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Biology

Ablação Mediada por Nitroreductase/Metronidazole e uma Plataforma MATLAB (RpEGEN) para estudar a regeneração do Pigmento Retinal de Zebrafish Epithelium

Published: March 2, 2022 doi: 10.3791/63658

Summary

Este protocolo descreve a metodologia para abolar geneticamente o epitélio pigmento da retina (RPE) usando um modelo transgênico de zebrafish. A adaptação do protocolo para incorporar a modulação da via de sinalização usando compostos farmacológicos é extensivamente detalhada. Uma plataforma MATLAB para quantificar a regeneração de RPE com base na pigmentação foi desenvolvida e é apresentada e discutida.

Abstract

O epitélio pigmento da retina (RPE) reside na parte de trás do olho e desempenha funções essenciais para manter a saúde e integridade dos tecidos adjacentes da retina e vascular. Atualmente, a capacidade reparativa limitada do RPE mamífero, que se restringe a pequenas lesões, tem dificultado o progresso na compreensão dos processos regenerativos in vivo RPE. Aqui, uma metodologia detalhada é fornecida para facilitar o estudo do reparo in vivo RPE utilizando o zebrafish, um modelo de vertebrado capaz de regeneração robusta do tecido. Este protocolo descreve um paradigma de lesão mediada por nitroreductase/metronidazol (NTR/MTZ) (rpe65a:nfsB-eGFP), que resulta em ablação dos dois terços centrais do RPE após tratamento de 24 horas com MTZ, com posterior recuperação tecidual. O foco é colocado em ablações de RPE em zebrafish larval e métodos para testar os efeitos de compostos farmacológicos na regeneração de RPE também são descritos. Também é discutida a geração e validação do RpEGEN, um script MATLAB criado para automatizar a quantificação da regeneração de RPE com base na pigmentação. Além dos mecanismos ativos de reparação de RPE, este protocolo pode ser expandido para estudos de degeneração de RPE e respostas de lesões, bem como os efeitos dos danos de RPE em tecidos adjacentes da retina e vascular, entre outros processos celulares e moleculares. Este sistema de zebrafish mantém uma promessa significativa na identificação de genes, redes e processos que impulsionam a regeneração do RPE e mecanismos relacionados à doença de RPE, com o objetivo de longo prazo de aplicar esse conhecimento a sistemas de mamíferos e, em última instância, ao desenvolvimento terapêutico.

Introduction

A metodologia aqui descrita detalha um protocolo para abolar geneticamente o epitélio pigmento da retina (RPE) utilizando zebrafish larval. O RPE se estende sobre a parte de trás do olho e reside entre as camadas estratificadas da retina neural e a camada de vasculatura que constitui o coroide. Suporte trófico, absorção de luz fototóxica e manutenção de proteínas do ciclo visual são apenas algumas das funções críticas que o RPE desempenha que são essenciais para sustentar a saúde e a integridade desses tecidos adjacentes1. Os danos ao RPE mamífero são reparáveis quando as lesões são pequenas2; no entanto, os danos sofridos por lesões maiores ou doenças degenerativas progressivas são irreversíveis. Em humanos, as doenças degenerativas de RPE (por exemplo, degeneração macular relacionada à idade (AMD) e doença de Stargardt levam à perda permanente da visão e, com poucas opções de tratamento disponíveis, diminuíram a qualidade de vida do paciente. A capacidade limitada de rpe mamífero para auto-reparação criou uma lacuna de conhecimento no campo dos processos regenerativos RPE. Dada a robusta capacidade regenerativa do zebrafish em muitos tipos diferentes de tecidos, este protocolo foi desenvolvido para estabelecer um sistema de vertebrados in vivo para facilitar estudos sobre a regeneração intrinseca do RPE e descobrir mecanismos que conduzem essa resposta. Usando o paradigma de ablação aqui descrito, a via de sinalização canônica Wnt3, a via mTOR4 e as respostas relacionadas à imunidade5 foram identificadas como mediadoras críticas da regeneração de RPE, provavelmente com funções sobrepostas.

Neste paradigma de ablação genética, o gene Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 zebrafish expressam o gene nitroreductase derivado da bactéria (NTR/nfsB)6 fundido ao eGFP sob controle do elemento melhorador RPE, rpe65a7. A ablação é alcançada adicionando o pró-drogas, metronidazol (MTZ), ao sistema de água que abriga zebrafish. A ativação intracelular de MTZ por nitroreductase resulta em cruzamento de DNA e apoptose em células expressasNTR/nfsB 8,9. Esta tecnologia tem sido amplamente utilizada em zebrafish para ablate células da retina 10,11,12,13 e outros tecidos 8. Juntos, esses elementos permitem a expressão direcionada (rpe65a) de uma metodologia de ablação celular indutível (NTR/MTZ)8,9 e um marcador fluorescente (eGFP) para visualização.

Outros modelos in vivo interessantes também existem que podem ser usados para estudar o potencial regenerativo do RPE14. Estes são amplos e incluem a transdiferenteição RPE-para-retina pós-retinoctomia em anfíbios, nos quais as células RPE perdidas para o recrescimento da retina são substituídas15,16; Restauração RPE pós-lesão no mouse MRL/MpJ "super curativo"17; e estimulação exógena da proliferação de RPE em um modelo de rato de RPE espontânea e degeneração da retina18, entre outros. Modelos in vitro, como células-tronco RPE humanas adultas (RPESCs)19 também foram desenvolvidos. Esses modelos são ferramentas valiosas que trabalham para desvendar os processos celulares relacionados à regeneração de RPE (por exemplo, proliferação, diferenciação, etc.); no entanto, o zebrafish é único em sua capacidade de reparo de RPE intrínseco pós-ablação.

Enquanto a metodologia aqui é escrita para focar na compreensão dos mecanismos que impulsionam a regeneração do RPE, a linha Tg(rpe65a:nfsB-eGFP) e este protocolo de ablação genética poderiam ser utilizados para estudar outros processos celulares, como apoptose RPE, degeneração RPE e o efeito da lesão de RPE em tecidos de retina e vascular adjacentes. O protocolo de ablação também pode ser modificado para incluir manipulação farmacológica, que é uma estratégia preliminar conveniente para rastrear caminhos de sinalização de interesse. Por exemplo, bloquear a via canônica Wnt usando o Inibidor do Wnt Response-1 (IWR-1)20, mostrou-se prejudicado a regeneração de RPE3. Isso foi repetido aqui para orientar os usuários através de um experimento de manipulação farmacológica e servir como prova de conceito para validar um script MATLAB (RpEGEN) criado para quantificar a regeneração de RPE com base na recuperação da pigmentação. Como a linha transgênica e o protocolo de ablação, os scripts RpEGEN são adaptáveis e podem ser usados para quantificar outros marcadores/processos celulares dentro do RPE.

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Protocol

Todas as metodologias aqui descritas estão em conformidade com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Pittsburgh.

1. Preparação antes da coleta de embriões de zebrafish

  1. Coloque a incubadora de embriões a 28,5°C.
  2. Prepare uma solução de estoque de 25x do inibidor de melanogênese, N-phenylthiourea (PTU)21,22. Esta solução de estoque é dimensionada a partir de uma receita comum22 e 1x é igual a 0,003% de peso por volume (% w/v) (por exemplo, 0,003 g de ptu em pó em 100 mL de solvente líquido).
    1. Para fazer uma grande solução de estoque PTU de 25x, adicione 0,75 g de ptu em pó a 1 L de água desionizada purificada (doravante chamada dH2O) e misture bem à temperatura ambiente (~25 °C) usando uma barra de mexida e placa de mexida. Armazene a 4°C por até 3 meses protegido contra a luz.
      NOTA: É difícil fazer com que a PTU entre em solução aquosa e pode ser necessária agitação prolongada durante a noite.
      ATENÇÃO: A PTU é perigosa e deve ser tomada cuidado para evitar a ingestão, inalação e/ou contato com a pele ou os olhos. O pó ptu e todos os derivados líquidos ptu descritos aqui podem precisar ser descartados como resíduos químicos, dependendo das regulamentações estaduais e institucionais. Recomenda-se a confirmação dos métodos adequados de eliminação de resíduos de PTU, se houver, antes do uso.
    2. Para fazer uma solução de trabalho ptu de 1,5x (doravante referida como 1,5x PTU), adicione 60 mL de solução de estoque ptu de 25x a 940 mL de água do centro de habitação de zebrafish (doravante chamada de água do sistema). Os parâmetros ideais de qualidade da água para os zebrafish foram descritos23 e as instalações aquáticas devem ter procedimentos padrão de monitoramento da água. Armazene 1,5x PTU a 28,5°C por 1-2 semanas protegido contra a luz.
      NOTA: Este protocolo é realizado rotineiramente usando as concentrações de PTU, solventes e parâmetros de armazenamento descritos na etapa 1.2. Como precaução, embriões/larvas devem ser observados a cada 1-2 dias enquanto em PTU para validar a eficácia e confirmar a despigmentação sustentada. As condições de dissolução e/ou armazenamento devem ser otimizadas se houver diminuição da solubilidade/eficácia do PTU.
  3. Prepare uma solução de estoque de 0,05% w/v azul de metileno, um inibidor de crescimento fúngico, adicionando 0,05 g de pó azul de metileno a 100 mL de dH2O. Misture bem usando uma barra de mexida e stir plate. Armazene a 4°C.
  4. Prepare pipetas para manipulação de embriões/larvas (por exemplo, embriões/larvas móveis entre placas de Petri, separando larvas durante a triagem de fluorescência, coletando larvas eutanizadas em tubos de microcentrifuge para fixação, etc.) cortando a extremidade afilada de uma pipeta pasteur de vidro usando uma caneta de assinatura de ponta de diamante. Etch em torno da circunferência da pipeta com a caneta de diamante e puxe suavemente ou estaque a extremidade para fazer uma ruptura limpa.
    NOTA: A boca da pipeta deve ser lisa e larga o suficiente para facilmente ocupar um embrião ainda dentro do chorão sem tesourar. Use uma pipeta de transferência de desenho de lâmpada como alternativa. As pipetas preparadas também podem ser usadas para remover líquido durante as alterações de água (em vez de derramar) para minimizar a perda de embriões/larvas.
  5. Prepare uma solução de 4% paraformaldeído (PFA) em 1x salina tamponada de fosfato (PBS) (por exemplo, adicione 10 mL de 16% PFA a 4 mL de PBS 10x e 26 mL de dH2O). Armazene a 4°C por até 4 semanas protegido contra a luz.
    ATENÇÃO: O paraformaldeído é um produto químico perigoso e deve ser manuseado em um capô de fumaça química e descartado corretamente. Deve-se tomar cuidado e devem ser usados equipamentos de proteção individual (EPI) para evitar ingestão, inalação e/ou contato com a pele ou os olhos.

2. Coleta e manutenção de embriões de zebrafish antes da ablação genética (0-5 dias após a fertilização)

  1. Mantenha o zebrafish adulto como descrito anteriormente 3,4,5. À tarde/noite antes da coleta de embriões, separe os zebrafish adultos em tanques de reprodução para desova.
  2. Na manhã seguinte (0 dias após a fertilização (dpf)), colete embriões em placas de Petri de 10 cm de diâmetro na água do sistema e remova todos os ovos inviáveis ou não fertilizados, que parecerão opacos e/ou apresentarão citoplasma irregular e decotefalhou 24.
    NOTA: Eventos normais de decote e estágio de desenvolvimento serão aparentes em embriões saudáveis como descrito25. As placas de petri devem ser mantidas três quartos cheias (~30 mL para uma placa de 10 cm de diâmetro) durante todo o protocolo.
    1. Adicione duas gotas de 0,05% w/v azul de metileno em cada placa de Petri, misture suavemente e armazene embriões a 28,5°C para o restante do protocolo.
  3. Em torno de 6h pós-fertilização (hpf)4,5,26, substitua a água do sistema em pratos petri embrião por 1,5x PTU (solução de trabalho feita na etapa 1.2.2) e reponha o azul de metileno.
    NOTA: A PTU deve ser adicionada aos embriões antes do início da pigmentação (ou seja, antes de 24 hpf)25, pois tecidos já pigmentados não despigmentarão após a adição de PTU21. Deve-se notar, no entanto, que a redução do tamanho dos olhos, déficits oculares e craniofaciais e interrupção de algumas vias de sinalização (por exemplo, sinalização da tireoide) foram relatadas em zebrafish tratados com PTU 27,28,29. A toxicidade do desenvolvimento da PTU parece depender da concentração e do tempo de adição dePTU 27,29. Como mencionado acima para validar a eficácia da PTU (etapa 1.2), os sinais de toxicidade da PTU também devem ser cuidadosamente monitorados e, se suspeitado, a concentração de trabalho e/ou o tempo de adição de PTU devem ser otimizados.
  4. Em 2-3 dpf, deschorionato embriões usando solução de pronase recém-feita.
    1. Dissolver a pronase em 1,5x PTU a uma concentração de 2 mg/mL por vórtice.
      ATENÇÃO: Pronase é embalada como um pó muito fino e é um irritante. Tome medidas para evitar inalação e/ou contato com pele, olhos, etc.
    2. Embriões eclodidos separados de embriões não-eclodidos e tratados com pronase apenas embriões não-eclodidos.
    3. Substitua 1,5x PTU por uma solução de pronase de 2 mg/mL feita na etapa 2.4.1 e deixe em embriões não-escaramuçados por 4-5 min com agitação suave (por exemplo, em um rotador/agitador de mesa ou por redemoinho manual).
    4. Despeje a solução de pronase e enxágue imediatamente com PTU de 1,5x fresco. Triturar suavemente 1,5x PTU enxaguar sobre embriões com uma pipeta de transferência de desenho de lâmpadas.
    5. Repita uma segunda lavagem ptu de 1,5x para descartar todos os detritos de chorão e, em seguida, reponha 1,5x PTU para manutenção.
      NOTA: Os embriões também podem ser descorrioados manualmente usando fórceps finos. Neste caso, os detritos de chorion devem ser removidos e 1,5x PTU reabastecidos após a descorção manual.
  5. Monitore a saúde embrião/larval e reponha 1,5x PTU a cada 1-2 dias. Embriões/larvas são mantidos em 1,5x PTU até ablação a 5 dpf.
    NOTA: A importância das etapas 2.3 e 2.4 são abordadas ainda mais na seção Discussão.

3. Triagem de larvas de zebrafish para rpe65a:nfsB-eGFP e ablação genética do epitélio pigmento da retina (5-6 dias após a fertilização)

  1. Faça uma solução fresca de 10 mM metronidazol (MTZ) em 5 dpf (dia de ablação). Este processo leva 2h para ser concluído.
    1. Adicione pó MTZ à água do sistema sem PTU e misture bem por um tremendo vigoroso (por exemplo, 250 rotações por minuto) por 1h a 37 °C.
    2. Esfrie a solução MTZ de 10 mM para um adicional de 1h à temperatura ambiente em um rotador/agitador de mesa e garanta a dissolução completa antes de adicionar a placas de Petri com larvas.
      NOTA: A triagem de fluorescência e a separação das larvas eGFP+ (etapa 3.2) podem ser realizadas durante as incubações de 37 °C e temperatura ambiente.
      ATENÇÃO: O MTZ é perigoso e deve ser tomado cuidado para evitar a ingestão, a inalação e/ou o contato com a pele ou os olhos. O pó de MTZ e todos os derivados líquidos aqui descritos podem precisar ser descartados como resíduos químicos, dependendo das regulamentações estaduais e institucionais. Recomenda-se a confirmação dos métodos adequados de eliminação de resíduos MTZ, se houver, antes do uso.
  2. Larvas de zebrafish de tela para o transgene rpe65a:nfsB-eGFP.
    1. Anestesiar larvas com 0,168 g/L de tricaine (MS-222) e larvas transgênicas separadas (eGFP+) (Figura 1) de larvas não transgênicas (eGFP-) utilizando um microscópio estéreo de fluorescência com um laser/filtro de excitação de 488 nm.
      NOTA: A tricaine deve ser adicionada a 1,5x PTU e/ou soluções de compostos farmacológicos, pois as larvas devem permanecer imersas no tratamento enquanto são rastreadas para eGFP. Incubar larvas em tricaine apenas durante a triagem (por exemplo, 10 min para uma única placa de Petri de 10 cm contendo 50 larvas).
    2. Acorde larvas examinadas imediatamente, pipetando diretamente em uma placa de Petri com PTU fresco de 1,5x sem tricaine.
    3. Após a conclusão da triagem, separe ainda mais as larvas eGFP+ em dois grupos de placas de Petri: um grupo para receber tratamento MTZ (ablated/MTZ+) e um grupo para ser o controle não-blado (MTZ-).
  3. Ablate o pigmento da retina epitélio.
    1. Remova 1,5x PTU dos pratos de controle não jateados (MTZ-) e adicione água fresca do sistema sem PTU.
    2. Remova 1,5x PTU dos pratos de tratamento ablados (MTZ+) e adicione a solução MTZ recém-feita de 10 mM (passo 3.1.).
    3. Remova a solução MTZ de 10 mM após exatamente 24 h (designada 1 dia após a lesão (dpi)) e adicione água fresca do sistema sem PTU. Altere a água do sistema fresco sem PTU no prato MTZ(es). Larvas não serão expostas novamente ao PTU pelo restante do protocolo.
      NOTA: Pode ser difícil pipetar ou derramar todos os 1,5x PTU (etapas 3.3.1 e 3.3.2) ou 10 mM MTZ (etapa 3.3.3) entre trocas de solução sem perda larval, pois os animais estão ativamente nadando ao redor. Nesse caso, a lavagem(es) da água do sistema sem PTU pode ser adicionada para garantir uma troca de soluções bem sucedida.

4. Manutenção larval pós-ablação genética (mais de 6 dias após a fertilização)

  1. Verifique as larvas e reponha a água do sistema sem PTU diariamente até a eutanásia (passo 5.6) ou retorne ao centro de habitação de zebrafish.
  2. Monitore o sucesso e a extensão da ablação in vivo em 2 dpi (7 dpf) utilizando iluminação de luz transmitida em um microscópio estéreo (Figura 2).

5. Incorporando tratamento farmacológico no protocolo de ablação de epitélio de pigmento de retina de zebrafish

NOTA: Como realizado anteriormente3, o tratamento com 15 μM IWR-1 ou controle de sulfeto de dimetil (DMSO) a partir de 4 dpf é descrito aqui como um experimento de exemplo para testar o RpEGEN. As concentrações e cronogramas podem variar com diferentes compostos farmacológicos e recomendações para validação dose-resposta, duração do tratamento, triagem e outros aspectos do desenho experimental para estudos de manipulação farmacológica são abordados na seção Discussão. Siga as etapas 6 e 7 se a análise de imagem for necessária.

  1. Coletar e manter embriões conforme descrito na etapa 2. Embriões descolados em 2 dpf.
  2. Tela larvas eGFP+ em 4 dpf conforme descrito na etapa 3.2. Em vez de placas de Petri, coloque larvas eGFP+ em placas de 6 poços a uma densidade de n ≤ 10 larvas por 6 poços para tratamento farmacológico. Designe placas separadas de 6 poços para larvas que não serãobladas (MTZ-) e larvas que serão abladas (MTZ+).
    NOTA: O sinal eGFP é visível em 4 dpf, mas parece mais escuro que a intensidade do sinal em 5 dpf.
  3. Pretreat 4 dpf eGFP+ larvas com 15 μM IWR-1 ou controle de veículo DMSO compatível com volume por exatamente 24 horas antes da ablação genética com solução MTZ de 10 mM.
    NOTA: Muitas vezes, muito pouco composto é necessário para experimentos de tratamento farmacológico. Para evitar a pesagem de pequenas quantidades de pó IWR-1, este composto farmacológico é adquirido já em solução DMSO, a uma concentração de 25 mM, e aliquoado em volumes menores na chegada para evitar repetidos ciclos de congelamento.
    1. Determine o volume de tratamentos farmacológicos e de controle de veículos necessários e alíquota de 1,5x PTU em tubos cônicos em conformidade. Recomenda-se um volume de 5 mL/poço de uma placa de 6 poços.
    2. Adicione ações IWR-1 a 1,5x PTU para uma concentração final de 15 μM IWR-1 (por exemplo, 3 μL de 25 mM IWR-1 por 5 mL de 1,5x PTU). Adicione um volume combinado de estoque DMSO a 1,5x PTU (por exemplo, 3 μL ≥ 99,7% DMSO por 5 mL de 1,5x PTU). Aqui, isso acabará rendendo uma concentração final de 0,06% de volume/volume (% v/v) DMSO. Misture bem com vórtice e confirme visualmente a dissolução dos compostos.
      ATENÇÃO: DMSO, IWR-1 e outros compostos e solventes farmacológicos podem precisar ser descartados como resíduos químicos, dependendo das regulamentações estaduais e institucionais. A confirmação do nível de risco e dos métodos adequados de eliminação de resíduos para esses compostos, se houver, é recomendada antes do uso.
    3. Remova 1,5x PTU das larvas eGFP+ em placas de 6 poços e adicione 5 mL/poço de 0,06% v/v DMSO ou 15 tratamentos IWR-1 de 15 μM da etapa 5.3.2.
  4. Em 5 dpf, abule o RPE. Além do pré-tratamento de 24 horas (etapa 5.3), as larvas permanecerão imersas em tratamentos farmacológicos e de controle veicular durante 24h de ablação genética com MTZ de 10 mM e durante a recuperação pós-ablação, até fixação (por exemplo, de 4 a 9 dpf).
    1. Faça 10 mM solução MTZ 2 h antes de realizar ablação genética (passo 3.1).
    2. Determine o volume de tratamentos farmacológicos e de controle de veículos necessários tanto para placas não abladas (MTZ-) quanto para ablação (MTZ+) e volumes apropriados de aliquot de água do sistema fresco sem solução PTU (MTZ-) ou 10 mM MTZ (MTZ+) em tubos cônicos. Isso produzirá quatro condições de tratamento: 1) 0,06% v/v DMSO, MTZ-; 2) 15 μM IWR-1, MTZ-; 3) 0,06% v/v DMSO, MTZ+; e 4) 15 μM IWR-1, MTZ+.
    3. Adicione as soluções de estoque IWR-1 e DMSO aos respectivos tubos cônicos, conforme realizado na etapa 5.3.2. Misture bem com vórtice e confirme visualmente a dissolução dos compostos.
    4. Remova tratamentos DMSO 0,06% v/v e 15 μM IWR-1 em 1,5x PTU (etapa 5.3.2) das placas designadas não abladas (MTZ-) e abladas (MTZ+) e reabasteça-se com os tratamentos adequados feitos na etapa 5.4.3.
    5. Remova tratamentos DMSO de 0,06% v/v e 15 tratamentos IWR-1 em solução MTZ de 10 mM após exatamente 24 h e reabasteça-se com tratamentos em água fresca do sistema sem PTU. Reabastecer tratamentos de 0,06% v/v DMSO e 15 tratamentos IWR-1 em água fresca do sistema sem PTU na placa nãoblada (MTZ-) 6-well(s).
  5. Siga a manutenção larval pós-ablação conforme descrito na etapa 4 e reponha 0,06% v/v DMSO ou 15 tratamentos IWR-1 μM diariamente em água do sistema sem PTU.
  6. Eutanize larvas em 9 dpf (4 dpi para irmãos tratados com MTZ) por imersão de animais em solução de tricaine 0,3 g/L (overdose letal) juntamente com resfriamento rápido (por exemplo, coloque placas de Petri no gelo) por pelo menos 20 min30. Verifique se as larvas não estão respondendo ao toque e fixação em 4% pfa (passo 1,5) por 3h em temperatura ambiente ou a 4 °C durante a noite.
  7. Processe o tecido larval pós-fixação para aquisição de imagens de pilha z em um microscópio confocal, conforme descrito anteriormente 5,31 e aqui na seção Resultados Representativos. A análise nas etapas 6 e 7 exigirá, no mínimo, a aquisição de marcadornuclear (por exemplo, DAPI) e imagens de pilha z-stack brightfield.

6. Pré-processamento de imagem de microscópio confocal em FIJI (ImageJ)

  1. Importar e formatar imagens de microscópio confocal z-stack usando FIJI32.
    1. Abra imagens de microscópio usando as opções de importação de bioformitos definidas para exibir pilha com: Hyperstack e modo de cor: Escala de cinza.
    2. Gere uma projeção de intensidade máxima da imagem do microscópio importado escolhendo imagem | Pilhas | Projeto Z. Na janela ZProjection , defina Start Slice e Stop Slice para incluir todas as fatias para essa imagem. Por exemplo, defina Start Slice: 1 e Stop Slice: 18 para uma pilha z que tem um total de 18 fatias. Escolha o tipo de projeção: Intensidade máxima e clique em OK.
    3. Converta o arquivo de projeção de intensidade máxima em uma imagem de 8 bits (se não já) escolhendo imagem | Tipo | 8 bits.
    4. Reoriente a imagem para que o lado dorsal seja para cima e distal (ou seja, a lente) é deixada escolhendo imagem | Transforme | Vire Horizontalmente (para o último comando, escolha a opção que melhor se adequa à direcionalidade necessária para essa imagem). Para obter uma imagem multicanal, clique em Yes in the Process Stack? janela para reorientar todos os canais.
      NOTA: Este passo é crítico, mas não é necessário se a imagem já estiver no dorsal para cima, orientação esquerda distal. Consulte a Figura 3A-D e a Figura 4 para obter imagens com olhos na direcionalidade correta para processamento.
    5. Salve a projeção de intensidade máxima de 8 bits como um arquivo TIF (Formato de arquivo de imagem marcado) escolhendo o Arquivo | Salve como | Tiff....
  2. Gerar região de interesse RPE (ROI) usando FIJI.
    1. Abra uma imagem TIF de 8 bits gerada como descrito na etapa 6.1. Inicie o Gerenciador de ROI escolhendo Analisar | Ferramentas | Gerente do ROI.
    2. Use | de imagem Zoom e alternar entre os canais DAPI e brightfield para identificar o ponto(s) em que o lado apical do RPE está adjacente à ponta da membrana limitante externa (OLM) (Figura 3B', B", D', D"; pontas de flecha azul). Use este marco anatômico como ponto de partida do ROI.
    3. Crie o ROI RPE com a ferramenta Seleções de Polígono (na barra de ferramentas FIJI) usando os canais de imagem DAPI e brightfield e função zoom (Imagem | Zoom) para identificar limites de RPE apical e basal. Leve as extremidades dorsal e ventral do ROI (ou seja, onde o ROI transita do lado apical para basal da RPE) para um ponto afiado em vez de embaraçar ou arredondar (Figura 3B', B", D', D"; linhas magenta).
      NOTA: Criar um final de ROI pontiagudo é um passo fundamental para otimizar a detecção de ponto final usando o RpEGEN e é abordado na seção Discussão.
    4. Adicione o ROI clicando em Adicionar no gerenciador de ROI. Ajuste o ROI conforme necessário e clique em Atualizar no Gerenciador de ROI.
    5. Salve o arquivo ROI escolhendo Mais>> | Salvar... dentro do ROI Manager. Use nomes idênticos para arquivos de imagem ROI e TIF combinados (por exemplo, [nome do arquivo].tif e [nome do arquivo].roi).
  3. Combine arquivos TIF e ROI de 8 bits para cada condição em uma única pasta. Por exemplo, a pasta, DMSO_9dpf, conterá todos os arquivos TIF e ROI combinados para o grupo larval tratado com 9 dpf (MTZ-) 0,06% v/v DMSO.

7. Quantificação e visualização da regeneração de RPE usando scripts RpEGEN

  1. Instale e prepare scripts RpEGEN.
    1. Baixe os últimos scripts do RpEGEN do repositório do GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) clicando em Code | Baixe ZIP.
    2. Descompacte a pasta e coloque-a no local desejado do espaço de trabalho (por exemplo, Desktop).
    3. Abra o MATLAB.
    4. Navegue até a pasta RpEGEN no painel pasta corrente (geralmente no lado esquerdo).
    5. Clique com o botão direito do mouse na pasta RpEGEN e escolha Adicionar ao caminho | Pastas e Subpastas selecionadas. Isso adiciona a pasta ao caminho MATLAB para que ela possa encontrar e executar automaticamente quaisquer scripts na pasta.
    6. Clique duas vezes na pasta RpEGEN no painel pasta corrente para mostrar todas as subpastas e arquivos M.
    7. Clique duas vezes no arquivo RpEGEN.m para abrir no painel do Editor .
    8. De acordo com a seção VARIÁVEIS DEFINIDAS PELO USUÁRIO do arquivo RpEGEN.m, digite os locais de diretório das pastas que contêm os arquivos ROI (.roi), arquivos de imagem (.tif) e onde os arquivos de saída devem ser salvos. Digite o nome do grupo para que o arquivo .mat seja exportado (por exemplo, DMSO_9dpf, DMSO_4dpi, etc.) e a localização do canal brightfield na pilha de imagens TIF (por exemplo, 3, se brightfield é o terceiro canal em uma pilha de imagens). Se o arquivo de imagem contém apenas a imagem de campo brilhante, então isso deve ser igual a 1.
  2. Execute o script RpEGEN.m e valide os resultados.
    NOTA: A RpEGEN requer que a caixa de ferramentas de processamento de imagem, a caixa de ferramentas de ajuste de curva e a caixa de ferramentas de estatística e aprendizado de máquina sejam ativadas na licença MATLAB do usuário para ser executada. Além disso, a caixa de ferramentas ReadImageJROIdisponível gratuitamente 33 é necessária para importar ROIs FIJI para o MATLAB; no entanto, ele é fornecido na pasta RpEGEN juntamente com outros arquivos M de função que não requerem qualquer ativação.
    1. Execute o script clicando no botão Executar no menu Editor na parte superior do MATLAB.
      NOTA: Uma vez iniciada, a janela Comando fornecerá saída verbosa indicando a progressão do script. Depois de salvar o arquivo MAT contendo os dados extraídos, uma figura de três painéis aparecerá e será salva como um PDF para o diretório de saída para cada execução de imagem. Estas são figuras de controle de qualidade (QC) para garantir que tudo tenha corrido corretamente e inclua: 1) a imagem de campo brilhante sobreposta pelo ROI (Figura 4A); 2) o ROI com distância angular central e associada (graus) (Figura 4G); e 3) o ROI com os valores de intensidade mediana da linha central (0-255, escala de cores de 8 bits) (Figura 4H). Aguarde até que os PDFs QC tenham sido salvos na pasta de saída e a última figura tenha desaparecido antes de prosseguir para a próxima etapa.
    2. Abra os PDFs individuais exportados para a pasta de saída em qualquer visualizador PDF e verifique se todos os ROIs correspondem às imagens de campo brilhante, que os valores da linha central são aproximações razoáveis do centro dos ROIs, e que os valores de intensidade mediana são adequadamente preenchidos com dados (ou seja, nem todos o mesmo valor em toda a linha central).
      NOTA: Uma descrição detalhada e estrutura de cada variável salva no arquivo MAT pelo RpEGEN.m podem ser encontradas na Tabela 1.
  3. Execute o roteiro de RpEGEN_PermPlot.m.
    NOTA: O script RpEGEN_PermPlot.m usa a saída do RpEGEN.m para executar comparações estatísticas usando uma simulação de permutação das medianas de dois grupos e também fornece o código para reproduzir os plots neste papel usando a caixa de ferramentas GRAMM34 disponível livremente, que também foi incluída na pasta RpEGEN.
    1. Clique duas vezes no arquivo RpEGEN_PermPlot.m para abrir em uma nova guia Editor .
    2. De acordo com a SEÇÃO 1 - VARIÁVEIS DEFINIDAS PELO USUÁRIO no arquivo RpEGEN_PermPlot.m, digite o local do diretório para a pasta de saída contendo os arquivos MAT de execução do RpEGEN.m e digite cada nome de arquivo MAT a ser carregado (por exemplo, DMSO_4dpi.mat, IWR1_4dpi.mat).
    3. Execute esta seção do script clicando no botão Executar seção no menu Editor na parte superior do MATLAB.
    4. Na Seção 2, digite os nomes dos dois grupos para comparação estatística nas variáveis data_A e data_B (estes são os grupos dos quais as medianas serão derivadas utilizando a simulação de permutação). Na variável bin_sz , digite o número de graus sobre os quais integrar os valores de intensidade mediana para os conjuntos de dados (padrão são caixas de 1 grau).
      NOTA: A variável reps indica o número de permutações a serem usada para construir uma distribuição de probabilidades e pode ser definida para qualquer número (o valor padrão é de 20.000). Em geral, um maior número de repetições será mais estatisticamente robusto, mas aumentará o tempo de processamento.
    5. Execute esta seção do script clicando no botão Executar seção no menu Editor na parte superior do MATLAB. Esta seção pode levar algum tempo para ser concluída dependendo do número de repetições especificadas, mas fornece uma atualização contínua de status na janela de comando.
    6. Execute as seções HEATMAP FIGURE e GROUP RESULTS E P-VALUES independentemente usando o botão Executar seção . Editar variáveis de dados em todas as seções comentadas com "ENTER DATA HERE". PDFs dessas figuras são automaticamente salvos para cada um e podem ser facilmente modificados em qualquer pós-processamento de software vetorial.
      NOTA: As parcelas geradas no arquivo RpEGEN_PermPlot.m são ad hoc e provavelmente exigirão modificações com base nas necessidades específicas de visualização e dados específicos de cada usuário. No entanto, os números fornecem uma base sólida que pode ser facilmente individualizada usando tanto sites MATLAB quanto GRAMM.

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Representative Results

A inibição da via de sinalização canônica do Wnt é conhecida por prejudicar significativamente a regeneração do RPE de zebrafish usando o paradigma de ablação genética (rpe65a:nfsB-eGFP) e a metodologia de manipulação farmacológica (IWR-1) descrita no protocolo3. Este experimento foi repetido aqui para validar um método automatizado para quantificar a regeneração de RPE de zebrafish com base na pigmentação. Os resultados resumidos abaixo abrangeram todas as etapas do protocolo, desde o dia da fertilização (0 dpf) até a quantificação da regeneração de RPE utilizando RpEGEN.

Implementação do protocolo de ablação RPE (com manipulação farmacológica) em zebrafish larval
Os embriões coletados de três grupos parentais separados (N = 3) iniciaram o tratamento com 1,5x PTU em torno de 6 hpf e a ausência de pigmentação no RPE e melanócitos superficiais foi confirmada visualmente em 1 dpf. Os embriões foram enzimaticamente descorioados em 2 dpf utilizando 2 mg/mL de pronase (etapa 2.4). Em 4 dpf, as larvas foram anestesiadas utilizando tricaine (MS-222) e rastreadas para eGFP utilizando um microscópio estéreo de fluorescência (passos 3.2 e 5.2). As larvas eGFP+ foram movidas para placas de 6 poços (n = 10 larvas/bem) e foram tratadas com 0,06% v/v DMSO (controle do veículo) ou 15 μM IWR-1 (etapa 5.3). A densidade larval relatada aqui foi inicialmente baseada na aproximação de 1 área de crescimento de larva/cm2 e foi validada através de um monitoramento cuidadoso da saúde (por exemplo, desenvolvimento da bexiga natação) ao longo do tempo. A intensidade do eGFP apareceu fraca em 4 dpf, de modo que as larvas foram re-tela em 5 dpf para confirmar a expressão eGFP brilhante (Figura 1). RPE65 (rpe65a em zebrafish) é um marcador de RPE7 maduro e, em peixes teleost, as células retina e RPE são continuamente geradas a partir da zona marginal ciliar (CMZ), um nicho de células-tronco na ponta distal da retina, adjacente à lente35. Assim, na linha transgênica rpe65a:nfsB-eGFP, o RPE mais imaturo existe na periferia e aparece eGFP- (aproximadamente um terço do tecido RPE total) enquanto os dois terços maduros e centrais do RPE expressa eGFP (Figura 1B; pontas de flecha branca). O transgene também era visível na glândula pineal (Figura 1A; ponta de flecha amarela), o que era esperado como rpe65a mostra expressão pineal em zebrafish36. Comparativamente fracas ou eGFP- larvas foram retiradas de placas de 6 poços e eutanizadas em 5 dpf. Exatamente 24 horas após o tratamento com DMSO ou IWR-1, 5 larvas dpf foram tratadas com MTZ de 10 mM para abltoar o RPE (etapas 3.1, 3.3 e 5.4). O MTZ foi lavado após exatamente 24 h (ou seja, em 6 dpf/1 dpi) para permitir que a regeneração do RPE ocorresse.

Larvas foram observadas diariamente em um microscópio estéreo utilizando iluminação de luz transmitida de 6 dpf/1 dpi até o tempo de eutanásia em 9 dpf/4 dpi. O sucesso da ablação genética foi confirmado in vivo em 2 dpi pela ausência de pigmento nos dois terços centrais do olho em larvas MTZ+ (Figura 2B; pontas de flechas vermelhas) em comparação com 7 irmãos dpf MTZ-control (Figura 2A) (passo 4.2). Como previsto, a área desprovida de pigmento em 2 dpi apareceu análoga à região da expressão transgênica rpe65a:nfsB-eGFP observada em 5 dpf (Figura 1B). A avaliação foi realizada em 2 dpi e não antes, pois o RPE passa por reigmentação após a remoção do PTU e dependendo do tempo de observação in vivo, uma diferença marcante entre o RPE central ablado e o RPE periférico (não ablatado) pode ser difícil de discernir se este último não foi totalmente repigmentado. Apesar da possibilidade de ambiguidade macroscópica, a ablação de RPE em 1 dpi mostrou-se previamente aparente no tecido seccionado, revelando uma perda da integridade do tecido RPE central e da camada nuclear externa (ONL; ou seja, fotorreceptora), juntamente com evidências de morte celular (núcleos pitnóticos) (Figura 5)3. Contra a perda de tecido, a proliferação robusta foi determinada como um driver-chave durante a regeneração tecidual no modelo3 de zebrafish rpe65a:nfsB-eGFP. Tanto a resposta apoptótica precoce, onde a ablação de RPE leva à degeneração de tecidos adjacentes (por exemplo, fotorreceptores e membrana de Bruch; Figura 6A-C), e a resposta proliferativa periférica-central que se segue, que produz "zonas" de regeneração heterogênea movendo-se para dentro para o local da lesão (Figura 6D-F), foram amplamente caracterizadas e discutidas anteriormente3.

Preparação de tecidos, aquisição de imagens confocal e pré-processamento de imagem para quantificação automatizada com base na pigmentação RPE usando RpEGEN
Em 9 dpf/4 dpi, as larvas tratadas DMSO e IWR-1 foram eutanizadas por overdose de tricaine e fixadas em 4% de PFA por 3h à temperatura ambiente (passo 5,6). Quatro larvas de cada grupo-mãe independente foram escolhidas aleatoriamente para processamento subsequente de tecidos (N = 3; n = 12 larvas por tratamento). Crioproteção, criosectioning (com 12 μm de espessura), contra-retenção nuclear com DAPI e montagem de deslizamento de cobertura foram realizadas como referenciadas na etapa 5.7 5,31. Uma seção central, com nervo óptico visível, de cada larva foi imagem em um microscópio de varredura a laser confocal usando um objetivo de imersão de óleo de 40x (abertura numérica = 1,30) para adquirir imagens de 512 x 512 pixels de pilha z com um intervalo de 1 μm z-step. Cada imagem continha dados de três canais: canal 1 = excitação de 405 nm para DAPI, canal 2 = excitação de 488 nm para eGFP, canal 3 = luz transmitida para brightfield. Como a intensidade dos pixels foi quantificada em imagens de campo brilhante, as configurações de tensão da lâmpada de luz transmitida foram mantidas constantes e todos os dados coletados para comparações estatísticas foram visualizados no mesmo dia.

As imagens de pilha de z-stack do microscópio confocal foram pré-processadas para quantificação automatizada, conforme descrito na etapa 6, usando FIJI. As imagens foram excluídas do pré-processamento e quantificação se o tecido fosse comprometido de forma a dificultar a geração de ROI (por exemplo, de rasgar (Figura 7A; pontas de flecha magenta) ou obstrução de marco (Figura 7B; magenta ovals)) ou medidas de intensidade de ROI de distorção (por exemplo, de dobras (Figura 7C; magenta ovais)). Apesar de omitir algumas larvas com esses critérios de exclusão, todos os conjuntos de dados aqui representam N = 3 com o seguinte número de réplicas biológicas (larvas): n = 11, DMSO MTZ-; n = 10, IWR-1 MTZ-; n = 11, DMSO MTZ+; n = 12, IWR-1 MTZ+. Utilizando o canal DAPI, os ROIs RPE foram iniciados identificando primeiro o ponto em que o lado apical dorsal do RPE (voltado para a retina) estava diretamente adjacente à ponta dorsal do OLM (Figura 3B',D'; pontas de flecha azul) (passo 6.2.2). Como a extensão de RPE distal pode variar entre as seções, o OLM foi usado como um marco anatômico para padronizar os pontos finais do ROI RPE e normalizar as medições de distância angular no MATLAB (onde 0° = ponto final do ROI dorsal e 180° = ponto final do ROI ventral). Ao realizar ablações de RPE com manipulação farmacológica ou em um fundo mutante, um marco anatômico deve ser identificado e validado antes do pré-processamento e quantificação. Aqui, o OLM era aparente em todas as larvas quantificadas e não foi comprometida por rasgos (como em Figura 7B) ou tratamento com DMSO ou IWR-1. Após a identificação do ponto de partida dorsal, os ROIs foram gerados seguindo o lado apical do RPE (dorsal-to-ventral) até que o ponto adjacente à ponta do OLM ventral fosse atingido (Figura 3B",D"; pontas de flecha azul). Em seguida, foi feito um ponto final do ROI ventral entre os lados apical e basal (voltado para coroide) da RPE, conforme discutido na etapa 6.2.3 (Figura 3B",D"; linha magenta). O ROI continuou, seguindo o lado basal do RPE (ventral-dorsal) até atingir o lado basal adjacente ao ponto de partida no OLM dorsal. O ROI foi então fechado criando uma extremidade dorsal pontuda (Figura 3B',D'; linha magenta) como feito ventrally. A ablação genética tem sido demonstrada como resultado de uma perda da expressão central eGFP que é recuperada à medida que a regeneração prossegue (resumida em Figura 6)3; assim, dependendo da extensão da regeneração e da intensidade do eGFP no ponto de interesse, o canal eGFP só pode ser útil para a geração de ROI no MTZ- grupo. Portanto, enquanto as aquisições confocal também continham imagens de canais eGFP, a geração de ROI foi concluída utilizando os canais DAPI e brightfield, conforme mencionado na etapa 6.2.3. A geração de ROI RPE foi simples em MTZ tratado com DMSO e IWR-1- grupos larvais e regiões englobadas com microvilli apical visivelmente pigmentado (Figura 3B; ponta de flecha vermelha) juntamente com os corpos celulares proeminentemente pigmentados. Os mesmos parâmetros foram aplicados ao MTZ+ grupos larvais (Figura 3D; cabeça de flecha vermelha); no entanto, devido ao tecido danificado residual dentro do local da lesão, microvilli apical e limites de pigmentação foram difíceis de delinear apenas no canal brightfield em alguns casos. Nessas áreas, o canal DAPI também foi utilizado para identificar detritos celulares dentro do local de lesão do RPE, que foi incluído no ROI (Figura 3C,D; exemplos de detritos celulares localizados no local de lesão são indicados com pontas de flecha ciano). Imunostaining com marcadores de RPE imaturo/maduro (por exemplo, ZPR2; Figura 6DE)37 e/ou fotorreceptores (por exemplo, ZPR1)37,38 também poderia ser empregado para facilitar a delineação de ROIs RPE em larvas abladas.

Anteriormente, as larvas abladas tratadas com IWR-1 de 4 dpf a 4 dpi apresentaram prejuízo significativo da regeneração de RPE em comparação com os controles de irmãos tratados com DMSO (Figura 8C)3. Isso foi relatado como o percentual de recuperação de pigmentos centrais, o que exigiu experiência prévia substancial com o modelo e medições manuais de distância angular para designar limites de regeneração (Figura 8B; pontas de flecha preta). O RpEGEN foi criado para automatizar a quantificação da regeneração de RPE e reduzir vieses intrínsecos. Não só isso, o RpEGEN também possibilitou a geração de conjuntos de dados altamente robustos; por exemplo, 10 pontos de dados foram gerados anteriormente a partir da quantificação manual de n = 10 larvas MTZ+ tratadas com DMSO (Figura 8C; % recuperação de pigmento por seção)3, enquanto 174.801 pontos de dados foram gerados a partir de n = 11 larvas MTZ+ tratadas pelo DMSO/ROIs aqui usando RpEGEN (Figura 9C; medições de intensidade de pixel).

O RpEGEN foi desenvolvido para avaliar gradualmente as mudanças regionais na pigmentação sobre a totalidade do RPE, derivando uma linha central esqueletizada (largura de 1 pixel) do ROI original gerado usando FIJI (Figura 4A,B). Para incorporar todos os pixels dentro do ROI para análise (ou seja, não apenas os pixels de linha central), uma transformação de distância euclidiana foi realizada em cada pixel da linha central para criar um mapa do índice central mais próximo para cada pixel na máscara roi. Este mapa de índices permitiu que cada pixel fora da linha central fosse atribuído a um único pixel de linha central, criando um conjunto de dados abrangente em todo o RPE para cada larva (Figura 4E). O comprimento dorsal-ventral do RPE foi representado pela distância angular (Figura 4G; 0-180°) em oposição à distância de pixels normalizada (Figura 4F; 0-1 unidades arbitrárias), pois isso foi mais intuitivo com base em medições anteriores da regeneração de RPE 3,4,5 e o fato de que a distância angular não varia com diferenças morfológicas. Intensidades medianas derivadas de caixas de 5 graus foram a métrica escolhida para destacar tendências em larga escala e minimizar a variabilidade de alta frequência observada nos dados binados de 1 grau (Tabela 1, Figura 10A). A simulação de permutação foi escolhida para testar a hipótese nula para ver se as medianas dos dois grupos de tratamento (aqui, DMSO MTZ+ e IWR-1 MTZ+ (ambos 4 dpi), Figura 10B) são semelhantes39. Esta técnica de resusartração carece de suposições rigorosas sobre a distribuição dos dados e pode ser usada em uma série de estatísticas de teste (por exemplo, média, mediana, etc.) para gerar estimativas robustas de valor p. Alguns desses parâmetros (por exemplo, tamanho da lixeira de dados brutos e medianos, repetições de simulação de permutação, etc.) podem ser adaptados e modificados para atender às necessidades do usuário. Para este último, 20.000 repetições foram escolhidas para gerar uma comparação estatisticamente robusta, no entanto, deve-se tomar cuidado para equilibrar a eficiência computacional com robustez estatística, pois poucas repetições podem produzir estimativas errôneas de p-valor. Recomenda-se que sejam executados múltiplos valores de repetição (10.000, 20.000, etc.) para garantir que a distribuição e os valores do valor p sejam relativamente estáveis antes de iniciar interpretações. O aumento das repetições de permutação aumentará o poder estatístico (mas também levará mais tempo para ser executado), o que pode ser benéfico para alguns conjuntos de dados.

Os conjuntos de dados de imagem confocal foram quantificados usando RpEGEN conforme descrito na etapa 7. Os scripts de suporte e RpEGEN anotados estão disponíveis no GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) juntamente com os arquivos TIF e ROI correspondentes para os usuários interessados testarem. Os heatmaps exibindo dados brutos de ROIs MTZ-larval mostraram uma distribuição global de intensidades de pixels mais escuras (onde 0 = preto e 255 = branco, 8 bits de escala de cor) abrangendo o comprimento dorsal (0°) ao ventral (180°) do RPE, independentemente do tratamento com DMSO de 0,06% v/v ou 15 μM IWR-1 (Figura 9A,B). A traçação da intensidade média dos pixels facilitou a visualização entre todos os grupos e mostrou semelhanças entre os grupos MTZ em todo o RPE (Figura 10A; linhas pretas e cinzas). Esses dados suportavam a presença de uma monocamada RPE pigmentada intacta (Figura 9E,F) e proporcionavam valores de intensidade de pixel mediana de linha de base (ou seja, abaixo de 150) para RPE nãoblado (Figura 10A; linhas pretas e cinzas). Comparativamente, os dados brutos (Figura 9C,D) e mediana (Figura 10A; linhas azuis e vermelhas) dos ROIs larval MTZ+ mostraram uma distribuição global de intensidades de pixels mais leves no RPE central, novamente, independentemente da condição de tratamento. As larvas tratadas com DMSO abladas mostraram distribuição centralizada de pixels de luz a aproximadamente 100° (± 15°) (Figura 9C; caixas laranja-vermelha). Isso correspondeu a uma ausência visível de pigmentação no local central de lesão RPE dentro/ao redor do nervo óptico (Figura 9G; pontas de flecha azul). As larvas tratadas com IWR-1 também mostraram distribuição centralizada de pixels de luz que foram expandidos tanto dorsalmente (para cerca de 50°) quanto ventrally (em aproximadamente 5°) quando comparados aos controles de irmãos tratados com DMSO MTZ+ (Figura 9D; lixeiras laranja-vermelhas). A presença de um local de lesão expandida era claramente visível no tecido seccionado (Figura 9H; pontas de flecha azul). Com exceção de duas caixas de 1 grau, a diferença observada entre os grupos MTZ+ foi estatisticamente significante no RPE central (Figura 10B; área azul claro sombreada entre ~40-140°; p-valor ≤ 0,05), indicando pigmentação RPE significativamente menos central em larvas tratadas com MTZ+ IWR-1 quando comparadas aos controles de irmãos tratados com DMSO MTZ+. A interpretação desses dados brutos (Figura 9C,D) e mediana (Figura 10A) com comparação estatística (Figura 10B) utilizando RpEGEN foi validada não apenas pela observação do tecido seccionado (Figura 9G,H), mas também apoiou achados anteriores da quantificação manual (Figura 8)3.

Figure 1
Figura 1: rpe65a:nfsB-eGFP expressão transgene em 5 dias após a fertilização. (A-C) Imagens completas de uma larva de 5 dpf tratada com PTU mostrando expressão transgênica fraca na glândula pineal (A; ponta de flecha amarela) e expressão transgênica brilhante no RPE (B,C) no momento da triagem para ablação genética. (B) A expressão transgênica é visivelmente localizada aos dois terços centrais do RPE, e as pontas das flechas brancas destacam a fronteira entre o RPE periférico (imaturo) e o RPE central (maduro). Verde = eGFP. O Anterior acabou. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Verificação da ablação genética bem sucedida do RPE in vivo. Imagens completas de (A) três larvas nãobladas (MTZ-) 7 dpf mostrando pigmentação RPE em todo o olho e (B) três larvas de dpi abladas (MTZ+) 2 mostrando uma zona de ablação onde há ausência de pigmento nos dois terços centrais do RPE (pontas das setas vermelhas). O Anterior acabou. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Regiões de interesse de RPE (ROIs) para quantificação automatizada utilizando RpEGEN. Crioseções transversais de (A,B) uma larva nãoblada (MTZ-) 9 dpf e (C,D) uma larva ablada (MTZ+) de 4 dpi com os ROIs RPE destacados em magenta. (B,D) Pontas de flechas vermelhas destacam regiões onde microvilli apical visivelmente pigmentado foram incluídos no ROI. (C,D) Pontas de flechas cianos apontam para o exemplo regiões de detritos DAPI+ localizados no local da lesão, que foi usado para incluir detritos de células RPE no ROI. (B',B",D',D") Os zooms digitais das regiões do ROI dorsal e ventral (caixas pontilhadas pretas em B e D) mostram pontos de partida sugeridos do ROI (pontas de seta azul) e as extremidades do ROI pontiagudos que são críticas para a detecção de ponto final no MATLAB. Imagens de Brightfield também são mostradas na Figura 9E,G. Branco/cinza = núcleos. Dorsal está para cima e distal é deixado. (A-D) Barras de escala = 40 μm. (B',B",D',D") Barras de escala = 10 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Fluxo de trabalho de processamento RpEGEN. (A) Exemplo de uma imagem de campo brilhante de 8 bits adequadamente orientada e ROI (vermelho) gerados pela FIJI importados para o MATLAB. Dorsal está para cima e distal é deixado. A barra de cor representa valores de intensidade de escala de cinza de 8 bits onde 0 = preto e 255 = branco. (B) A esqueletização binária inicial (branca) da máscara roi (vermelha) mostrando a presença de esporas errôneas e o delineamento dos pontos de partida e extremidade para delineamento geodésico da distância da distância dos pixels, conforme mostrado em (C). A barra de cores em (C) representa a distância de pixel euclidiano. (D) Os esporas são removidos usando um caminho simplificado de menor custo desde o pixel final até o pixel inicial, resultando em uma linha central contínua desprovida de esporas (vermelhas). (E) Índices de linha central linear mais próximos baseados em uma distância transformada entre todos os pixels da máscara ROI e os pixels central (branco). Esses valores de índice permitem que cada pixel de imagem dentro da máscara ROI seja atribuído ao pixel central mais próximo para análise. A barra de cor representa os valores lineares do índice de pixels da linha central. (F) Um exemplo da distância de pixel normalizada ao longo da linha central, onde 0 (azul, pixel mais dorsal) é o pixel inicial e 1 (vermelho, mais desalterna pixel ventral) é o pixel final. (G) Semelhante a (F) mas usando a distância angular, onde 0 graus (azul) é o pixel inicial e 180 graus (vermelho) é o pixel final. (H) Exemplo dos valores medianos de intensidade de pixel calculados para cada pixel central. A barra de cores representa o valor médio de intensidade em escala de cinza de todos os pixels roi contribuindo para cada pixel central. Este número mostra imagens de um conjunto de dados de teste e não larvas dos grupos de tratamento DMSO de 0,06% v/v ou 15 μM IWR-1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Evidência de ablação de RPE e degeneração fotorreceptora. (A) Crioseções transversais de uma larva de 6 dpf nãoblada. (A,A') Após a exposição à PTU, a expressão transgênica é restrita a células RPE maduras, com a expressão mais brilhante confinada aos dois terços centrais do RPE. Pontas de flecha indicam microvilli apical. (A") Imagens de contraste de interferência diferencial (DIC) revelam a arquitetura de camada nuclear externa normal (ONL; ou seja, fotorreceptora). (B,B') Crioseções transversais de uma larva de 1 dpi revelam interrupção significativa da morfologia celular eGFP+ e desorganização na laminação ONL. Setas indicam núcleos delaminados e pitnóticos. (B) As imagens DIC revelam ainda mais a interrupção acentuada da arquitetura ONL. Verde = eGFP, azul = núcleos, amarelo = ONL. Dorsal está para cima e distal é deixado. A barra de escala em (A) representa 40 μm e pode ser aplicada a (B). A barra de escala em (A') representa 40 μm e pode ser aplicada (A",B',B"). Este texto de legenda de figura e figura foi modificado a partir de Hanovice et al. 2019 (Figura 1)3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Modelo de regeneração de RPE em zebrafish larval. (A) nfsB-eGFP é expresso em RPE maduro nos dois terços centrais do olho. (B) A aplicação de MTZ leva à apoptose (TUNEL, vermelho) de RPE e fotorreceptores. (C) A ablação de RPE leva à degeneração dos fotorreceptores e da membrana de Bruch (linha pontilhada). (D) RPE nãoblado na periferia começam a proliferar e se estendem até o local da lesão (azul). (E) À medida que o EGFP+ RPE regenerado aparece na periferia, o RPE pode ser dividido em quatro zonas: RPE periférico (pRPE), RPE diferenciado (dRPE), zona de transição (TZ) e local de lesão (IS). (E, inset) RPE diferenciado regenerado (verde) aparece na periferia proximal para o RPE periférico nãoblado, e contém células proliferativas adjacentes à zona de transição. A zona de transição consiste em células RPE ainda diferenciadas (ZPR2, vermelhas) e células proliferativas (azul). O local da lesão compreende células proliferativas não espigmentadas que não expressam nenhum marcador de diferenciação RPE. (F) A regeneração de uma camada RPE funcional e da membrana de Bruch é completa em 14 dpi. Este texto de legenda de figura e figura foi modificado a partir de Hanovice et al. 2019 (Figura 14)3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Seções de tecido comprometido excluídas da análise de imagem. (A-C) Crioseções transversais de larvas dos conjuntos de dados 0,06% v/v DMSO e 15 μM IWR-1 que atenderam aos critérios de exclusão. Uma larva mostra a ruptura dorsal do tecido RPE (A; pontas de flecha magenta) e duas outras larvas mostram dobras teciduais que ou obstruem um marco anatômico (OLM dorsal) no canal DAPI (B; ovais pontilhados magenta) ou podem distorcer as medidas de intensidade de RPE do canal de campo brilhante (C; ovais pontilhados de magenta). Branco/cinza = núcleos. Dorsal está para cima e distal é deixado. Barras de escala = 40 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: A inibição farmacológica usando IWR-1 prejudica a regeneração do RPE. Crioseções transversais de larvas abladas (MTZ+) 4 dpi de (A) 0,06% v/v DMSO e (B) 15 μM IWR-1 grupos de tratamento. As imagens de Brightfield (A,B) e a quantificação de porcentagem de recuperação/seção de RPE (C) mostram um atraso significativo na recuperação de uma monocamada pigmentada em larvas tratadas IWR-1 (teste t não pago do aluno, *** p < 0,0001). (B) As pontas de flecha preta indicam a borda central do RPE regenerador. Dorsal está para cima e distal é deixado. A barra de escala em (B) representa 40 μm e pode ser aplicada a (A). Este texto de legenda de figura e figura foi modificado de Hanovice et al. 2019 (Figura 13)3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: Saída bruta de dados da quantificação automatizada da regeneração de RPE em RpEGEN. (A-D) Heatmaps mostrando distribuições de intensidade de pixels de campo brilhante compiladas de toda a região do ROI RPE, desde dorsais (x-eixos; distância angular = 0°) até ventral (x-eixos; distância angular = 180°), para todas as larvas em cada conjunto de dados: (A) n = 11, DMSO MTZ-; (B) n = 10, IWR-1 MTZ-; (C) n = 11, DMSO MTZ+; (D) n = 12, IWR-1 MTZ+ (de três grupos parentais independentes, N = 3). Por exemplo, (A) exibe dados de 177.460 pixels em 11 ROIs. Nos eixos y, a intensidade do pixel é mostrada com base em uma escala de cores de 8 bits onde 0 = preto e 255 = branco. Os dados brutos são exibidos em caixas de 5 graus (x-eixo) por caixas de valor de intensidade de 5-8 bits (eixo y) onde vermelho = contagem máxima de lixo e azul escuro = contagem mínima de lixo. (E-H) Crioseções transversais de larvas representativas (E,F) nãobladas (MTZ-) 9 dpf larvas e (G,H) abladas (MTZ+) 4 dpi larvas de 0,06% v/v DMSO e 15 μM IWR-1 grupos de tratamento. Rois RPE são destacados em magenta e são indicados extremos de distância angular (0° = dorsal, 180° = ventral). Em linhas gerais, esses dados mostram a distribuição de pixels mais escuros (valores de intensidade entre 0-150) em (A,B,E,F) ROIs nãoblados quando comparados com ROIs (C,D,G,H), independentemente do tratamento. Dados de ROIs ablados mostram (C,G) distribuição centralizada (100° ± 15°) de pixels mais leves (valores de intensidade entre 150-250) no grupo de tratamento DMSO que (D,H) expande dorsalmente (para ~50°) e ligeiramente ventrally (por ~5°) em larvas tratadas pelo IWR-1. (G,H) Estas zonas centrais de ablação sem pigmento são destacadas por pontas de flecha azul. Setas pretas indicam a localização do nervo óptico. Imagens de larvas tratadas com DMSO também são mostradas na Figura 3. Barras de escala = 40 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 10
Figura 10: Resultados do grupo e comparação estatística derivados da quantificação automatizada da regeneração de RPE em valores medianos binificados de 5 graus e 95% de envelopes de confiança derivados dos dados brutos para cada grupo. O enredo mostra semelhança entre os grupos MTZ (linhas pretas e cinzas) através do comprimento dorsal (0°) ao ventral (180°) do RPE com diferenças notáveis entre e entre os grupos MTZ+ (linhas azuis e vermelhas) no RPE central (área azul claro sombreada entre ~40-140°). Especificamente, a intensidade média do pixel aparece mais leve (0 = preto e 255 = branco) no IWR-1 MTZ+ 4 dpi quando comparado a qualquer outro grupo de tratamento, o que corresponde à diminuição da pigmentação central de RPE. (B) Uma comparação estatística dos valores medianos derivados de caixas de 1 grau através do comprimento dorsal (0°) ao ventral (180°) do RPE para DMSO MTZ+ 4 dpi e IWR-1 MTZ+ 4 dpi reforça a observação em (A). Os valores foram calculados utilizando-se uma simulação de permutação com 20.000 repetições e um teste de dois lados para cada bin de 1 grau. Sob a hipótese nula de que os dois grupos possuem valores medianos semelhantes para qualquer bin de 1 grau correspondente, um valor p ≤ 0,05 indica uma diferença estatisticamente significativa entre as medianas do grupo (linha preta tracejada = intervalo de confiança de 95% (IC)). A presença de valores p ≤ 0,05 em todo o RPE central (área azul claro sombreada entre ~40-140°) indica significativamente menos pigmentação em larvas tratadas com IWR-1 abladas (MTZ+). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nome variável Tipo variável Tamanho variável Descrição variável
ROIname Célula {N x 1} Nomes dos arquivos ROI processados
ROIxy Célula {N x 1} Vértices ROI para cada arquivo ROI processado
IMGname Célula {N x 1} Nomes dos arquivos de imagem TIF processados
IMG Célula {N x 1} Dados de imagem brightfield de 8 bits para cada TIF processado
ROIBW Célula {N x 1} Máscara de ROI lógica (0 ou 1) com as mesmas dimensões das imagens IMG
Cline Célula c/ Tabelas {N x 1} (n x 16) Dados de linha central para imagens individuais, incluindo x, y, distância, ângulo, índice, # de pontos e estatísticas
CIdx Célula {N x 1} Dados de índices de linha central relacionando máscara roi apontam para o ponto central mais próximo para o cálculo de CLine
CLineBW Célula {N x 1} Matriz lógica (0 ou 1) com as mesmas dimensões das imagens IMG indicando a localização da linha central (=1)
RAW_data Mesa N x 3 Tabela combinando todos os dados brutos para cada pixel nos ROIs em todas as diferentes imagens IMG
BIN_1_deg_all Mesa N x 9 Tabela contendo dados e estatísticas binados de 1 grau usando os dados de RAW_data
BIN_5_deg_all Mesa N x 9 Tabela contendo dados e estatísticas binados de 5 graus usando os dados de RAW_data
BIN_10_deg_all Mesa N x 9 Tabela contendo dados e estatísticas binados de 10 graus usando os dados de RAW_data

Tabela 1: Descrição das variáveis exportadas do script RpEGEN.m para o arquivo MAT. As definições são as seguintes: ROI(s) = região(s) de interesse; TIF = formato de arquivo de imagem marcado.

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Discussion

Este protocolo descreve a metodologia para ablto genético do RPE e mecanismos de estudo de degeneração e regeneração em zebrafish envelhecidos em larvas. Este protocolo também foi realizado com sucesso em zebrafishadulto 3, mas com caracterização menos extensa, e é por isso que as larvas são o foco aqui. Aspectos críticos desta parte do protocolo (etapas 1-4) incluem: 1) adicionar 1,5x PTU a embriões antes do início da melanogênese, 2) descorioar embriões tratados com PTU em 2-3 dpf, 3) triagem cuidadosa para eGFP, e 4) tempo de mudanças de água durante a ablation genética com MTZ. A PTU inibe a síntese de melanina 21,22 e tem sido utilizada neste paradigma de ablação de RPE para facilitar a triagem para a expressão transgê geral rpe65a:nfsB-eGFP e permitir a caracterização de processos degenerativos e regenerativos de RPE com base na ausência e retorno subsequente, respectivamente, do tecido pigmentado 3. Como a PTU inibirá mais pigmentação, mas não tecidos de despigment uma vez que a melanogênese tenha começado21, ptu deve ser adicionado antes do início da pigmentação, que começa em torno de 24 hpf em zebrafish25. Aqui, e em estudos anteriores 4,5, ptu foi adicionado em aproximadamente 6 hpf26 para garantir a inibição antes da síntese de melanina começar. Embora a PTU permita a visualização das principais etapas do protocolo, o tratamento de PTU pode afetar alguns aspectos do desenvolvimento (como discutido na etapa 2.3) e prejudicar a eclosão de embriões. Este último processo, se adiado por muito tempo, pode levar a déficits de morfologia e motilidade e afetar a viabilidade40; assim, descorioar embriões (incubação) enzimáticamente com pronase ou usar manualmente fórceps em 2-3 dpf é importante para manter e padronizar a saúde larval antes da ablação genética. Outra consideração importante para evitar problemas com a saúde e viabilidade larval mais antigas (não relacionada ao tratamento de PTU), é que as larvas devem iniciar regimes de alimentação padronizados se permanecerem fora de um sistema de instalações aquáticas após 9 dpf/4 dpi para experimentos41.

Como explicado, rpe65a impulsiona a expressão transgênica em RPE maduro nos dois terços centrais do olho posterior. A expressão do eGFP em larvas de 5 dpf tratadas com PTU é normalmente facilmente detectada e visivelmente intensa (brilhante), como mostrado na Figura 1. Larvas que expressam mal o eGFP a 5 dpf em comparação com irmãos com expressão brilhante também podem ser observadas. A variação nas relações de intensidade de expressão (ou seja, brilhante versus dim) entre gerações também pode existir, com algumas gerações tendo larvas mais mal expressas do que outras. De qualquer forma, larvas com expressão dim eGFP geralmente representam uma minoria dos animais em cada embreagem. Embora não se saiba se as larvas mal expressas apresentam fenótipos de lesão RPE menos graves, as ablações foram realizadas na brilhante coorte eGFP+ de cada embreagem e irmãos relativamente fracos foram eutanizados na triagem e excluídos da análise. Da mesma forma, a caracterização extensiva dos fenótipos de ablação e regeneração de RPE de zebrafish tem sido realizada em larvas heterozigosas para o transgene rpe65a:nfsB-eGFP, através do cruzamento rpe65a:nfsB-eGFP adultos heterozigosos para adultos wildtype3. É improvável, no entanto, não saber se larvas homozigos para rpe65a:nfsB-eGFP apresentam fenótipos de ablação mais severos. Outros esforços para padronizar o protocolo de ablation incluem a adição de volumes iguais e medidos (por exemplo, 30 mL por placa de Petri de 10 cm) às placas MTZ e MTZ+ durante o período de ablação genética de 24 horas. Da mesma forma, as larvas em pratos de tratamento farmacológico receberam volumes iguais e medidos (por exemplo, 5 mL por 6-well) e reposição oportuna de compostos frescos (por exemplo, a cada 24 h). Ao manusear pratos com diferentes tratamentos compostos MTZ e/ou farmacológicos, devem ser tomadas medidas cuidadosas para evitar derramamentos e contaminação cruzada inadvertida durante o transporte e mudanças de água.

O protocolo de ablação de RPE de zebrafish pode ser modificado para incluir manipulação farmacológica (etapa 5). Isso foi feito anteriormente para identificar vias de sinalização de resposta imune5, mTOR4 e Wnt3 como reguladores críticos da regeneração do RPE; Este último tem se mostrado repetível aqui e foi usado para validar o RpEGEN. Além de iluminar caminhos críticos de regeneração de RPE, a manipulação farmacológica tem sido amplamente empregada para estudos de regeneração da retina de zebrafish 10,42,43,44,45,46,47. Antes da incorporação no protocolo de ablação do RPE, os agentes farmacológicos devem ser rigorosamente avaliados quanto à toxicidade, eficácia e duração do tratamento. Isso pode ser feito por: realizar experimentos de resposta a doses para avaliar a toxicidade48; avaliação da expressão de genes/proteínas-alvo conhecidos 4,5; e avaliando as consequências funcionais conhecidas da manipulação farmacológica, por exemplo, o esgotamento dos leucócitos com tratamento PLX3397 48,49,50,51. Aqui, DMSO (controle de veículos) e IWR-1 foram adicionados 24 h antes da ablação genética e as larvas foram examinadas imediatamente antes do pré-tratamento farmacológico em 4 dpf. Enquanto as larvas eGFP+ são distinguíveis das larvas eGFP em 4 dpf, a intensidade do eGFP pode parecer bastante fraca, razão pela qual as larvas foram reteladas para a expressão eGFP em 5 dpf (Resultados Representativos). A triagem para eGFP antes de 4 dpf pode ser difícil, pois a expressão pode ser tão baixa a ponto de ser indetectável ao olho. Assim, o pré-tratamento com agentes farmacológicos antes de 4 dpf (ou seja, em 2 dpf)4 pode ser adicionado a larvas não polidas que serão separadas em 5 dpf quando o eGFP estiver claramente visível. Em qualquer cenário em que as larvas precisem ser manipuladas (por exemplo, durante a triagem, incorporação de imagens, etc.), as condições de tratamento farmacológico devem ser mantidas e, independentemente da idade de triagem, a RPE deve ser ablada com MTZ em 5 dpf.

Além do protocolo de ablação genética, são delineadas instruções passo a passo para pré-processamento de imagens de microscópio confocal e quantificação automatizada da regeneração de RPE usando RpEGEN (etapas 6-7). O RpEGEN foi criado para padronizar a quantificação de regeneração de RPE entre os usuários e aumentar a robustez do conjunto de dados de saída, minimizando vieses intrínsecos que podem vir com a quantificação manual tediosa feita anteriormente. Aspectos críticos desta parte do protocolo são realizados durante a geração de ROI (etapa 6). Primeiro, a imagem/olho deve estar na orientação dorsal para cima, d distal esquerda (por exemplo, Figura 3A-D, Figura 4) como RpEGEN foi otimizado para essa direcionalidade. Também é fundamental que as extremidades dorsal e terminal ventral dos ROIs RPE afunilam para uma ponta pontiaguda, como mostrado na Figura 3B',B,"D',D" (linhas magenta). Se essas extremidades forem ao quadrado ou arredondadas, o script RpEGEN pode ter dificuldade em determinar os pixels de início e extremidade do esqueleto da linha central e pode gerar esporas nas extremidades do ROI terminal em vez de uma linha centralizada (Figura 4B). Esporas nas extremidades do ROI terminal podem levar ao encurtamento da linha central durante o deses spurring (Figura 4D) e/ou problemas com medições de distância angular no RPE periférico (Figura 4G). Sistemas de nomeação idênticos para os arquivos TIF e ROI correspondentes a cada larva individual também é um passo significativo e imperativo para emparelhar o arquivo TIF de 8 bits com o ROI correto em RpEGEN. Nomes de arquivos TIF e ROI incompatíveis resultarão em falha na geração do fluxo de trabalho de processamento RpEGEN descrito na seção Resultados Representativos (Figura 4) e, em última instância, impedirão a quantificação de regeneração do RPE usando este script.

Coletivamente, este protocolo fornece instruções para abltoar com sucesso o RPE em zebrafish larval, manipular caminhos de sinalização que possam ser de interesse pré, durante ou pós-RPE, e quantificar a regeneração de RPE de forma padronizada com vieses inerentes limitados. No contexto dos modelos in vivo e in vitro disponíveis para estudar o potencial regenerativo do RPE, o zebrafish é único em sua capacidade de regeneração intrínseca de RPE14. No entanto, trata-se de um modelo agudo de lesão de RPE, não crônico, assim como as doenças degenerativas do RPE voltadas para o desenvolvimento terapêutico (por exemplo, AMD). Embora esta seja uma limitação do modelo, continua a ser uma excelente plataforma para estudar os mecanismos de regeneração de RPE, que são amplamente desconhecidos, e podem ser adaptáveis no futuro para estudar lesões crônicas e doenças. As ferramentas e metodologia aqui descritas são versáteis e também podem ser aplicadas a estudos de processos celulares envolvidos na resposta degenerativa e para estudar o destino dos tecidos adjacentes ao RPE após a ablação. Da mesma forma, o script RpEGEN poderia ser modificado para atender às necessidades de saída de dados do usuário; por exemplo, realizar análises espaciais de marcadores diferentes do pigmento (por exemplo, sondas de hibridização in situ , expressão proteica, etc.).

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Disclosures

L.L.L. é o co-inventor da Patente dos EUA nº 9.458.428, que descreve um método acelerado para derivar o epitélio do pigmento da retina a partir de células-tronco pluripotentes humanas; não tem relação com o conteúdo aqui. J.M.G. e G.B.F. não têm nada a revelar.

Acknowledgments

O trabalho aqui descrito foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (RO1-EY29410 a J.M.G, e nih CORE Grant P30-EY08098 para o Departamento de Oftalmologia); o Centro de Transplante e Terapia Imunológica da UPMC (para L.L.L. e J.M.G.); e a Cadeira E. Ronald Salvitti em Pesquisa oftalmológica (para J.M.G.). Apoio adicional foi recebido da Wiegand Fellowship em Oftalmologia (para L.L.L), da Eye & Ear Foundation de Pittsburgh, e de uma bolsa irrestrita da Research to Prevent Blindness, Nova York, NY. Os autores também desejam agradecer amanda Platt por assistência técnica e Dr. Hugh Hammer e a equipe aquática para um excelente apoio aos animais.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) Millipore Sigma D9542
6-well plates Fisher Scientific 07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 05-539-13 Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing pen Fisher Scientific 50-254-51 Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % Fisher Scientific BP231 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large) Fisher Scientific 3720A
Embryo incubator (mini/tabletop) Labnet I5110A
Fluorescence stereo microscope Zeiss Axio Zoom.V16 Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-4 Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo Millipore Sigma 5.04462 Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder) Fisher Scientific BP117-100 Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ) Millipore Sigma M3761 Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU) Millipore Sigma P7629 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free Fisher Scientific AA433689M Chemical waste, proper disposal required
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712 10 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets) Millipore Sigma P3813 Used to make 10 X PBS stock
Pronase Millipore Sigma PRON-RO
Shaking incubator Benchmark H2010 Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscope Leica S9i Or similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forceps Fine Science Tools 91150-20 Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shaker Scilogex SK-D1807-E
Transfer pipette Millipore Sigma Z135003 3.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Pentair TRS1, TRS2, TRS5 Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ) FIJI (Fiji is Just ImageJ) https://imagej.net/software/fiji/ Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tos MathWorks https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB support MathWorks https://www.mathworks.com/support.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Ablação Mediada por Nitroreductase/Metronidazole e uma Plataforma MATLAB (RpEGEN) para estudar a regeneração do Pigmento Retinal de Zebrafish Epithelium
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Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross,More

Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross, J. M. Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (181), e63658, doi:10.3791/63658 (2022).

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