Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Karaciğer Dokusunun 3D Hücre Kültürü Modelinde Histone Post-Translasyonel Modifikasyonlarının Küresel Düzeyde Nicelleştirilmesi

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63606
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry, Albert Einstein College of Medicine

Summary

Bu protokol, üç boyutlu bir hücre kültürü sisteminin, kromatin modifikasyonlarını fizyolojik bir durumda modellemek, tedavi etmek ve analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini özetlemektedir.

Abstract

Memeli hücrelerinin düz kültürleri, hücre fizyolojisini anlamak için yaygın olarak kullanılan in vitro bir yaklaşımdır, ancak bu sistem doğal olmayan hızlı hücre replikasyonu nedeniyle katı dokuların modellenmesinde sınırlıdır. Bu, olgun kromatini modellerken özellikle zordur, çünkü hızlı çoğalan hücreler sıklıkla DNA replikasyonuna katılır ve heterojen bir poliploid popülasyona sahiptir. Aşağıda, üç boyutlu (3B) bir hücre kültürü sistemi kullanarak sessiz kromatin modifikasyonlarının modellenmesi, işlenmesi ve analiz edilmesi için bir iş akışı sunulmaktadır. Bu protokolü kullanarak, hepatosellüler karsinom hücre hatları, aktif besin difüzyonu ve düşük kesme kuvvetleri sağlayan bir inkübatörde tekrarlanabilir 3D sferoidler olarak yetiştirilir. Sodyum bütirat ve sodyum süksinat ile tedavi, sırasıyla histon asetilasyon ve süksinilasyonda bir artışa neden oldu. Histon asetilasyon ve süksinilasyon seviyelerindeki artışlar daha açık kromatin durumu ile ilişkilidir. Sferoidler daha sonra hücre çekirdeklerinin izolasyonu için toplanır ve histon proteinleri translasyonel modifikasyonlarının analizi için ekstrakte edilir. Histon analizi, tandem kütle spektrometrisi ile çevrimiçi olarak birleştirilmiş sıvı kromatografisi ve ardından şirket içi hesaplamalı bir boru hattı ile gerçekleştirilir. Son olarak, kombinatoryal histon işaretlerinin sıklığını ve oluşumunu araştırmak için veri gösterimi örnekleri gösterilmiştir.

Introduction

19. yüzyılın sonlarından bu yana, hücre kültürü sistemleri, insan vücudunun dışındaki hücrelerin büyümesini ve gelişmesini incelemek için bir model olarak kullanılmıştır 1,2. Kullanımları, dokuların ve organların hem sağlıklı hem de hastalıklı bağlamlarda nasıl çalıştığını incelemek için genişletilmiştir 1,3. Süspansiyon hücreleri (örneğin, kan hücreleri) Petri kaplarında veya şişelerinde sorunsuz ve birbirinin yerine büyür, çünkü in vivo üç boyutlu (3B) yapılarda bir araya gelmezler. Katı organlardan türetilen hücreler iki boyutlu (2B) veya 3B kültür sistemlerinde büyüyebilir. 2D kültürde, hücreler düz bir yüzeye yapışan tek katmanlı bir tabakada yetiştirilir 2,4. 2D hücre kültürü sistemleri, üstel büyüme ve hızlı bir iki katına çıkma süresi, tipik olarak 24 saat ila birkaç gün5 ile karakterize edilir. 3B sistemlerdeki hücreler, doku benzeri konglomeraları daha yakından modelleyen karmaşık hücre-hücre etkileşimleri oluşturmak için büyürler ve iki katına çıkma sürelerinin 1 aya veya daha uzun bir süreye ulaşabileceği dinamik bir dengeye ulaşma yetenekleri ile karakterize edilirler5.

Bu yazıda, azaltılmış yerçekimini simüle eden dönen hücre kültürü sistemlerinde 3D sferoidleri büyütmek için yenilikçi bir metodolojisunulmaktadır 6. Bu, NASA tarafından 1990'lardatanıtılan bir hücre kültürü sisteminin basitleştirilmiş bir türevidir 7. Bu yaklaşım, eğirme şişeleri gibi mevcut yöntemlerde ortaya çıkan kesme kuvvetlerini en aza indirir ve küresel tekrarlanabilirliğiarttırır 6. Ek olarak, dönen biyoreaktör aktif besin difüzyonunu artırarak medya değişiminin pratik olmadığı asılı damla hücre kültürü gibi sistemlerde meydana gelen nekrotik oluşumu en aza indirir6. Bu şekilde, hücreler çoğunlukla bozulmadan büyür ve dokuda büyüyen hücrelerle ilişkili yapısal ve fizyolojik özelliklerin oluşmasına izin verir. Bu şekilde kültürlenen C3A hepatositleri (HepG2 / C3A) sadece ultrastrüktürel organellere sahip olmakla kalmadı, aynı zamanda in vivo1,2 olarak gözlemlenen seviyelerle karşılaştırılabilir miktarda ATP, adenilat kinaz, üre ve kolesterol üretti. Ek olarak, 2D ve .3D hücre kültürü sistemlerinde yetiştirilen hücreler farklı gen ekspresyon kalıpları sergiler8. 3D sferoidler olarak yetiştirilen C3A hepatositlerinin gen ekspresyon analizi, bu hücrelerin çok çeşitli karaciğere özgü proteinleri ve karaciğer fonksiyonunu düzenleyen anahtar yollarda yer alan genleri ifade ettiğini göstermiştir8. Önceki yayınlar, 2D kültürde üstel olarak büyüyen hücrelerin proteomları ile 3D sferoid kültürlerde dinamik dengedeki hücreler arasındaki farkları göstermiştir5. Bu farklılıklar, hücre5'in yapısını, işlevini ve fizyolojisini etkileyen hücresel metabolizmayı içerir. 2D kültürde yetiştirilen hücrelerin proteomu hücre replikasyonunda yer alan proteinlerde daha zenginleştirilirken, 3D sferoidlerin proteomu karaciğer işlevselliğinde daha zenginleştirilmiştir5.

3D sferoidler olarak yetiştirilen hücrelerin daha yavaş replikasyon hızı, kromatin durumu ve modifikasyonları (örneğin histon kırpma9) ile ilişkili spesifik fenomenleri daha doğru bir şekilde modeller. Histon kırpma, histon N-terminal kuyruğunun bir kısmının proteolitik bölünmesine neden olan geri dönüşümsüz bir histon post-translasyonel modifikasyondur (PTM). Biyolojik işlevi hala tartışılırken10,11,12,13, birincil hücrelerdeki ve karaciğer dokusundaki varlığının, sferoidler olarak yetiştirilen HepG2 / C3A hücreleri tarafından modellendiği, ancak düz hücreler olarak modellenmediği açıktır9. Bu kritiktir, çünkü kromatin durumu ve modifikasyonları çoğunlukla genlere erişilebilirliği ve dolayısıyla ekspresyonlarını modüle ederek DNA okumasını düzenler14. Histon PTM'leri ya histonların monte edildiği nükleozomların net yükünü etkileyerek ya da dolaylı olarak kromatin yazarlarını, okuyucularını ve silgilerini işe alarak kromatin durumunu doğrudan etkiler14. Bugüne kadar yüzlerce histon PTM15 tanımlanmıştır ve kromatinin hücre tarafından DNA16'yı yorumlamak için kullanılan bir "histon kodu" barındırdığı hipotezini güçlendirmiştir. Bununla birlikte, sayısız PTM kombinasyonunun tanımlanması15 ve histon PTM'lerin kombinasyonlarının sıklıkla izolasyonda bulunan PTM'lerden farklı biyolojik işlevlere sahip olduğunun keşfi (örneğin Fischle, et al.17), "histon kodunun" şifresini çözmek için daha fazla çalışmanın gerekli olduğunu vurgulamaktadır.

Şu anda, histon PTM analizi, antikorları (örneğin, batı lekeleri, immünofloresan veya kromatin immünopresipitasyonunu takiben dizileme [ChIP-seq]) veya kütle spektrometrisi (MS) kullanan tekniklere dayanmaktadır. Antikor bazlı teknikler yüksek duyarlılığa sahiptir ve histon izlerinin genom çapında lokalizasyonu hakkında ayrıntılı bilgi sağlayabilir, ancak kombinasyonlarda bulunan nadir PTM'lerin veya PTM'lerin incelenmesinde sıklıkla sınırlıdır18,19,20. MS, tek ve birlikte var olan protein modifikasyonlarının, özellikle histon proteinlerinin 18,19,20 yüksek verimli ve tarafsız tanımlanması ve nicelleştirilmesi için daha uygundur. Bu nedenlerden dolayı, bu ve diğer birkaç laboratuvar, MS boru hattını histon peptitlerinin (aşağıdan yukarıya MS), bozulmamış histon kuyruklarının (orta-aşağı MS) ve tam uzunlukta histon proteinlerinin (yukarıdan aşağıya MS) analizi için optimize etmiştir 21,22,23.

Aşağıda, HepG2 / C3A sferoidlerini büyütmek ve bunları nano-sıvı kromatografisi yoluyla histon peptid analizine (aşağıdan yukarıya MS) hazırlamak için bir iş akışı, çevrimiçi olarak tandem kütle spektrometresi (NLC-MS / MS) ile birleştirilmiştir. Bir 2D hücre kültürü yetiştirildi ve hücreler toplandı ve sferoidler oluşturmaya başlayacakları bir biyoreaktöre aktarıldı (Şekil 1). Kültürde 18 gün sonra, sferoidler, histon asetilasyon ve süksinilasyonun göreceli bolluğunu arttırmak için sodyum bütirat veya sodyum süksinat ile muamele edildi. Özellikle, 3D kültürler, düz kültür eşdeğerlerinin yanı sıra genotoksik bileşiklerle de tedavi edilebilir; Aslında, son yayınlar, 3D kültürdeki hücrelerin toksikoloji yanıtının, birincil dokulara 2D düz kültür24,25'tekilerden daha benzer olduğunu vurgulamaktadır. Hücreler daha sonra belirtilen zaman noktalarında toplandı ve nükleer izolasyon yapıldı. Daha sonra, ilk olarak Garcia ve ark.26 tarafından geliştirilen bir protokole göre, tripsin sindiriminden önce ve sonra propiyonik anhidrit ile histonlar çıkarıldı ve türetildi. Bu prosedür, ters faz kromatografisi (C18) ile çevrimiçi ayırma ve MS ile tespit için uygun boyutta peptitler üretir. Son olarak, histon peptitleri tanımlandı ve ölçüldü ve üretilen veriler daha eksiksiz bir biyolojik yorumlama için çeşitli şekillerde temsil edildi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması

  1. Hücre büyüme ortamı (HepG2 / C3A hücreleri için): Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamına (DMEM, 4.5 g / L glikoz içeren DMEM) fetal sığır serumu (FBS) (% 10 v / v), L-glutamin takviyesi (% 1 v / v) ve penisilin / streptomisin (% 0.5 v / v) ekleyin. Büyüme ortamı maksimum 2 hafta boyunca 4 ° C'de saklanır.
  2. 200 mM sodyum bütirat (NaBut) çözeltisi: 10 mL hazırlamak için, 10 mL ddH 2 O'da 220.18 mg NaBut'u yeniden askıya alın-20° C'de 1 mL alikot saklayın. Hücre işleminden önce, çözeltiyi 0,45 mm'lik bir şırınga filtresi kullanarak filtreleyin ve 20 mM'lik bir çalışma konsantrasyonu için filtrelenmiş çözeltinin 1 mL'sini 9 mL hücre büyüme ortamına ekleyin.
  3. 100 mM sodyum süksinat (NaSuc) çözeltisi: 10 mL hazırlamak için, 10 mL ddH 2 O. -20°C'de 1 mL aliquots saklayın. Hücre işleminden önce, çözeltiyi 0,45 mm'lik bir şırınga filtresi kullanarak filtreleyin ve 10 mM'lik bir çalışma konsantrasyonu için filtrelenmiş çözeltinin 1 mL'sini 9 mL hücre büyüme ortamına ekleyin.
  4. Soğuk 0,2 M H2S04: 1 L hazırlamak için, 990 mL HPLC sınıfı suya 10 mL konsantreH2S04 ekleyin. 4 °C'de saklayın.
  5. Soğuk aseton +% 0.1 hidroklorik asit (HCl): Asetona konsantre HCl (% 0.1 v / v) ekleyin. 4 °C'de saklayın.
  6. 100 mM NH 4 HCO3 çözeltisi, pH 8.0: 1 L hazırlamak için, 1 L HPLC sınıfı suda 7.91 g NH4HCO3'ü yeniden askıya alın. 50 mL aliquots -20 °C'de saklayın.
  7. % 0.1 Trifloroasetik asit (TFA) çözeltisi: HPLC sınıfı suya konsantre TFA (% 0.1 v / v) ekleyin. 4 °C'de saklayın.
  8. % 60 asetonitril ve% 0.1 TFA çözeltisi: HPLC sınıfı suya HPLC sınıfı asetonitril (% 60 v / v) ekleyin. Ardından, bu çözeltiye konsantre TFA (% 0,1 v / v) ekleyin. 4 °C'de saklayın.
  9. % 2 HPLC sınıfı asetonitril +% 0.1 formik asit: HPLC sınıfı suya HPLC sınıfı asetonitril (% 2 v / v) ekleyin. Daha sonra, bu çözeltiye konsantre formik asit (% 0.1 v / v) ekleyin.
  10. %80 HPLC sınıfı asetonitril + %0,1 formik asit: HPLC sınıfı suya HPLC sınıfı asetonitril (%80 v/v) ekleyin. Daha sonra, bu çözeltiye konsantre formik asit (% 0.1 v / v) ekleyin.

2. 3D kültür sisteminin hazırlanması

NOT: Birincil veya ölümsüzleştirilmiş farklı hücreler farklı kültür özelliklerine sahiptir, bu nedenle sferoidlerin oluşumu hücre tipleri arasında farklılık gösterebilir. Bu protokol, biyoreaktörler ve yenilikçi bir 3D hücre kültürü sistemi kullanılarak HepG2 / C3A sferoid oluşumu için kurulmuştur.

  1. Standart büyüme ortamını kullanarak, hücreleri% 80 birleşene kadar tek katmanlı olarak büyütün.
  2. HBSS (75cm2 şişe için 5 mL) ile hücreleri yıkayın ve HBSS'de seyreltilmiş 5 mL% 0.05 tripsin-EDTA içeren hücreleri% 5 CO 2 ile 37 oC'de 5 dakika boyunca inkübe edin (1:2 seyreltme).
  3. Mikroskop altında hücre ayrılmasını kontrol edin ve 3 mL fetal sığır serumu (FBS) veya büyüme ortamı (% 5-10 FBS içeren) ekleyerek tripsini nötralize edin.
  4. Hücre sayısını sayın ve maksimum 1,5 mL hacimde 1 x 106 hücre elde etmek için hücre süspansiyonunu seyreltin.
  5. Ultra düşük ataşmanlı 24 delikli yuvarlak alt plakayı, kuyuları 0,5 mL büyüme ortamı ile yıkayarak dengeleyin. Hava kabarcıklarını kuyunun yüzeyinden çıkarmak için plakayı 3.000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
  6. Hücre süspansiyonunu plakaya aktarın ve 120 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın.
  7. Plakayı 37 oC'de 24 saat boyunca küresel oluşum için% 5 CO2 ile inkübe edin. Bu arada, nem odasını 25 mL steril su ve hücre odasını 9 mL büyüme ortamı ile doldurarak biyoreaktörü dengeleyin.
  8. Klinostat inkübatöründe dönen biyoreaktörü,% 5 CO 2 ile 37 oC'de 24 saat boyuncainkübe edin.

3. Biyoreaktörlerde sferoidlerin büyümesi

NOT: Sferoidlerin yapısını korumak için, 3D yapıların işlenmesinde geniş delik uçları kullanılır.

  1. 1 mL genişliğinde delik uçlarıyla hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek sferoidleri ultra düşük bağlantı plakasından ayırın ve doku kültürü ile işlenmiş bir kaba aktarın.
  2. Tabağı 0,5 mL önceden ısıtılmış büyüme ortamı ile yıkayın ve aynı kaba aktarın.
  3. Sferoidlerin kalitesini mikroskopi ile değerlendirin ve yeterince oluşturulmuş sferoidleri seçin. Kaliteli sferoidler tek tip boyuta, kompaktlığa ve yuvarlaklığa sahiptir.
  4. Sferoidleri, 5 mL taze büyüme ortamı ile doldurulmuş dengeli biyoreaktörlere aktarın. Sferoidleri aktardıktan sonra, biyoreaktörü taze büyüme ortamı ile tamamen doldurun.
  5. Biyoreaktörü klinostat inkübatörüne yerleştirin ve dönme hızını 10-11 rpm'ye ayarlayın.
  6. Her 2-3 günde bir, 10 mL eski medyayı kaldırıp 10 mL taze medya ile değiştirerek büyüme medyasını değiştirin.
  7. Dönme hızını küresel büyümeye göre ayarlayın, sferoidler boyut ve sayı olarak büyüdükçe artar.
  8. Kültürde 18 gün sonra, sferoidler tedavi ve / veya toplama için hazırdır.

4. Küresel tedavi ve toplama

NOT: Bu protokolde, HepG2 / C3A sferoidleri, sırasıyla asetilasyon ve süksinilasyon içeren histon işaretlerinin seviyelerini değerlendirmek için sodyum bütirat (NaBut) ve sodyum süksinat (NaSuc) ile muamele edilir.

  1. Uygun çalışma konsantrasyonuna sahip büyüme ortamını bileşik olarak hazırlayın (örneğin, 20 mM NaBut veya 10 mM NaSuc). Biyoreaktördeki medyayı işlenmiş ortamla değiştirin.
    NOT: Bir kontrol koşulu oluşturmak için, tedaviyi eklemeden önce deneyler için yeterli sayıda sferoid toplayın veya tedavi edilmemiş sferoidler için bir biyoreaktör belirleyin.
  2. Yeterli tedavi süresini takiben proteomik analiz için sferoidleri toplayın (örneğin; NaSuc tedavisi için 48 saat ila 1 hafta veya NaBut tedavisi için 48-72 saat).
    NOT: Bu protokol kullanılarak histon ekstraksiyonu için, yaklaşık 1 x 106 hücre içeren altı ila sekiz sferoid toplandı.
    1. Üst porttan biyoreaktörden 3-5 mL ortam çıkarın.
    2. Ön portu açın ve sferoidleri çıkarmak ve mikro santrifüj tüplerine yerleştirmek için 1 mL genişliğinde bir delik ucu kullanın.
    3. Sferoidleri 5 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj yapın ve ortamı atın.
      NOT: Biyoreaktördeki ortam değiştirilebilir ve biyoreaktör ek tedavi süresi veya iyileşme için inkübatöre iade edilebilir.
    4. FBS'yi çıkarmak için sferoidleri 200 μL HBSS ile yıkayın. 5 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın.
      NOT: Sferoidler işlenene kadar -80 oC'de saklanabilir.

5. Histon ekstraksiyonu

NOT: Histüllerde bulunan birçok bazik amino asit kalıntısı, fosforik asit omurgasına sahip DNA ile yakından etkileşime girmelerini sağlar. Histonlar çekirdekteki en temel proteinlerden bazıları olduğundan, buz gibi sülfürik asit (0.2 MH2S04) ile ekstrakte edildiklerinde minimum kirlenme olur. Histon olmayan proteinler güçlü asit içinde çökelecektir. % 33'lük bir nihai konsantrasyona seyreltilmiş yüksek konsantrasyonlu trikloroasetik asit (TCA), daha sonra sülfürik asitten histonları çökeltmek için kullanılır. Tüm histon ekstraksiyonu için tüm numuneleri, tüpleri ve reaktifleri buz üzerinde tutun.

  1. Hücre peletine (~10-20 μL) beş hacim (~100 μL) soğuk0,2M H 2 SO4 ekleyin ve peleti bozmak ve histonları serbest bırakmak için yukarı ve aşağı pipet ekleyin.
  2. Tüpleri sabit dönüşte 4 saate kadar veya 4 oC'de sallayarak inkübe edin.
    NOT: 500 μL'den daha büyük bir hacme sahip yeniden askıya alınmış numuneler için, histonları çıkarmak için 2 saatlik bir inkübasyon yeterlidir (daha uzun inkübasyon, diğer temel nükleer proteinlerin ekstraksiyonu ile sonuçlanabilir). Hacmi 200 μL'den az olan yeniden askıya alınmış numunelerde, daha iyi bir verim için 4 saatlik bir inkübasyon gereklidir.
  3. 4 °C'de 5 dakika boyunca 3.400 x g'de santrifüj. Süpernatantı yeni bir tüpte toplayın ve peleti daha sonra atın.
  4. Soğuk konsantre TCA'yı son %25-%33 v/v (örneğin, 40-60 μL soğuk TCA: 120 μL süpernatant) oluşturacak şekilde ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın.
  5. Tüpleri sabit dönüşte en az 1 saat veya 4 oC'de çalkalayarak inkübe edin.
    NOT: Daha küçük başlangıç pelet boyutları için, gece boyunca inkübasyon önerilir.
  6. 4 oC'de 5 dakika boyunca 3.400 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice aspire edin; tüpün veya peletin kenarlarına dokunmayın.
    NOT: Histonlar tüpün her iki tarafında ve dibinde birikir. Tüpün en altında oluşan beyaz çözünmez pelet çoğunlukla histon olmayan proteinler ve diğer biyomolekülleri içerir.
  7. Tüpü (duvarlar ve pelet) soğuk aseton + %0,1 HCl ile cam Pasteur pipet (~500 μL/tüp) kullanarak yıkayın.
  8. 4 oC'de 5 dakika boyunca 3.400 x g'de santrifüj yapın Tüpü çevirerek süpernatantı atın.
  9. Tüpü (duvarlar ve pelet) cam bir Pasteur pipet (~500 μL/tüp) kullanarak %100 soğuk asetonla yıkayın. 4 o C'de 5 dakika boyunca 3.400 x g'de santrifüj.
  10. Tüpü çevirerek süpernatantı atın ve kalan asetonu pipetle atın. Kapağı açın ve numuneyi tezgahta ~ 20 dakika boyunca hava ile kurulayın.
  11. Propilasyona devam edin veya numuneleri kullanana kadar -80 oC'de saklayın.

6. Türevlendirmenin ilk turu

NOT: Histon proteinlerini sindirmek için tripsin kullanımı, geleneksel proteomik kurulumlar kullanılarak tanımlanması zor olan aşırı küçük peptitlere yol açar. Bu nedenle, propiyonik anhidrit, modifiye edilmemiş ve monometil lizin kalıntılarının ɛ-amino gruplarını kimyasal olarak türetmek için kullanılır. Bu, tripsin proteolizini C-terminal arginin kalıntıları ile sınırlar. 96 delikli plakalardaki numuneler için, reaktif toplama için çok kanallı pipetlerin ve rezervuarların kullanılması önerilir (Şekil 2A). Derivatizasyon, peptidlerin serbest N-terminini etiketlemek için sindirimden sonra peptid hidrofobikliğini ve dolayısıyla ters faz kromatografik retansiyonunu arttırmak için de gerçekleştirilir.

  1. Numuneleri 100 mM amonyum bikarbonatta (pH 8.0) %15-%20 asetonitril içeren 20 μL içinde yeniden askıya alın. 15 s için vorteks ve sonra 30 s için 1.000 x g'de aşağı doğru döndürün.
  2. Sekiz veya daha fazla numune varsa, her bir yeniden askıya alınmış numuneyi 96 delikli bir plakaya aktarın.
    NOT: Numuneler 96 delikli bir plakaya aktarılmamışsa, 6.3-6.7, 7.1-7.5 ve 8.1-8.5 numaralı adımlarda tek kanallı pipet kullanılabilir.
  3. Kaputun altında, çok kanallı bir pipet kullanarak 2 μL propiyonik anhidrit ekleyin. 5 kat yukarı ve aşağı pipetle çekerek karıştırın.
  4. Çok kanallı pipet kullanarak hızlı bir şekilde 10 μL amonyum hidroksit ekleyin. 5 kat yukarı ve aşağı pipetle çekerek karıştırın.
    NOT: Propiyonik asit, propiyonik anhidrit ile peptitlerden serbest aminler arasındaki reaksiyonun bir ürünüdür ve numune pH'ını azaltabilir. pH 8, numuneye 1:5 (v/v) oranında amonyum hidroksit eklenerek yeniden oluşturulabilir.
  5. pH test kağıdını kullanarak pH'ın 8 olduğundan emin olun. pH 8 <, 1 μL amonyum hidroksit ekleyerek ayarlayın. pH 8 >, 1 μL formik veya asetik asit ekleyerek ayarlayın. pH 10 >, diğer amino asit kalıntılarının daha yüksek pKa ile etiketlenmesi mümkündür.
  6. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
  7. 6.3-6.6 arasındaki adımları yineleyin. Çift tur histon propiyonilasyonu, neredeyse tam reaksiyon verimliliği sağlar.
  8. Tüm kuyucuklar tamamen kuruyana kadar (~ 9 saat) hızlı vakumda kuru plaka.
  9. Tripsin sindirimine devam edin veya numuneleri kullanana kadar -80 oC'de saklayın.

7. Histon sindirimi

NOT: Histonlar, arginin ve lizin kalıntılarının karboksil tarafında kesen tripsin kullanılarak peptitlere sindirilir. Bununla birlikte, propiyonilasyon lizin kalıntılarını değiştirdiğinden, sadece arginin kalıntıları parçalanır (Şekil 2B).

  1. Tripsin çözeltisi hazırlayın (50 mM NH 4 HCO3, pH 8.0'da 25ng / μL). Her numuneye 20 μL tripsin (500 ng) ekleyin.
    1. 50 mM NH 4 HCO 3 çözeltisi hazırlamakiçin, 100 mM NH4HCO3 çözeltisi 1:1 v / v'yi HPLC sınıfı su ile seyreltin.
  2. pH test kağıdını kullanarak pH'ın 8 olduğundan emin olun. pH 8 <, 1 μL amonyum hidroksit ekleyerek ayarlayın. pH 8 >, 1 μL formik veya asetik asit ekleyerek ayarlayın.
  3. Gece boyunca oda sıcaklığında sindirin veya 6-8 saat boyunca 37 oC'de inkübe edin.
  4. Mümkünse, ~ 3 saatlik sindirimden sonra pH'ı kontrol edin, çünkü azalmış olabilir. pH 8 <, 1 μL amonyum hidroksit ekleyerek ayarlayın.
  5. Ek 5 μL 50 ng / μL tripsin çözeltisi (250 ng) ekleyin ve sindirime devam edin.
  6. İkinci propilasyon turuna geçin veya numuneleri kullanana kadar -80 oC'de saklayın.

8. Peptit N-terminin türevleştirilmesi

NOT: Histon peptidlerin N-terminüslerinde propiyonilasyonu, propiyonil grubu peptid hidrofobikliğini arttırdığından, ters fazlı sıvı kromatografisi (örneğin, histon H3'ün 3-8 amino asitleri) ile en kısa peptitlerin tutulmasını arttırır.

  1. Kaputun altında, çok kanallı pipeti kullanarak 2 μL propiyonik anhidrit ekleyin. 5 kat yukarı ve aşağı pipetle çekerek karıştırın.
  2. Çok kanallı pipeti kullanarak hızlı bir şekilde 10 μL amonyum hidroksit ekleyin. 5 kat yukarı ve aşağı pipetle çekerek karıştırın.
    NOT: Propiyonik asit, propiyonik anhidrit ile peptitlerden serbest aminler arasındaki reaksiyonun bir ürünüdür ve numune pH'ını azaltabilir. pH 8, numuneye 1:5 (v/v) oranında amonyum hidroksit eklenerek yeniden oluşturulabilir.
  3. pH test kağıdını kullanarak pH'ın 8 olduğundan emin olun. pH 8 <, 1 μL amonyum hidroksit ekleyerek ayarlayın. pH 8 >, 1 μL formik veya asetik asit ekleyerek ayarlayın. pH 10 >, diğer amino asit kalıntılarının daha yüksek pKa ile etiketlenmesi mümkündür.
  4. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
  5. 8.1-8.4 arasındaki adımları yineleyin. Çift tur histon propiyonilasyonu, neredeyse tam reaksiyon verimliliği sağlar.
  6. Tüm kuyucuklar tamamen kuruyana kadar (~ 9 saat) hızlı vakumda kuru plaka.
  7. Tuzdan arındırma adımına geçin veya numuneleri kullanana kadar -80 oC'de saklayın.

9. Tuzdan arındırma ve numune temizleme

NOT: Numunede bulunan tuzlar kütle spektrometresi analizine müdahale eder. Tuzlar ayrıca elektrosprey sırasında iyonize edilir ve peptitlerden gelen sinyalleri bastırabilir. Tuzlar, peptidler üzerinde iyonik addüktler oluşturabilir, bu da addüklenen peptidin farklı bir kütleye sahip olmasına neden olur. Bu, peptidin sinyal yoğunluğunu azaltır ve uygun tanımlama ve nicelleştirmeyi önler. Tuzdan arındırma kurulumu Şekil 2C'de gösterilmiştir.

  1. HLB reçinesini (% 100 asetonitrilde 50 mg / mL) manyetik bir karıştırma plakası üzerinde karıştırmaya başlayın.
  2. Akışı toplamak için 96 delikli polipropilen filtre plakasının altına yerleştirilmiş 96 delikli bir toplama plakası olduğundan emin olun.
  3. Filtre plakasına kuyucuk başına 70 μL HLB süspansiyon ekleyin. Sıçramayı önlemek için vakumu yavaşça açın. Akış akışını atın.
  4. Reçineyi 100 μL% 0.1 TFA ile yıkayın. Sıçramayı önlemek için vakumu yavaşça açın. Akış akışını atın.
  5. Her numuneyi% 0.1 TFA'nın 100 μL'sinde yeniden askıya alın. pH'ı kontrol edin; ~2-3 olmalıdır.
  6. Her numuneyi her bir kuyucuğa yükleyin. Sıçramayı önlemek için vakumu yavaşça açın. Akış akışını atın.
  7. 100 μL% 0.1 TFA ile yıkayın. Sıçramayı önlemek için vakumu yavaşça açın. Akış akışını atın.
  8. Toplama plakasını 96 delikli yeni bir toplama plakasıyla değiştirin.
  9. Kuyu başına 60 μL %60 asetonitril/%0,1 TFA ekleyin. Sıçramayı önlemek için vakumu yavaşça açın. Akışı toplayın ve hızlı bir vakumda kurutun.
  10. LC-MS/MS'ye geçin veya numuneleri kullanana kadar -80 oC'de saklayın.

10. Kütle spektrometresi ile birleştirilmiş sıvı kromatografisi ile histon peptid analizi

  1. Mobil fazları yüksek performanslı sıvı kromatografisinde (HPLC) çalışacak şekilde hazırlayın. Mobil Faz A (MPA): % 2 HPLC sınıfı asetonitril +% 0.1 formik asit. Mobil Faz B (MPB): %80 HPLC sınıfı asetonitril + %0.1 formik asit.
  2. HPLC yöntemini aşağıdaki gibi programlayın: (1) 30 dakika boyunca% 4 -% 34 MPB; (2) 5 dakika boyunca% 34 -% 90 MPB; ve (3) 5 dakika boyunca izokratik% 90 MPB. Aşağıdaki önerilen sütun özelliklerini kullanın: C18 3 μm ambalaj malzemesi, 75 μm iç çap, 20-25 cm uzunluk. 75 μm iç çapa sahip nano sütunlar için akış hızını 250-300 nL/dk olarak ayarlayın.
    1. HPLC'nin numune yüklemeden önce kolon dengesini otomatikleştirmek üzere programlanmaması durumunda, (4) 1 dakika boyunca %90-%4 MPB ve 10 dakika boyunca (5) izokratik %4 MPB ekleyin.
  3. MS edinme yöntemini programlayın.
    1. Cihazın her görev döngüsünün başında bir tam MS taraması gerçekleştirdiğinden emin olun. Sinyal ekstraksiyonu sırasında kullanılabilecek kütle doğruluğu nedeniyle yüksek çözünürlüklü enstrümantasyon (örneğin, orbitrap veya uçuş zamanı analizörleri) önerilir. Bununla birlikte, düşük çözünürlüklü enstrümantasyon daha önce tarif edildiği gibide kullanılabilir 27,28.
    2. Tam MS taramasını, her biri 300-1100 m/z m/z aralığını kapsayan 50 m/z yalıtım genişliğine sahip 16 MS/MS tarama olayının izlediğinden emin olun. Örneğin, ilk tarama sinyalleri 300-350 m / z'de, ikincisi 350-400 m / z'de vb. İzole etmelidir. Mümkünse, MS / MS taramalarını da yüksek çözünürlükte alın, ancak tam MS taramasına kıyasla daha düşük çözünürlük yeterlidir (bozulmamış iyonlara kıyasla daha küçük parça iyonu kütleleri nedeniyle).
    3. HPLC yöntemi, ~ 3-40 s tepe genişliklerine sahip kromatografik sinyaller üretecektir; Doğru sinyal ölçümünü sağlamak için, kütle spektrometresinin kromatografik tepe başına en az 10 görev döngüsü gerçekleştirdiğinden emin olun (yani, 3 s veya daha hızlı bir görev döngüsü).
    4. Tuzak tarzı bir kütle analizörü (orbitrap, iyon tuzağı) kullanıyorsanız, iyon enjeksiyon süresi sınırının <200 ms olarak ayarlandığından emin olun; diğer analizörler için (kuadrupol, uçuş süresi), daha hızlı tarama süreleri nedeniyle bu bir sorun değildir. Bir ön test gerekebilir.
      NOT: Histon peptid analizi için MS yöntemleri hakkında daha fazla ayrıntı aşağıdaki referanslarda bulunabilir27,28,29.
  4. Numuneyi 10 μL MPA'da yeniden askıya alın, bu da ~ 1 μg / μL sindirilmiş histon örneğine karşılık gelir. Partideki tüm numuneler benzer seyreltmeler ve hacimler kullanılarak yükleniyorsa, kesin yükleme miktarı kritik değildir (ayrıca değerlendirilmesi önemsiz değildir).
  5. HPLC sütununa 1 μL numune yükleyin.
  6. Adım 10.1-10.3'te programlanmış LC-MS/MS yöntemini çalıştırın.

11. Veri analizi

  1. MS ham veri dosyalarını, en yoğun alan entegrasyonunu gerçekleştirmek için tasarlanmış yazılıma aktarın.
    NOT: EpiProfile30,31 mevcut çalışmada kullanılmıştır ve bilinen histon peptitlerinin güvenilir pik alan ekstraksiyonu için optimize edildiğinden genellikle tavsiye edilir. Bununla birlikte, Skyline 32,33 gibi ekstrakte edilmiş iyon kromatografisi için serbestçe kullanılabilen diğer yazılımlar uygundur.
  2. Belirli (değiştirilmemiş) bir peptidin nispi bolluğunu, tek bir peptidin alanının, tüm modifiye formlarında peptidin toplam alanına bölünmesiyle hesaplayın. EpiProfile30,31 gibi yazılımlar zaten sinyal ekstraksiyonu için peptit kütüphaneleri içermektedir. Aksi takdirde, manuel olarak veya rutin proteomik boru hatlarını kullanarak peptid tanımlama yoluyla ilgilenilen peptidlerden oluşan bir kütüphane oluşturun.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu protokolde, HepG2 / C3A sferoidleri, her ikisi de histon PTM'lerin küresel seviyelerini etkileyen 20 mM NaBut ve 10 mM NaSuc ile tedavi edildi (Şekil 3A). Histon PTM'leri daha sonra MS / MS edinimi yoluyla tek kalıntı seviyesinde tanımlanmış ve ölçülmüştür (Şekil 3B).

Numuneler replikalarda çalıştırıldığında, numuneler arasında bir PTM'nin katlama değişimi zenginleştirmesini ve gözlemin tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için istatistiksel analiz yapılabilir. Gösterilen veriler, asetilasyonlarla modifiye edilmiş peptitlerin, NaBut ve kontrol ile muamele edilen sferoidlerde zenginleştirildiğini göstermektedir (Şekil 3C), NaSuc ile muamele edilen örnekler, lizin süksinilasyonu ile modifiye edilmiş histon peptidlerinin daha yüksek bir göreceli bolluğuna sahiptir (Şekil 3D). Bu hesaplamalar ayrı bir yayında detaylandırıldığı gibi bir elektronik tablo programında yapılmıştır34. Belirli bir histon modifikasyonunun genel bir artışı, analiz edilen modifikasyon bölgeleri hakkında ayrıntılı bilgi korunurken bile, belirli bir modifikasyonun daha yüksek bir küresel bolluğunu gözlemlemenin daha sezgisel hale geldiği radar grafiklerinde daha iyi temsil edilebilir (Şekil 3E, F).

Bu protokol, sık sık modifiye edilmiş K9, S10 ve K14 kalıntılarını içeren histon H3 amino asit kalıntıları 9-17'den bir peptit üretir. Gösterilen veriler, NaBut ile tedavinin H3K14ac seviyelerini arttırdığını, ancak yalnızca H3K9me2 ile birlikte modifiye edilmiş histonlarda ve H3K9me3 ile değil (Şekil 4A) olduğunu göstermektedir. İki modifikasyon arasındaki birlikte var olma frekansı, düğümlerin bireysel modifikasyonları temsil ettiği, konektör çizgilerinin kalınlığının iki PTM arasındaki birlikte var olma frekansını temsil ettiği bir halka grafiği olarak daha sezgisel olarak temsil edilebilir (Şekil 4B). Bazen, birlikte yaşama sıklığı etkilenmez, ancak çubuk grafikler olarak temsil edilen veriler yanıltıcı olabilir. Örneğin, Şekil 4A'da gösterilen veriler, H3K9me2K14ac kombinasyonunun NaBut tedavisinde kontrolden daha bol olduğunu göstermektedir. Bu doğrudur, ancak verilen bu kombinasyon tedaviden bağımsız olarak en sık görülenidir. Şekil 4B , H3K9me2K14ac ve H3K9me3K14ac'nin tedaviden (çizgi kalınlığı) bağımsız olarak en sık kombinatoryal modeller olduğunu, ancak H3K14ac'nin (düğüm) küresel seviyelerinin deneyde gerçekten değişen şey olduğunu açıkça göstermektedir.

Bu protokol, K5, K8, K12 ve K16 pozisyonlarında (çoğunlukla asetilasyonlarla) değiştirilebilir kalıntıları içeren histon H4 kalıntıları 4-17'den bir peptit üretir. Kontrol ve NaBut tedavisini karşılaştırırken, verileri örneğin kelime bulutları olarak temsil ederek asetilasyon kombinasyonlarında bir artış gözlemlemek mümkündür (Şekil 4C). Bu gösterim, histon H4'ün modifiye edilmemiş versiyonunun kontrol örneğinde en bol miktarda bulunduğunu açıkça vurgularken, NaBut ile tedavi edilen sferoidler ikili, üçlü ve dörtlü asetillenmiş histon H4 proteoformlarında zenginleştirilmiştir. Bununla birlikte, kelime bulutları tam değerleri görüntülemede sınırlıdır; Bir histon kodunun göreceli bolluğu, metnin boyutuna göre kıvrılmamalıdır, bu da yanlış tahmin edilebilir. Bu nedenle, Venn diyagramları veya UpSetR gösterimi35 gibi daha modern eşdeğerler, birlikte var olan histon PTM'lerin tam niceliğini göstermek için kullanılabilir (Şekil 4D, E). Gösterilen veriler, histon H4 üzerindeki asetilasyonların seçilmiş kombinasyonlarının NaBut tedavisinde kontrole kıyasla nispeten daha bol olduğunu bir kez daha vurgulamaktadır.

Figure 1
Şekil 1: 3D sferoidlerin histon peptid analizi için iş akışı. HepG2 / C3A hücreleri ilk olarak% 80 akıcılığa ulaşana kadar 2D kültürde yetiştirilir. Hücreler daha sonra dengeli bir biyoreaktöre aktarılır ve sferoidler oluşturmak için 10-11 rpm'de dönecekleri klinostat inkübatörünün içine yerleştirilir. 18 gün sonra, sferoidler 20 mM NaBut veya 10 mM NaSuc ile muamele edilir ve karşılık gelen zaman noktalarından sonra hasat edilir. Çekirdekler hücrelerden izole edilir ve 0.2M H2S04 ile histon ekstraksiyonu gerçekleştirilir. Histon türevlendirmesi daha sonra tripsin sindiriminden önce ve sonra propiyonik anhidrit ile gerçekleştirilir ve elde edilen kısa peptitlerin sıvı kromatografisi ile tutulmasını sağlar. Numunelerin tuzu alınır ve daha sonra adım 10'da belirtilen LC-MS/MS yöntemi kullanılarak çalıştırılır ve elde edilen veriler adım 11'de açıklandığı gibi analiz edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Propiyonilasyon ve tuzdan arındırma adımları için kurulum . (A) Propiyonilasyon bir duman davlumbazında gerçekleştirilir ve tüm bileşenler, adımların hızlı bir şekilde art arda gerçekleştirilebilmesi için düzenlenir. (B) Histon H3.1 kuyruğunda ilk propilasyon turu, tripsin sindirimi ve ikinci tur propiyonilasyonun şeması. (C) Tuz azaltma, tezgahta 96 delikli bir vakum manifoldu ve 96 delikli bir polipropilen filtre plakası kullanılarak gerçekleştirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Bireysel histon modifikasyonlarının gösterimi. (A) Kontrol ve tedavi edilen (20 mM NaBut veya 10 mM NaSuc) HepG2/C3A sferoidlerindeki yaygın global histon modifikasyonlarının göreceli bolluğunu gösteren çubuk grafik. (B) Kontrol altındaki ve tedavi edilen (20 mM NaBut veya 10 mM NaSuc) HepG2 / C3A sferoidlerinin 9-17 histon H3 peptid (KSTGGKAPR) kalıntıları üzerinde meydana gelen tek histon PTM'lerin bolluğunu gösteren çubuk grafik. (C,D) 20 mM NaBut (C) veya 10 mM NaSuc (D) ile tedaviyi takiben histon peptid PTM'lerin kıvrım değişimini ve diferansiyel ekspresyonunun önemini gösteren volkan grafikleri. Vurgulanan mavi ve yeşil noktalar sırasıyla asetillenmiş ve süksinillenmiş kalıntıları temsil eder. (E,F) Kontrole kıyasla sırasıyla 20 mM NaBut veya 10 mM NaSuc ile tedaviyi takiben tek histon peptid asetilasyon (E) veya süksinilasyon (F) bolluğunu gösteren radar grafikleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Birlikte var olan histon modifikasyonlarının gösterimi . (A) Kontrol altındaki ve tedavi edilen (20 mM NaBut veya 10 mM NaSuc) HepG2/C3A sferoidlerinin 9-17 numaralı histon H3 (KSTGGKAPR) kalıntıları üzerinde meydana gelen kombinatoryal histon PTM'lerin bolluğunu gösteren çubuk grafik. (B) Kontrol altındaki histon H3 (KSTGGKAPR) kalıntıları üzerindeki kombinatoryal histon PTM'ler arasındaki ilişkiyi gösteren halka grafikleri ve tedavi edilen (20 mM NaBut) HepG2/C3A sferoidleri. Düğüm renginin yoğunluğu, tedavi grubundaki tek bir PTM'nin bolluğuna karşılık gelirken, çizgi kalınlığı PTM'nin birlikte oluşma sıklığına karşılık gelir. (C) Kombinatoryal histon PTM'lerin sıklığını gösteren kelime bulutları, kontrol altındaki histon H4 kalıntıları üzerinde ve tedavi edilen (20 mM NaBut) HepG2/C3A sferoidleri. Metnin boyutu, belirtilen kombinatoryal PTM'nin bolluğuna karşılık gelir. (D,E) Kontrolde histon H4 peptid kalıntıları 4-17 ve 20 mM NaBut ile işlenmiş numuneler üzerinde birlikte var olan modifikasyonların sıklığını temsil eden Venn diyagramı. Veriler ShinyApp UpSetR35 kullanılarak görüntülenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Bu protokol kullanılarak tespit edilen peptitlerin listesi. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Histon PTM'lerin analizi, tipik proteomik analiz boru hattından temel olarak farklıdır. Çoğu histon PTM'nin hala esrarengiz biyolojik fonksiyonları vardır; Sonuç olarak, Gen Ontolojisi veya yol veritabanları gibi ek açıklamalar kullanılamaz. Histon modifikasyonlarını, katalizörlerinden sorumlu enzim veya bu PTM'leri bağlayan alanları içeren proteinlerle ilişkilendiren çeşitli kaynaklar mevcuttur (örneğin, HISTome36). Ayrıca, küresel histon PTM seviyeleri düzenlendiğinde kromatinin genel durumu hakkında spekülasyon yapmak mümkündür. Örneğin, histon asetilasyonunun veya süksinilasyon gibi diğer asilasyonların genel bir artışı normalde kromatin yoğuşma giderimiile ilişkilidir 37,38.

MS analizi, amino asit dizisi üzerindeki tam lokalizasyonları gibi bu modifikasyonlar hakkında daha ayrıntılı bilgi sağlar. Bu protokolde, MS / MS edinimi, biyolojik yorumlama için kritik olabilecek histon PTM'leri tanımlamak ve ölçmek için kullanılır. Örneğin, histon H3'ün (H3K4me3) lizin 4'ü üzerindeki trimetilasyon, aktif olarak transkribe edilmiş genlerin39'unun promotörleri üzerinde zenginleştirilirken, lizin 9 (H3K9me3) üzerindeki aynı modifikasyon, heterokromatin40'ı oluşturur. Histon modifikasyonları şu anda belirli hastalıklarda biyobelirteçler olarak kullanılmaktadır; Bu nedenle, histon analizi, tedaviye yanıta ek olarak hastalık patolojisini incelemek için kullanılabilir (örneğin, epigenetik ilaçlarla)41,42.

Tek PTM'lerin aksine birden fazla PTM arasındaki etkileşimleri görsel olarak temsil etmek daha zordur. Halka grafikleri gibi mevcut grafikler iki PTM'nin birlikte var olma sıklığını gösterebilirken, aynı anda ikiden fazla PTM arasındaki birlikte var olma sıklığını temsil edemezler, çünkü bu, ağın üç boyutlu bir temsilini gerektirir. Bu nedenle, üç veya daha fazla PTM düşünüldüğünde histon kodlarındaki değişiklikleri vurgulamak için diğer gösterimler daha uygun olabilir. Genel olarak, veri gösterimini çeşitlendirmek, örnekler arasındaki önemli değişiklikleri gözlemlemek için daha yüksek şans sunar. Bu protokol, histon PTM'lerin ve birlikte var olan PTM'lerin düzenlemelerini görüntülemek için farklı çizimlere örnekler sunar.

Bu protokol, tripsin sindirimi (yaklaşık 4-20 amino asit) nedeniyle nispeten küçük histon peptitler üretmesine rağmen, seçilen peptitler çoklu değiştirilebilir kalıntılar içerir. Bu peptitlerin analizi, PTM'lerin birlikte var olma frekanslarının nicelleştirilmesine izin verir, bu da belirli bir veri kümesinde hangi kombinatoryal histon işaretlerinin düzenlendiği hakkında önemli bilgiler ortaya çıkarabilir. Özellikle, numune hazırlama sırasında histonların miktarının yapıldığı hiçbir adım yoktur. Bunun dört nedeni vardır: (1) tripsin çok çeşitli aktivitelere sahiptir ve çok çeşitli enzim-numune oranlarında kullanılabilir (1:10-1:200). Ekstrakte edilen histonların deneysel verimi beklenenden farklı olsa bile, bu protokol kullanılarak sindirim ile ilgili sorunlarla karşılaşılmamıştır. (2) Bu protokol, hassasiyet eksikliği nedeniyle histon nicelemesinin gerçekleştirilmesinin zor olabileceği küçük malzeme miktarları için tasarlanmıştır. (3) Histon materyalinin miktarından bağımsız olarak sabit bir tripsin konsantrasyonu kullanarak, kromatografi performansını karşılaştırmak için triptik peptitleri (tripsin otolize ettiği gibi) kullanabiliriz. Numune verimindeki küçük değişiklikler, normalleştirme işlemi sırasında payda olarak belirli bir peptid için tüm (değiştirilmemiş) sinyalleri kullanan veri analiz yazılımı (adım 11) tarafından normalleştirilecektir. (4) Son olarak, başlangıç malzemesinin miktarının dramatik bir şekilde küçümsenmesi, nanoLC kromatografik sütunun aşırı yüklenmesinde sorunlara neden olabilir. Ancak, bu protokolde belirtildiği gibi tuz alma adımının gerçekleştirilmesi bu sorunun oluşmasını engeller. Aşırı miktarda başlangıç malzemesi (örneğin >100 μg) durumunda, tuzdan arındırma reçinesinin kapasitesinin sınırı aşılacaktır ve yükleme adımı sırasında fazla numune yıkanacaktır.

Bu analiz ile tespit edilen tüm peptitlerin Şekil 3 ve Şekil 4'te vurgulanmadığını belirtmek önemlidir. Ayrıca, tüm histon modifikasyonları bu özel numune hazırlama ve toplama yöntemleri kullanılarak tespit edilemez. Ek Tablo 1 , açıklanan işlem hattı kullanılarak çıkarılan tüm peptid sinyallerini listelemek için sağlanmıştır. Açıklanan numune hazırlığı bunların tespiti için uygun olmadığından birkaç iyi bilinen değişiklik tabloda listelenmemiştir. Dikkate değer örnekler, histon H2A ve H2B'den ubikitinile edilmiş peptitler ve histon H2A'nın fosforilasyonudur. X (DNA hasarının genel bir belirteci). Bunun nedeni, bu PTM'lerle ilişkili peptitlerin propiyonilasyonunun, C18 kromatografisi ve tarif edilen MS tespit yöntemi için uygun olmayan aşırı uzun peptitlere yol açmasıdır. Literatürde mevcut olan ancak Ek Tablo 1'de bulunmayan diğer modifikasyonlar, laktilasyon 43 veya serototilasyon44 gibi çok düşük bolluk modifikasyonlarıdır (şu anda sadece immünopresipitasyon veya spesifik hücre tedavisi gibizenginleştirme stratejilerinden sonra MS kullanılarak tespit edilebilir). Polimerizasyonun veya histon dizisine heterojen kovalent bağlanmanın neden olduğu öngörülemeyen kütle kaymalarına sahip histon modifikasyonları da dikkate alınmaz (örneğin, poli-ADP-ribosilasyon45 ve glikasyon46). Ek olarak, bu protokol HepG2 / C3A sferoidlerini tedavi etmek için NaSuc ve NaBut'u kullanır, ancak diğer ilaçlar / epigenetik değiştiriciler ve 2D / 3D hücre kültürü tipleri ile kullanılmak üzere değiştirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların rekabet eden finansal çıkarları yoktur.

Acknowledgments

Sidoli laboratuvarı, Lösemi Araştırma Vakfı (Hollis Brownstein Yeni Araştırmacı Araştırma Bursu), AFAR (Sagol Network GerOmics ödülü), Deerfield (Xseed ödülü), Relay Therapeutics, Merck ve NIH Direktör Ofisi'ni (1S10OD030286-01) minnetle kabul eder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% trypsin-EDTA solution Gibco 25300054
0.5-20 µL pipet tips BRAND 13-889-172 (Fisher Scientific)
1.5 mL microcentrifuge tubes Bio-Rad 2239480
10 µL multi-channel pipette BRAND BR7059000 (Millipore Sigma)
10 mL syringe Henke Sass Wolf 14-817-31 (Fisher Scientific) Luer lock tip, graduated to 12 mL
10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettes Eppendorf 14-285-904 (Fisher Scientific)
1000 µL pipet tips Rainin 30389164
18 G syringe needle Air-Tite 14-817-100 (Fisher Scientific) 3" length, 0.05" diameter
200 µL multi-channel pipette Corning 4082
2-200 µL pipet tips BRAND Z740118 (Millipore Sigma)
24-well ultra-low attachment microplate Corning 07-200-602
75 cm2  U-shaped cell culture flask Corning 461464U Untreated, with vent cap
96-well skirted plate Axygen PCR-96-FS-C (Corning)
Acetone Fisher Scientific A949-1 Acetone should be used cold
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) Sigma-Aldrich A6141-25G
Ammonium hydroxide solution Fisher Scientific AC423300250
Cell culture grade water Corning 25-055-CV
ClinoReactor CelVivo 10004-12 Bioreactor for 3D cell culture
ClinoStar CelVivo N/A Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture
Control unit CelVivo N/A Tablet for ClinoStar settings
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Corning 17-205-CV 1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35-010-CV
Formic acid Thermo Scientific 28905
Fume hood Mott N/A Model 7121000
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-8B 9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile
Glutagro supplement Corning 25-015-CI 200 mM L-ananyl-L-glutamine
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Corning 21-022-CV 1X solution without calcium, magnesium, and phenol red
HPLC grade acetonitrile Fisher Scientific A955-4
HPLC grade water Fisher Scientific W6-1
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A481-212
Ice N/A N/A
MEM non-essential amino acids Corning 25-025-CI 100X solution
Oasis HLB resin Waters 186007549 Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer Thermo Fisher Scientific IQLAAEGAAPFADBMBHQ High resolution mass spectrometer
Oro-Flex I polypropylene filter plate Orochem OF1100 96-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI 100X solution
pH paper Hydrion Z111848 (Sigma-Aldrich) 0-13 pH test paper
Pipette gun Eppendorf Z666467 (Millipore Sigma)
Polymicro capillary Molex 50-110-7740 (Fisher Scientific) Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD
Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile Fisher Scientific 1367549
Propionic anhydride Sigma-Aldrich 240311-50G
Refrigerated centrifuge Thermo Scientific 75-217-420
Reprosil-Pur resin MSWIL R13.AQ.0003 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size
Rotator Clay Adams 25477 (American Laboratory Trading) Nutator Mixer 1105
Sequencing grade modified trypsin Promega V5111
Sodium butyrate Thermo Scientific A11079
Sodium succinate dibasic Sigma-Aldrich 14160-100G
SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes) Savant 20249 (American Laboratory Trading)
SpeedVac vacuum concentrator (96-well) Thermo Scientific 15308325 Savant SPD1010
Sterile hood Thermo Scientific 1375 Class II, Type A2
Sulfuric acid (H2SO4) Fisher Scientific 02-004-375 Baker Analyzed ACS reagent
Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish Fisher Scientific 08-772-23
Trichloroacetic acid (TCA) Thermo Scientific AC421451000 Resuspend 100% w/v in HPLC grade water
Trifluoroacetic acid (TFA) Fisher Scientific PI28904 Sequencing grade
Vacuum manifold 96-well Millipore MAVM0960R
Vortex Sigma-Aldrich Z258415
Water bath Fisher Scientific FSGPD10
Wide bore pipet tips 1000 µL Axygen 14-222-703 (Fisher Scientific)
Wide bore pipet tips 200 µL Axygen 14-222-730 (Fisher Scientific)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  2. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  3. Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
  4. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology (Bethesda). 32 (4), 266-277 (2017).
  5. Wrzesinski, K., et al. The cultural divide: exponential growth in classical 2D and metabolic equilibrium in 3D environments. PLoS One. 9 (9), 106973 (2014).
  6. Wrzesinski, K., Fey, S. J. Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors. Bioengineering (Basel). 5 (1), 22 (2018).
  7. Gonda, S. R., et al. Three-dimensional transgenic cell model to quantify genotoxic effects of space environment. Advances in Space Research. 27 (2), 421-430 (2001).
  8. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  9. Tvardovskiy, A., et al. Top-down and middle-down protein analysis reveals that intact and clipped human histones differ in post-translational modification patterns. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (12), 3142-3153 (2015).
  10. Azad, G. K., et al. Modifying chromatin by histone tail clipping. Journal of Molecular Biology. 430 (18), 3051-3067 (2018).
  11. Kragesteen, B. K., Amit, I. Heads or tails: histone tail clipping regulates macrophage activity. Nature Immunology. 22 (6), 678-680 (2021).
  12. Dhaenens, M. Histone clipping: the punctuation in the histone code. EMBO Reports. 22 (8), 53440 (2021).
  13. Anderson, L. C., et al. Analyses of histone proteoforms using front-end electron transfer dissociation-enabled orbitrap instruments. Molecular and Cellular Proteomics. 15 (3), 975-988 (2016).
  14. Morgan, M. A. J., Shilatifard, A. Reevaluating the roles of histone-modifying enzymes and their associated chromatin modifications in transcriptional regulation. Nature Genetics. 52 (12), 1271-1281 (2020).
  15. Chan, J. C., Maze, I. Nothing is yet set in (hi)stone: novel post-translational modifications regulating chromatin function. Trends in Biochemical Sciences. 45 (10), 829-844 (2020).
  16. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
  17. Fischle, W., et al. Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains. Genes and Development. 17 (15), 1870-1881 (2003).
  18. Onder, O., et al. Progress in epigenetic histone modification analysis by mass spectrometry for clinical investigations. Expert Review of Proteomics. 12 (5), 499-517 (2015).
  19. Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. Journal of Proteomics. 75 (12), 3419-3433 (2012).
  20. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural and Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
  21. Moradian, A., et al. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
  22. Zheng, Y., Huang, X., Kelleher, N. L. Epiproteomics: quantitative analysis of histone marks and codes by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 142-150 (2016).
  23. Sidoli, S., Garcia, B. A. Middle-down proteomics: a still unexploited resource for chromatin biology. Expert Review of Proteomics. 14 (7), 617-626 (2017).
  24. Stampar, M., et al. Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals. Science of the Total Environment. 755, 143255 (2021).
  25. Calitz, C., et al. Toxicity and anti-prolific properties of Xysmalobium undulatum water extract during short-term exposure to two-dimensional and three-dimensional spheroid cell cultures. Toxicology Mechanisms and Methods. 28 (9), 641-652 (2018).
  26. Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
  27. Sidoli, S., et al. Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra (SWATH) analysis for characterization and quantification of histone post-translational modifications. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (9), 2420-2428 (2015).
  28. Sidoli, S., et al. Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications. Analytical Chemistry. 87 (22), 11448-11454 (2015).
  29. Karch, K. R., Sidoli, S., Garcia, B. A. Identification and quantification of histone PTMs using high-resolution mass spectrometry. Methods in Enzymology. 574, 3-29 (2016).
  30. Yuan, Z. F., et al. EpiProfile quantifies histone peptides with modifications by extracting retention time and intensity in high-resolution mass spectra. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (6), 1696-1707 (2015).
  31. Yuan, Z. F., et al. EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2533-2541 (2018).
  32. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
  33. Pino, L. K., et al. The Skyline ecosystem: Informatics for quantitative mass spectrometry proteomics. Mass Spectrometry Reviews. 39 (3), 229-244 (2020).
  34. Aguilan, J. T., Kulej, K., Sidoli, S. Guide for protein fold change and p-value calculation for non-experts in proteomics. Molecular Omics. 16 (6), 573-582 (2020).
  35. Lex, A., et al. UpSet: Visualization of intersecting sets. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 20 (12), 1983-1992 (2014).
  36. Shah, S. G., et al. HISTome2: a database of histone proteins, modifiers for multiple organisms and epidrugs. Epigenetics and Chromatin. 13 (1), 31 (2020).
  37. Xie, Z., et al. Lysine succinylation and lysine malonylation in histones. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (5), 100-107 (2012).
  38. Liu, J., et al. Histone succinylation and its function on the nucleosome. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (15), 7101-7109 (2021).
  39. Howe, F. S., et al. Is H3K4me3 instructive for transcription activation. Bioessays. 39 (1), 1-12 (2017).
  40. Nicetto, D., Zaret, K. S. Role of H3K9me3 heterochromatin in cell identity establishment and maintenance. Current Opinion in Genetics and Development. 55, 1-10 (2019).
  41. Wojcik, J. B., et al. Histone H3K27 dimethyl loss is highly specific for malignant peripheral nerve sheath tumor and distinguishes true PRC2 loss from isolated H3K27 trimethyl loss. Modern Pathology. 32 (10), 1434-1446 (2019).
  42. Sellers, W. R., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
  43. Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
  44. Farrelly, L. A., et al. Histone serotonylation is a permissive modification that enhances TFIID binding to H3K4me3. Nature. 567 (7749), 535-539 (2019).
  45. Chen, Q., et al. ADP-ribosylation of histone variant H2AX promotes base excision repair. The EMBO Journal. 40 (2), 104542 (2021).
  46. Zheng, Q., et al. Reversible histone glycation is associated with disease-related changes in chromatin architecture. Nature Communications. 10 (1), 1289 (2019).

Tags

Biyoloji Sayı 183 3D kültür histonlar kütle spektrometrisi doğrudan enjeksiyon çeviri sonrası modifikasyonlar
Karaciğer Dokusunun 3D Hücre Kültürü Modelinde Histone Post-Translasyonel Modifikasyonlarının Küresel Düzeyde Nicelleştirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Joseph-Chowdhury, J. S. N.,… More

Joseph-Chowdhury, J. S. N., Stransky, S., Graff, S., Cutler, R., Young, D., Kim, J. S., Madrid-Aliste, C., Aguilan, J. T., Nieves, E., Sun, Y., Yoo, E. J., Sidoli, S. Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue. J. Vis. Exp. (183), e63606, doi:10.3791/63606 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter