Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Avaliação da Probabilidade Aberta do Poro de Transição de Permeabilidade Mitocondrial na Configuração do Coenzyme Q Excesso

Published: June 1, 2022 doi: 10.3791/63646
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Anesthesiology, Columbia University Medical Center

Summary

Este método explora a contribuição do poro de transição de permeabilidade mitocondrial para o vazamento de prótons de baixa condução para determinar o limiar de tensão para abertura de poros em camundongos neonatais frágeis da síndrome X com aumento do teor de coenzyme mitocondrial de cardiomiocrata Q em comparação com o controle do tipo selvagem.

Abstract

O pore de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP) é um megacancanal de membrana mitocondrial interna (IMM) de tensão. O mPTP media o vazamento de prótons em todo o IMM durante a abertura de baixa condutância e é especificamente inibido pela ciclosporina A (CsA). Coenzyme Q (CoQ) é um regulador do mPTP, e diferenças específicas de tecido foram encontradas no conteúdo coq e probabilidade aberta do mPTP no cérebro e mitocôndrias cardíacas em um modelo de rato recém-nascido de síndrome X frágil (FXS, Fmr1 nocaute). Desenvolvemos uma técnica para determinar o limiar de tensão para abertura de mPTP nesta cepa mutante, explorando o papel do mPTP como um canal de vazamento de prótons.

Para isso, o consumo de oxigênio e o potencial de membrana (ΔΦ) foram medidos simultaneamente em mitocôndrias isoladas usando polarografia e um eletrodo seletivo de íons (TPP+) durante a respiração do vazamento. O limiar para abertura de MPTP foi determinado pelo início da inibição mediada por CsA do vazamento de prótons em potenciais específicos da membrana. Utilizando essa abordagem, as diferenças na tensão do mPTP foram precisamente definidas no contexto do excesso de CoQ. Esta nova técnica permitirá futura investigação para aprimorar a compreensão da regulação fisiológica e patológica da abertura de baixa condutura do MPTP.

Introduction

O mPTP media a transição de permeabilidade (PT), pela qual o IMM torna-se abruptamente permeável para pequenas moléculas e solutos 1,2. Este fenômeno marcante é uma partida distinta da impermeabilidade característica do IMM, que é fundamental para o estabelecimento do gradiente eletroquímico necessário para a fosforilação oxidativa3. Pt, ao contrário de outros mecanismos de transporte mitocondrial, é um processo de alta condução, não específico e não seletivo, permitindo a passagem de uma gama de moléculas de até 1,5 kDa 4,5. O mPTP é um canal fechado de tensão dentro do IMM cuja abertura altera ΔΦ, produção de ATP, homeostase de cálcio, produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e viabilidade celular4.

No extremo patológico, a abertura de alta condutância patológica e prolongada de mPTP leva ao colapso do gradiente eletroquímico, inchaço matricial, esgotamento de nucleotídeos matriciais de piridina, ruptura da membrana externa, liberação de proteínas intermembranas (incluindo citocromo c), e, finalmente, morte celular 4,6. Essa abertura patológica de MPTP foi implicada em lesão de isquemia cardíaca- reperfusão, insuficiência cardíaca, lesão cerebral traumática, várias doenças neurodegenerativas e diabetes 1,7. No entanto, a abertura de MPTP de baixa condução é de natureza fisiológica e, ao contrário da abertura de alta condução, não leva a uma profunda despolarização ou inchaço mitocondrial4.

A abertura de baixa condução do poro restringe a permeabilidade a ~300 Da, permite a passagem de prótons independentes da síntese de ATP, e é uma fonte potencial de vazamento fisiológico deprótons 5. A abertura fisiológica de MPTP causa um declínio controlado em ΔΦ, aumenta o fluxo de elétrons através da cadeia de transporte respiratório, e resulta em uma pequena explosão ou flash de superóxido, contribuindo para a sinalização ROS8. A regulação dessa abertura transitória de MPTP é importante para a homeostase de cálcio e desenvolvimento celular normal e maturaçãode 4,9,10,11. A abertura transitória de poros no desenvolvimento de neurônios, por exemplo, desencadeia diferenciação, enquanto o fechamento do mPTP induz o amadurecimento em cardiomiócitos imaturos 4,5.

Embora a significância funcional do PMP em saúde e doença seja bem estabelecida, sua identidade molecular precisa permanece debatida. O progresso na estrutura molecular e na função do MPTP foi amplamente revisto em outros lugares12. Resumidamente, atualmente, os estados de alta e baixa condução do MPTP têm sido considerados mediados por entidades distintas12. Os principais candidatos são o ATP de F1/F0 synthase (ATP synthase) e o transporte de nucleotídeos de adenina (ANT) para modos de alta e baixa condução, respectivamente12.

Apesar da falta de consenso quanto à identidade exata do componente formador de poros do MPTP, algumas características-chave foram detalhadas. Uma característica bem estabelecida do mPTP é que ele é regulado pelo gradiente eletroquímico de tal forma que a despolarização do IMM leva à abertura de poros13. Trabalhos anteriores mostraram que o estado redox dos grupos de thiol vicinal altera a tensão do mPTP, de tal forma que a oxidação abre o poro em ΔΦs relativamente maior, e a redução do grupo thiol resulta na probabilidade de mPTP14. No entanto, a identidade do sensor de tensão proteinácea é desconhecida.

Várias pequenas moléculas que modulam a probabilidade aberta do poro foram identificadas. Por exemplo, o mPTP pode ser estimulado a abrir com cálcio, fosfato inorgânico, ácidos graxos e ROS e pode ser inibido por nucleotídeos de adenina (particularmente ADP), magnésio, prótons e CsA 5,12. Os mecanismos de ação de alguns desses reguladores foram elucidados. O cálcio mitocondrial desencadeia a abertura do MPTP pelo menos em parte, vinculando-se à subunidade β do ATP synthase15. A ROS pode ativar o mPTP diminuindo sua afinidade com a ADP e aumentando sua afinidade com a ciclofilina D (CypD), o ativador mPTP proteináceo mais bem estudado16. O mecanismo de ativação do mPTP por fosfato inorgânico e ácidos graxos é menos claro. Quanto aos inibidores endógenos, acredita-se que a ADP iniba o mPTP por vinculação na ant ou atp synthase, enquanto o magnésio exerce seu efeito inibidor deslocando o cálcio de seu local de ligação 15,17,18,19.

O pH baixo inibe a abertura de mPTP protonando histidina 112 da subunidade de proteína de sensibilidade à oligomicina regulatória (OSCP) da ATP synthase 12,20,21. O prototípico inibidor farmacológico do mPTP, CsA, atua por vinculação de CypD e impedindo sua associação com a OSCP22,23. Trabalhos anteriores também mostraram que uma variedade de análogos de CoQ interagem com o mPTP, inibindo-o ou ativando-o24. Em trabalhos recentes, encontramos evidências de um mPTP patologicamente aberto, vazamento excessivo de prótons e fosforilação oxidativa ineficiente devido a uma deficiência de CoQ em mitocôndrias de cérebros de filhotes de camundongos FXS recém-nascidos25.

O fechamento do poro com CoQ exógeno bloqueou o vazamento patológico de prótons e induziu a maturidade morfológica das espinhas dendríticas25. Curiosamente, nos mesmos animais, os cardiomiócitos FXS apresentaram níveis excessivos de CoQ e probabilidade de MPTP fechado em comparação com os controles do tipo selvagem26. Embora a causa dessas diferenças específicas do tecido nos níveis de CoQ seja desconhecida, os achados ressaltam o conceito de que o CoQ endógeno é provavelmente um regulador-chave do mPTP. No entanto, há uma grande lacuna em nosso conhecimento porque o mecanismo de inibição mediada pelo CoQ do MPTP permanece desconhecido.

A regulação do MPTP é um determinante crítico da sinalização celular e sobrevivência4. Assim, detectar a abertura de MPTP dentro das mitocôndrias é fundamental quando se considera mecanismos fisiodicos específicos. Normalmente, o limiar para abertura de poros de alta condução é determinado usando cálcio para desencadear a transição de permeabilidade. Esse carregamento de cálcio leva ao colapso do potencial da membrana, ao desacoplamento rápido da fosforilação oxidativa e ao inchaço mitocondrial27,28. Buscamos desenvolver um método para detectar abertura de MPTP de baixa condução in situ, sem induzi-la por si só.

A abordagem explora o papel do mPTP como um canal de vazamento de prótons. Para isso, foram empregados eletrodos seletivos Clark-Type e TPP+ para medir simultaneamente o consumo de oxigênio e o potencial da membrana, respectivamente, em mitocôndrias isoladas durante a respiraçãodo vazamento 29. O limiar para abertura de MPTP foi determinado pelo início da inibição mediada por CsA do vazamento de prótons em potenciais específicos da membrana. Utilizando essa abordagem, foram precisamente definidas as diferenças de tensão do mPTP no contexto do excesso de CoQ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

A aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro Médico da Universidade de Columbia foi obtida para todos os métodos descritos. FXS (Fmr1 KO) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J) e controle (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ) foram adquiridos comercialmente (ver a Tabela dos Materiais). Cinco a onze animais foram utilizados em cada grupo experimental. Ratos pós-natal 10 (P10) foram usados para modelar por um ponto de tempo na infância humana.

1. Isolamento mitocondrial do coração do rato

  1. Prepare buffers para experimentos de isolamento mitocondrial e respiração, conforme descrito na Tabela 1. Armazene a 4 °C se for feita com antecedência.
    1. Prepare 15% de gradiente de densidade: diluir o gradiente de densidade comercial médio a 80% de volume/volume (v/v) com diluente gradiente de densidade. Diluir ainda mais 80% de gradiente de densidade médio 15% v/v adicionando tampão de isolamento mitocondrial (MI)/albumina de soro bovino (BSA).
  2. Isole mitocôndrias de tecido fresco, não congelado para esses experimentos e use no dia da preparação, normalmente dentro de cinco horas26. Realize todos os passos de isolamento no gelo.
    1. Decapite o rato e extiria o coração. Lave imediatamente 1-2 vezes em uma placa de Petri com MI/BSA gelada. Corte o átrio e pique o tecido.
    2. Transfira o tecido cardíaco picado para um homogeneizador de vidro contendo 1 mL de MI/BSA. Homogeneize com um pilão (A) mais solto (10 traçados), depois um pilão (B) mais apertado (10 traçados).
    3. Centrifugar a homogeneidade a 1.100 × g por 2 min a 4 °C para remover detritos nucleares e celulares.
    4. Pegue o supernatante suavemente sem tocar em nenhuma pelota macia, e cuidadosamente coloque-o em cima de 700 μL de 15% de gradiente de densidade em um tubo de centrífuga. Centrifugar a 18.500 × g para 15 min a 4 °C.
    5. Resuspenha a pelota em 1 mL de tampão de sacarose (SB)/BSA e centrifugado a 10.000 × g por 10 min a 4 °C.
    6. Remova e descarte completamente o supernatante. Resuspenha a pelota em SB/BSA para um volume final de 55 μL.
    7. Quantifique o teor de proteína mitocondrial usando um ensaio padrão, como o ensaio proteico bicinchonínico (BCA).

2. Consumo de oxigênio mitocondrial (O2) e ΔΦ

  1. Montagem e calibração do eletrodo de oxigênio
    1. Configure e calibrar o eletrodo de oxigênio (veja a Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
      1. Coloque uma queda de 50% da solução de cloreto de potássio (KCl) em cima da cúpula do disco de eletrodo.
      2. Coloque um pequeno pedaço ~2 cm2 espaçador de papel de cigarro coberto com um pedaço ligeiramente maior da membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) fornecida sobre a gota de eletrólito.
      3. Usando a ferramenta aplicadora fornecida, empurre o pequeno disco de eletrodo O-ring sobre a cúpula do eletrodo.
        NOTA: Certifique-se de que não há bolhas de ar e que a membrana é lisa.
    2. Cubra bem o reservatório com a solução de eletrólitos.
    3. Coloque bem o o-ring maior no recreio ao redor do disco de eletrodos.
    4. Instale o disco na câmara de eletrodos e conecte-o à unidade de controle.
    5. Adicione 2 mL de água desomada de ar à câmara de reação e ao ímã revestido de PTFE à câmara.
    6. Conecte a câmara à parte traseira da unidade de controle.
    7. Coloque a temperatura em 37 °C e a velocidade de agitação para 100.
    8. Deixe 10 min para que a temperatura do sistema se equilibre antes de iniciar a calibração.
    9. Na guia Calibração , selecione Calibração de fase líquida para realizar a calibração da fase líquida. Confirme se a temperatura está definida para 37 °C , a velocidade de agitação é de 100, e a pressão é definida para pressão atmosférica (101,32 kPa).
    10. Pressione OK e espere o sinal para planar.
    11. Quando um planalto é alcançado, pressione OK.
    12. Estabeleça zero O2 na câmara adicionando uma pequena quantidade (~20 mg) de dithionite de sódio.
    13. Pressione OK e espere o sinal para planar.
    14. Quando um platô é atingido, pressione Salvar para aceitar a calibração.
  2. Conjunto de eletrodos TPP+-seletivo
    1. Encha a ponta de eletrodo seletivo TPP+- com solução TPP de 10 mM utilizando a seringa fornecida e agulha flexível, tomando cuidado para evitar bolhas de ar.
    2. Monte o aparelho de eletrodo TPP+-seletivo, incluindo o eletrodo de referência e o suporte de eletrodos, (ver Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
    3. Brevemente, solte a tampa do suporte do eletrodo e insira o eletrodo de referência interna na ponta TPP+. Aperte a tampa para fixar a ponta. Conecte o cabo fornecido ao suporte do eletrodo e à porta auxiliar da caixa de controle.
    4. Insira o eletrodo seletivo TPP+e os eletrodos de referência no conjunto adaptado do êmbolo para eletrodos seletivos de íons. Conecte o eletrodo de referência à porta de referência da caixa de controle.
    5. Insira os eletrodos de abseleição e referência TPP+no conjunto adaptado do êmbolo para eletrodos seletivos de íons.
  3. Preparação da câmara de reação
    1. Adicione a mistura de reação à câmara de reação: 10 mM de succinato (substrato complexo II), rotenona de 5 μM (inibidor complexo I), 80 ng mL−1 nigericin (para colapsar pH gradiente em IMM), 2,5 μg mL-1 oligomicina (para induzir a respiração do estado 4) e tampão de reação de respiração (RB)/BSA tampão de reação a um volume final de 1 mL. Tome cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar na câmara.
    2. Feche a câmara com o conjunto de êmbolo adaptado com o TPP+-seletivo e o eletrodo de referência no lugar. Selecione GO para começar a gravar. Uma vez que a câmara esteja fechada, introduza reagentes adicionais diretamente na solução de reação usando microsiringes separados modificados com tubos plásticos para ajustar o comprimento da agulha.
  4. Calibração TPP+
    1. Uma vez obtido um sinal de tensão estável, calibrar o eletrodo TPP+-seletivo adicionando incrementos de 1 μM de uma solução TPP de 0,1 mM a uma concentração final de 3 μM. Observe que há um declínio logarítmico no sinal de tensão TPP+ a cada adição.
      NOTA: Calibrar o eletrodo TPP+-seletivo no início de cada experimento.
  5. Aquisição de dados
    1. Permita que os traços O2 e TPP+ se estabilizem e adicione 100 μg de mitocôndrias de cardiomiocócito recém-preparadas à câmara de reação a uma concentração final de 0,1 mg mL-1 através da porta de adição de reagente no conjunto do êmbolo. Observe a diminuição dos níveis de O2 na câmara à medida que as mitocôndrias se energizam e consomem O2 e o aumento abrupto do sinal de tensão TPP+ à medida que as mitocôndrias geram um potencial de membrana e tomam TPP+ da solução.
    2. Adicione 2,5 μg mL-1 oligomicina para induzir a respiração do estado 4.
      NOTA: As taxas de consumo O2 agora representarão a taxa de respiração de vazamento de prótons. A oligomicina pode ser adicionada à câmara de reação antes do TPP+ como alternativa.
  6. Avaliando a probabilidade aberta do mPTP
    1. Observe que ΔΦ declina ao longo do tempo durante a respiração do vazamento. Uma vez alcançado o ΔΦ desejado, adicione 1 μM CsA (inibidor de mPTP) à câmara de reação para avaliar a probabilidade aberta do mPTP naquele ΔΦ específico.
    2. Meça o efeito do CsA no consumo de O2 e ΔΦ antes e depois da adição de CsA
    3. Determine a dependência de tensão da abertura de mPTP variando o ΔΦ no qual csA é adicionado em experimentos sucessivos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

São mostradas as curvas típicas de consumo O2 e ΔΦ geradas nesses experimentos (Figura 1A,B). O declínio logarítmico no sinal de tensão com calibração TPP+ é mostrado no início de cada experimento. A ausência deste padrão logarítmico pode sugerir um problema com o eletrodo seletivo TPP+. Mitocôndrias normalmente geram ΔΦ imediatamente após a adição ao tampão respiratório. ΔΦ pode ser interpretado a partir de alterações na tensão TPP+ com base na equação de Nernst (razão logarítmica de [TPP+ dentro da matriz mitocondrial] para [TPP+])30. Note que o fisiológico ΔƏ aproxima o nível tpp+ de 2 μM da curva padrão. Os limiares de tensão foram assim definidos em relação ao padrão TPP+ de 2 μM (denotado como sinal de tensão Δ mV TPP+).

Por exemplo, "high ΔΦ" foi definido como ~Δ0 mV (no nível tpp+ de 2 μM), um "ΔΦ intermediário" foi definido em ~Δ5 mV (abaixo de 2 μM TPP+) e "baixo ΔΦ" foi definido em ~Δ10 mV (abaixo de 2 μM TPP+) (Figura 1A,B). Em experimentos piloto, mitocôndrias em Δ0 mV apresentaram probabilidade fechada 100% mPTP e aquelas em Δ10 mV apresentaram probabilidade 100% aberta; gráficos representativos são mostrados na Figura 1A,B. O limiar de Δ5 mV foi, portanto, arbitrariamente escolhido como um Δ Δ Δ. intermediário. Note que nesses experimentos, após a adição de mitocôndrias à câmara de reação, as mitocôndrias estão no estado 2 de respiração onde são expostas ao excesso de substrato. Mitocôndrias não são estimuladas a entrar no estado 3 com ADP; como resultado, uma vez que a oligomicina é adicionada, eles transitam diretamente para o estado 4 oligomicina (respiração de vazamento). Como resultado, uma diferença considerável no consumo de oxigênio normalmente não é observada após a adição de oligomicina, sugerindo que o synthase ATP contribui minimamente para a respiração durante o estado 2 (Figura 1A,B). Para avaliar o estado aberto ou fechado do mPTP, a taxa de consumo O2 e o potencial de membrana pouco antes e logo após a adição de CsA são comparadas (Figura 1C). Uma diminuição da taxa de consumo O2 e um aumento e estabilização de Δ Δ ª em resposta à CsA indicam o fechamento de um mPTP aberto (bloqueio de vazamento de prótons mediados poros) (Figura 1C, curvas pretas).

Quando o mPTP é fechado, não há queda na taxa de consumo O2 , e ΔΦ não aumenta e estabiliza, mas continua a cair (Figura 1C, curvas vermelhas). Os resultados experimentais demonstram probabilidades de MPTP fechados e abertos semelhantes em ΔIções altas e baixas, respectivamente, no controle FVB e mitocôndrias cardíacas FMR1 KO (Figura 1D). Esses achados são consistentes com propriedades conhecidas sensíveis à tensão do mPTP, onde o poro tende a ser fechado em ΔΦs altos e aberto aΔΔS baixos 13. Assim, utilizando este método, demonstramos de forma confiável a dependência usual de tensão do mPTP em ambas as cepas. Curiosamente, no limiar intermediário ΔΦ (limiar de Δ5 mV), mitocôndrias cardíacas fmr1 KO demonstraram aumento da probabilidade de mPTP fechado em comparação com os controles FVB (Figura 1D). Assim, as mitocôndrias cardíacas fmr1 ko demonstraram uma mudança na gating de tal forma que o poro exigiu um ΔΦ inferior para que a abertura fosse acionada. Isso é consistente com a constatação anterior de que os KOs fmr1 têm níveis elevados de CoQ e um mPTP26 relativamente fechado. Assim, o método identificou um limiar ΔΦ ideal para resolver diferenças na abertura do MPTP. É importante ressaltar que a definição desse limiar de ΔΦ permitirá uma investigação mais aprofundada para entender melhor como o CoQ regula o mPTP e como a deficiência de CoQ leva à abertura de poros patológicos no FXS.

Figure 1
Figura 1: Detecção de baixa condução mPTP probabilidade aberta. (A, B) Curvas representativas do consumo simultâneo de O2 (vermelho, os números são taxas em nmol de O2 mL-1 min-1 mg protein-1) com ΔΦ (preto, [TPP+]). Setas indicam a adição de TPP+, mitocôndrias, oligomicina e CsA. Limiares de alta, intermediária e baixa tensão em relação ao nível de calibração TPP+ de 2 μM são mostrados. A adição de CsA em limiares de tensão alto (A) e baixo (B) é mostrada. (C) Seção ampliada das curvas de consumo O2 (superior) e ΔΦ (inferior) em (A) e (B) no ponto de adição de CsA, ilustrando mPTP fechado (vermelho) em altas curvas ΔΦ (insensível ao CsA) e mPTP aberto (preto) no baixo Δ Δ (sensível ao CSA). (D) Os gráficos sumários de mPTP de status aberto e fechado em ΔΦs altos, baixos e intermediários são mostrados para controles FVB (preto) e FMR1 KOs (cinza). Cinco a 11 animais foram avaliados em cada limiar de ΔƏ; p os valores foram calculados utilizando-se um teste qui-quadrado, *p < 0,05. Abreviaturas: ΔΦ = potencial da membrana mitocondrial; mPTP = poros de transição de permeabilidade mitocondrial; TPP+ = tetrafenófosio; mito = mitocôndrias; oligo = oligomicina; CsA = ciclosporina A; ΔΨ = ; KO = nocaute. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Componente MI/BSA* SB/BSA* Diluente de Gradiente de Densidade RB/BSA*
Manitol 225 mM - - -
Sacarose 75 mM 250 mM 1 M 200 mM
HEPES 5 mM 5 mM 50 mM 5 mM
EGTA 1 mM 0,1 mM 10 mM -
Kcl - - - 25 mM
KH2PO4 - - - 2 mM
MgCl2 - - - 5 mM
pH** 7.4 7.4 - 7.2
BSA*** 0.10% 0.10% - 0.02%
AP5A*** - - - 30 mM

Tabela 1: Tampões e soluções.
* Filtrar através de filtros de 0,2 μm
**Ajuste o pH com hidróxido de potássio de 3 M conforme necessário.
Denota componentes tampão que são adicionados pouco antes do isolamento mitocondrial.
Abreviaturas: MI = tampão de isolamento mitocondrial; SB = tampão de sacarose; RB = Tampão de respiração; BSA = albumina de soro bovino livre de ácido graxo; HEPES = 4-(2-hidroxiilo)-1-piperazineethanethanesulfônico; EGTA = etileno glicol-bis (β-aminoetil éter)-N,N,N′,N′,N′-tetraacético ácido; KCl = cloreto de potássio; KH2PO4 = fosfato de dihidrogênio de potássio; MgCl2 = cloreto de magnésio; AP5A = P1,P5-diadenosina-pentafosfato pentafosfato pentasofeno pentasofeno.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Este artigo descreve um método para avaliar a probabilidade aberta do mPTP. Especificamente, o limiar de tensão para abertura de mPTP de baixa condução foi determinado pela avaliação do efeito da inibição de CsA no vazamento de prótons sobre uma gama de ΔΦs. Usando esta técnica, pudemos identificar diferenças na tensão do mPTP entre camundongos FXS e controles FVB consistentes com suas diferenças no conteúdo coQ específico do tecido. Fundamental para o sucesso dessa metodologia é que as mitocôndrias são recém-isoladas antes do uso e são de boa qualidade. Mitocôndrias que são danificadas durante o isolamento ou muito velhas não serão capazes de gerar ΔΦ apropriada e normalmente serão desacopladas. Observe que, embora o pH da matriz normalmente contribua para a força motivo do próton, a nigericina é usada para colapsar ΔpH em todo o IMM nesses experimentos, como descrito anteriormente em protocolos padrão que avaliam o vazamento de prótons29. Portanto, neste caso, a força motivo do próton é equivalente a ΔΦ, o que simplifica a abordagem experimental.

Outra consideração importante é que alguns dos inibidores usados na mistura de respiração (como rotenona, oligomicina e CsA) são difíceis de enxaguar entre experimentos porque aderem a superfícies plásticas da câmara de reação, incluindo os eletrodos seletivos de íons. A câmara deve ser lavada rotineiramente com etanol e uma suspensão de mitocôndrias congeladas preparadas para "limpar" esses inibidores da câmara e reduzir a probabilidade de transporte inibidor que pode afetar a reprodutibilidade de experimentos.

Como as mitocôndrias devem estar recém preparadas para manter sua integridade, este método não é aceitável para análises de alto rendimento. Além disso, quantidades relativamente grandes de mitocôndrias são necessárias para cada experimento. Normalmente, para animais P10, mitocôndrias suficientes podem ser isoladas de um órgão para realizar um único experimento. Portanto, testar condições diferentes no mesmo lote de mitocôndrias geralmente não é possível. Se os experimentos forem realizados com animais mais velhos, essa limitação é menos um problema, dado o tamanho relativamente maior de tecidos e órgãos.

Existem vários métodos bem descritos para estudar a probabilidade aberta do MPTP em mitocôndrias intactas isoladas. Técnicas, como o inchaço da matriz mitocondrial e os ensaios de capacidade de carga ou retenção de cálcio, necessariamente desencadeiam o PT de alta condução e, portanto, não permitem o estudo da abertura fisiológica de baixa condutância que é de interesse nesses experimentos28. A técnica de remendo fornece um método poderoso e direto para estudar a dependência de tensão de estados de alta ou baixa condução do mPTP31,32. No entanto, é uma técnica trabalhosa, onde apenas uma única mitocôndria e uma única condição experimental podem ser estudadas de cada vez, o que dificultaos estudos comparativos 32,33.

Além disso, a membrana mitocondrial externa é tipicamente linseada, e a membrana mitocondrial interna é tipicamente rompida nos métodos de remendo utilizados para mitocôndrias isoladas, o que pode resultar na perda de fatores regulatórios mPTP que não estão intimamente associados com o IMM31. A abertura de baixa condutura do mPTP também tem sido estudada usando uma variedade de técnicas de fluorescência tipicamente empregando um éster de tetrametilrhodamina (para avaliar alterações em ΔΦ) sozinho ou em combinação com calceína, cuja fluorescência intramitocondrial é suscetível à saciação de cobalto quando o mPTP está aberto 8,34. No entanto, em abordagens baseadas em fluorescência, como as mudanças em Δ Δ São expressas como mudanças relativas na fluorescência, a abordagem normalmente não permite uma medição precisa de ΔΦ 8,34.

Este método fornece uma nova abordagem alternativa para avaliar a abertura de baixa condutura do mPTP em relação ao ΔΦ. Por meio dessa abordagem, os pesquisadores podem estudar a regulação da tensão fisiológica e patológica do MPTP. Essa técnica também promete ajudar a entender o papel do desenvolvimento do MPTP na maturação de órgãos, pois pode ser aplicado a diversos tecidos e diferentes estágios de desenvolvimento. Esta abordagem pode ser facilmente aplicada ao estudo da gating de tensão do mPTP no tecido de cérebro do rato FXS, que anteriormente exibia níveis de CoQreduzidos 25. Além disso, propomos que essa técnica também possa ser usada para estudar como outros agentes, endógenos ou exógenos, impactam a tensão do mPTP. Assim, será uma ferramenta útil para ampliar a compreensão da contribuição do MPTP para a saúde e a doença.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Acknowledgments

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Fisher Scientific 15630080
Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1 PP systems 941039
BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft. Fisher Scientific 14-170-11B to modify the length of the hamilton synringe as needed
Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free Sigma A7030-10G
Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm World Precision Inst. LLC DRIREF-2
Electrode Holder for KWIK-Tips World Precision Inst. LLC KWIK-2  ion selective electrode holder
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid  (EGTA) Sigma 324626
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME FXS mice, Fmr1 KO 
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME FVB mice
Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk Cole-Parmer EW-07938-30 microsyringe
Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle Cole-Parmer EW-07938-02 microsyringe
Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete PP systems OXYTHERM+R oxygen electrode and software
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma 1374248
Mannitol Sigma M9546-250G
P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A) Sigma D4022-10MG
Percoll Sigma P1644 medium for density gradient separation
Potassium chloride (KCl) Sigma P3911
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Sigma 5.43841
Sucrose Sigma S0389
TPP+ Electrode Tips (3) World Precision Inst. LLC TIPTPP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rasola, A., Bernardi, P. The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis. Apoptosis. 12 (5), 815-833 (2007).
  2. Szabó, I., Zoratti, M. The mitochondrial megachannel is the permeability transition pore. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 24, 111-117 (1992).
  3. Brand, M., Ferguson, S., Nunnari, J., Kühlbrandt, W. Molecular Biology of the Cell. Alberts, B., et al. 14, Garland Science. Chapter 14 767-830 (2002).
  4. Perez, M. J., Quintanilla, R. A. Development or disease: duality of the mitochondrial permeability transition pore. Developmental Biology. 426 (1), 1-7 (2017).
  5. Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metabolism. 21 (2), 206-214 (2015).
  6. Javadov, S., Kuznetsov, A. Mitochondrial permeability transition and cell death: the role of cyclophilin d. Frontiers in Physiology. 4, 76 (2013).
  7. Dorn, G. W. Mechanisms of non-apoptotic programmed cell death in diabetes and heart failure. Cell Cycle. 9 (17), 3442-3448 (2010).
  8. Boyman, L., et al. Dynamics of the mitochondrial permeability transition pore: Transient and permanent opening events. Archives of Biochemistry and Biophysics. 666, 31-39 (2019).
  9. Hom, J. R., et al. The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte differentiation. Developmental Cell. 21 (3), 469-478 (2011).
  10. Hou, Y., et al. Mitochondrial superoxide production negatively regulates neural progenitor proliferation and cerebral cortical development. Stem Cells. 30 (11), 2535-2547 (2012).
  11. Elrod, J. W., et al. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca(2+) exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3680-3687 (2010).
  12. Bonora, M., Giorgi, C., Pinton, P. Molecular mechanisms and consequences of mitochondrial permeability transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2021).
  13. Bernardi, P. Modulation of the mitochondrial cyclosporin A-sensitive permeability transition pore by the proton electrochemical gradient. Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization. Journal of Biological Chemistry. 267 (13), 8834-8839 (1992).
  14. Petronilli, V., et al. The voltage sensor of the mitochondrial permeability transition pore is tuned by the oxidation-reduction state of vicinal thiols. Increase of the gating potential by oxidants and its reversal by reducing agents. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16638-16642 (1994).
  15. Giorgio, V., et al. Ca(2+) binding to F-ATP synthase beta subunit triggers the mitochondrial permeability transition. European Molecular Biology Organization Reports. 18 (7), 1065-1076 (2017).
  16. Halestrap, A. P., Woodfield, K. Y., Connern, C. P. Oxidative stress, thiol reagents, and membrane potential modulate the mitochondrial permeability transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase. Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3346-3354 (1997).
  17. Szabo, I., Bernardi, P., Zoratti, M. Modulation of the mitochondrial megachannel by divalent cations and protons. Journal of Biological Chemistry. 267 (5), 2940-2946 (1992).
  18. Karch, J., et al. Inhibition of mitochondrial permeability transition by deletion of the ANT family and CypD. Science Advances. 5 (8), (2019).
  19. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  20. Antoniel, M., et al. The unique histidine in OSCP subunit of F-ATP synthase mediates inhibition of the permeability transition pore by acidic pH. European Molecular Biology Organization Reports. 19 (2), 257-268 (2018).
  21. Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Archives of Biochemistry and Biophysics. 195 (2), 460-467 (1979).
  22. Halestrap, A. P., Connern, C. P., Griffiths, E. J., Kerr, P. M. Cyclosporin A binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury. Molecular and Cellular Biochemistry. 174 (1-2), 167-172 (1997).
  23. Giorgio, V., Fogolari, F., Lippe, G., Bernardi, P. OSCP subunit of mitochondrial ATP synthase: role in regulation of enzyme function and of its transition to a pore. British Journal of Pharmacology. 176 (22), 4247-4257 (2019).
  24. Fontaine, E., Ichas, F., Bernardi, P. A ubiquinone-binding site regulates the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Biological Chemistry. 273 (40), 25734-25740 (1998).
  25. Griffiths, K. K., et al. Inefficient thermogenic mitochondrial respiration due to futile proton leak in a mouse model of fragile X syndrome. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 34 (6), 7404-7426 (2020).
  26. Barajas, M., et al. The newborn Fmr1 knockout mouse: a novel model of excess ubiquinone and closed mitochondrial permeability transition pore in the developing heart. Pediatric Research. 89 (3), 456-463 (2021).
  27. Parks, R. J., Murphy, E., Liu, J. C. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 11 187-196 (2018).
  28. Carraro, M., Bernardi, P. Measurement of membrane permeability and the mitochondrial permeability transition. Methods in Cell Biology. 155, 369-379 (2020).
  29. Affourtit, C., Wong, H., Brand, M. D. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 9 157-170 (2018).
  30. Teodoro, J. S., Palmeira, C. M., Rolo, A. P. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 6 109-119 (2018).
  31. Neginskaya, M. A., Pavlov, E. V., Sheu, S. S. Electrophysiological properties of the mitochondrial permeability transition pores: Channel diversity and disease implication. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1862 (3), 148357 (2021).
  32. Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241 (2), 139-176 (1995).
  33. Yajuan, X., Xin, L., Zhiyuan, L. A comparison of the performance and application differences between manual and automated patch-clamp techniques. Current Chemical Genomics. 6, 87-92 (2012).
  34. Petronilli, V., et al. Transient and long-lasting openings of the mitochondrial permeability transition pore can be monitored directly in intact cells by changes in mitochondrial calcein fluorescence. Biophysical Journal. 76 (2), 725-734 (1999).

Tags

Biologia Edição 184
Avaliação da Probabilidade Aberta do Poro de Transição de Permeabilidade Mitocondrial na Configuração do Coenzyme Q Excesso
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Griffiths, K. K., Wang, A., Levy, R. … More

Griffiths, K. K., Wang, A., Levy, R. J. Assessment of Open Probability of the Mitochondrial Permeability Transition Pore in the Setting of Coenzyme Q Excess. J. Vis. Exp. (184), e63646, doi:10.3791/63646 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter