Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Geração de Padrões para Microscopia de Tração de Micropattern

Published: February 17, 2022 doi: 10.3791/63628
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Boston University

Summary

Descrevemos melhorias em um método padrão para medir forças de tração celular, baseado na impressão de microcontatos com uma única etapa de padronização subtrativa de matrizes de pontos de proteínas de matriz extracelular em hidrogéis macios. Este método permite uma fabricação mais simples e consistente dos padrões da ilha, essenciais para controlar a forma do aglomerado celular.

Abstract

Microscopia de tração de micropattern permite o controle da forma de células únicas e aglomerados celulares. Além disso, a capacidade de padronizar na escala de comprimento de micrômetro permite o uso dessas zonas de contato padronizadas para a medição de forças de tração, uma vez que cada ponto micropatterado permite a formação de uma única adesão focal que, em seguida, deforma o hidrogel macio e subjacente. Esta abordagem tem sido usada para uma ampla gama de tipos de células, incluindo células endoteliais, células musculares lisas, fibroblastos, plaquetas e células epiteliais.

Esta revisão descreve a evolução de técnicas que permitem a impressão de proteínas de matriz extracelular em hidrugas de poliacrilamida em uma matriz regular de pontos de tamanho e espaçamento pré-especificados. Como padrões de escala de micrômetros são difíceis de imprimir diretamente em substratos macios, os padrões são primeiro gerados em tampas de vidro rígidas que são então usados para transferir o padrão para o hidrogel durante a gelação. Primeiro, descreve-se a abordagem original de impressão de microcontatos para gerar matrizes de pequenos pontos no deslizamento de tampas. Um segundo passo que remove a maior parte do padrão para deixar ilhas de pequenos pontos é necessário para controlar as formas de células e aglomerados celulares em tais matrizes de pontos padronizados.

Em seguida, uma evolução dessa abordagem que permite a geração de ilhas de pontos usando um único passo de padronização subtrativa é descrita. Essa abordagem é muito simplificada para o usuário, mas tem a desvantagem de uma vida útil reduzida para o molde mestre necessário para fazer os padrões. Finalmente, são descritas as abordagens computacionais desenvolvidas para a análise de imagens de pontos deslocados e campos de tração gerados por células subsequentes, e são fornecidas versões atualizadas desses pacotes de análise.

Introduction

A maioria dos fenótipos celulares exercem forças de tração em seu ambiente. Essas forças de tração são geradas pelo citoesqueleto contractil de uma célula, que é uma rede de actina e miosina, e outros biopolímeros filamentosos e proteínas de crosslinking 1,2,3,4. As forças geradas dentro da célula podem ser transmitidas para o ambiente extracelular ou células adjacentes, principalmente através de proteínas transmembranas, como integrins e cadherinas, respectivamente 5,6. Como uma célula se espalha ou contrai - e as magnitudes das forças de tração associadas a esses movimentos - é o resultado de uma conversa íntima com seu ambiente, que depende em grande parte do tipo e quantidade de proteína presente na matriz extracelular (ECM)7,8 e da rigidez do ECM. De fato, a microscopia de força de tração tornou-se uma ferramenta inestimável para entender a resposta celular a estímulos locais, como rigidez de substrato, tensões mecânicas impostas e cepas, ou contato com outras células. Essas informações são diretamente relevantes para a compreensão de doenças como câncer e asma 9,10,11,12.

Um sistema que pode ser usado para medir a deformação induzida pela força de um substrato de propriedades materiais conhecidas é necessário para calcular forças de tração. Essas mudanças devem ser acompanhadas ao longo do tempo, exigindo técnicas de imagem e processamento de imagens. Um dos primeiros métodos utilizados para determinar as forças de tração celular foi a observação e análise da contração de hidrogéis de colágeno semeados com células, embora este método fosse apenas semiquantitativo13. Outro método mais refinado foi medir as forças de tração exercidas por células únicas, determinando as forças resultantes da deformação de uma fina folha de silicone14. Posteriormente, foram desenvolvidas técnicas de medição mais quantitativas, e esses métodos também permitiram o uso de hidrogéis macios, como poliacrilamida (PAA)12,15,16. Ao utilizar esses materiais macios, as forças de tração poderiam ser determinadas a partir do deslocamento induzido pela força de contas deslocadas aleatoriamente embutidas no hidrogel e nas propriedades mecânicas do gel16,17. Outro avanço veio com o desenvolvimento de matrizes de micropostos feitas de polidimimetilsiloxano macio (PDMS) para que sua deflexão pudesse ser medida e convertida em força usando a teoria do feixe18.

Finalmente, métodos para micropatterning hidrogéis macios foram desenvolvidos à medida que essas abordagens permitem o controle das áreas de contato para adesão celular. Medindo a deformação do micropattern dentro da área de contato de uma célula, as forças de tração poderiam facilmente ser calculadas porque uma imagem de referência livre de força não é necessária19. Este método tem sido amplamente adotado, pois permite a padronização indireta de uma matriz regular de pontos de adesão de proteína fluorescente do tamanho de mícrons e discretos em géis PAA para a medição das forças de tração celular20. Para calcular essas forças, um algoritmo de processamento de imagem, que pode rastrear os movimentos de cada ponto micropatterado sem exigir a entrada do usuário, foi desenvolvido21.

Embora este método seja simples para criar grades inteiras de padrões de pontos, é mais complicado quando padrões de manchas isoladas (ou ilhas) de pontos são desejados. Ilhas micropatteradas são úteis quando o controle da forma, e até certo ponto do tamanho, de aglomerados de células é necessário. Para criar essas ilhas, o método acima mencionado de impressão de microcontatos requer dois passos distintos: i) usar um selo PDMS para criar um padrão de alta fidelidade de pontos em um deslizamento de cobertura, e então ii) usando um segundo selo PDMS diferente para remover a maioria desses pontos, deixando para trás ilhas isoladas de pontos21. A dificuldade em criar ilhas com este método original é agravada pelo fato de que fazer padrões de grade consistentes na primeira etapa do processo é desafiador por si só. Os selos de microimpressão são compostos por uma matriz de micropostos circulares, do qual o diâmetro corresponde ao tamanho do ponto desejado. Esses selos são então revestidos com uma camada uniforme de proteína e, em seguida, estampados com uma quantidade precisa de pressão sobre tampas tratadas para criar o padrão desejado. Por um lado, aplicar muita pressão ao carimbo pode resultar em transferência de proteínas irregulares e má fidelidade de padrões devido à fivela de pilares ou flacidez entre pilares, levando ao contato com o vidro. Por outro lado, aplicar pouca pressão resulta em pouca ou nenhuma transferência de proteínas e má fidelidade padrão. Por essas razões, um processo de transferência que pode ser usado para criar consistentemente micropatters de alta qualidade de ilhas isoladas de pontos em apenas um passo é desejado.

Aqui, um método é descrito para o micropatterning indireto de ilhas de proteína fluorescente do tamanho de mícrons pontos de adesão em um gel PAA que é mais consistente e versátil do que os métodos previamente desenvolvidos. Considerando que os métodos de micropatterning indiretos mais antigos dependem da transferência de padrões proteicos de um selo PDMS para um substrato intermediário, o método introduzido aqui usa selos PDMS em vez disso como um vaso para remoção de proteínas, não adição. Isso é feito primeiro alterando fundamentalmente a estrutura dos selos PDMS utilizados. Em vez de fazer selos compostos de um padrão de pilares circulares espaçados uniformemente, os selos são compostos por um padrão de buracos circulares espaçados uniformemente neste método.

Com esta nova estrutura, a superfície desses selos PDMS pode então ser tratada com glutaraldeído como descrito anteriormente 20,29,30, tornando o selo capaz de se unir covalentemente com proteína. Quando usados em uma mancha de vidro revestida uniformemente com proteína fluorescente, esses selos PDMS tratados com glutaraldeído são usados para remover a maior parte da proteína na superfície do deslizamento de cobertura, deixando para trás apenas o padrão desejado de pontos pré-determinados pela localização de orifícios do tamanho de mícrons no selo. Essa mudança aumenta a taxa de sucesso para gerar padrões compostos por uma grade quase contínua de pontos e para a criação de ilhas isoladas de pontos em apenas um passo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Criação de mestres do silicone

NOTA: A maior parte do processo de concepção, criação e solução de problemas dos mestres do silício para a repetida moldagem dos selos PDMS foi coberta anteriormente21, de modo que apenas diferenças fundamentais nesta nova abordagem serão descritas aqui.

  1. Crie o design para a máscara fotográfica usando AutoCAD ou software de design similar. Cubra um lado da máscara fotográfica, um fino pedaço de vidro, com uma fina camada de cromo para controlar a dispersão da luz UV. Desenhe a máscara fotográfica para que a luz UV brilhante através dele até o fotoresist escolhido crie um mestre de silicone com o inverso das características desejadas nos selos PDMS finais. Veja a Figura 1 para o desenho desta máscara.
    NOTA: Se as características desejadas ou a área fora delas devem ser transparentes na máscara de fotomassão depende do fotoresist escolhido. O fotoresist usado aqui é SU-8 2005 (ATENÇÃO: inflamável, irritante de pele e olhos; mantenha-se longe do calor/chamas/faíscas e use luvas de proteção e óculos durante o manuseio), um fotoresist negativo que é capaz de fazer características de 5 μm de altura com paredes laterais quase verticais.
    1. Cure o fotoresist negativo expondo-o à luz UV e removendo o SU-8 não curado com um solvente químico. Portanto, desenhe as características primárias da máscara para ser transparente enquanto a área circundante da máscara é opaca.
    2. Para este novo método de remoção, projete a máscara fotográfica para que seja composta por dois quadrados de 1,5 x 1,5 cm (Figura 1A), um cheio de uma grade uniforme de 2 círculos de 2 μm espaçados 6 μm centro a centro, e outro composto por muitas ilhas quadradas que são versões menores e isoladas desse mesmo padrão de grade (Figura 1B). Faça ilhas dos seguintes tamanhos: 6 x 6 pontos, 12 x 12 pontos, 25 x 25 pontos e 42 x 42 pontos.
      NOTA: O diâmetro dos pontos de adesão (2 μm) foi escolhido com base em estudos anteriores que mediram as forças de tração celular22,23. A máscara usada aqui é de 101,6 x 101,6 mm e é revestida de um lado com uma camada de 0,06 μm de espessura de cromo, o que é recomendado por causa das pequenas características do mestre. A máscara usada aqui foi encomendada por uma empresa externa de impressão de máscaras.
  2. Dentro de uma sala de limpeza, cubra o wafer de silicone escolhido uniformemente com fotoresist. Como um passo opcional, trate a superfície do wafer em um asher de plasma antes de cobri-lo com resistência.
    NOTA: Aqui, são utilizados wafers de 100 mm de diâmetro. O tratamento em um asher de plasma torna o wafer mais favorável à ligação ao SU-8 e ajuda a evitar a delaminação do SU-8 do wafer.
  3. Execute as seguintes etapas de acordo com as instruções do fabricante fotoresistista:
    1. Gire o wafer revestido para criar a espessura desejada, variando o tempo de rotação com base na espessura desejada e no tipo de resistência. Para um SU-8 2005 de 5 μm de espessura, divida o programa de spin recomendado nas três etapas seguintes:
      1. Cubra o wafer com fotoresist ao girar a 500 RPM por 10 s com uma rampa de 100 RPM/s.
      2. Reduza a espessura de resistência para cerca de 5 μm girando o wafer a 3.000 RPM com uma rampa de 300 RPM/s para 30 s.
      3. Desacelere lentamente o wafer depois de girar reduzindo a velocidade para 0 RMP com uma rampa de 500 RPM/s para 1 s.
    2. Prepare a resistência para exposição uv, assando-a brevemente em uma placa quente de 95 °C. Modificar o tempo gasto na placa de aquecimento de acordo com a espessura desejada da resistência; O tempo de cozimento é de 2 min para um SU-8 2005 de 5 μm de espessura.
    3. Exponha a resistência à luz UV para curar totalmente as características desejadas. Tenha cuidado com a superexposição, pois isso pode tornar o SU-8 frágil e afetar a qualidade geral do mestre resultante.
      1. Use energia de exposição de 105 mJ/cm2 para um SU-8 2005 de 5 μm de espessura. Com base na potência da lâmpada UV disponível, calcule o tempo de exposição dividindo a energia de exposição pela potência da lâmpada em mW.
        NOTA: Como a lâmpada usada aqui tem potência de 8 mW, o tempo de exposição deve ser de 13,1 s.
    4. Para definir as características SU-8 após o desenvolvimento, asse novamente em uma placa quente de 95 °C, desta vez por 3 min. Aguarde que as características desejadas do mestre apareçam dentro de 1 min durante esta etapa de cozimento se a resistência foi exposta corretamente.
    5. Remova o SU-8 nãocurado do wafer de silício usando o desenvolvedor SU-8. Seja minucioso ao remover o SU-8 nãocurado, pois ele pode ficar preso entre as características do tamanho de míccro e espaçadas no wafer.
      ATENÇÃO: O desenvolvedor SU-8 é um irritante de pele e olhos inflamáveis; mantenha-o longe do calor/chamas/faíscas e use luvas de proteção e óculos ao manuseá-lo.
    6. Após o desenvolvimento, enxágue com acetona para remover o excesso do desenvolvedor no wafer e secá-lo completamente com uma pistola de spray de nitrogênio.
      ATENÇÃO: A acetona é uma pele inflamável e irritante para os olhos; mantenha-o longe das chamas/faíscas e use luvas de proteção e óculos ao manuseá-lo.
    7. Opcionalmente, para SU-8 2005, asse em uma placa quente de 200 °C por 10 minutos.
      NOTA: Este cozimento duro adiciona força mecânica ao fotoresist.
  4. Depois de ser permitido esfriar, coloque o wafer em uma bandeja de porta-wafers e, em seguida, lançá-lo em PDMS. Primeiro, complete um tratamento de silanização no wafer para tornar as características SU-8 do mestre de silício menos propensas a se ligar ao PDMS e, portanto, menos propensas a serem removidas da superfície do wafer.
    1. Para completar o tratamento de superfície de silanização, coloque o mestre e uma pequena mancha de vidro dentro de um desiccador designado apenas para uso com silanes. Coloque 1-2 pequenas gotas de Trichloro (1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silane no deslizamento de tampa, feche o desiccador e execute-o sob vácuo por 30 minutos a uma pressão de 4.500 Pa24.
      ATENÇÃO: Trichloro (1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silane é uma pele inflamável e irritante para os olhos; mantenha-o longe do calor/chamas/faíscas, use luvas de proteção e óculos durante o manuseio e trabalhe sob um capô de fumaça.
    2. Desligue o vácuo e deixe o mestre e cubra o desiccador por mais 30 minutos.
      NOTA: O mestre está pronto para o casting em PDMS.

2. Impressão subtraída de microcontatos

  1. Misture PDMS na razão correta de agente de cura para base com base nas instruções do fabricante. Deixe-o sentar à temperatura ambiente e pressão por 15 minutos; então, degas sob vácuo por 15 minutos.
  2. Despeje o PDMS no mestre e coloque-o em uma incubadora definida para 37 °C durante a noite para curar.
  3. Remova o mestre da incubadora e deixe esfriar até a temperatura ambiente.
  4. Enquanto o mestre está esfriando, sonicate 25 mm cobre manchas no etanol por 10 minutos. Use tantas tampas quanto o número de selos que estão sendo preparados.
  5. Enxágue completamente as tampas de 25 mm com água desionizada (DI) e seque usando uma pistola de ar filtrada.
  6. O plasma trata as tampas por 1 min usando um limpador de plasma sob vácuo em alta (potência de radiofrequência de 30 W). Certifique-se de liberar o vácuo lentamente após o tratamento para evitar que as tampas se movam dentro da câmara.
    NOTA: O tratamento plasmátrico da superfície do vidro serve a dois propósitos: limpa a superfície do vidro para remover contaminantes e gera grupos polares à base de oxigênio na superfície do vidro para torná-lo hidrofóbico25. Esta hidroofobidade torna a superfície do vidro mais agradável à ligação proteica.
  7. Em uma sala desprovida de luz solar direta/iluminação aérea, cubra cada tampa com 100 μL de solução proteica com rótulo fluorescente a uma concentração de pelo menos 100 μg/mL, cubra para proteção extra contra a luz e deixe-a sentar por 20 minutos.
    NOTA: Aqui, a fibronectina isolada do plasma humano e tingida com AlexaFluor 488 é usada.
    1. Para tingir fibronectina, combine fibronectina sem rótulo de concentração e volume conhecidos com a quantidade apropriada de corante fluorescente em um tubo de 1,5 mL. Cubra o tubo com papel alumínio para proteger o corante da luz e incuba-o à temperatura ambiente por 1h, misturando suavemente a cada 10 minutos girando o tubo de cabeça para baixo 5-10 vezes.
      NOTA: A quantidade de corante necessária varia de acordo com o corante utilizado e a massa de proteína que está sendo utilizada. Consulte o Arquivo Suplementar 1 para a calculadora usada para determinar a quantidade apropriada de corante para fibronectina rotulada com Alexa 488. De acordo com as instruções do fabricante, o excesso de corante pode ser filtrado com o uso de colunas de desalhante (veja a Tabela de Materiais).
  8. Enxágüe cada tampa completamente com água DI, e remova o excesso de água da superfície, tocando suavemente as laterais de cada folha de papel em uma toalha de papel ou material absorvente similarmente. Deixe as tampas descobertas no escuro por pelo menos 30 minutos para permitir que sequem completamente.
  9. Enquanto as tampas revestidas de proteína secam, remova o carimbo PDMS do mestre cortando-o com um bisturi ou outra lâmina afiada.
    NOTA: É melhor não tentar cortar o PDMS na primeira tentativa, pois aplicar tanta pressão vai quebrar o wafer de silício e danificar o mestre.
  10. O plasma trata os selos PDMS por 2 minutos sob vácuo em alta (potência de radiofrequência de 30 W).
  11. Dentro de um capô de fumaça, coloque os selos em um recipiente com tampa e cubra cada carimbo com uma camada muito fina (<100 μL) de 10% (3-aminopropil)trimexisilano (3-APTMS) diluído em 100% etanol.
    ATENÇÃO: 3-APTMS é uma pele inflamável e irritante para os olhos; mantenha-o longe das chamas/faíscas, use luvas de proteção e óculos durante o manuseio e trabalhe sob um capô de fumaça. O revestimento excessivo da solução 3-APTMS fará com que uma filme laranja se forme mais tarde neste processo. Este tratamento de superfície 3-APTMS incorpora a funcionalidade de amina na superfície do selo PDMS, o que permitirá uma maior derivação da superfície do selo mais tarde nodia 26.
  12. Cubra o recipiente com os selos e deixe-os sentar em temperatura ambiente por 5 minutos.
  13. Usando água DI, enxágue bem cada carimbo em ambos os lados.
  14. Coloque os selos em um recipiente limpo e cubra-os liberalmente com 2,5% de glutaraldeído em água DI.
    ATENÇÃO: Glutaraldeído é tóxico; usar luvas de proteção e óculos ao manusear e trabalhar sob um capô de fumaça). Este tratamento de glutaraldeído ao lado do tratamento 3-APTMS anterior fornece funcionalidades de aldeído na superfície dos selos PDMS, que podem reagir com os grupos de amina nas proteínas para criar uma ligação secundária de amina, que é fundamental para o processo de remoção de proteínas27.
  15. Cubra os selos, deixe-os sentar em temperatura ambiente por 30 minutos e, em seguida, enxágue bem com água DI novamente. Remova o excesso de água da superfície dos selos da mesma forma que as tampas, e permita que os selos sequem descobertos por ~30 min.
  16. Depois de 30 min, verifique se as tampas revestidas de proteína e os selos estão secos. Se ambos não estiverem completamente secos, use uma pistola de ar filtrada para secá-las completamente, garantindo que as tampas não sejam expostas à luz por um período prolongado.
  17. Uma vez que as tampas e os selos estejam secos, empurre o padrão de selos para baixo nas tampas com pressão suficiente para que os selos entrem em contato total com a superfície do deslizamento de tampas. Deixe os selos em contato com as tampas por 15 minutos.
    NOTA: Devido à ligação covalente entre o carimbo de glutaraldeído com a camada proteica na tampa de vidro - que é muito mais forte do que as fracas interações hidrofóbicas entre a camada proteica e a tampa de vidro - as proteínas devem descascar o vidro de acordo com o padrão no selo PDMS uma vez que ele é removido.
  18. Depois de 15 min, descasque cuidadosamente os selos PDMS das tampas.
    NOTA: Se o processo de remoção funcionou corretamente, os selos não devem sair das tampas sem resistência, mas também não devem ser tão firmemente grudado nas tampas que não podem ser removidos sem força excessiva.
  19. Verifique a fidelidade das tampas padronizadas usando o filtro apropriado em um microscópio fluorescente (dependendo de qual corante fluorescente as proteínas são marcadas).
  20. Use as tampas padronizadas imediatamente ou salve-as e armazene-as longe da luz direta.

3. Deslizamentos de cobertura ativados

NOTA: As tampas inferiores para uso na câmara experimental para géis PAA são feitas nesta etapa. Esta mancha inferior é especialmente tratada para permitir que o gel PAA permaneça firmemente aderido à medida que o deslizamento de cobertura padrão superior é removido durante o processo de padronização. Técnicas semelhantes também são descritas em outros lugares 10,12,15,28.

  1. Sonicate 30 mm cobre manchas em 100% etanol por 10 minutos, enxaguar com água DI e, em seguida, completamente seco com uma pistola de ar filtrada. Prepare até 6 tampas por vez por lote em uma placa de 6 poços.
  2. O plasma trata as tampas por 1 min no alto (poder de radiofrequência de 30 W) e, em seguida, coloque cada tampa em um poço de uma placa de 6 poços.
  3. Cubra cada tampa com uma camada muito fina de 5% de APTMS em etanol em um capô de fumaça.
    NOTA: Um resíduo de laranja se formará em caso de revestimento excessivo neste processo.
  4. Cubra a placa de 6 poços e deixe as tampas sentarem por 5 minutos.
  5. Enxágüe as tampas (ambos os lados) e o interior de cada poço completamente com água DI e remova o excesso de água dentro dos poços.
  6. Coloque as tampas de volta na placa de 6 poços e adicione aproximadamente 2 mL de glutaraldeído de 0,5% em água DI.
  7. Cubra a placa de 6 poços e deixe as tampas sentarem-se na solução de glutaraldeído por 30 minutos; em seguida, enxágue bem as tampas e os poços de cada placa com água DI.
  8. Armazene as tampas tratadas em água DI dentro das placas de 6 poços por até duas semanas ou use-as imediatamente. Certifique-se de que as tampas estão completamente secas antes de usar.

4. Fabricação de gel PAA e transferência de padrão

NOTA: Uma vez feitas coberturas padronizadas, elas devem ser usadas para transferir esses padrões proteicos para o hidrogel PAA logo depois (<24 h)1,29,30. A seguinte receita é para um gel PAA com um módulo young de 3,6 kPa. As quantidades de bis-acrilamida, acrilamida e dI podem ser variadas para ajustar a rigidez dos géis PAA12.

  1. Pouco antes de começar a fazer o precursor do hidrogel PAA, remova o ácido acrílico N-hidroxisuccinimida (NHS)-éster da geladeira para que possa atingir a temperatura ambiente antes de ser aberto. Prepare um prato de deslizamento intercambiável, esterilizando-o com 70% de etanol e deixando-o sentar sob luz UV em um armário de biossegurança por pelo menos 30 minutos antes do uso.
    ATENÇÃO: O NHS é uma pele tóxica e irritante para os olhos; use luvas de proteção e óculos ao manuseá-lo, e trabalhe sob um capô de fumaça.
    1. Adicione 1,25 mL de 40% de acrilamida em água DI a um tubo cônico de 15 mL.
      ATENÇÃO: A crilamida é uma pele tóxica e irritante para os olhos; use luvas de proteção e óculos ao manuseá-lo, e trabalhe sob um capô de fumaça.
    2. Adicione 175 μL de solução de bis-acrilamida em água DI ao mesmo tubo (passo 4.1.1).
      ATENÇÃO: Bis-acrilamida é uma pele tóxica e irritante para os olhos; use luvas de proteção e óculos ao manuseá-lo, e trabalhe sob um capô de fumaça.
    3. Adicione 500 μL de salina tamponada com fosfato de 10x (PBS).
      ATENÇÃO: A PBS é um irritante para os olhos; use luvas de proteção e óculos durante o manuseio.
    4. Adicione 2.915 mL de água DI.
  2. Pipeta 969 μL deste precursor em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, e armazene o resto a 4 °C por até duas semanas.
  3. Meça ~50-100 mg de persulfato de amônio (APS) em outro tubo de microcentrifuuagem e dilui-o em água DI até 100 mg/mL; reserve-o para uso mais tarde. Abra o éster NHS (agora em temperatura ambiente) no capô e meça cuidadosamente até 3 mg de NHS em um tubo de microcentrifuuagem. Diluir o NHS-éster para 1 mg/mL em 1x PBS.
    ATENÇÃO: APS é um irritante de pele e olhos; use luvas de proteção e óculos ao manuseá-lo, e trabalhe sob um capô de fumaça. Tanto o APS quanto o NHS-éster se hidrizarão ao longo do tempo, fazendo com que a atividade dos produtos químicos na solução de estoque varie. Portanto, ambas as soluções devem ser preparadas frescas o tempo todo (ao contrário do resto do precursor).
  4. Execute os próximos três passos em um capô de fumaça:
    1. Adicione 2 μL de tetrametetilenodiamina (TEMED) ao tubo de microcentrifusagem contendo a alíquota de 969 μL do precursor de PAA.
      ATENÇÃO: TEMED é uma pele inflamável e irritante para os olhos; mantenha-o longe do calor/chama/faíscas, use luvas de proteção e óculos durante o manuseio e trabalhe sob um capô de fumaça. TEMED é um dos dois agentes de crosslinking críticos para a polimerização do hidrogel PAA, sendo o outro APS.
    2. Adicione 15 μL de ácido clorídrico de 1 M para diminuir o pH da solução de hidrogel e evitar a hidrólise do NHS-éster.
      ATENÇÃO: O ácido clorídrico é uma pele corrosiva e irritante para os olhos; use luvas de proteção e óculos ao manuseá-lo, e trabalhe sob um capô de fumaça.
    3. Adicione 10 μL da solução NHS-ér ao tubo.
      NOTA: O NHS é fundamental para o processo de padronização. Ele reagirá com grupos de amina nas proteínas na tampa padronizada para formar uma ligação de amida estável, o que permitirá que o padrão seja transferido do deslizamento de tampa de vidro para a superfície do gel PAA à medida que polimeriza31.
  5. Execute estas etapas finais em um gabinete de biossegurança:
    1. Coloque cuidadosamente a tampa de 30 mm dentro da parte metálica do conjunto de pratos de deslizamento (3-APTMS e lado tratado com glutaraldeído) e enrosque o anel de plástico por cima. Configure o deslizamento de cobertura padronizado para que possa ser facilmente alcançado na próxima etapa, ainda protegendo-o da luz tanto quanto possível.
    2. Pipeta 5 μL de solução APS no resto do precursor paa no tubo de microcentrifuuge, inverta-o para misturar e, em seguida, imediatamente pipeta 35 μL dessa solução para o deslizamento de tampa de 30 mm.
    3. Deixe cair o lado da proteína de deslizamento de cobertura padronizada para baixo na solução, tomando cuidado para não criar bolhas de ar no hidrogel. Proteja o hidrogel da luz e deixe polimerizar por 90 minutos.
    4. Uma vez que o hidrogel tenha polimerizado, use uma lâmina de barbear ou bisturi para remover o deslizamento superior, garantindo que o deslizamento não deslize do gel ou caia de volta no gel uma vez que tenha sido removido, pois isso arruinará o padrão na superfície do gel.
      NOTA: Não deixe o gel descoberto em uma área com fluxo de ar significativo (como um armário de biossegurança).
    5. Para passivar qualquer NHS-éster restante no hidrogel, adicione 2 mL de PBS estéril ao gel e incubar a 37 °C por 45 min. Prepare imediatamente os géis para experimentos ou armazene-os durante a noite em PBS estéril a 4 °C até o uso.

5. Imagem

  1. Para se preparar para experimentos com células, ligue o calor (37 °C) e a umidade (70%) no microscópio à tarde antes de um experimento planejado para permitir que o equipamento dentro da câmara de microscópio se equilibre até a temperatura mais alta.
    NOTA: Esta etapa minimiza a deriva z causada por flutuações de temperatura.
  2. Pouco antes do início do experimento, ligue a fonte de CO2 da câmara.
  3. Para evitar a deriva x-y causada pelo movimento repetido do estágio do microscópio durante o experimento, fixe o conjunto de pratos de deslizamento de cobertura intercambiável segurando o hidrogel semeado por células para o palco com fita dupla face.
  4. Olhe sobre o gel para encontrar quadros de interesse para a imagem, salvando cada posição de estágio das seções a serem imagens.
  5. Tanto na visão brightfield quanto na visão fluorescente correspondente à proteína rotulada, defina o software de microscópio para visualizar cada quadro uma vez a cada 5 minutos por 2 h.

6. Análise de imagem

NOTA: Foi desenvolvido um sistema que pode medir a deformação dos géis PAA padronizados, determinando a localização dos pontos de tração, interpolando os locais iniciais dos pontos deformados e, em seguida, calculando as forças de tração celular em cada local. Qualquer sistema de software capaz de realizar processamento de imagens e cálculos numéricos pode ser usado. O programa visa determinar rapidamente as forças de tração, eliminando os procedimentos de entrada e pré-processamento do usuário que contribuam para erros relacionados ao usuário. O código usado aqui está disponível aqui como Arquivos Suplementares 2-10, e esses arquivos, juntamente com um par de imagens de prática, podem ser acessados em www.bu.edu/mml/downloads.

  1. Em um software de processamento de imagens, abra todas as imagens individuais tiradas durante um experimento timelapse de cada visualização de microscópio usada em ordem, da primeira à última imagem capturada, e transforme-as em uma única pilha de imagens (clicando em Imagem | Pilhas | Imagens para Stack). Certifique-se de que há duas pilhas de imagens separadas: uma da visão de campo brilhante das células e uma da visão fluorescente do padrão ao qual elas estão anexadas.
    1. Se houver deriva nas imagens fluorescentes (ou seja, a ilha de interesse se move na x- e/ou y-direção entre cada quadro por >1-2 μm), primeiro processe a pilha de imagens com o plugin StackReg (P. Thévenaz, Instituto Federal Suíço de Tecnologia lausanne) para recenter cada imagem na pilha com base na posição do primeiro (clicando em Plugins | | StackReg | de tradução OK).
      NOTA: Isso é crítico porque mesmo a deriva sub-μm pode afetar significativamente o cálculo final das forças de tração, especialmente em géis mais rígidos onde esta deriva x-y está fora da faixa de ruído esperado. Este código salvará as imagens após a retirada de deriva, que pode então ser transformada em uma nova pilha de imagens a ser analisada.
  2. Insira as pilhas de imagens brilhantes e fluorescentes no CTFTimelapse.m (Arquivo Suplementar 2).
    1. Especifique o diretório de arquivos onde as pilhas de imagens estão localizadas na linha 7.
    2. Nas linhas 8 e 9, especifique os nomes da pilha de imagens fluorescentes e da pilha fluorescente de campo brilhante correspondente, respectivamente.
    3. Especificar rigidez do gel PAA (Pa):
      1. Nas linhas 11-14, que incluem alguns moduli elásticos diferentes de hidrogéis PAA usados com mais frequência, comente (tipo % no início da linha) todos, exceto o módulo elástico do gel nas imagens que estão sendo analisadas. Alternativamente, adicione o módulo elástico se ainda não estiver presente e comente o resto (3658.19 Pa para imagens de teste).
    4. Especifique o raio de ponto (m) na linha 15 (1 × 10-6 m para imagens de teste).
    5. Especifique o diâmetro máximo possível do ponto (μm) na linha 16 (2,5 μm para imagens de teste).
    6. Especificar a proporção de pixels (μm/pixel):
      1. Nas linhas 17-20, que incluem algumas proporções diferentes de pixels de imagem baseadas em configurações de imagem usadas anteriormente, comente (tipo % no início da linha) todos, exceto a razão de pixels das imagens que estão sendo analisadas. Alternativamente, adicione a relação de pixels usada se ainda não estiver presente e comente o resto (0,1613 μm/pixel para imagens de teste).
    7. Nas linhas 35 e 87, especifique o diretório de arquivos onde estão localizados os arquivos necessários de processamento de imagens.
      NOTA: A partir da pilha de imagens fluorescentes, o código determina a localização de cada ponto fluorescente e rastreia o movimento de cada ponto entre cada imagem na pilha20. A posição inicial dos pontos impressos do microcontato é conhecida porque eles não se deformam quando devidamente transferidos para o hidrogel32.
  3. Aguarde que dois números e uma caixa de diálogo apareçam assim que o programa encontrar os pontos. Use a Figura 1 para garantir que o programa tenha encontrado os pontos corretos e não encontrou muitos pontos onde não havia nenhum. Use a Figura 2 para escolher a grade retangular que ajuda o programa a localizar e calcular as forças de tração celular.
    NOTA: A Figura 1 é a imagem de campo brilhante da célula com os pontos encontrados pelo programa (que será vermelho) sobreposto sobre ele (ver Figura 3A). Figura 2 é uma imagem que exibe os mesmos pontos mostrados na Figura 1 , mas sem a imagem de campo brilhante no fundo.
    1. Aguarde que a caixa de diálogo pressione "Enter" após a seleção do ponto- em que cada ponto é um dos pontos vermelhos encontrados pelo programa e tem um botão grande dentro do seu rótulo Enter.
    2. Escolha quatro pontos diferentes na Figura 2 para criar uma grade retangular ao redor e incluindo a célula/cluster nesse padrão. Selecione cada ponto um por um com um clique esquerdo do mouse e confirme-o pressionando Enter on the button in thementionedmentioned dialog box. Mantenha a contagem de quantos pontos estão entre o primeiro e o segundo ponto, bem como o primeiro e o terceiro ponto, pois o programa pedirá esses valores uma vez que todos os pontos de quatro cantos tenham sido selecionados. Digite esses valores na janela de comando (digite o número de pontos e clique no botão enter no teclado quando solicitado).
  4. Uma vez escolhida a grade retangular, aguarde que o script calcule as forças de tração que ele encontra dentro da grade com base nos locais dos pontos fluorescentes. Observe que o script primeiro encontra o vetor de deslocamento (u) do centro geométrico de cada ponto e, em seguida, calcula o vetor de força de tração correspondente (F) usando Eq (1):
    Equation 1(1)
    Onde E é o módulo do Young do substrato PAA, um é o raio dos marcadores de ponto fluorescente, e ν é a razão de Poisson do substrato PAA32. Eq (1) assume que o substrato é um infinito meio espaço elástico elástico, que as forças de tração são aplicadas no centro de cada marcador de ponto circular, e que o espaçamento entre os marcadores de ponto é suficientemente grande para que seus respectivos deslocamentos não interajam entre si23.
    NOTA: Nos experimentos aqui descritos, são utilizados marcadores de ponto de raio a = 1 μm e espaçamento de 6 μm centro-centro. As setas de força de tração dentro da célula/aglomerado apontando para dentro em direção ao centro da célula devem estar presentes, enquanto a área fora da célula/cluster não deve ter setas de tração presentes (ver Figura 3C-E). Setas de tração apontando para fora de dentro da célula/cluster ou muitas grandes setas de tração presentes fora da célula são indicativas de uma grade retangular mal escolhida.
  5. Uma vez que o campo de tração correto seja encontrado, selecione uma região de interesse apropriada (ROI) ao redor da célula/cluster, que inclui todas as setas de tração dentro da célula usando o cursor.
    1. Para desenhar o ROI, clique à esquerda quantas vezes for necessário para desenhar uma forma de polígono com o máximo de lados desejado, ajuste a forma ou mova o ROI depois de desenhado pelo clique esquerdo nos cantos ou bordas, respectivamente. Uma vez que o ROI é desenhado, clique duplo à esquerda para passar para a próxima imagem na pilha. Repita isso para todas as imagens na pilha brightfield.
      NOTA: O código economizará dados de força de tração e deslocamento para cada ponto de tempo na mesma pasta que as pilhas de imagens originais, que podem então ser analisadas mais adiante.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Os hidrogéis PAA com o módulo young de E = 3,6 kPa e a razão de Poisson de ν = 0,445 foram feitos para uso por este método de micropatterning subtrativo. Os hidrogéis foram feitos para ter ~100 μm de espessura, o que permite que eles sejam imagens com a configuração de imagem usada aqui, ao mesmo tempo em que impedem que as células desenham o deslizamento rígido abaixo do gel, o que causaria problemas em estudos focados na rigidez celular dessensibilizando23,33. Géis de muitos outros níveis de rigidez (até 30 kPa) foram feitos com sucesso e imagedos usando o método de micropatterning indireto34, de modo que o método não se limita ao uso de apenas 3,6 kPa hidrogel. As tampas são tratadas com antecedência com glutaraldeído para permitir que o gel permaneça fixo à tampa inferior quando a mancha de cobertura padrão superior for removida (Figura 2C,D).

Para visualizar e medir as forças de tração celular dentro dos clusters, os hidrogéis de 3,6 kPa foram indiretamente padronizados com fibronectina fluorescente (Figura 2A-D) para criar padrões insulares de tamanho e forma predeterminados (Figura 2E). Outros tipos de proteínas também podem ser padronizadas nesses hidrogéis macios 21,35,36,37,38. A qualidade do padrão transferido está relacionada diretamente à fidelidade do molde mestre a partir do qual o selo PDMS é lançado. Moldes que tiveram delaminação SU-8 verão uma deterioração na qualidade dos padrões feitos a partir de selos lançados a partir desses moldes delaminados. Por exemplo, moldes com SU-8 delaminados muitas vezes criarão micropatterns contendo seções de fibronectina não reesqueada entre as ilhas predeterminadas. Se lançados em um gel, esses padrões permitem a fixação celular ao gel em áreas fora da micropattern ilha. Por causa disso, aglomerados de células de imagem ligados a padrões de ilhas totalmente ou principalmente intactos era a prioridade.

Células musculares lisas vasculares bovinas (BVSMCs) foram semeadas nesses hidrogéis a uma densidade de aproximadamente 60-80 × 103 células/gel para promover a formação de clusters e permitidas a adesão por 18-24 horas antes da imagem. Pouco antes dos experimentos, as células foram manchadas com uma mancha de núcleo de células vivas para permitir que as células vivas fossem identificadas e determinar o número de células em cada aglomerado. Ilhas micropattern com e sem células foram imagens e analisadas. Ilhas de imagem sem células permitiram o cálculo do ruído presente nos cálculos de força de tração para géis de 3,6 kPa. Essas medidas de deslocamento falso-positivas podem então ser usadas para determinar um valor de limiar adequado abaixo do qual os deslocamentos devem ser excluídos.

Verificou-se que 0,3 μm é geralmente suficiente para eliminar a infidelidade padrão que leva a medidas de deslocamento falso-positivas. Isso pode causar a perda de trações de baixa força, mas é essencial para remover trações falso-positivas. Quando a imagem, os aglomerados de células em padrões de ilhas praticamente intactos foram priorizados (ou seja, aqueles que não faltam muitos, se algum pontos) e principalmente padrões intactos sem células. Cada ROI foi imageado uma vez a cada 5 minutos por 2 h. O microscópio usado para capturar imagens de ambas as células e os géis PAA padronizados durante experimentos de timelapse estendido foi um microscópio de fluorescência com um estágio automático, uma fonte de luz de fluorescência, uma câmera e um software de microscópio padrão. Este microscópio tem um conjunto personalizado de filtros para observar muitas cores diferentes de fluorescência. O objetivo utilizado para visualizar as células e o hidrogel padronizado é um objetivo de imersão em água de 40x, NA = 1,15. Este microscópio também é equipado com uma temperatura personalizada (37 °C)-, umidade (70%)-, e sistema regulamentado por CO2 (5%) para manter as células viáveis durante longos experimentos.

Para calcular as forças de tração a partir das imagens das ilhas de micropattern, o software de análise de imagens foi usado para rastrear os deslocamentos dos pontos fluorescentes de fibronectina ao longo do tempo. Conhecendo os deslocamentos dos pontos fluorescentes e a rigidez do gel PAA sobre o qual os pontos são padronizados, o programa pode determinar os valores das forças de tração transmitidas por células individuais e aglomerados no substrato PAA. No entanto, existem duas maneiras pelas quais o programa se torna incapaz de determinar valores de tração. Se muitos pontos dentro de um determinado quadro de interesse forem deformados, o programa luta para calcular forças, já que o programa conta com a maioria dos pontos em uma imagem analisada para não ser deformado. Além disso, se dois pontos estiverem muito próximos um do outro (distância centro-centro de ≤2 μm20), os deslocamentos dos pontos individuais podem interferir uns com os outros, o que impede a determinação precisa de seus valores reais de deslocamento e, portanto, seus valores de tração. Enquanto os micropatterns forem projetados com pontos bem espaçados, as células não devem ser capazes de deslocar os pontos tanto que se tornam tão próximos, mesmo em substratos mais suaves.

A Figura 3 mostra as capacidades do método de padronização de remoção. Aqui, a capacidade deste método de fabricar padrões isolados e bem definidos de ilha de forma predeterminada é mostrada na Figura 3B-E, onde os pontos de adesão da fibronectina estão presentes apenas dentro da área desejada da ilha. Estas ilhas isoladas de pontos de adesão permitem ainda melhor controle da forma de cluster, como mostrado na Figura 3A. Como a forma e o tamanho das ilhas são consistentes, os aglomerados celulares que se prendem e crescem nelas também tenderão a ter forma consistente, já que os padrões da ilha limitam a área de crescimento do cluster. Finalmente, a Figura 3B-E também mostra a capacidade dessas ilhas de serem usadas para calcular forças de tração celular e a tendência dessas forças de tração mudarem ao longo do tempo. Aqui, as forças de tração do aglomerado são as maiores ao redor das bordas da ilha. Isso é esperado porque as células nas bordas de um aglomerado têm menos interações com outras células no aglomerado do que aquelas no interior do aglomerado. Assim, essas células nas bordas exercem maiores forças sobre o substrato em resposta à contração citoesquelético do que as células do interior.

Figure 1
Figura 1: Design de fotomask. (A) Uma representação da primeira metade do desenho de fotomasca usado aqui, uma grade discreta de pontos de 2 μm de diâmetro espaçados a 6 μm centro-a-centro. Enquanto a imagem mostrada aqui é apenas uma pequena parte do design, esta grade preenche um espaço de 1,5 x 1,5 cm total na fotomask. (B) Uma representação da segunda metade do desenho da máscara fotográfica; mostrado aqui são seis pequenas ilhas de 6 x 6 pontos. Na fotomask, há vários tamanhos diferentes de ilhas: 6 x 6 (mostrado aqui), 12 x 12, 25 x 25 e 42 x 42 pontos. Uma matriz igualmente espaçada (50 μm entre ilhas) de cada tamanho de ilha ocupa um espaço de 1,5 x 0,375 cm, e as matrizes de diferentes ilhas são separadas por 50 μm. Os pontos em cada ilha têm 2 μm de diâmetro e espaçados 6 μm centro a centro. As duas seções da máscara descritas em A e B são separadas por 0,75 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Impressão subtraída de microcontato. (A) Um selo PDMS é tratado com glutaraldeído e colocado em contato com um deslizamento de vidro uniformemente revestido com solução de fibronectina fluorescente. (B) Após a remoção da mancha de cobertura, o selo PDMS retira a maior parte da fibronectina fluorescente na superfície do deslizamento de cobertura, deixando pontos de proteína do tamanho de mícrons apenas em locais predeterminados pelo desenho do selo PDMS. (C) O deslizamento de cobertura padronizado é colocado em contato com uma solução de pré-iólio PAA e NHS. (D) Uma vez que o gel PAA tenha sido permitido polimerizar totalmente, o deslizamento superior é removido, e um padrão de fibronectina é impresso na superfície do gel PAA. (E) Um exemplo de um discreto padrão de ilha composto de pontos espaçados uniformemente em um hidrogel PAA com um módulo young de 3,6 kPa. Barra de escala = 20 μm. Abreviaturas: PDMS = polidimimetilsiloxano; PAA = poliacrilamida; NHS = N-hidroxisuccinimida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Análise de células em micropatterns insulares. (A) Uma imagem de campo brilhante de um aglomerado de 3 BVSMCs sobrepostos a uma micropattern da ilha de fibronectina fluorescente em um hidrogel PAA com um módulo de Young de 3,6 kPa é mostrada. Os pontos têm 2 μm de diâmetro e são separados por 6 μm de centro a centro. (B) O padrão fluorescente mostra que alguns dos pontos de fibronectina na ilha foram deslocados devido à aplicação de forças pelos BVSMCs. (C) As forças de tração aplicadas nos pontos de adesão no ponto de partida 1 (início de um experimento de 2h). A direção desses vetores de força é indicada pela direção das setas coloridas. Sua magnitude é indicada pela cor da seta e seu valor correspondente na barra de cor (todos os valores de força estão em nN). O comprimento do vetor é relativo com base nas forças mínimas e máximas calculadas pelo programa para cada ponto de tempo. (D) Forças de tração do mesmo cluster no ponto de tempo 13 (no meio de um experimento de 2 h) (E) Forças de tração do mesmo cluster no ponto de tempo 25 (fim de um experimento de 2 h). Abreviaturas = BVSMCs = células musculares lisas vasculares bovinas; PAA = poliacrilamida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Calculadora para rotulagem de fibronectina Esta é uma ferramenta para calcular a quantidade correta de corante fluorescente Alexa488 para usar ao rotular fibronectina. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo Suplementar 2: CTFTimelapse.m Este é o arquivo de processamento de imagem, que permite o cálculo das forças de tração celular conforme descrito na Seção 5 (Análise de Imagem). Isso inclui selecionar uma grade desejada de pontos (Etapas 6.3-6.3.2) e escolher a região de interesse para os cálculos ctf (Etapas 6.5 e 6.5.1). Todos os seguintes arquivos suplementares são chamados diretamente por este script ou uma das outras funções usadas dentro dele. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo Suplementar 3: analyze_initial_image_4.m Esta função é chamada por CTFTimelapse.m, e seu objetivo é localizar e alinhar os pontos fluorescentes em uma grade a partir do primeiro quadro da pilha de imagens do padrão de grade deformado para corresponder ao padrão original de grade não deformada. Isso permite cálculos de força de tração para o primeiro quadro na pilha de imagens. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo Suplementar 4: analyze_subsequent_images.m Esta função é chamada por CTFTimelapse.m, e seu objetivo é localizar e alinhar os pontos fluorescentes em uma grade de todos os quadros da pilha de imagens do padrão de grade deformado após o primeiro. Isso permite cálculos de força de tração para todos os quadros na pilha de imagens após o primeiro. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo Suplementar 5: bpass.m Esta função é chamada tanto por analyze_initial_image_4.m e analisar subsequent_images.m, e seu objetivo é implementar um filtro de bandpass de espaço real que processa a pilha de imagens do padrão de grade deformado. Este filtro suprime o ruído dos pixels e as variações de imagem de comprimento de onda longa, mantendo informações de um tamanho característico. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo Suplementar 6: CellBoundary.m Esta função é chamada por CTFTimelapse.m, e seu objetivo é que ele permite que o usuário do programa desenhe uma região de interesse em torno da célula/cluster para a qual as forças de tração devem ser calculadas. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo Suplementar 7: pkfnd.m Esta função é chamada tanto por analyze_initial_image_4.m quanto analyze_subsequent_images.m, e seu objetivo é encontrar maxima local em uma imagem com precisão no nível de pixel. Estes picos são usados por cntrd.m para localizar o padrão de grade fluorescente para CTFTimelapse.m. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo Suplementar 8: cntrd.m Esta função é chamada tanto por analyze_initial_image_4.m quanto analyze_subsequent_images.m, e seu objetivo é localizar o centroide de pontos brilhantes em uma imagem para precisão abaixo de pixels. Isso permite a localização do padrão da grade fluorescente pelo CTFTimelaspe.m, conforme descrito na Etapa 6.3. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo Suplementar 9: FourCorners.m Esta função é chamada tanto por analyze_initial_image_4.m quanto analyze_subsequent_images.m, e seu objetivo é pegar a grade escolhida pelo usuário (Passos 6.3-6.3.2) e calcular a distância entre cada ponto de canto em dois eixos ortogonais. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo Suplementar 10: track.m Esta função é chamada tanto por analyze_initial_image_4 e analyze_subsequent_images,m, e seu objetivo é acompanhar o movimento dos pontos no padrão de grade fluorescente entre os quadros, o que é essencial para o cálculo das forças de tração correspondentes. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Um método aprimorado de padronização indireta de hidrogéis PAA é descrito neste artigo. Essa abordagem baseia-se em métodos que já foram utilizados anteriormente 20,35,36,37,38,39,40,41,42. A principal mudança é que os selos PDMS são agora usados para remover proteínas e deixar o padrão desejado para trás no substrato intermediário, em vez de carimbar diretamente o padrão sobre ele. Isso permite a criação muito mais consistente de micropatterns de alta fidelidade e a criação de ilhas micropatteradas isoladas que antes necessitavam de duas etapas de produção. A forma e o tamanho dos padrões da ilha feitos com este método também são mais facilmente controlados do que aqueles feitos com o método anterior de duas etapas. A nova técnica é menos suscetível à quantidade de pressão aplicada durante a microimpressão do que a técnica antiga. Uma segunda vantagem é que este método de remoção pode fazer padrões de ilha de forma e tamanho controlados em apenas um passo. Em contraste, os métodos anteriores exigiam duas etapas para fazer ilhas, incluindo carimbo para deposição e carimbo subsequente para remoção, e as formas dessas ilhas são menos precisas do que as feitas com o método de remoção.

A principal desvantagem deste método é que a vida útil dos mestres usados para moldar o novo estilo de selos PDMS parece ser menor do que as usadas no método de carimbo anterior. Isso provavelmente pode ser atribuído à forma dos novos mestres usados no método de remoção. Os antigos mestres eram compostos por uma área de 1,5 x 1,5 cm de SU-8 composta de buracos circulares igualmente espaçados de 5 μm de profundidade, que quando lançados em PDMS, criariam selos compostos de postes cilíndricos igualmente espaçados da mesma altura. Por outro lado, os novos mestres são compostos por uma área de 1,5 x 1,5 cm de 5 μm de altura SU-8 postes cilíndricos, que, quando lançados em PDMS, fazem selos que são compostos de orifícios espaçados uniformemente.

Com essa mudança na estrutura dos mestres, descobriu-se que o SU-8 tende a ser delaminado da superfície muito mais facilmente do que no método antigo. Precauções foram tomadas para evitar isso, como tratar a superfície dos wafers de silício em um asher de plasma para torná-los mais favoráveis à ligação ao SU-8. A superfície dos wafers também foi silanizada antes do primeiro fundição em PDMS para evitar que o SU-8 grude no PDMS após a remoção dos selos. Apesar disso, a delaminação SU-8 dos wafers de silício foi observada após repetida fundição em PDMS, e deve-se ter cuidado para garantir que novos wafers de silício sejam feitos antes da perda do mestre atual. Uma maneira possível de evitar essa delaminação é usar o método PDMS de duplo elenco, que foi descrito anteriormente43, embora este outro método tenha suas limitações.

Outra deficiência deste método (e outros métodos que usam hidrogéis deformáveis para medir as forças de tração44) é que o campo de tração não está em equilíbrio mecânico devido ao ruído experimental. Assim, é necessária uma análise pós-processamento para obter um campo de tração equilibrado após a calculação das forças de tração. Uma maneira de equilibrar as forças de tração é obter as forças mais próximas das medidas que satisfazem o equilíbrio usando um método de menos quadrados. Como resultado, a magnitude e orientação das forças de tração medidas tornam-se alteradas45.

Há limitações para este método de calcular forças de tração celular. Para determinar com precisão as forças de tração celular usando Eq. (1) (etapa 5.4), o padrão deve ser projetado de tal forma que o deslocamento de um ponto de adesão não afete significativamente o deslocamento daqueles diretamente adjacentes a ele. Teoricamente, o deslocamento de uma região de adesão circular na superfície de um meio-espaço infinito devido a uma força tangencial agindo no centro diminui à medida que uma distância radial do centro do círculo aumenta23. Especificamente, para um substrato cuja razão de Poisson é ~0,445 (como os descritos aqui), o deslocamento na borda da região circular é de aproximadamente dois terços do deslocamento no centro da região. No entanto, as previsões teóricas não se estendem além da região circular. Assim, supõe-se que a tendência de diminuição da magnitude do deslocamento, determinada teoricamente23, continua além da borda do círculo de adesão. No projeto de micropattern descrito aqui, são utilizados 2 pontos circulares de 2 μm espaçados de 6 μm centro a centro. A razão para este espaçamento é que um deslocamento a uma distância de 6 μm do centro de um ponto é estimado em aproximadamente 1/12do deslocamento no centro do ponto, que se supõe ser pequeno o suficiente para afetar os valores de deslocamento dos pontos adjacentes. No entanto, é possível que as forças de tração exercidas pelas células possam deslocar os pontos de adesão em um substrato tanto que a distância centro-centro entre elas se torna inferior a 2 μm. Neste caso, a suposição sobre o deslocamento de pontos de adesão adjacentes não interferindo uns com os outros não se sustenta, e as forças de tração não podem ser calculadas com precisão com a equação dada na etapa 6.4 (Eq (1)).

A técnica proposta fornece uma ferramenta poderosa para medir forças de tração celular. Essas forças dão uma visão do ambiente mecânico de células individuais e aglomerados e podem ajudar a entender se e como diferentes tipos de células mantêm a estabilidade mecânica. Manter um nível homeostático de tensão celular é essencial para muitos processos celulares, e a perda dessa homeostase tensional tem sido associada a várias doenças, como aterosclerose, asma e câncer 9,10,12. A homeostase tensional é definida como a capacidade de uma célula ou de um aglomerado de células para manter um nível consistente de tensão, com uma baixa variabilidade temporal em torno de um set point46.

Este método de micropatterning indireto pode ser usado para determinar a capacidade de vários tipos de células para manter a homeostase tensional, tanto nos níveis individual quanto multicelular. Isso é feito rastreando mudanças nos valores do campo de tração celular ao longo do tempo e, em seguida, quantificando a flutuação temporal do campo de tração utilizando o coeficiente de variação (CV), o que representa essa razão do desvio padrão da magnitude do campo de tração ao seu valor médio. A soma das magnitudes das forças de tração e a magnitude do momento contratil (o primeiro momento das forças de tração) são usadas como métricas escalares da magnitude do campo de tração46. Se o CV do campo de tração permanecer próximo de zero durante um experimento timelapse, ele mostra que a célula/cluster manteve a homeostase tensional ao longo do tempo46.

Em resumo, este novo método de micropatterning indireto de hidrogéis macios oferece um método mais simples e eficiente de criar hidrogéis padronizados do que os métodos anteriores. Existem certos passos que podem ser dados para melhorar e expandir este método. Em primeiro lugar, melhorar o processo de fabricação dos mestres do silício de uma forma que prolongue sua vida útil eliminaria a desvantagem primária deste método de micropatterning. Quanto às formas de expandir este método, explorar diferentes formas insulares além das ilhas quadradas descritas aqui melhoraria a versatilidade deste método.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Paul Barbone, do Departamento de Engenharia Mecânica da Universidade de Boston, por discussões úteis e assistência com a análise de dados. Este estudo foi apoiado pela bolsa NSF CMMI-1910401.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-aminopropyl)trimethoxysilane Sigma Aldrich #281778
1.5 mL Microcentrifuge tube Fisher Scientific #05-408-129
15 mL conical tube Fisher Scientific #05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask Advance Reproductions Corporation N/A Custom-designed mask
6 Well Plates Fisher Scientific #07-200-83
Acetone Fisher Scientific #A18P-4
Acrylamide Solution, 40% Sigma Aldrich #A4058
AlexaFluor 488 Thermo Fisher #A20000
Aminonium Persulfate Fisher Scientific #BP179-25
Bisacrylamide Fisher Scientific #PR-V3141
Ethanol Greenfield Global #111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm round Fisher Scientifc #12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm round Warner #64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 Camera Hamamatsu #C10600-10B
Human Plasma Valley Biomedical #HP1051P Used to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 N Millipore Sigma #1.09057
ImageJ Wayne Rasband #1.53n
Interchangeable Coverslip Dish Set Bioptechs #190310-35
Kim Wipes Fisher Scientific #06-666-11C
Mask Alinger Karl Suss #MA6
Matlab 2021 Mathworks #R2021a
MetaMorph Basic Molecular Devices #v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide ester Sigma Aldrich #130672-5G
NucBlue Live Cell Stain Thermo Fisher #R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope Olympus #IX81
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare #52-1308-00
Photoresist Spinner Hood Headway Research #PWM32
Plasma Cleaner Harrick #PDC-001
Plasma Etcher TePla #M4L
Prior Lumen 200Pro Light Source Prior Scientific #L200
Silicon Wafers, 100 mm University Wafer #809
SU-8 2005 Kayaku Advanced Materials Inc. #NC9463827
SU-8 Developer Kayaku Advanced Materials Inc. #NC9901158
Sylgard 184 Silicone Elastomer Essex Brownell #DC-184-1.1
Tetramethylethylenediamine Fisher Scientific #BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma Aldrich #448931
UAPON-40XW340 Objective Olympus #N2709300
UV Flood Exposure Newport #69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm Ted Pella, Inc. #19395-40

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  2. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  3. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), 55172 (2013).
  4. Bhadriraju, K., et al. Activation of ROCK by RhoA is regulated by cell adhesion, shape, and cytoskeletal tension. Experimental Cell Research. 313 (16), 3616-3623 (2007).
  5. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  6. Ganz, A., et al. Traction forces exerted through N-cadherin contacts. Biology of the Cell. 98 (12), 721-730 (2006).
  7. Chopra, A., et al. Reprogramming cardiomyocyte mechanosensing by crosstalk between integrins and hyaluronic acid receptors. Journal of Biomechanics. 45 (5), 824-831 (2012).
  8. Winer, J. P., Chopra, A., Kresh, J. Y., Janmey, P. A. Substrate elasticity as a probe to measure mechanosensing at cell-cell and cell-matrix junctions. Mechanobiology of cell-cell and cell-matrix interactions. , Springer. Boston, MA. 11-22 (2011).
  9. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
  10. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS One. 7 (2), 32572 (2012).
  11. Lavoie, T. L., et al. Disrupting actin-myosin-actin connectivity in airway smooth muscle as a treatment for asthma. Proceedings of the American Thoracic Society. 6 (3), 295-300 (2009).
  12. Kraning-Rush, C. M., et al. Quantifying traction stresses in adherent cells. Methods in Cell Biology. 110, 139-178 (2012).
  13. Halliday, N. L., Tomasek, J. J. Mechanical properties of the extracellular matrix influence fibronectin fibril assembly in vitro. Experimental Cell Research. 217 (1), 109-117 (1995).
  14. Harris, A. K., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
  15. Aratyn-Schaus, Y., et al. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (46), e2173 (2010).
  16. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  17. Sniadecki, N. J., Chen, C. S. Microfabricated silicone elastomeric post arrays for measuring traction forces of adherent cells. Methods in Cell Biology. 83, 313-328 (2007).
  18. Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (4), 1484-1489 (2003).
  19. Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
  20. Polio, S. R., Smith, M. L. Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces. Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).
  21. Polio, S. R., et al. Topographical control of multiple cell adhesion molecules for traction force microscopy. Integrative Biology. 6 (3), 357-365 (2014).
  22. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
  23. Maloney, J. M., et al. Influence of finite thickness and stiffness on cellular adhesion-induced deformation of compliant substrata. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 78 (1), Pt 1 041923 (2008).
  24. Gilles, S. Chemical modification of silicon surfaces for the application in soft lithography. Technical Report Juel-4249. , Available from: https://www.osti.gov/etdeweb/biblio/21084355 (2007).
  25. Lim, K. B., Lee, D. C. Surface modification of glass and glass fibers by plasma surface treatment. Surface and Interface Analysis. 36, 254-258 (2004).
  26. Beal, J. H. L., Bubendorfer, A., Kemmitt, T., Hoek, I., Arnold, W. M. A rapid, inexpensive surface treatment for enhanced functionality of polydimethylsiloxane microfluidic channels. Biomicrifluidics. 6 (3), 36503 (2012).
  27. Goddard, J. M., Erickson, D. Bioconjugation techniques for microfluidic biosensors. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394 (2), 469-479 (2009).
  28. Rajagopalan, P., et al. Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata. Biophysical Journal. 87 (4), 2818-2827 (2004).
  29. Tang, X., Yakut Ali, M., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 3197-3206 (2012).
  30. Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2010).
  31. Rusmini, F., Zhong, Z., Feijen, J. Protein immobilization strategies for protein biochips. Biomacromolecules. 8 (6), 1775-1789 (2007).
  32. Polio, S. R., et al. A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8 (1), 82-88 (2012).
  33. Buxboim, A., et al. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
  34. Xu, H., et al. Focal adhesion displacement magnitude is a unifying feature of tensional homeostasis. Acta Biomaterialia. 113, 327-379 (2020).
  35. Shen, K., et al. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (22), 7791-7796 (2008).
  36. Eichinger, C. D., Hsiao, T. W., Hlady, V. Multiprotein microcontact printing with micrometer resolution. Langmuir. 28 (4), 2238-2243 (2012).
  37. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (22), e1065 (2008).
  38. Zollinger, A. J., et al. Dependence of tensional homeostasis on cell type and on cell-cell interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (3), 175-184 (2018).
  39. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Extending microcontact printing as a microlithographic technique. Langmuir. 13 (7), 2059-2067 (1997).
  40. Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  41. Rottmar, M., et al. Stem cell plasticity, osteogenic differentiation and the third dimension. Journal of Materials Science-Materials in Medicine. 21 (3), 999-1004 (2010).
  42. Desai, R. A., et al. Subcellular spatial segregation of integrin subtypes by patterned multicomponent surfaces. Integrative Biology. 3 (5), 560-567 (2011).
  43. Kim, S. H., Lee, S., Ahn, D., Park, J. Y. PDMS double casting method enabled by plasma treatment and alcohol passivation. Sensors and Actuators B: Chemical. 293, 115-121 (2019).
  44. Butler, J. P., Tolić-Nǿrrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  45. Canović, E. P., et al. Biomechanical imaging of cell stiffness and prestress with subcellular resolution. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 665-678 (2014).
  46. Stamenović, D., Smith, M. L. Tensional homeostasis at different length scales. Soft Matter. 16 (30), 6946-6963 (2020).

Tags

Bioengenharia Edição 180
Geração de Padrões para Microscopia de Tração de Micropattern
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bunde, K. A., Stamenović, D.,… More

Bunde, K. A., Stamenović, D., Smith, M. L. Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy. J. Vis. Exp. (180), e63628, doi:10.3791/63628 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter