Summary

Évaluation de la probabilité ouverte du pore de transition de perméabilité mitochondriale dans le cadre de l’excès de coenzyme Q

Published: June 01, 2022
doi:

Summary

Cette méthode exploite la contribution du pore de transition de perméabilité mitochondriale à la fuite de protons à faible conductance pour déterminer le seuil de tension pour l’ouverture des pores chez les souris atteintes du syndrome de l’X fragile néonatal avec une teneur accrue en coenzyme Q mitochondriale cardiomyocytaire par rapport au contrôle wildtype.

Abstract

Le pore de transition de perméabilité mitochondriale (mPTP) est un méga-canal de membrane mitochondriale interne (IMM) voltage-dépendant, non sélectif et important pour la santé et la maladie. Le mPTP médie la fuite de protons à travers l’IMM lors de l’ouverture à faible conductance et est spécifiquement inhibé par la cyclosporine A (CsA). La coenzyme Q (CoQ) est un régulateur de la mPTP, et des différences spécifiques aux tissus ont été trouvées dans la teneur en CoQ et la probabilité ouverte de la mPTP dans le cerveau antérieur et les mitochondries cardiaques dans un modèle murin nouveau-né du syndrome de l’X fragile (FXS, Fmr1 knockout). Nous avons développé une technique pour déterminer le seuil de tension pour l’ouverture mPTP dans cette souche mutante, en exploitant le rôle du mPTP en tant que canal de fuite de protons.

Pour ce faire, la consommation d’oxygène et le potentiel membranaire (ΔΨ) ont été mesurés simultanément dans des mitochondries isolées à l’aide de la polarographie et d’une électrode sélective d’ions tétraphénylphosphonium (TPP+) pendant la respiration des fuites. Le seuil d’ouverture du mPTP a été déterminé par l’apparition d’une inhibition médiée par la CsA de la fuite de protons à des potentiels membranaires spécifiques. En utilisant cette approche, les différences de tension gating du mPTP ont été définies avec précision dans le contexte de l’excès de CoQ. Cette nouvelle technique permettra d’étudier à l’avenir la compréhension de la régulation physiologique et pathologique de l’ouverture à faible conductance du mPTP.

Introduction

Le mPTP médie la transition de perméabilité (PT), par laquelle l’IMM devient brusquement perméable aux petites molécules et solutés 1,2. Ce phénomène frappant s’écarte nettement de l’imperméabilité caractéristique de l’IMM, qui est fondamentale pour établir le gradient électrochimique nécessaire à la phosphorylation oxydative3. La PT, contrairement à d’autres mécanismes de transport mitochondrial, est un processus à haute conductance, non spécifique et non sélectif, permettant le passage d’une gamme de molécules jusqu’à 1,5 kDa 4,5. Le mPTP est un canal dépendant de la tension au sein de l’IMM dont l’ouverture modifie ΔΨ, la production d’ATP, l’homéostasie du calcium, la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et la viabilité cellulaire4.

À l’extrême pathologique, l’ouverture incontrôlée et prolongée à haute conductance du mPTP entraîne l’effondrement du gradient électrochimique, le gonflement de la matrice, l’épuisement des nucléotides pyridine de la matrice, la rupture de la membrane externe, la libération de protéines intermembranaires (y compris le cytochrome c) et, finalement, la mort cellulaire 4,6. Une telle ouverture pathologique de la PTP a été impliquée dans une ischémie cardiaque-reperfusion, une insuffisance cardiaque, une lésion cérébrale traumatique, diverses maladies neurodégénératives et le diabète 1,7. Cependant, l’ouverture mPTP à faible conductance est de nature physiologique et, contrairement à l’ouverture à haute conductance, ne conduit pas à une dépolarisation profonde ou à un gonflement mitochondrial4.

L’ouverture à faible conductance du pore limite la perméabilité à ~300 Da, permet le passage de protons indépendamment de la synthèse de l’ATP et constitue une source potentielle de fuite physiologique deprotons 5. L’ouverture physiologique de la mPTP provoque un déclin contrôlé de ΔΨ, augmente le flux d’électrons à travers la chaîne de transport respiratoire et entraîne une courte rafale ou un flash de superoxyde, contribuant à la signalisation ROS8. La régulation d’une telle ouverture transitoire de mPTP est importante pour l’homéostasie du calcium et le développement et la maturation cellulaires normaux 4,9,10,11. L’ouverture transitoire des pores dans les neurones en développement, par exemple, déclenche la différenciation, tandis que la fermeture du mPTP induit la maturation dans les cardiomyocytes immatures 4,5.

Bien que l’importance fonctionnelle du PTPm dans la santé et la maladie soit bien établie, son identité moléculaire précise reste débattue. Les progrès réalisés dans la structure moléculaire et la fonction du PTPNm ont fait l’objet d’un examen approfondi ailleurs12. Brièvement, à l’heure actuelle, les états de conductance élevée et faible du PTP ont été supposés être médiés par des entités distinctes12. Les principaux candidats sont l’ATP synthase F1/F0 (ATP synthase) et le transporteur de nucléotides d’adénine (ANT) pour les modes de conductance élevée et faible, respectivement12.

Malgré l’absence de consensus concernant l’identité exacte de la composante formant des pores du PTP, certaines caractéristiques clés ont été détaillées. Une caractéristique bien établie du mPTP est qu’il est régulé par le gradient électrochimique tel que la dépolarisation de l’IMM conduit à l’ouverture des pores13. Des travaux antérieurs ont montré que l’état redox des groupes thiol vicinaux modifie la grille de tension du mPTP, de sorte que l’oxydation ouvre le pore à des ΔΨs relativement plus élevés, et que la réduction du groupe thiol entraîne une probabilité mPTP fermée14. Cependant, l’identité du capteur de tension protéique est inconnue.

Diverses petites molécules qui modulent la probabilité d’ouverture du pore ont été identifiées. Par exemple, le mPTP peut être stimulé pour s’ouvrir avec du calcium, du phosphate inorganique, des acides gras et des ROS et peut être inhibé par les nucléotides d’adénine (en particulier l’ADP), le magnésium, les protons et le CsA 5,12. Les mécanismes d’action de certains de ces régulateurs ont été élucidés. Le calcium mitochondrial déclenche l’ouverture de la mPTP au moins en partie en se liant à la sous-unité β de l’ATP synthase15. Ros peut activer le mPTP en diminuant son affinité pour l’ADP et en améliorant son affinité pour la cyclophiline D (CypD), l’activateur protéique mPTP le mieux étudié16. Le mécanisme d’activation du mPTP par le phosphate inorganique et les acides gras est moins clair. En ce qui concerne les inhibiteurs endogènes, on pense que l’ADP inhibe le mPTP en se liant à l’ANT ou à l’ATP synthase, tandis que le magnésium exerce son effet inhibiteur en déplaçant le calcium de son site de liaison 15,17,18,19.

Un pH bas inhibe l’ouverture de la mPTP en protonant l’histidine 112 de la sous-unité de la protéine régulatrice de la sensibilité à l’oligomycine (OSCP) de l’ATP synthase 12,20,21. L’inhibiteur pharmacologique prototypique du mPTP, CsA, agit en liant CypD et en empêchant son association avec OSCP22,23. Des travaux antérieurs ont également montré qu’une variété d’analogues de la CoQ interagissent avec le mPTP, l’inhibant ou l’activant24. Dans des travaux récents, nous avons trouvé des preuves d’une mPTP pathologiquement ouverte, d’une fuite excessive de protons et d’une phosphorylation oxydative inefficace due à un déficit en CoQ dans les mitochondries du cerveau antérieur des bébés souris FXSnouveau-nés 25.

La fermeture du pore avec de la CoQ exogène a bloqué la fuite pathologique de protons et induit la maturité morphologique des épines dendritiques25. Fait intéressant, chez les mêmes animaux, les cardiomyocytes FXS avaient des niveaux excessifs de CoQ et une probabilité de mPTP fermée par rapport aux témoins de type sauvage26. Bien que la cause de ces différences spécifiques aux tissus dans les niveaux de CoQ soit inconnue, les résultats soulignent le concept selon lequel la CoQ endogène est probablement un régulateur clé de la mPTP. Cependant, il existe une lacune majeure dans nos connaissances car le mécanisme d’inhibition médiée par la CoQ de la PTPm reste inconnu.

La régulation du mPTP est un déterminant essentiel de la signalisation cellulaire et de la survie4. Ainsi, la détection de l’ouverture de la mPTP dans les mitochondries est essentielle lorsque l’on considère des mécanismes physiopathologiques spécifiques. En règle générale, le seuil d’ouverture des pores à haute conductance est déterminé à l’aide de calcium pour déclencher la transition de perméabilité. Une telle charge en calcium entraîne l’effondrement du potentiel membranaire, le découplage rapide de la phosphorylation oxydative et le gonflement mitochondrial27,28. Nous avons cherché à développer une méthode pour détecter l’ouverture mPTP à faible conductance in situ, sans l’induire en soi.

L’approche exploite le rôle du mPTP en tant que canal de fuite de protons. Pour ce faire, des électrodes sélectives d’ions de type Clark et TPP+ ont été utilisées pour mesurer simultanément la consommation d’oxygène et le potentiel membranaire, respectivement, dans des mitochondries isolées pendant la respiration des fuites29. Le seuil d’ouverture du mPTP a été déterminé par l’apparition d’une inhibition médiée par la CsA de la fuite de protons à des potentiels membranaires spécifiques. En utilisant cette approche, les différences de tension du mPTP dans le contexte de l’excès de CoQ ont été définies avec précision.

Protocol

L’approbation du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Columbia University Medical Center a été obtenue pour toutes les méthodes décrites. Les souris FXS (Fmr1 KO) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J) et de contrôle (FVB) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ) utilisées comme systèmes modèles pour cette étude ont été acquises commercialement (voir la Table des matériaux). Cinq à onze animaux ont été u…

Representative Results

La consommation typique d’O2 et les courbes ΔΨ générées dans ces expériences sont montrées (Figure 1A,B). La baisse logarithmique du signal de tension avec l’étalonnage TPP+ est montrée au début de chaque expérience. L’absence de ce schéma logarithmique peut suggérer un problème avec l’électrode sélective TPP+. Les mitochondries génèrent généralement ΔΨ immédiatement après l’ajout au tampon respiratoire. ΔΨ…

Discussion

Cet article décrit une méthode pour évaluer la probabilité d’ouverture du mPTP. Plus précisément, le seuil de tension pour l’ouverture mPTP à faible conductance a été déterminé en évaluant l’effet de l’inhibition de CsA sur la fuite de protons sur une plage de ΔΨs. En utilisant cette technique, nous avons pu identifier des différences dans la grille de tension du mPTP entre les souris FXS et les contrôles FVB compatibles avec leurs différences dans la teneur en CoQ spécifique des tissus. Un él?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail est soutenu par les subventions suivantes : NIH/NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), Columbia University Irving Medical Center Target of Opportunity Provost award to the Department of Anesthesiology (K.K.G.), Society of Pediatric Anesthesia Young Investigator Research Award (K.K.G.), et NIH/NINDS R01NS112706 (R.J.L.)

Materials

4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Fisher Scientific 15630080
Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1 PP systems 941039
BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft. Fisher Scientific 14-170-11B to modify the length of the hamilton synringe as needed
Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free Sigma A7030-10G
Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm World Precision Inst. LLC DRIREF-2
Electrode Holder for KWIK-Tips World Precision Inst. LLC KWIK-2  ion selective electrode holder
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid  (EGTA) Sigma 324626
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME FXS mice, Fmr1 KO 
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME FVB mice
Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk Cole-Parmer EW-07938-30 microsyringe
Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle Cole-Parmer EW-07938-02 microsyringe
Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete PP systems OXYTHERM+R oxygen electrode and software
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma 1374248
Mannitol Sigma M9546-250G
P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A) Sigma D4022-10MG
Percoll Sigma P1644 medium for density gradient separation
Potassium chloride (KCl) Sigma P3911
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Sigma 5.43841
Sucrose Sigma S0389
TPP+ Electrode Tips (3) World Precision Inst. LLC TIPTPP

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Cite This Article
Griffiths, K. K., Wang, A., Levy, R. J. Assessment of Open Probability of the Mitochondrial Permeability Transition Pore in the Setting of Coenzyme Q Excess. J. Vis. Exp. (184), e63646, doi:10.3791/63646 (2022).

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