte begrenset i å studere sjeldne PTMer eller PTMer til stede i kombinasjoner 18,19,20. MS er mer egnet for høy gjennomstrømning og objektiv identifisering og kvantifisering av enkelt- og sameksisterte proteinmodifikasjoner, spesielt histoneproteiner 18,19,20. Av disse grunnene har dette og flere andre laboratorier optimalisert MS-rørledningen for analyse av histonepeptider (bottom-up MS), intakte histonehaler (middels ned MS) og histoneproteiner i full lengde (ovenfra og ned MS)21,22,23.
Nedenfor er en arbeidsflyt for dyrking av HepG2/C3A-sfæroider og klargjøring av dem for histonepeptidanalyse (bottom-up MS) via nano-flytende kromatografi, kombinert online med tandemmassespektrometri (nLC-MS/MS). En 2D-cellekultur ble dyrket og cellene ble høstet og overført til en bioreaktor hvor de skulle begynne å danne sfæroider (figur 1). Etter 18 dager i kultur ble sfæroider behandlet med natrium butyrat eller natrium succinate for å øke de relative overflodene av histonacetylering og kortfattethet. Spesielt kan 3D-kulturer behandles med gentoksiske forbindelser like godt som deres flate kulturekvivalenter; Faktisk fremhever nyere publikasjoner at toksikologiresponsen til celler i 3D-kultur er mer lik primærvev enn de i 2D flat kultur24,25. Celler ble deretter samlet inn på bestemte tidspunkter og kjernefysisk isolasjon ble utført. Deretter ble histoner ekstrahert og avlet med propionisk anhydrid før og etter trypsin fordøyelse i henhold til en protokoll først utviklet av Garcia et al.26. Denne prosedyren genererer peptider av riktig størrelse for online separasjon med omvendt fasekromatografi (C18) og deteksjon med MS. Til slutt ble histonepeptider identifisert og kvantifisert, og de genererte dataene var representert på flere måter for en mer fullstendig biologisk tolkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av buffere og reagenser
- Cellevekstmedier (for HepG2/C3A-celler): Tilsett foster bovint serum (FBS) (10 % v/v), ikke-essensielle aminosyrer (1 % v/v), L-glutamintilskudd (1 % v/v) og penicillin/streptomycin (0,5 % v/v) til Dulbeccos modifiserte ørns medium (DMEM, DMEM, inneholder 4,5 g/l glukose). Vekstmedier lagres ved 4 °C i maksimalt 2 uker.
- 200 mM natrium butyrat (NaBut) oppløsning: For å forberede 10 ml, resuspend 220.18 mg NaBut i 10 ml ddH2O. Oppbevar 1 ml aliquots ved -20 °C. Før cellebehandling, filtrer løsningen ved hjelp av et 0,45 mm sprøytefilter og tilsett 1 ml av den filtrerte løsningen til 9 ml cellevekstmedier for en arbeidskonsentrasjon på 20 mM.
- 100 mM natriumsuccinat (NaSuc)-oppløsning: For å tilberede 10 ml, resuspend 162,05 mg NaSuc i 10 ml ddH2O. Oppbevar 1 ml aliquots ved -20 °C. Før cellebehandling, filtrer løsningen ved hjelp av et 0,45 mm sprøytefilter og tilsett 1 ml av den filtrerte løsningen til 9 ml cellevekstmedier for en arbeidskonsentrasjon på 10 mM.
- Kald 0,2 M H2SO4: For å forberede 1 L, tilsett 10 ml konsentrert H2SO4 til 990 ml HPLC-vann. Oppbevars ved 4 °C.
- Kald aceton + 0,1% saltsyre (HCl): Tilsett konsentrert HCl (0,1% v / v) til aceton. Oppbevars ved 4 °C.
- 100 mM NH4HCO3-oppløsning , pH 8.0: For å forberede 1 L, resuspend 7,91 g NH4HCO3 i 1 L HPLC-klasse vann. Oppbevar 50 ml aliquots ved -20 °C.
- 0,1 % trifluoroedtisk syre (TFA)-løsning: Tilsett konsentrert TFA (0,1 % v/v) til HPLC-vann. Oppbevars ved 4 °C.
- 60 % acetonitril/0,1 % TFA-løsning: Tilsett ACETONITRIL I HPLC-klasse (60 % v/v) i HPLC-vann. Deretter legger du til konsentrert TFA (0,1% v / v) til denne løsningen. Oppbevars ved 4 °C.
- 2 % acetonitril i HPLC-klasse + 0,1 % maursyre: Tilsett ACETONITRIL I HPLC-klasse (2 % v/v) i HPLC-grad vann. Tilsett deretter konsentrert maursyre (0,1% v / v) til denne løsningen.
- 80 % acetonitril i HPLC-klasse + 0,1 % maursyre: Tilsett ACETONITRIL I HPLC-klasse (80 % v/v) i HPLC-klasse vann. Tilsett deretter konsentrert maursyre (0,1% v / v) til denne løsningen.
2. Utarbeidelse av 3D-kultursystemet
MERK: Ulike celler, primære eller udødelige, har forskjellige kulturegenskaper, slik at dannelsen av sfæroider kan variere mellom celletyper. Denne protokollen er etablert for HepG2/C3A sfæroiddannelse ved hjelp av bioreaktorer og et innovativt 3D-cellekultursystem.
- Bruk standard vekstmedier, vokse celler som en monolayer til de er 80% confluent.
- Vask celler med HBSS (5 ml for en 75 cm2 kolbe) og inkuber celler med 5 ml 0,05% trypsin-EDTA fortynnet i HBSS (1:2 fortynning) i 5 min ved 37 oC med 5% CO2.
- Kontroller celleavløsning under et mikroskop og nøytraliser trypsin ved å legge til 3 ml foster bovint serum (FBS) eller vekstmedier (som inneholder 5% -10% FBS).
- Tell antall celler og fortynn celleopphenget for å oppnå 1 x 106 celler i et maksimalt volum på 1,5 ml.
- Likevekt en ultra-lav feste 24-brønns rund bunnplate (som inneholder flere mikrobrønner per brønn) ved å vaske brønnene med 0,5 ml vekstmedier. Sentrifuger platen i 5 min ved 3000 x g for å fjerne luftbobler fra brønnens overflate.
- Overfør celleopphenget til platen og sentrifuger i 3 min ved 120 x g.
- Inkuber platen i 24 timer ved 37 oC med 5 % CO2 for sfæroiddannelse. I mellomtiden likevekter bioreaktoren ved å fylle fuktighetskammeret med 25 ml sterilt vann og cellekammeret med 9 ml vekstmedier.
- Inkuber bioreaktoren, roter i clinostat-inkubatoren, i 24 timer ved 37 oC med 5% CO2.
3. Vekst av sfæroider i bioreaktorer
MERK: For å bevare strukturen av sfæroider, brukes brede borespisser til håndtering av 3D-strukturene.
- Løsne sfæroider fra den ultra-lave festeplaten ved å forsiktig pipettere opp og ned med 1 ml brede borespisser og overføre til en vevskulturbehandlet tallerken.
- Vask platen med 0,5 ml forvarmede vekstmedier og overfør til samme tallerken.
- Evaluer kvaliteten på sfæroider ved mikroskopi og velg tilstrekkelig dannede sfæroider. Sfæroider av god kvalitet har jevn størrelse, kompaktitet og rundhet.
- Overfør sfæroider til likevektede bioreaktorer fylt med 5 ml ferske vekstmedier. Etter overføring av sfæroidene, fyll bioreaktoren helt med friske vekstmedier.
- Plasser bioreaktoren i clinostat-inkubatoren og juster rotasjonshastigheten til 10-11 rpm.
- Utveksle vekstmedier hver 2-3 dager ved å fjerne 10 ml gamle medier og erstatte det med 10 ml ferske medier.
- Juster rotasjonshastigheten i henhold til sfæroidvekst, og øk etter hvert som sfæroidene vokser i størrelse og antall.
- Etter 18 dager i kultur er sfæroider klare til behandling og/eller
4. Sfæroid behandling og innsamling
MERK: I denne protokollen behandles HepG2/C3A-sfæroider med natriumsylasjon (NaBut) og natriumsuccinat (NaSuc) for å evaluere nivåene av histonemerker som inneholder henholdsvis acetylering og korttylering.
- Forbered vekstmedier med riktig arbeidskonsentrasjon av forbindelse (f.eks. 20 mM NaBut eller 10 mM NaSuc). Utveksle media i bioreaktoren med de behandlede mediene.
MERK: For å etablere en kontrolltilstand, samle enten nok sfæroider til eksperimenter før du tilsetter behandlingen eller utpeke en bioreaktor for ubehandlede sfæroider. - Samle sfæroider for proteomisk analyse etter tilstrekkelig behandlingstid (f.eks. 48 timer til 1 uke for NaSuc-behandling eller 48-72 timer for NaBut-behandling).
MERK: For histoneutvinning ved hjelp av denne protokollen ble seks til åtte sfæroider som inneholder omtrent 1 x 106 celler samlet inn.- Fjern 3-5 ml medier fra bioreaktoren gjennom toppporten.
- Åpne frontporten og bruk en 1 ml bred borespiss for å fjerne sfæroider og plassere dem i mikrocentrifugerør.
- Sentrifuger sfæroidene ved 100 x g i 5 minutter og kast medier.
MERK: Mediene i bioreaktoren kan endres og bioreaktoren kan returneres til inkubatoren for ytterligere behandlingstid eller gjenoppretting. - Vask sfæroider med 200 μL HBSS for å fjerne FBS. Sentrifuge ved 100 x g i 5 min og fjern supernatanten.
MERK: Sfæroider kan oppbevares ved -80 oC til behandling.
5. Histone ekstraksjon
MERK: De mange grunnleggende aminosyrerester som er tilstede i histoner, gjør at de kan samhandle tett med DNA, som har en fosforsyre ryggrad. Fordi histoner er noen av de mest grunnleggende proteinene i kjernen, når de ekstraheres med iskald svovelsyre (0,2 M H2SO4) er det minimal forurensning. De ikke-histone proteinene vil utfelle i sterk syre. Høyt konsentrert trichloroacetic acid (TCA) fortynnet til en endelig konsentrasjon på 33% brukes etterpå for å utfelle histoner fra svovelsyren. Hold alle prøver, rør og reagenser på is for hele histoneutvinningen.
- Tilsett fem volumer (~100 μL) kald 0,2 M H2SO4 i cellepelleten (~10-20 μL), og pipette opp og ned for å forstyrre pelletsen og frigjøre histoner.
- Inkuber rør i opptil 4 timer ved konstant rotasjon eller risting ved 4 oC.
MERK: For gjenbrukte prøver som har et volum som er større enn 500 μL, er en 2 h inkubasjon tilstrekkelig til å trekke ut histoner (lengre inkubasjon kan føre til utvinning av andre grunnleggende kjerneproteiner). For resuspenderte prøver med et volum mindre enn 200 μL, er det nødvendig med en 4 h inkubasjon for et bedre utbytte. - Sentrifuge ved 3400 x g i 5 min ved 4 °C. Samle supernatant i et nytt rør og kast pellet senere.
- Tilsett kaldkonsentrert TCA slik at den utgjør en endelig 25% -33% v / v (f.eks. 40-60 μL kald TCA: 120 μL supernatant) og bland ved å invertere røret noen ganger.
- Inkuber rør i minst 1 time ved konstant rotasjon eller risting ved 4 oC.
MERK: For mindre startpelletsstørrelser anbefales en inkubasjon over natten. - Sentrifuge ved 3400 x g i 5 min ved 4 oC. Kast supernatant ved pipettering. Aspirer supernatanten forsiktig; Ikke berør sidene av røret eller pelletsen.
MERK: Histoner deponeres både på sidene og på undersiden av røret. Den hvite uoppløselige pellets dannet helt nederst på røret inneholder for det meste ikke-histone proteiner og andre biomolekyler. - Vask røret (vegger og pellets) med kaldt aceton + 0,1% HCl ved hjelp av en glass Pasteur pipette (~ 500 μL / rør).
- Sentrifuge ved 3400 x g i 5 min ved 4 oC. Kast supernatanten ved å snu røret.
- Vask røret (vegger og pellets) med 100% kaldt aceton ved hjelp av en pasteurpipette i glass (~500 μL/rør). Sentrifuge ved 3400 x g i 5 min ved 4 oC.
- Kast supernatanten ved å vippe røret og pipetten ut av det gjenværende acetonet. Åpne lokket og lufttørk prøven på benken i ca. 20 min.
- Fortsett til propionylering eller lagre prøver i -80 oC til bruk.
6. Første runde med avledning
MERK: Bruk av trypsin for å fordøye histoneproteiner fører til for små peptider som er vanskelige å identifisere ved hjelp av tradisjonelle proteomiske oppsett. Av denne grunn brukes propionisk anhydrid til kjemisk avledning av ɛ-aminogrupper av umodifiserte og monometyllyneinrester. Dette begrenser trypsinproteolyse til C-terminal argininrester. For prøver i 96-brønnsplater anbefales bruk av flerkanals pipetter og reservoarer for reagensoppsamling (figur 2A). Avledning utføres også etter fordøyelsen for å merke den frie N-termini av peptidene økende peptidhydrofobitet og dermed reversert fase kromatografisk oppbevaring.
- Resuspendprøver i 20 μL 15%-20% acetonitril i 100 mM ammoniumbikarbonat (pH 8,0). Virvel i 15 s, og spinn deretter ned på 1000 x g i 30 s.
- Hvis det er åtte eller flere prøver, overfører du hver resuspended prøve til en 96-brønns plate.
MERK: Hvis prøvene ikke er overført til en 96-brønnsplate, kan en enkanals pipette brukes i trinn 6.3-6.7, 7.1-7.5 og 8.1-8.5. - Under panseret, tilsett 2 μL propionisk anhydrid ved hjelp av en flerkanals pipette. Bland ved å pipettere opp og ned 5x.
- Tilsett raskt 10 μL ammoniumhydroksid ved hjelp av en flerkanals pipette. Bland ved å pipettere opp og ned 5x.
MERK: Propionsyre er et produkt av reaksjonen mellom propionisk anhydrid og frie aminer fra peptider og kan redusere prøven pH. pH 8 kan reetableres ved å tilsette ammoniumhydroksid i prøven med et forhold på 1:5 (v/v). - Kontroller at pH er 8 ved hjelp av pH-testpapir. Hvis pH < 8, juster ved å tilsette 1 μL ammoniumhydroksid. Hvis pH > 8, juster ved å tilsette 1 μL maursyre eller eddiksyre. Når pH > 10, er merking av andre aminosyrerester med høyere pKa mulig.
- Inkuber ved romtemperatur i 10 min.
- Gjenta trinn 6.3-6.6. En dobbel runde med histonpropionylering sikrer nesten fullstendig reaksjonseffektivitet.
- Tørrplate i hastighetsvakuum til alle brønnene er helt tørket (~9 h).
- Fortsett til trypsin fordøyelsen eller lagre prøver ved -80 oC til bruk.
7. Histone fordøyelse
MERK: Histoner fordøyes i peptider ved hjelp av trypsin, som kutter på karboksylsiden av arginin- og lysinrester. Men siden propionylering endrer lysinrester, er bare argininrester spaltet (figur 2B).
- Forbered trypsinoppløsning (25 ng/μL i 50 mM NH4HCO3, pH 8.0). Tilsett 20 μL trypsin (500 ng) i hver prøve.
- For å tilberede 50 mM NH4HCO3-oppløsning , fortynn 100 mM NH4HCO3-løsning 1:1 v/v med HPLC-vann.
- Kontroller at pH er 8 ved hjelp av pH-testpapir. Hvis pH < 8, juster ved å tilsette 1 μL ammoniumhydroksid. Hvis pH > 8, juster ved å tilsette 1 μL maursyre eller eddiksyre.
- Fordøy ved romtemperatur over natten eller inkuber ved 37 oC i 6-8 timer.
- Hvis det er mulig, kontroller pH etter ~ 3 h fordøyelse, da det kan ha gått ned. Hvis pH < 8, juster ved å tilsette 1 μL ammoniumhydroksid.
- Tilsett ytterligere 5 μL 50 ng/μL trypsinoppløsning (250 ng) og fortsett fordøyelsen.
- Fortsett til andre runde med propionylering eller lagre prøver ved -80 oC til bruk.
8. Derivatisering av peptid N-termini
MERK: Propionylering av histonepeptider ved deres N-terminus forbedrer oppbevaringen av de korteste peptidene ved omvendt væskekromatografi (f.eks. aminosyrer 3-8 av histone H3), da propionylgruppen øker peptidhydrofobiteten.
- Under panseret, tilsett 2 μL propionisk anhydrid ved hjelp av flerkanals pipetten. Bland ved å pipettere opp og ned 5x.
- Tilsett raskt 10 μL ammoniumhydroksid ved hjelp av flerkanalspipetten. Bland ved å pipettere opp og ned 5x.
MERK: Propionsyre er et produkt av reaksjonen mellom propionisk anhydrid og frie aminer fra peptider, og kan redusere prøven pH. pH 8 kan reetableres ved å tilsette ammoniumhydroksid i prøven med et forhold på 1:5 (v/v). - Kontroller at pH er 8 ved hjelp av pH-testpapir. Hvis pH < 8, juster ved å tilsette 1 μL ammoniumhydroksid. Hvis pH > 8, juster ved å tilsette 1 μL maursyre eller eddiksyre. Når pH > 10, er merking av andre aminosyrerester med høyere pKa mulig.
- Inkuber ved romtemperatur i 10 min.
- Gjenta trinn 8.1-8.4. En dobbel runde med histonpropionylering sikrer nesten fullstendig reaksjonseffektivitet.
- Tørrplate i hastighetsvakuum til alle brønnene er helt tørket (~9 h).
- Fortsett til avsaltingstrinnet eller lagre prøver ved -80 oC til bruk.
9. Avsalting og prøveopprydding
MERK: Salter som finnes i prøven forstyrrer massespektrometrianalysen. Salter ioniseres også under elektrospray og kan undertrykke signaler fra peptider. Salter kan danne ioniske addukter på peptider, noe som fører til at det adduserte peptidet har en annen masse. Dette reduserer peptidets signalintensitet og forhindrer riktig identifisering og kvantifisering. Oppsettet for avsalting er illustrert i figur 2C.
- Begynn å blande HLB-harpiksen (50 mg/ml i 100 % acetonitril) på en magnetisk røreplate.
- Pass på at det er plassert en 96-brønns oppsamlingsplate under 96-brønns polypropylenfilterplaten for å samle gjennomstrømningen.
- Tilsett 70 μL HLB-suspensjon per brønn til filterplaten. Slå forsiktig på vakuumet for å unngå sprut. Kast gjennomstrømningen.
- Vask harpiksen med 100 μL 0,1% TFA. Slå forsiktig på vakuumet for å unngå sprut. Kast gjennomstrømningen.
- Resuspend hver prøve i 100 μL av 0,1% TFA. Kontroller pH; det skal være ~ 2-3.
- Last hver prøve inn i hver brønn. Slå på vakuumet forsiktig for å unngå sprut. Kast gjennomstrømningen.
- Vask med 100 μL 0,1% TFA. Slå på vakuumet forsiktig for å unngå sprut. Kast gjennomstrømningen.
- Sett på plass oppsamlingsplaten med en ny 96-brønns oppsamlingsplate.
- Tilsett 60 μL 60% acetonitril/0,1% TFA per brønn. Slå på vakuumet forsiktig for å unngå sprut. Samle gjennomstrømningen og tørk i et hastighetsvakuum.
- Fortsett til LC-MS/MS eller lagre prøver ved -80 oC til bruk.
10. Histon peptidanalyse via flytende kromatografi kombinert med massespektrometri
- Forbered de mobile fasene for å kjøre på høyytelses væskekromatografi (HPLC). Mobil fase A (MPA): 2 % HPLC-grad acetonitril + 0,1 % maursyre. Mobil fase B (MPB): 80 % HPLC-klasse acetonitril + 0,1 % maursyre.
- Programmer HPLC-metoden på følgende måte: (1) 4%-34% MPB over 30 min; (2) 34%-90% MPB over 5 min; og (3) isokratisk 90% MPB i 5 min. Bruk følgende anbefalte kolonneegenskaper: C18 3 μm emballasjemateriale, 75 μm innvendig diameter, 20-25 cm lengde. Sett strømningshastigheten til 250-300 nL/min for nanokolonner med en innvendig diameter på 75 μm.
- I tilfelle HPLC ikke er programmert til å automatisere kolonnelikevekt før prøvelasting, inkluderer (4) 90% -4% MPB over 1 min og (5) isokratisk 4% MPB over 10 minutter.
- Programmere MS-anskaffelsesmetoden.
- Kontroller at instrumentet utfører én fullstendig MS-skanning i begynnelsen av hver driftssyklus. Instrumentering med høy oppløsning (f.eks. orbitrap- eller flytidsanalysatorer) anbefales på grunn av massenøyaktigheten som kan brukes under signalutvinning. Instrumentering med lav oppløsning kan imidlertid også brukes som tidligere beskrevet27,28.
- Kontroller at hele MS-skanningen etterfølges av 16 MS/MS-skanningshendelser, hver med en isolasjonsbredde på 50 m/z, som strekker seg over m/z-området 300-1100. For eksempel bør den første skanningen isolere signaler ved 300-350 m / z, den andre ved 350-400 m / z, etc. Hvis det er mulig, må du også anskaffe MS/MS-skanninger i høy oppløsning, men lavere oppløsning sammenlignet med hele MS-skanningen er tilstrekkelig (på grunn av de mindre massene av fragmentioner sammenlignet med intakte ioner).
- HPLC-metoden vil generere kromatografiske signaler med toppbredder på ~ 3-40 s; For å sikre riktig signal kvantifisering, sørg for at massespektrometeret utfører minst 10 driftssykluser per kromatografisk topp (dvs. en driftssyklus på 3 s eller raskere).
- Hvis du bruker en masseanalysator i overlappingsstil (orbitrap, ionfelle), må du kontrollere at tidsbegrensningen for ioninnsprøyting er satt til <200 ms. for andre analysatorer (quadrupole, time-of-flight), er dette ikke et problem på grunn av deres raskere skannetid. Det kan være nødvendig med en foreløpig test.
MERK: Flere detaljer om MS-metoder for histone peptidanalyse finner du i følgende referanser 27,28,29.
- Resuspendprøve i 10 μL MPA, som tilsvarer ~1 μg/μL fordøyd histoneprøve. Den nøyaktige lastemengden er ikke kritisk (heller ikke triviell å vurdere) hvis alle prøvene i batchen lastes ved hjelp av lignende fortynninger og volumer.
- Last inn 1 μL prøve på HPLC-kolonnen.
- Kjør LC-MS/MS-metoden som er programmert i trinn 10.1-10.3.
11. Dataanalyse
- Importer MS Raw-datafilene til programvare som er utviklet for å utføre toppområdeintegrasjon.
MERK: EpiProfile 30,31 brukes i den nåværende studien og anbefales generelt, da den er optimalisert for pålitelig toppområdeutvinning av kjente histonepeptider. Imidlertid er annen fritt tilgjengelig programvare for ekstrahert ionkromatografi som Skyline32,33 egnet. - Beregn den relative overfloden av et gitt (un)modifisert peptid som arealet av et enkelt peptid delt på det totale arealet av peptidet i alle sine modifiserte former. Programvare som EpiProfile30,31 inneholder allerede biblioteker med peptider for signalutvinning. Ellers, generer et bibliotek av peptider av interesse enten manuelt eller via peptididentifikasjon ved hjelp av rutinemessige proteomiske rørledninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokollen ble HepG2/C3A-sfæroider behandlet med 20 mM NaBut og 10 mM NaSuc, som begge påvirket globale nivåer av histone PTMer (figur 3A). Histone PTM-er ble deretter identifisert og kvantifisert på enkeltrester via MS/MS-oppkjøp (figur 3B).
Når prøver kjøres i repliker, kan statistisk analyse utføres for å vurdere foldeendringsberikelsen av en PTM mellom prøver, samt reproduserbarheten av observasjonen. Dataene som vises viser at peptider modifisert med acetylering er beriket i sfæroider behandlet med NaBut vs. kontroll (figur 3C), mens prøver behandlet med NaSuc har en høyere relativ overflod av histone peptider modifisert med lysin succinylering (figur 3D). Disse beregningene ble gjort i et regnearkprogram som beskrevet i en egen publikasjon34. En samlet økning av en gitt histone modifikasjon kan bedre representeres i radarplott, hvor det å observere en høyere global overflod av en viss modifikasjon blir mer intuitivt, selv om du opprettholder detaljert informasjon om modifikasjonsstedene analysert (Figur 3E, F).
Denne protokollen genererer et peptid fra histone H3 aminosyrerester 9-17, som inkluderer de ofte modifiserte rester K9, S10 og K14. Dataene som vises indikerer at behandling med NaBut øker nivåene av H3K14ac, men bare på histoner som er komodifisert med H3K9me2 og ikke H3K9me3 (figur 4A). Sameksistensfrekvensen mellom to modifikasjoner kan representeres mer intuitivt som en ringgraf, der nodene representerer individuelle endringer, mens tykkelsen på koblingslinjene representerer sameksistensfrekvensen mellom de to PTMene (figur 4B). Noen ganger påvirkes ikke sameksistensfrekvensen, men data som representeres som stolpeplott, kan være villedende. For eksempel indikerer dataene som er representert i figur 4A at kombinasjonen H3K9me2K14ac er mer rikelig i NaBut-behandling enn i kontroll. Dette er riktig, men denne gitte kombinasjonen er den hyppigste uavhengig av behandlingen. Figur 4B viser tydelig at H3K9me2K14ac og H3K9me3K14ac er de hyppigste kombinatoriske mønstrene uavhengig av behandling (linjetykkelse), men at globale nivåer av H3K14ac (node) er det som virkelig endres i eksperimentet.
Denne protokollen genererer et peptid fra histone H4-rester 4-17, som inkluderer modifiserbare rester i stillingene K5, K8, K12 og K16 (for det meste ved acetylering). Ved sammenligning av kontroll og NaBut-behandling er det mulig å observere en økning i kombinasjoner av acetyleringer ved å representere data som for eksempel ordskyer (figur 4C). Denne representasjonen fremhever tydelig at den umodifiserte versjonen av histone H4 er mest rikelig i kontrollprøven, mens sfæroider behandlet med NaBut er beriket i dobbelt, triply og quadruply acetylated histone H4 proteoformer. Ordskyer er imidlertid begrenset til å vise nøyaktige verdier. Den relative overfloden av en histonekode bør devoluteres av størrelsen på teksten, som kan estimeres unøyaktig. Derfor kan Venn-diagrammer eller mer moderne ekvivalenter som UpSetR-representasjon35 brukes til å vise den nøyaktige kvantifiseringen av samtidige histone PTMer (figur 4D, E). Dataene som vises fremhever nok en gang at utvalgte kombinasjoner av acetyleringer på histone H4 er relativt rikeligere i NaBut-behandling sammenlignet med kontroll.
Figur 1: Arbeidsflyt for histone peptidanalyse av 3D-sfæroider. HepG2/C3A-celler dyrkes først i 2D-kultur til de når 80% samløp. Cellene overføres deretter til en likevektet bioreaktor og plasseres i clinostat-inkubatoren der de vil rotere ved 10-11 rpm for å danne sfæroider. Etter 18 dager behandles sfæroidene med enten 20 mM NaBut eller 10 mM NaSuc og høstes etter deres tilsvarende tidspunkter. Nuklei er isolert fra cellene og histone ekstraksjon utføres med 0,2 M H2SO4. Histonavledning utføres deretter med propionisk anhydrid før og etter trypsin fordøyelse for å sikre oppbevaring av de resulterende korte peptidene ved flytende kromatografi. Eksempler avsaltes og kjøres deretter ved hjelp av LC-MS/MS-metoden som er nevnt i trinn 10, og de resulterende dataene analyseres som beskrevet i trinn 11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oppsett for propionylerings- og avsaltingstrinn. (A) Propionylering utføres i en avtrekkshette og alle komponenter er lagt ut slik at trinnene kan utføres i rask rekkefølge. (B) Skjematisk i første runde av propionylering, trypsin fordøyelse og andre runde av propionylering på histone H3.1 hale. (C) Avsalting utføres på benken ved hjelp av en 96-brønns vakuummanifold og en 96-brønns polypropylenfilterplate. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representasjon av individuelle histone modifikasjoner. (A) Bar graf som viser den relative overflod av vanlige globale histone modifikasjoner i kontroll og behandlet (20 mM NaBut eller 10 mM NaSuc) HepG2 / C3A sfæroider. (B) Bar graf som viser overflod av single histone PTMs forekommer på rester 9-17 av histone H3 peptid (KSTGGKAPR) i kontroll og behandlet (20 mM NaBut eller 10 mM NaSuc) HepG2 / C3A sfæroider. (C,D) Vulkanplott som viser foldeendringen og betydningen av differensialuttrykket til histonepeptid PTMer etter behandling med 20 mM NaBut (C) eller 10 mM NaSuc (D). Uthevede blå og grønne punkter representerer henholdsvis acetylerte og succinylaterte rester. (E,F) Radarplott som viser overflod av single histone peptid acetylering (E) eller succinylering (F) etter behandling med henholdsvis 20 mM NaBut eller 10 mM NaSuc sammenlignet med kontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representasjon av eksisterende histone modifikasjoner. (A) Bar graf som viser overflod av kombinatoriske histone PTMer som forekommer på rester 9-17 av histone H3 (KSTGGKAPR) i kontroll og behandlet (20 mM NaBut eller 10 mM NaSuc) HepG2 / C3A sfæroider. (B) Ringgrafer som viser forholdet mellom kombinatoriske histone PTMer på rester 9-17 av histone H3 (KSTGGKAPR) i kontroll og behandlet (20 mM NaBut) HepG2/C3A sfæroider. Intensiteten av nodefargen tilsvarer overflod av en enkelt PTM i behandlingsgruppen, mens linjetykkelsen tilsvarer frekvensen av PTM-koforekomst. (C) Word-skyer som viser frekvensen av kombinatoriske histone PTMer på histone H4 rester i kontroll og behandlet (20 mM NaBut) HepG2 / C3A sfæroider. Størrelsen på teksten tilsvarer overflod av den angitte kombinatoriske PTM. (D,E) Venn diagram som representerer frekvensen av samtidige modifikasjoner på histone H4 peptidrester 4-17 i kontroll og 20 mM NaBut behandlede prøver. Data vises ved hjelp av ShinyApp UpSetR35. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende tabell 1: Liste over peptider oppdaget ved hjelp av denne protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analysen av histone PTMer er fundamentalt forskjellig fra den typiske proteomiske analyserørledningen. De fleste histone PTMs har fortsatt gåtefulle biologiske funksjoner; Som et resultat er merknader som Gene Ontology eller pathway-databaser ikke tilgjengelige. Det finnes flere ressurser som forbinder histone modifikasjoner med enzymet som er ansvarlig for deres katalyse eller proteiner som inneholder domener som binder disse PTM-ene (f.eks. HISTome36). I tillegg er det mulig å spekulere på den generelle tilstanden til kromatin når globale nivåer av histone PTMer er regulert. For eksempel er en generell økning av histonacetylering eller andre atylerasjoner som kortfattethet normalt forbundet med kromatindekondensasjon37,38.
MS-analyse gir mer detaljert informasjon om disse modifikasjonene, for eksempel deres eksakte lokalisering på aminosyresekvensen. I denne protokollen brukes MS/MS-anskaffelse til å identifisere og kvantifisere histone PTMer, som kan være avgjørende for biologisk tolkning. For eksempel er trimetylering på lysin 4 av histone H3 (H3K4me3) beriket på promotorer av aktivt transkriberte gener39, mens den samme modifikasjonen på lysin 9 (H3K9me3) benchmarks utgjør heterochromatin40. Histone modifikasjoner brukes for tiden som biomarkører i spesifikke sykdommer; Som sådan kan histoneanalyse brukes til å studere sykdomspatologi i tillegg til responsen på behandlingen (f.eks. med epigenetiske legemidler)41,42.
Det er mer utfordrende å visuelt representere interaksjoner mellom flere PTMer i motsetning til enkle PTMer. Selv om eksisterende diagrammer, for eksempel ringdiagrammer, kan vise sameksistensfrekvensen for to PTMer, kan de ikke representere sameksistensfrekvensen mellom mer enn to PTMer om gangen, siden dette vil kreve en tredimensjonal representasjon av nettverket. Derfor kan andre representasjoner være mer hensiktsmessige for å fremheve endringer i histonekoder når tre eller flere PTMer vurderes. Generelt gir diversifisering av datarepresentasjon større sjanser til å observere betydelige endringer mellom prøver. Denne protokollen presenterer eksempler på forskjellige illustrasjoner for å vise forskrifter for histone PTMer og ko-eksisterende PTMer.
Selv om denne protokollen genererer relativt små histone peptider på grunn av trypsin fordøyelse (ca. 4-20 aminosyrer), inneholder utvalgte peptider flere modifiserbare rester. Analysen av disse peptidene muliggjør kvantifisering av sameksistensfrekvenser av PTMer, noe som kan avsløre viktig informasjon om hvilke kombinatoriske histonemerker som er regulert i et gitt datasett. Spesielt er det ingen trinn under prøveforberedelse der kvantifisering av histoner utføres. Det er fire grunner til dette: (1) trypsin har et bredt spekter av aktiviteter og kan brukes ved et bredt spekter av enzym til prøveforhold (1:10-1:200). Selv når det eksperimentelle utbyttet av ekstraherte histoner er forskjellig fra den forventede, har det ikke oppstått problemer med fordøyelsen ved hjelp av denne protokollen. (2) Denne protokollen er beregnet for små mengder materiale, hvor histone kvantifisering kan være vanskelig å utføre på grunn av mangel på følsomhet. (3) Ved å bruke en konstant trypsinkonsentrasjon uavhengig av mengden histonmateriale, kan vi bruke tryptiske peptider (som trypsin autolyzes) for å benchmark kromatografi ytelse. Små variasjoner i prøveutbyttet vil bli normalisert av dataanalyseprogramvare (trinn 11), som bruker alle (un)modifiserte signaler for et gitt peptid som nevner under normaliseringsprosessen. (4) Endelig kan dramatisk underestimering av mengden startmateriale skape problemer med å overbelaste nanoLC-kromatografisk kolonne. Hvis du utfører avsaltingstrinnet som angitt i denne protokollen, forhindrer du imidlertid at dette problemet finner sted. Ved for store mengder startmateriale (f.eks. >100 μg) vil grensen for kapasiteten til avsaltingsharpiksen overskrides, og eventuell overflødig prøve vil bli vasket bort under lastetrinnet.
Det er viktig å merke seg at ikke alle peptidene som er oppdaget av denne analysen, er fremhevet i figur 3 og figur 4. I tillegg kan ikke alle histone modifikasjoner påvises ved hjelp av disse spesifikke prøveforberedelses- og anskaffelsesmetodene. Supplerende tabell 1 er gitt for å liste opp alle peptidsignalene som ekstraheres ved hjelp av den beskrevne rørledningen. Noen få kjente modifikasjoner er ikke oppført i tabellen, da det beskrevne prøvepreparatet ikke er egnet for deteksjon. Bemerkelsesverdige eksempler er allestedsnærværende peptider fra histone H2A og H2B, og fosforylering av histone H2A. X (en generell markør for DNA-skade). Dette er fordi propionylering av peptider forbundet med disse PTM-ene fører til for lange peptider, som ikke er egnet for C18-kromatografi og den beskrevne MS-deteksjonsmetoden. Andre modifikasjoner som finnes i litteraturen, men som ikke finnes i supplerende tabell 1 , er svært lave overflodsmodifikasjoner (som for tiden bare kan påvises ved hjelp av MS etter berikelsesstrategier som immunrecipitation eller spesifikk cellebehandling), for eksempel laktylering43 eller serotonylering44. Histone modifikasjoner med uforutsigbare masseskift forårsaket av polymerisasjon eller heterogen kovalent binding til histone sekvensen er heller ikke vurdert (f.eks. poly-ADP-ribosylering45 og glykasjon46). I tillegg bruker denne protokollen NaSuc og NaBut til å behandle HepG2/C3A-sfæroider, men den kan endres for bruk med andre legemidler/epigenetiske modifikatorer og 2D/3D-cellekulturtyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Sidoli-laboratoriet anerkjenner takknemlig Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics award), Deerfield (Xseed Award), Relay Therapeutics, Merck og NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA solution | Gibco | 25300054 | |
| 0.5-20 µL pipet tips | BRAND | 13-889-172 (Fisher Scientific) | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Bio-Rad | 2239480 | |
| 10 µL multi-channel pipette | BRAND | BR7059000 (Millipore Sigma) | |
| 10 mL syringe | Henke Sass Wolf | 14-817-31 (Fisher Scientific) | Luer lock tip, graduated to 12 mL |
| 10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettes | Eppendorf | 14-285-904 (Fisher Scientific) | |
| 1000 µL pipet tips | Rainin | 30389164 | |
| 18 G syringe needle | Air-Tite | 14-817-100 (Fisher Scientific) | 3" length, 0.05" diameter |
| 200 µL multi-channel pipette | Corning | 4082 | |
| 2-200 µL pipet tips | BRAND | Z740118 (Millipore Sigma) | |
| 24-well ultra-low attachment microplate | Corning | 07-200-602 | |
| 75 cm2 U-shaped cell culture flask | Corning | 461464U | Untreated, with vent cap |
| 96-well skirted plate | Axygen | PCR-96-FS-C (Corning) | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | Acetone should be used cold |
| Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | A6141-25G | |
| Ammonium hydroxide solution | Fisher Scientific | AC423300250 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| ClinoReactor | CelVivo | 10004-12 | Bioreactor for 3D cell culture |
| ClinoStar | CelVivo | N/A | Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture |
| Control unit | CelVivo | N/A | Tablet for ClinoStar settings |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 17-205-CV | 1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Formic acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Fume hood | Mott | N/A | Model 7121000 |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | 9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile |
| Glutagro supplement | Corning | 25-015-CI | 200 mM L-ananyl-L-glutamine |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1X solution without calcium, magnesium, and phenol red |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6-1 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A481-212 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| MEM non-essential amino acids | Corning | 25-025-CI | 100X solution |
| Oasis HLB resin | Waters | 186007549 | Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | High resolution mass spectrometer |
| Oro-Flex I polypropylene filter plate | Orochem | OF1100 | 96-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | 100X solution |
| pH paper | Hydrion | Z111848 (Sigma-Aldrich) | 0-13 pH test paper |
| Pipette gun | Eppendorf | Z666467 (Millipore Sigma) | |
| Polymicro capillary | Molex | 50-110-7740 (Fisher Scientific) | Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD |
| Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile | Fisher Scientific | 1367549 | |
| Propionic anhydride | Sigma-Aldrich | 240311-50G | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific | 75-217-420 | |
| Reprosil-Pur resin | MSWIL | R13.AQ.0003 | 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size |
| Rotator | Clay Adams | 25477 (American Laboratory Trading) | Nutator Mixer 1105 |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium butyrate | Thermo Scientific | A11079 | |
| Sodium succinate dibasic | Sigma-Aldrich | 14160-100G | |
| SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes) | Savant | 20249 (American Laboratory Trading) | |
| SpeedVac vacuum concentrator (96-well) | Thermo Scientific | 15308325 | Savant SPD1010 |
| Sterile hood | Thermo Scientific | 1375 | Class II, Type A2 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | 02-004-375 | Baker Analyzed ACS reagent |
| Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish | Fisher Scientific | 08-772-23 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Thermo Scientific | AC421451000 | Resuspend 100% w/v in HPLC grade water |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Fisher Scientific | PI28904 | Sequencing grade |
| Vacuum manifold 96-well | Millipore | MAVM0960R | |
| Vortex | Sigma-Aldrich | Z258415 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
| Wide bore pipet tips 1000 µL | Axygen | 14-222-703 (Fisher Scientific) | |
| Wide bore pipet tips 200 µL | Axygen | 14-222-730 (Fisher Scientific) |
References
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology (Bethesda). 32 (4), 266-277 (2017).
- Wrzesinski, K., et al. The cultural divide: exponential growth in classical 2D and metabolic equilibrium in 3D environments. PLoS One. 9 (9), 106973 (2014).
- Wrzesinski, K., Fey, S. J. Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors. Bioengineering (Basel). 5 (1), 22 (2018).
- Gonda, S. R., et al. Three-dimensional transgenic cell model to quantify genotoxic effects of space environment. Advances in Space Research. 27 (2), 421-430 (2001).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Tvardovskiy, A., et al. Top-down and middle-down protein analysis reveals that intact and clipped human histones differ in post-translational modification patterns. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (12), 3142-3153 (2015).
- Azad, G. K., et al. Modifying chromatin by histone tail clipping. Journal of Molecular Biology. 430 (18), 3051-3067 (2018).
- Kragesteen, B. K., Amit, I. Heads or tails: histone tail clipping regulates macrophage activity. Nature Immunology. 22 (6), 678-680 (2021).
- Dhaenens, M. Histone clipping: the punctuation in the histone code. EMBO Reports. 22 (8), 53440 (2021).
- Anderson, L. C., et al. Analyses of histone proteoforms using front-end electron transfer dissociation-enabled orbitrap instruments. Molecular and Cellular Proteomics. 15 (3), 975-988 (2016).
- Morgan, M. A. J., Shilatifard, A. Reevaluating the roles of histone-modifying enzymes and their associated chromatin modifications in transcriptional regulation. Nature Genetics. 52 (12), 1271-1281 (2020).
- Chan, J. C., Maze, I. Nothing is yet set in (hi)stone: novel post-translational modifications regulating chromatin function. Trends in Biochemical Sciences. 45 (10), 829-844 (2020).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
- Fischle, W., et al. Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains. Genes and Development. 17 (15), 1870-1881 (2003).
- Onder, O., et al. Progress in epigenetic histone modification analysis by mass spectrometry for clinical investigations. Expert Review of Proteomics. 12 (5), 499-517 (2015).
- Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. Journal of Proteomics. 75 (12), 3419-3433 (2012).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural and Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
- Moradian, A., et al. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
- Zheng, Y., Huang, X., Kelleher, N. L. Epiproteomics: quantitative analysis of histone marks and codes by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 142-150 (2016).
- Sidoli, S., Garcia, B. A. Middle-down proteomics: a still unexploited resource for chromatin biology. Expert Review of Proteomics. 14 (7), 617-626 (2017).
- Stampar, M., et al. Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals. Science of the Total Environment. 755, 143255 (2021).
- Calitz, C., et al. Toxicity and anti-prolific properties of Xysmalobium undulatum water extract during short-term exposure to two-dimensional and three-dimensional spheroid cell cultures. Toxicology Mechanisms and Methods. 28 (9), 641-652 (2018).
- Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
- Sidoli, S., et al. Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra (SWATH) analysis for characterization and quantification of histone post-translational modifications. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (9), 2420-2428 (2015).
- Sidoli, S., et al. Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications. Analytical Chemistry. 87 (22), 11448-11454 (2015).
- Karch, K. R., Sidoli, S., Garcia, B. A. Identification and quantification of histone PTMs using high-resolution mass spectrometry. Methods in Enzymology. 574, 3-29 (2016).
- Yuan, Z. F., et al. EpiProfile quantifies histone peptides with modifications by extracting retention time and intensity in high-resolution mass spectra. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (6), 1696-1707 (2015).
- Yuan, Z. F., et al. EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2533-2541 (2018).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Pino, L. K., et al. The Skyline ecosystem: Informatics for quantitative mass spectrometry proteomics. Mass Spectrometry Reviews. 39 (3), 229-244 (2020).
- Aguilan, J. T., Kulej, K., Sidoli, S. Guide for protein fold change and p-value calculation for non-experts in proteomics. Molecular Omics. 16 (6), 573-582 (2020).
- Lex, A., et al. UpSet: Visualization of intersecting sets. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 20 (12), 1983-1992 (2014).
- Shah, S. G., et al. HISTome2: a database of histone proteins, modifiers for multiple organisms and epidrugs. Epigenetics and Chromatin. 13 (1), 31 (2020).
- Xie, Z., et al. Lysine succinylation and lysine malonylation in histones. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (5), 100-107 (2012).
- Liu, J., et al. Histone succinylation and its function on the nucleosome. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (15), 7101-7109 (2021).
- Howe, F. S., et al. Is H3K4me3 instructive for transcription activation. Bioessays. 39 (1), 1-12 (2017).
- Nicetto, D., Zaret, K. S. Role of H3K9me3 heterochromatin in cell identity establishment and maintenance. Current Opinion in Genetics and Development. 55, 1-10 (2019).
- Wojcik, J. B., et al. Histone H3K27 dimethyl loss is highly specific for malignant peripheral nerve sheath tumor and distinguishes true PRC2 loss from isolated H3K27 trimethyl loss. Modern Pathology. 32 (10), 1434-1446 (2019).
- Sellers, W. R., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
- Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
- Farrelly, L. A., et al. Histone serotonylation is a permissive modification that enhances TFIID binding to H3K4me3. Nature. 567 (7749), 535-539 (2019).
- Chen, Q., et al. ADP-ribosylation of histone variant H2AX promotes base excision repair. The EMBO Journal. 40 (2), 104542 (2021).
- Zheng, Q., et al. Reversible histone glycation is associated with disease-related changes in chromatin architecture. Nature Communications. 10 (1), 1289 (2019).
