Summary
该协议描述了使用转基因斑马鱼模型对视网膜色素上皮（RPE）进行遗传消融的方法。使用药理学化合物调整方案以纳入信号通路调节被广泛详细。开发了一种基于色素沉着的量化RPE再生的MATLAB平台，并进行了介绍和讨论。
Abstract
视网膜色素上皮（RPE）位于眼睛的后部，执行维持邻近视网膜和血管组织的健康和完整性所必需的功能。目前，哺乳动物RPE的修复能力有限，仅限于小损伤，阻碍了理解 体内 RPE再生过程的进展。在这里，提供了一个详细的方法，以促进利用斑马鱼的 体内 RPE修复的研究，斑马鱼是一种能够进行强大组织再生的脊椎动物模型。该方案描述了转基因硝基还原酶/甲硝唑 （NTR/MTZ） 介导的损伤范式 （rpe65a：nfsB-eGFP），其在 MTZ 治疗 24 小时后可消融 24 小时后消融 RPE 的中央三分之二，随后组织恢复。重点放在斑马鱼幼虫的RPE消融上，并概述了测试药理学化合物对RPE再生的影响的方法。还讨论了RpEGEN的生成和验证，RpEGEN是一种MATLAB脚本，用于基于色素沉着自动量化RPE再生。除了活性RPE修复机制外，该方案还可以扩展到RPE变性和损伤反应的研究，以及RPE损伤对邻近视网膜和血管组织以及其他细胞和分子过程的影响。这种斑马鱼系统在识别驱动RPE再生和RPE疾病相关机制的基因，网络和过程方面具有重大前景，其长期目标是将这些知识应用于哺乳动物系统，并最终实现治疗发展。
Introduction
本文描述的方法详细说明了利用斑马鱼幼虫遗传消融视网膜色素上皮（RPE）的方案。RPE延伸到眼睛的后部，位于神经视网膜的分层层和构成脉络膜的脉管系统层之间。营养支持，光毒性光的吸收和视觉周期蛋白的维持只是RPE执行的一些关键功能，这些功能对于维持这些相邻组织的健康和完整性至关重要1。当病变较小时，对哺乳动物RPE的损害是可以修复的2;然而，较大的损伤或进行性退行性疾病所遭受的损害是不可逆的。在人类中，RPE 退行性疾病（例如，年龄相关性黄斑变性 （AMD） 和 Stargardt 病）导致永久性视力丧失，并且由于可用的治疗选择很少，患者生活质量下降。哺乳动物RPE自我修复能力有限，这在RPE再生过程领域造成了知识空白。鉴于斑马鱼在许多不同组织类型中具有强大的再生能力，该方案旨在建立 体内 脊椎动物系统，以促进对内在再生RPE的研究，并揭示驱动该反应的机制。使用此处概述的消融范式，规范的Wnt信号通路3，mTOR通路4和免疫相关反应5 已被确定为RPE再生的关键介质，可能具有重叠的功能。
在这种遗传消融范式中，斑马鱼（rpe65a：nfsB-eGFP）3表达细菌来源的硝基还原酶（NTR / nfsB）基因6在RPE增强子元件rpe65a7的控制下融合到eGFP。消融是通过在斑马鱼系统水中加入前体药物甲硝唑（MTZ）来实现的。硝基还原酶对MTZ的细胞内活化导致NTR / nfsB表达细胞8，9中的DNA交联和凋亡。该技术已广泛应用于斑马鱼中，以消融视网膜10，11，12，13和其他组织的细胞8。这些元素共同实现了诱导细胞消融方法（NTR / MTZ）8，9和荧光标记物（eGFP）的靶向表达（rpe65a）以进行可视化。
还存在其他有趣的 体内 模型，可用于研究RPE14的再生潜力。这些是广泛的，包括两栖动物视网膜切除术后的RPE到视网膜转分化，其中因视网膜再生而失去的RPE细胞被替换15，16;RPE修复损伤后“超强愈合”MRL/MpJ小鼠17;和自发性RPE和视网膜变性18的大鼠模型中RPE增殖的外源性刺激等。体 外 模型，如成人人RPE干细胞（RPESCs）19 也被开发出来。这些模型都是有价值的工具，用于揭示与RPE再生相关的细胞过程（例如，增殖，分化等）;然而，斑马鱼在消融后具有固有的RPE修复能力方面是独一无二的。
虽然这里的方法是为了专注于理解驱动RPE再生的机制， 但Tg（rpe65a：nfsB-eGFP） 系和这种遗传消融方案可用于研究其他细胞过程，如RPE凋亡，RPE变性以及RPE损伤对邻近视网膜和血管组织的影响。消融方案也可以修改以包括药物操作，这是筛选目标信号通路的便捷初步策略。例如，使用 Wnt 反应抑制剂 -1 （IWR-1）20 阻断规范的 Wnt 途径已被证明会损害 RPE 再生3。这里重复了这一点，以指导用户完成药理学操作实验，并作为概念验证，以验证为根据色素沉着的恢复来量化RPE再生而创建的MATLAB脚本（RpEGEN）。与转基因系和消融方案一样，RpEGEN脚本具有适应性，可用于量化RPE中的其他标记物/细胞过程。
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Protocol
此处概述的所有方法均符合匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的要求。
1.斑马鱼胚胎收集前的准备
- 将胚胎培养箱设置为28.5°C。
- 制备黑色素生成抑制剂N-苯基硫脲（PTU）21，22的25x储备溶液。该储备溶液根据常用配方22进行缩放，1x等于每体积0.003%重量（%w / v）（例如，将0.003 g PTU粉末放入100 mL液体溶剂中）。
- 要制作25x PTU大储备溶液，将0.75gPTU粉末加入1L纯化去离子水（以下称为dH2O）中，并使用搅拌棒和搅拌板在室温（〜25°C）下充分混合。在4°C下储存长达3个月，避光。
注意：很难使PTU进入水溶液中，并且可能需要延长搅拌过夜。
注意：PTU是危险的，应注意防止摄入，吸入和/或与皮肤或眼睛接触。根据国家和机构法规，PTU粉末和本文中描述的所有PTU液体衍生物可能需要作为化学废物进行处理。建议在使用前确认适当的PTU废物处理方法（如果有的话）。 - 要制造1.5x PTU工作溶液（以下简称1.5x PTU），请在940 mL斑马鱼围栏设施水（以下简称系统水）中加入60 mL的25x PTU储备溶液。23 描述了斑马鱼的最佳水质参数，水生设施应制定标准的水监测程序。在28.5°C下储存1.5倍PTU，避光1-2周。
注意：该方案常规使用步骤1.2中描述的PTU浓度，溶剂和储存参数执行。作为预防措施，在 PTU 中应每 1-2 天观察一次胚胎/幼虫，以验证疗效并确认持续脱色。如果怀疑 PTU 溶解度/功效降低，应优化溶解和/或储存条件。
- 要制作25x PTU大储备溶液，将0.75gPTU粉末加入1L纯化去离子水（以下称为dH2O）中，并使用搅拌棒和搅拌板在室温（〜25°C）下充分混合。在4°C下储存长达3个月，避光。
- 通过向100 mL dH2O中加入0.05g亚甲蓝粉末来制备0.05%w / v亚甲基蓝的储备溶液，真菌生长抑制剂。使用搅拌棒和搅拌板充分混合。储存在4°C。
- 通过使用金刚石笔尖划线笔切回玻璃巴斯德移液器的锥形末端，准备用于胚胎/幼虫操作的移液器（例如，在培养皿之间移动胚胎/幼虫，在荧光筛选期间分离幼虫，将安乐死幼虫收集到微量离心管中进行固定等）。用金刚石笔在移液器的圆周上蚀刻，然后轻轻拉动或扣断末端以使其完全断裂。
注意：移液器的口应光滑且足够宽，以便轻松吸收仍在绒毛膜内的胚胎而不会剪切。使用灯泡拉伸转移移液器作为替代方法。准备好的移液器也可用于在换水（而不是倒入）期间去除液体，以最大限度地减少胚胎/幼虫的损失。 - 在1x磷酸盐缓冲盐（PBS）中制备4%多聚甲醛（PFA）溶液（例如，向4mL 10x PBS和26mL dH 2 O中加入10mL的16%PFA）。在4°C下储存长达4周，避光。
注意：多聚甲醛是一种危险化学品，应在化学通风橱中处理并妥善处理。应注意，并应穿戴个人防护装备（PPE），以防止摄入、吸入和/或与皮肤或眼睛接触。
2.斑马鱼胚胎在基因消融前的收集和维持（受精后0-5天）
- 维持斑马鱼成虫，如前所述3，4，5。在胚胎收集前的下午/晚上，将成年斑马鱼分离到繁殖池中产卵。
- 第二天早上（受精后0天（dpf）），将胚胎收集到系统水中直径10厘米的培养皿中，并取出所有不活跃或未受精的卵子，这些卵子将显得不透明和/或显示不规则的细胞质和失败的裂解24。
注意：正常切割和发育分期事件在健康胚胎中将很明显，如上所述25。在整个方案中，培养皿应保持四分之三的满量（对于直径为10cm的培养皿，约30 mL）。- 向每个培养皿中加入两滴0.05%w / v亚甲基蓝，轻轻混合，并将胚胎储存在28.5°C，用于方案的其余部分。
- 受精后约6小时（hpf）4，5，26，用1.5x PTU（步骤1.2.2中制成的工作溶液）替换胚胎培养皿中的系统水并补充亚甲蓝。
注意：在色素沉着发作之前（即在24 hpf之前）25必须将PTU添加到胚胎中，因为添加PTU21后已经着色的组织不会脱色。然而，应该注意的是，PTU处理的斑马鱼27，28，29中报告了眼睛尺寸减小，眼部和颅面功能障碍以及某些信号通路（例如甲状腺信号传导）的破坏。PTU的发展毒性似乎取决于PTU添加27，29的浓度和时间。如上所述，验证PTU功效（步骤1.2），还应仔细监测PTU毒性的迹象，如果怀疑，应优化PTU加用的工作浓度和/或时间。 - 在2-3 dpf上，使用新鲜制作的促胰岛素溶液对胚胎进行去皮化。
- 通过涡旋将蛋白酶溶解在1.5x PTU中，浓度为2mg / mL。
注意：Pronase被包装成非常细的粉末，是一种刺激物。采取措施避免吸入和/或接触皮肤、眼睛等。 - 将孵化的胚胎与未孵化的胚胎分开，仅对未孵化的胚胎进行原酶处理。
- 用步骤2.4.1中制备的2mg / mL促酶溶液替换1.5x PTU，并在未孵化的胚胎上以轻柔的搅拌（例如，在桌面旋转器/摇床上或通过手动旋转）留在未孵化的胚胎上4-5分钟。
- 倒出促酶溶液，立即用新鲜的1.5倍PTU冲洗。轻轻地研磨1.5x PTU，用球吸转移液管冲洗胚胎。
- 重复第二次 1.5 倍 PTU 冲洗以丢弃所有绒毛膜碎屑，然后补充 1.5 倍 PTU 进行维护。
注意：胚胎也可以使用细尖的镊子手动去皮。在这种情况下，应清除脉络膜碎屑，并在手动去皮后补充1.5倍PTU。
- 通过涡旋将蛋白酶溶解在1.5x PTU中，浓度为2mg / mL。
- 监测胚胎/幼虫健康，每1-2天补充1.5倍PTU。胚胎/幼虫保持在1.5x PTU中，直到以5 dpf消融。
注：步骤 2.3 和 2.4 的重要性将在“讨论”部分进一步讨论。
3. 斑马鱼幼虫的rpe65a：nfsB-eGFP和视网膜色素上皮的遗传消融（受精后5-6天）
- 在5 dpf（消融日）上制作新鲜的10mM甲硝唑（MTZ）溶液。此过程需要 2 小时才能完成。
- 将MTZ粉末加入没有PTU的系统水中，并通过剧烈摇动（例如，每分钟250转）在37°C下彻底混合1小时。
- 在室温下，在台式旋转器/摇床上冷却10 mM MTZ溶液，并确保在将幼虫添加到培养皿之前完全溶解。
注意：eGFP + 幼虫的荧光筛选和分离（步骤3.2）可以在37°C和室温孵育期间进行。
注意：MTZ是危险的，应注意防止摄入，吸入和/或与皮肤或眼睛接触。根据国家和机构法规，MTZ粉末和本文中描述的所有液体衍生物可能需要作为化学废物进行处理。建议在使用前确认适当的MTZ废物处理方法（如果有的话）。
- 筛选斑马鱼幼虫的 rpe65a：nfsB-eGFP转基因。
- 使用荧光立体显微镜和488nm激发激光/滤光片，用0.168g / L三卡因（MS-222）麻醉幼虫，并将转基因（eGFP +）幼虫（图1）与非转基因（eGFP-）幼虫分开。
注意：应将三卡因添加到1.5x PTU和/或药理学化合物溶液中，因为幼虫在筛查eGFP时应保持浸没在治疗中。仅在筛选期间在三卡因中孵育幼虫（例如，对于含有50只幼虫的10cm培养皿，≤10分钟）。 - 通过直接移液到培养皿中，立即唤醒筛选的幼虫，其中含有新鲜的1.5x PTU，不含三卡因。
- 在完成筛选后，将eGFP + 幼虫进一步分成两组培养皿：一组接受MTZ处理（消融/ MTZ +），一组作为未升压（MTZ-）对照组。
- 使用荧光立体显微镜和488nm激发激光/滤光片，用0.168g / L三卡因（MS-222）麻醉幼虫，并将转基因（eGFP +）幼虫（图1）与非转基因（eGFP-）幼虫分开。
- 消融视网膜色素上皮。
- 从未升压 （MTZ-） 控制培养皿中取出 1.5 倍 PTU，并在不使用 PTU 的情况下添加新鲜系统水。
- 从消融（MTZ +）处理皿中取出1.5倍PTU，并加入新鲜制作的10 mM MTZ溶液（步骤3.1）。
- 在正好24小时（指定为损伤后1天（dpi））后取出10 mM MTZ溶液，并在没有PTU的情况下加入新鲜系统水。更换MTZ培养 皿上没有PTU的新鲜系统水。在方案的其余部分，幼虫不会再次暴露于PTU。
注意：在溶液交换之间移液或倒出所有1.5x PTU（步骤3.3.1和3.3.2）或10 mM MTZ（步骤3.3.3）可能很困难，因为动物正在积极地游来游去。在这种情况下，可以添加不含PTU的系统水洗涤，以确保成功更换溶液。
4. 遗传消融术后幼虫维持（受精后6天以上）
- 每天检查幼虫并补充没有PTU的系统水，直到安乐死（步骤5.6）或返回斑马鱼住房设施。
- 使用体视显微镜上的透射光照明，以2 dpi（7 dpf）监测 体内 消融的成功和程度（图2）。
5. 将药物治疗纳入斑马鱼视网膜色素上皮消融方案
注意：与之前执行3一样，此处概述了从4 dpf开始使用15μM IWR-1或体积匹配的二甲基亚砜（DMSO）载体控制进行处理，作为测试RpEGEN的示例实验。浓度和时间表可能因不同的药理学化合物而异，讨论部分讨论了剂量反应验证，治疗持续时间，筛选和药理学操作研究实验设计的其他方面的建议。如果需要进行影像分析，请执行步骤 6 和 7。
- 按照步骤2中所述收集和维持胚胎。以2 dpf对胚胎进行去皮化。
- 按照步骤3.2所述，以4 dpf对eGFP + 幼虫进行筛选。而不是培养皿，将eGFP + 幼虫放入6孔板中，密度为n≤每6孔10个幼虫进行药物治疗。为将要未消融的幼虫（MTZ-）和将要消融的幼虫（MTZ +）指定单独的6孔板。
注意：eGFP 信号在 4 dpf 上可见，但在 5 dpf 上看起来比信号强度暗。 - 在使用10 mM MTZ溶液进行基因消融之前，用15μM IWR-1或体积匹配的DMSO载体对照预处理4 dpf eGFP + 幼虫24小时。
注意：通常，药物治疗实验只需要很少的化合物。为了避免称出少量的IWR-1粉末，该药理化合物已经在DMSO溶液中购买，浓度为25 mM，并在抵达时等分到较小的体积中，以避免重复的冻融循环。- 确定所需的药物和载体对照治疗的体积，并相应地将1.5x PTU等分到锥形管中。建议 5 mL/孔 6 孔板的体积。
- 将 IWR-1 储备液加入 1.5x PTU，最终浓度为 15 μM IWR-1（例如，每 5 mL 1.5x PTU 中 3 μL 25 mM IWR-1）。将匹配体积的 DMSO 储备液加入 1.5 倍 PTU（例如，每 5 毫升 1.5 倍 PTU ≥ 99.7% DMSO）。在这里，这最终将产生0.06%体积/体积（% v / v）DMSO的最终浓度。通过涡旋充分混合，并直观地确认化合物的溶解。
注意：DMSO、IWR-1 和其他药理化合物和溶剂可能需要作为化学废物处理，具体取决于州和机构法规。建议在使用前确认这些化合物的危险水平和适当的废物处理方法（如果有的话）。 - 从6孔板中的eGFP + 幼虫中除去1.5x PTU，并从步骤5.3.2中加入5mL /孔中新鲜制作的0.06%v / v DMSO或15μM IWR-1处理。
- 在 5 dpf 时，消融 RPE。除了24小时的预处理（步骤5.3）外，幼虫还将在10 mM MTZ的遗传消融24小时和消融后恢复期间保持浸入药理学和载体对照治疗中，直到固定（例如，从4-9 dpf）。
- 在进行基因消融前2小时制作10 mM MTZ溶液（步骤3.1）。
- 确定未稀释 （MTZ-） 和烧蚀 （MTZ+） 6 孔板所需的药理学和载体对照处理的体积，并将适当体积的无 PTU （MTZ-） 或 10 mM MTZ 溶液 （MTZ+） 的新鲜系统水等分试样放入锥形管中。这将产生四种处理条件：1）0.06%v / v DMSO，MTZ-;2） 15 μM IWR-1， MTZ-;3） 0.06% v/v DMSO， MTZ+;和 4） 15 μM IWR-1， MTZ+。
- 按照步骤5.3.2中的步骤，将IWR-1和DMSO储备溶液添加到相应的锥形管中。通过涡旋充分混合，并直观地确认化合物的溶解。
- 从指定的未升压（MTZ-）和烧蚀（MTZ+）6孔板中取出1.5倍PTU（步骤5.3.2）中的0.06%v / v DMSO和15μM IWR-1处理，并用步骤5.4.3中的适当处理补充。
- 在10 mM MTZ溶液中去除0.06%v / v DMSO和15μM IWR-1处理，精确24小时后，并在没有PTU的新鲜系统水中补充处理。在未稀释 （MTZ-） 6 孔板上补充 0.06% v/v DMSO 和 15 μM IWR-1 处理，无需 PTU 的新鲜系统水。
- 按照步骤4中概述的消融后进行幼虫维持，并在没有PTU的系统水中每天补充0.06%v / v DMSO或15μM IWR-1处理。
- 通过将动物浸入0.3g / L三卡因溶液（致命过量）中并快速冷却（例如， 将培养皿放在冰上）以9 dpf（年龄匹配的MTZ处理的兄弟姐妹为4 dpi）对幼虫实施安乐死至少20分钟30。检查以确保幼虫对触摸无反应，并在室温下或在4°C过夜时以4%PFA（步骤1.5）固定3小时。
- 在共聚焦显微镜上处理固定后幼虫组织以进行z-stack图像采集，如前面5，31 和此处的代表性结果部分所述。步骤6和7中的分析至少需要获取核标记物（例如DAPI）和明场z-stack图像。
6. 斐济共聚焦显微镜z-stack图像预处理（ImageJ）
- 使用FIJI32导入共聚焦显微镜z-stack图像并设置其格式。
- 使用设置为“查看堆栈”的“ 生物格式导入选项” 打开显微镜图像 ：超堆叠 和 颜色模式：灰度。
- 通过选择图像投影来生成导入的显微镜图像的最大强度 投影|堆栈|Z 项目。在 ZProjection 窗口中，设置 “开始切片” 和 “停止切片” 以包括该图像的所有切片。例如， 将 “开始切片：1” 和 “停止切片：18 ”设置为总共包含 18 个切片的 z 堆栈。选择 投影类型：最大强度 ，然后单击 确定。
- 通过选择“图像|将最大强度投影文件转换为 8 位图像（如果尚未 转换为图像）类型 |8 位。
- 通过选择“图像”，重新定向图像，使背侧向上并留下远端（即镜头），方法是选择“图像|转换|水平翻转（对于最后一个命令，请选择最适合该图像所需方向性的选项）。对于多通道图像，请单击“进程堆栈？” 窗口以重新定向所有通道。
注意：此步骤至关重要，但如果图像已经位于背侧向上，左远端方向，则不需要此步骤。请参阅图3A-D和图4，了解眼睛在正确方向上进行处理的图像。 - 通过选取“文件|，将 8 位最大强度投影存储为标记图像文件格式 （TIF） 文件另存为|蒂夫....
- 使用斐济生成感兴趣的 RPE 区域 （ROI）。
- 打开按照步骤 6.1 中所述生成的 8 位 TIF 映像。通过选择 “分析|”启动 ROI 管理器工具|投资回报率经理。
- 使用 图像| 在 DAPI 和明场通道之间缩放和切换，以识别 RPE 顶侧与外限制膜 （OLM） 尖端相邻的点（图 3B'， B“， D'， D”;蓝色箭头）。使用此解剖学里程碑作为 ROI 起点。
- 使用多边 形选择 工具（位于斐济工具栏中）使用 DAPI 和明场图像通道以及缩放功能（图像|缩放）以识别顶端和基底 RPE 边界。将ROI的背端和腹端（即ROI从RPE的顶侧过渡到基底侧）带到尖锐的点，而不是钝化或四舍五入（图3B'，B“，D'，D”;洋红色线）。
注意：创建指向的 ROI 端是使用 RpEGEN 优化端点检测的关键步骤，讨论部分将对此进行介绍。 - 通过在 ROI 管理器中单击 “添加 ”来添加 ROI。根据需要调整投资回报率，然后单击投资回报率管理器中的 更新 。
- 通过选择“更多”来保存 ROI 文件 >> |救。。。 在投资回报率经理内。对匹配的 ROI 和 TIF 图像文件使用相同的名称（例如，[文件名].tif和 [文件名].roi）。
- 将每个条件的 8 位 TIF 和 ROI 文件合并到一个文件夹中。例如， 文件夹DMSO_9dpf将包含 9 dpf 未升压 （MTZ-） 0.06% v/v DMSO 处理的幼虫组的所有匹配的 TIF 和 ROI 文件。
7. 使用RpEGEN脚本对RPE再生进行量化和可视化
- 安装并准备 RpEGEN 脚本。
- 通过单击“代码|从 GitHub 存储库 （https://github.com/burchfisher/RpEGEN） 下载最新的 RpEGEN 脚本 下载压缩文件。
- 解压缩文件夹并将其放置在所需的工作区位置（例如，桌面）。
- 打开 MATLAB。
- 导航到“当前文件夹”窗格中的 RpEGEN 文件夹 （通常位于左侧）。
- 右键单击 RpEGEN 文件夹，然后选择 添加到路径|选定的文件夹和子文件夹。这会将文件夹添加到 MATLAB 路径，以便它可以自动查找并运行该文件夹中的任何脚本。
- 双击“当前文件夹”窗格中的 RpEGEN 文件夹以显示所有子文件夹和 M 文件。
- 双击 RpEGEN.m 文件以在 编辑器 窗格中打开。
- 在 RpEGEN.m 文件的“ 用户定义的变量 ”部分下，输入包含 ROI 文件 （.roi）、图像文件（.tif）的文件夹的目录位置以及应保存输出文件的位置。输入要导出的 .mat 文件的组名（例如，DMSO_9dpf、DMSO_4dpi等）和明场通道在 TIF 图像堆栈中的位置（例如，如果明场是图像堆栈中的第三个通道，则为 3）。如果图像文件仅包含明场图像，则此值应等于 1。
- 运行 RpEGEN.m 脚本并验证结果。
注意：RpEGEN 需要在用户 MATLAB 许可证上激活图像处理工具箱、曲线拟合工具箱以及统计和机器学习工具箱才能运行。此外，需要免费提供的ReadImageJROI工具箱33 才能将斐济投资回报率导入MATLAB;但是，它与不需要任何激活的其他函数M文件一起在RpEGEN文件夹中提供。- 通过单击 MATLAB 顶部“编辑器”菜单中的“运行”按钮来运行脚本。
注意：启动后， “命令 ”窗口将提供指示脚本进度的详细输出。保存包含提取数据的MAT文件后，将出现一个三面板图形，并将其作为PDF保存到每次图像运行的输出目录中。这些是质量控制（QC）数字，以确保一切都正常运行，包括：1）ROI覆盖的明场图像（图4A）;2）具有中心线和相关角距离（度）的ROI（图4G）;3）具有中心线中位数强度值（0-255，8位色标）的ROI（图4H）。等到QC PDF已保存到输出文件夹并且最后一个数字消失后，然后再继续下一步。 - 在任何 PDF 查看器中打开导出到输出文件夹的单个 PDF，并验证所有 ROI 是否与明场图像匹配，中心线值是否为 ROI 中心的合理近似值，以及是否用数据适当地填充了中位数强度值（即，在整个中心线上不是所有相同的值）。
注意：RpEGEN.m 保存在 MAT 文件中的每个变量的详细说明和结构可在 表 1 中找到。
- 通过单击 MATLAB 顶部“编辑器”菜单中的“运行”按钮来运行脚本。
- 运行 RpEGEN_PermPlot.m 脚本。
注意：RpEGEN_PermPlot.m 脚本使用 RpEGEN.m 的输出，通过对两组中位数的排列模拟来运行统计比较，还提供了使用免费提供的 GRAMM 工具箱34 复制本文中的绘图的代码，该工具箱也包含在 RpEGEN 文件夹中。- 双击 RpEGEN_PermPlot.m 文件以在新的 编辑器 选项卡中打开。
- 在RpEGEN_PermPlot.m 文件中 的第 1 部分 - 用户定义变量 下，输入包含运行 RpEGEN.m 的 MAT 文件的输出文件夹的目录位置，并输入要加载的每个 MAT 文件名（例如，DMSO_4dpi.mat、IWR1_4dpi.mat）。
- 通过单击 MATLAB 顶部“编辑器”菜单中的“运行部分”按钮来运行脚本的此部分。
- 在第 2 节中，输入两个组的名称，以便在 data_A 和 data_B 变量（这些是使用排列模拟从中导出中位数的组）中进行统计比较的名称）。在 bin_sz 变量中，输入要对数据集的中位数强度值进行积分的度数（默认值为 1 度条柱）。
注意： reps 变量指示用于构建概率分布的排列数，可以设置为任意数字（默认值为 20，000）。通常，重复次数越多，在统计上就越健壮，但会增加处理时间。 - 通过单击 MATLAB 顶部“编辑器”菜单中的“运行部分”按钮来运行脚本的此部分。根据指定的重复次数，此部分可能需要一些时间才能完成，但会在命令窗口中提供连续的状态更新。
- 使用运行部分按钮独立运行热图图并对结果和 P 值部分进行分组。编辑任何注释为“在此处输入数据”部分的数据变量。这些数字的PDF会自动保存，并且可以在任何矢量软件后处理中轻松修改。
注意： RpEGEN_PermPlot.m 文件中生成的绘图是 临时 的，可能需要根据每个用户的特定数据和可视化需求进行修改。但是，这些数字确实提供了坚实的基础，可以使用MATLAB和GRAMM网站轻松个性化。
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Representative Results
已知抑制规范的Wnt信号通路会显着损害斑马鱼RPE再生使用方案3中描述的遗传消融范式（rpe65a：nfsB-eGFP）和药理学操作方法（IWR-1）。本文重复该实验，验证了一种基于色素沉着的斑马鱼RPE再生量化自动化方法。下面总结的结果涵盖了方案的所有步骤，从受精当天（0 dpf）到使用RpEGEN量化RPE再生。
在斑马鱼幼体中实施RPE消融方案（通过药物操作）
从三个独立的亲本组（N = 3）收集的胚胎开始以1.5x PTU治疗，约6 hpf，并且在1 dpf上视觉上证实了RPE和表面黑素细胞中没有色素沉着。使用2mg / mL的pronase在2 dpf上酶解去胚层化胚胎（步骤2.4）。在4 dpf上，使用三卡因（MS-222）麻醉幼虫，并使用荧光立体显微镜筛选eGFP（步骤3.2和5.2）。将eGFP + 幼虫移入6孔板（n = 10个幼虫/孔），并用0.06%v / v DMSO（载体对照）或15μM IWR-1（步骤5.3）处理。这里报告的幼虫密度最初基于1幼虫/ cm2 生长面积的近似值，并通过随时间的仔细健康监测（例如，游泳膀胱发育）进行验证。eGFP的强度在4 dpf时显得暗淡，因此在5 dpf上重新筛选幼虫以确认明亮的eGFP表达（图1）。RPE65（斑马鱼中的rpe65a）是成熟RPE7 的标志物，并且在硬骨鱼中，视网膜和RPE细胞不断从睫状体边缘区（CMZ）产生，这是视网膜远端尖端的干细胞位，靠近晶状体35。因此，在 rpe65a：nfsB-eGFP转基因系中，越不成熟的RPE存在于外围并出现eGFP- （约占总RPE组织的三分之一），而成熟的，中心三分之二的RPE表达eGFP（图1B;白色箭头）。转基因在松果体中也可见（图1A;黄色箭头），预计 rpe65a 在斑马鱼36中显示出松果体表达。从6孔板中取出相对暗淡或eGFP- 幼虫，并在5 dpf上安乐死。在DMSO或IWR-1处理后24小时，用10mM MTZ处理5 dpf幼虫以消融RPE（步骤3.1，3.3和5.4）。MTZ在正好24小时后（即，以6 dpf / 1 dpi）冲洗掉，以允许RPE再生发生。
每天在体视显微镜上观察幼虫，使用从6 dpf / 1 dpi到9 dpf / 4 dpi安乐死时间的透射光照明。通过MTZ +幼虫（图2B;红色箭头）中MTZ+幼虫中眼睛中央三分之二的色素在体内2 dpi上确认遗传消融的成功（图2B;红色箭头），而7 dpf MTZ-对照兄弟姐妹（图2A）（步骤4.2）。正如预期的那样，2 dpi上没有色素的区域似乎类似于在5 dpf上观察到的rpe65a：nfsB-eGFP转基因表达的区域（图1B）。评估是在2 dpi上进行的，而不是更早的，因为RPE在去除PTU后进行再吸收，并且根据体内观察的时间，如果后者没有完全重新表达，则很难辨别消融的中央RPE和未存活（未升压）外周RPE之间的显着差异。尽管可能存在宏观模糊性，但先前在切片组织中以1 dpi进行的RPE消融是显而易见的，揭示了中心RPE和外核层（ONL;即光感受器）组织完整性的丧失以及细胞死亡的证据（pyknotic nuclei）（图5）3。与组织损失相反，在rpe65a：nfsB-eGFP斑马鱼模型3中，稳健增殖被确定为组织再生的关键驱动因素。早期凋亡反应，其中RPE消融导致邻近组织（例如，光感受器和Bruch膜）的变性;图6A-C）和随后的外周至中心增殖反应，其产生向内移动到损伤部位的异质再生“区域”（图6D-F），已被广泛表征和讨论之前3。
组织制备、共聚焦图像采集和图像预处理，用于使用RpEGEN基于RPE色素沉着的自动定量
在9 dpf / 4 dpi上，DMSO和IWR-1处理的幼虫通过三卡因过量安乐死，并在室温下以4%PFA固定3小时（步骤5.6）。从每个独立亲本组中随机选择4个幼虫进行后续组织处理（N = 3; n = 12个幼虫每次处理）。冷冻保护，冷冻切片（厚度为12μm），使用DAPI进行核复染和盖玻片安装，如步骤5.75，31中所述。使用40x油浸物镜（数值孔径= 1.30）在共聚焦激光扫描显微镜上对来自每个幼虫的具有可见视神经的中央部分进行成像，以1μm z步间隔获取512 x 512像素z-stack图像。每个图像包含来自三个通道的数据：通道1 = 405 nm激发用于DAPI，通道2 = 488 nm激发用于eGFP，通道3 = 用于明场的透射光。由于在明场图像中量化了像素强度，透射光灯电压设置保持不变，并且在同一天对收集的所有用于统计比较的数据进行成像。
使用FIJI预处理共聚焦显微镜z-stack图像，以便按照步骤6所述进行自动定量。如果组织以一种难以产生ROI的方式（例如，撕裂（图 7A;洋红色箭头）或地标障碍物（图 7B;洋红色椭圆形））或倾斜ROI强度测量（例如，从折叠（图7C;洋红色椭圆形））。尽管省略了一些具有这些排除标准的幼虫，但此处的所有数据集都表示N = 3，生物重复次数（幼虫）：n = 11，DMSO MTZ-;n = 10， IWR-1 MTZ-;n = 11， DMSO MTZ+;n = 12， IWR-1 MTZ+.使用DAPI通道，通过首先确定RPE背顶侧（视网膜朝向）与OLM背端直接相邻的点（图 3B'，D';蓝色箭头）（步骤 6.2.2）。由于远端RPE延伸可能因切片而异，因此OLM被用作解剖学标志，以标准化RPE ROI终点并使MATLAB中的角度距离测量标准化（其中0°=背侧ROI终点，180°=腹侧ROI终点）。当使用药物操作或在突变背景中进行RPE消融时，应在预处理和定量之前识别和验证解剖学标志物。在这里，OLM在所有定量的幼虫中都很明显，并且没有被撕裂损害（如 图 7B）或用DMSO或IWR-1治疗。在确定背侧起点后，在RPE的顶侧（背侧至腹侧）之后产生ROI，直到到达腹侧OLM尖端附近的点（图 3B",D";蓝色箭头）。然后，在RPE的顶侧和基底（脉络膜面）之间建立腹侧ROI终点，如步骤6.2.3（图 3B",D";洋红色行）。ROI继续沿RPE的基侧（腹侧至背侧）进行，直到到达与背侧OLM起点相邻的基侧。然后通过创建一个尖背端（图 3B',D';洋红色线）在腹侧完成。遗传消融已被证明会导致中枢eGFP表达的丧失，随着再生的进行而恢复（总结于 图 6)3;因此，根据再生程度和目标时间点eGFP的强度，eGFP通道可能仅用于MTZ中的ROI生成- 群。因此，虽然共聚焦采集也包含eGFP通道图像，但如步骤6.2.3所述，使用DAPI和明场通道完成了ROI生成。在 DMSO 和 IWR-1 处理的 MTZ 中，RPE ROI 生成非常简单- 具有明显色素的顶端微绒毛（图 3B;红色箭头）以及明显色素沉着的细胞体。相同的参数应用于 MTZ+ 幼虫群（图 3D;红色箭头）;然而，由于损伤部位内残留的受损组织，在某些情况下，仅在明场通道中难以描绘顶端微绒毛和色素沉着边界。在这些区域，DAPI通道还用于识别RPE损伤部位内的细胞碎片，该碎片包含在ROI（图3C,D;损伤部位局部细胞碎片的例子用青色箭头表示）。使用未成熟/成熟 RPE 标志物进行免疫染色（例如，ZPR2; 图 6D，E)37 和/或光感受器（例如 ZPR1）37,38 也可用于促进在消融幼虫中概述RPE ROI。
以前，与DMSO处理的兄弟对照组相比，用IWR-1处理的消融幼虫从4 dpf到4 dpi显示出RPE再生的显着损害（图8C）3。据报道，这是中心颜料回收率的百分比，这需要大量先前的模型经验和手动测量角距离以指定再生边界（图8B;黑色箭头）。RpEGEN的创建是为了自动量化RPE再生并减少固有偏差。不仅如此，RpEGEN还支持生成高度健壮的数据集;例如，以前通过手动定量n = 10个DMSO处理的MTZ + 幼虫（图8C;每段测量的色素回收率百分比）3生成了10个数据点，而使用RpEGEN从n = 11个DMSO处理的MTZ + 幼虫/ ROI中生成了174，801个数据点（图9C;像素强度测量）。
RpEGEN的开发是为了通过从使用FIFI生成的原始ROI中推导出骨架化中心线（1像素宽度）来逐步评估整个RPE色素沉着的区域变化（图4A，B）。为了将所有像素合并到ROI中以进行分析（即，不仅仅是中心线像素），对距中心线的每个像素执行欧氏距离变换，以创建ROI掩模中每个像素最接近中心线索引的地图。该索引图允许将中心线外的每个像素归因于单个中心线像素，从而为每个幼虫的整个RPE创建一个全面的数据集（图4E）。RPE的背侧到腹侧长度由角距离（图4G;0-180°）表示，而不是归一化像素距离（图4F;0-1任意单位），因为基于先前对RPE再生3，4，5 的测量以及角度距离不随形态差异而变化的事实，这更直观。从5度箱中得出的中位数强度是选择的指标，以突出显示大规模趋势并最小化在1度分档数据中观察到的高频变异性（表1， 图10A）。选择排列仿真来检验原假设，以查看两个治疗组（此处为 DMSO MTZ+ 和 IWR-1 MTZ+ （均为 4 dpi）， 图 10B）的中位数是否相似39。这种重采样技术缺乏对数据分布的严格假设，可用于一系列检验统计量（例如，平均值、中位数等），以生成可靠的 p 值估计值。这些参数中的许多（例如，原始数据和中位数数据的箱大小，排列模拟重复等）可以进行调整和修改以适应用户需求。对于后者，选择20，000次重复以产生统计稳健的比较，但是，应注意平衡计算效率和统计稳健性，因为重复次数太少可能会产生错误的 p值估计。建议在开始解释之前运行多个重复值（10，000，20，000等），以确保 p值分布和值相对稳定。增加排列重复将增加统计功效（但也需要更长的时间来运行），这可能对某些数据集有益。
如步骤7所述，使用RpEGEN对共聚焦图像数据集进行量化。带注释的 RpEGEN 和支持脚本可在 GitHub（https://github.com/burchfisher/RpEGEN）上获得，以及 8 位 TIF 和相应的 ROI 文件，供感兴趣的用户进行测试。显示来自MTZ-幼虫ROIs的原始数据的热图显示，无论使用0.06%v / v DMSO或15μM IWR-1进行处理，都具有较暗像素强度（其中0 =黑色和255 =白色，8位色标）的总体分布，跨越RPE的背侧（0°）至腹侧（180°）长度（图9A，B）。绘制中位数像素强度有助于所有组之间的可视化，并显示RPE中MTZ-组之间的相似性（图10A;黑线和灰线）。这些数据支持存在完整的着色RPE单层（图9E，F），并为未升空的RPE提供了基线中位数像素强度值（即低于150）（图10A;黑色和灰色线）。相比之下，来自MTZ+幼虫ROIs的原始（图9C，D）和中位数（图10A;蓝线和红线）数据再次显示，无论治疗条件如何，中心RPE中较轻像素强度的总体分布。消融的DMSO处理的幼虫在大约100°（±15°）处显示光像素的集中分布（图9C;橙红色的箱子）。这对应于视神经内/周围中央RPE损伤部位的可见色素沉着缺失（图9G;蓝色箭头）。与MTZ + DMSO处理的兄弟对照相比，消融的IWR-1处理的幼虫还显示出光像素的集中分布，这些光像素在背侧（至约50°）和腹侧（约5°）扩展（约5°）（图9D;橙红色箱）。在切片组织中清晰可见扩大的损伤部位的存在（图9H;蓝色箭头）。除两个1度箱外，MTZ+组间观察到的差异在中央RPE中具有统计学意义（图10B;浅蓝色阴影区域在~40-140°之间;p值≤0.05），表明与MTZ + DMSO处理的同级对照相比，MTZ + IWR-1处理的幼虫中枢RPE色素沉着显着减少。使用RpEGEN对这些原始（图9C，D）和中位数（图10A）数据的解释与统计比较（图10B）不仅通过观察切片组织（图9G，H）进行验证，而且还支持先前的手动定量发现（图8）3。
图1：受精后5天的rpe65a：nfsB-eGFP转基因表达。 （A-C）PTU处理的5 dpf幼虫的全贴样图像显示松果体中的转基因表达不明显（A;黄色箭头）和RPE（B，C）中明亮的转基因表达，在基因消融筛查时。（B）转基因表达明显局限于RPE的中央三分之二，白色箭头突出了外周（未成熟）和中心（成熟）RPE之间的边界。绿色 = eGFP。前部是向上的。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看此图的放大版本。
图2： 体内RPE成功遗传消融的验证。 （A）三个未升空（MTZ-）7 dpf幼虫的全贴图像显示整个眼睛的RPE色素沉着和（B）三个消融（MTZ +）2 dpi幼虫显示消融区，其中RPE的中央三分之二 （红色箭头）中没有色素。前部是向上的。比例尺 = 100 μm。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 3：使用 RpEGEN 进行自动定量的 RPE 感兴趣区域 （ROI）。横向冷冻切片（A，B）未凋亡（MTZ-）9 dpf幼虫和（C，D）消融（MTZ +）4 dpi幼虫，RPE ROI以洋红色突出显示。（B，D）红色箭头突出显示ROI中包含明显色素的顶端微绒毛的区域。（C，D）青色箭头指向损伤部位定位DAPI+碎片的示例区域，该碎片用于将RPE细胞碎片包含在ROI中。（B'，B“，D'，D”）背侧和腹侧 ROI 区域（B 和 D 中的黑色虚线框）的数字缩放显示建议的 ROI 起点（蓝色箭头）和尖头 ROI 端点，这对于 MATLAB 中的端点检测至关重要。明场图像也如图9E，G所示。白色/灰色 = 细胞核。背侧向上，远端左侧。（A-D）比例尺 = 40 μm. （B'，B“，D'，D”） 比例尺 = 10 μm。请点击此处查看此图的大图。
图 4：RpEGEN 处理工作流程。 （A） 导入 MATLAB 的正确定向的 8 位明场图像和斐济生成的 ROI（红色）的示例。背侧向上，远端左侧。颜色条表示 8 位灰度强度值，其中 0 = 黑色，255 = 白色。（B） ROI 掩码（红色）的初始二进制骨架化（白色），显示存在错误的杂散以及测地线像素距离描绘的起点和终点的描绘，如（C）所示。（C） 中的颜色条表示欧氏像素距离。（D） 使用从末端像素回到起始像素的简化成本最低路径去除杂散，从而形成没有杂散的连续中心线（红色）。（E） 基于 ROI 掩码中所有像素与中心线像素（白色）之间的距离变换的最近线性中心线索引。这些索引值允许将 ROI 掩膜中的每个图像像素分配给最近的中心线像素进行分析。颜色条表示线性中心线像素索引值。（F） 沿中心线的归一化像素距离的示例，其中 0（蓝色，最远端的背侧像素）是起始像素，1（红色，最远端腹侧像素）是结束像素。（G） 与 （F） 类似，但使用角距离，其中 0 度（蓝色）是起始像素，180 度（红色）是结束像素。（H） 为每个中心线像素计算的中位数像素强度值的示例。颜色条表示所有 ROI 像素的中位数灰度强度值，这些像素对每个给定的中心线像素都有影响。该图显示了来自测试数据集的图像，而不是来自0.06%v / v DMSO或15μM IWR-1处理组的幼虫。 请点击此处查看此图的大图。
图5：RPE消融和感光器变性的证据。（A）未升温的6 dpf幼虫的横向冷冻切片。（A，A'）暴露于PTU后，转基因表达仅限于成熟的RPE细胞，最亮的表达仅限于RPE的中央三分之二。箭头表示顶端微绒毛。（A“）差分干涉对比度（DIC）图像揭示了正常的外核层（ONL;即光感受器）结构。（B，B'）1 dpi幼虫的横向冷冻切片显示ONL层压中eGFP + 细胞形态和紊乱的显着破坏。箭头表示分层和皮指核。（B“）DIC图像进一步揭示了ONL架构的显着破坏。绿色 = eGFP，蓝色 = 原子核，黄色 = ONL。背侧向上，远端左侧。（A） 中的比例尺表示 40 μm，可应用于 （B）。比例尺（A'）表示40μm，可以应用于（A“，B'，B”）。此图和图例文本已从Hanovice等人2019（图1）3中修改。 请点击此处查看此图的大图。
图6：斑马鱼幼虫RPE再生模型。（A）nfsB-eGFP在眼睛中央三分之二的成熟RPE中表达。（B）MTZ的应用导致RPE和光感受器的凋亡（TUNEL，红色）。（C）RPE消融导致光感受器和布鲁赫膜（虚线）的变性。（D）外围未掺杂的RPE开始增殖并延伸到损伤部位（蓝色）。（E）当再生的eGFP+ RPE出现在外围时，RPE可分为四个区域：外周RPE（pRPE），分化RPE（dRPE），过渡区（TZ）和损伤部位（IS）。（E，插图）再生分化的RPE（绿色）出现在未升空的外周RPE近端的外围，并且包含与过渡区相邻的增殖细胞。过渡区由仍在分化的RPE细胞（ZPR2，红色）和增殖细胞（蓝色）组成。损伤部位包括不色素沉着的增殖细胞，不表达任何RPE分化标志物。（F）功能性RPE层和Bruch膜的再生完成14 dpi。此图和图例文本已从Hanovice等人2019（图14）3中修改。请点击此处查看此图的大图。
图 7：从图像分析中排除的受损组织切片。（A-C） 从符合排除标准的 0.06% v/v DMSO 和 15 μM IWR-1 数据集中横向冷冻取样幼虫。一只幼虫显示背侧RPE组织撕裂（A;洋红色箭头），另外两只幼虫显示组织折叠，阻塞DAPI通道中的解剖学特征（背侧OLM）（B;洋红色虚线椭圆形）或可能使明场通道的RPE强度测量结果倾斜（C;洋红色点状椭圆形）。白色/灰色 = 细胞核。背侧向上，远端左侧。比例尺 = 40 μm。请点击此处查看此图的大图。
图8：使用IWR-1的药理抑制会损害RPE再生。对来自（A）0.06%v / v DMSO和（B）15μM IWR-1治疗组的消融（MTZ +）4 dpi幼虫进行横向冷冻切片。明场图像（A，B）和RPE恢复率/截面（C）的定量显示IWR-1处理的幼虫中色素单层的恢复显着延迟（学生的未成对t检验，*** p <0.0001）。（B） 黑色箭头表示再生 RPE 的最中心边缘。背侧向上，远端左侧。（B） 中的比例尺表示 40 μm，可应用于 （A）。此图和图例文本已从 Hanovice 等人处修改而来。 2019 年（图 13）3.请点击此处查看此图的大图。
（A-D）热图显示了从整个RPE ROI区域编译的明场像素强度分布，从背侧（x轴;角距离= 0°）到腹侧（x轴;角距离= 180°），对于每个数据集中的所有幼虫：（A）n = 11，DMSO MTZ-;（B） n = 10， IWR-1 MTZ-;（C） n = 11， DMSO MTZ+;（D） n = 12， IWR-1 MTZ+ （来自三个独立的父组，N = 3）。例如，（A） 显示 11 个 ROI 中 177，460 像素的数据。在 y 轴上，像素强度基于 8 位色阶显示，其中 0 = 黑色，255 = 白色。原始数据显示在 5 度（x 轴）x 5-8 位强度值（y 轴）的条柱中，其中红色 = 最大箱数，深蓝色 = 最小箱数。（E-H）从0.06%v / v DMSO和15μM IWR-1治疗组中横向冷冻切片代表（E，F）未稀释（MTZ-）9 dpf幼虫和（G，H）消融（MTZ +）4 dpi幼虫。RPE ROI 以洋红色突出显示，并指示角度距离极端值（0° = 背侧，180° = 腹侧）。从广义上讲，这些数据显示，与（C，D，G，H）消融的ROI相比，（A，B，E，F）未降压的ROI中较暗像素（强度值在0-150之间）的分布，无论治疗如何。来自消融ROIs的数据显示（C，G）集中（100°±15°）在DMSO处理组中较轻的像素（强度值在150-250之间）分布，其中（D，H）在IWR-1处理的幼虫中向背侧（至~50°）和略微腹侧（约5°）扩张。（G，H）这些没有色素的中央消融区由蓝色箭头突出显示。黑色箭头表示视神经的位置。来自DMSO处理的幼虫的图像也如图3所示。比例尺 = 40 μm。请点击此处查看此图的大图。
图10：从RpEGEN中RPEGEN中RPE再生的自动定量得出的组结果和统计比较。（A）从每组的原始数据中得出的5度分档中值和95%置信包络线。该图显示了RPE背侧（0°）至腹侧（180°）长度的MTZ-组（黑色和灰色线）之间的相似性，在中央RPE（~40-140°之间的浅蓝色阴影区域）的MTZ+组（蓝线和红线）之间有显着差异。具体而言，与任何其他治疗组相比，IWR-1 MTZ+ 4 dpi 的中位像素强度（0 = 黑色和 255 = 白色）看起来更轻，这对应于中心性 RPE 色素沉着的减少。（B） 对 DMSO MTZ+ 4 dpi 和 IWR-1 MTZ+ 4 dpi 的 RPE 背侧 （0°） 至腹侧 （180°） 长度的 1 度条柱得出的中值进行统计比较，可增强 （A） 中的观察结果。使用具有20，000次重复的排列模拟和每个1度箱的双侧检验来计算p值。在两组对任何相应的 1 度条柱具有相似中位数的原假设下，p 值 ≤ 0.05 表示组中位数之间存在统计显著性差异（虚线黑线 = 95% 置信区间 （CI））。与消融（MTZ+）DMSO处理的兄弟对照相比，中央RPE（约40-140°之间的浅蓝色阴影区域）的p值≤0.05，表明消融（MTZ +）IWR-1处理的幼虫色素沉着明显减少。请点击此处查看此图的大图。
| 变量名 | 变量类型 | 可变大小 | 变量描述 | ||
| 罗伊纳姆 | 细胞 | {N x 1} | 已处理的 ROI 文件的名称 | ||
| RoIxy | 细胞 | {N x 1} | 处理的每个 ROI 文件的 ROI 顶点 | ||
| IMGname | 细胞 | {N x 1} | 已处理的 TIF 图像文件的名称 | ||
| 断续器 | 细胞 | {N x 1} | 处理的每个TIF的8位明场图像数据 | ||
| 断续器 | 细胞 | {N x 1} | 逻辑（0 或 1）ROI 掩码，其尺寸与 IMG 图像相同 | ||
| 克莱恩 | 带表格的单元格 | {N x 1} （n x 16） | 单个图像的中心线数据，包括 x、y、距离、角度、索引、点数和统计数据 | ||
| CIdx | 细胞 | {N x 1} | 将 ROI 掩码点与最近中心线点相关联的中心线数据进行显示，以计算 CLine | ||
| CLineBW | 细胞 | {N x 1} | 逻辑（0 或 1）矩阵，其尺寸与指示中心线位置的 IMG 图像相同 （=1） | ||
| RAW_data | 桌子 | N x 3 | 表格，其中包含所有不同IMG图像中ROI中每个像素的所有原始数据 | ||
| BIN_1_deg_all | 桌子 | N x 9 | 包含 1 度装箱数据和使用RAW_data数据统计的表 | ||
| BIN_5_deg_all | 桌子 | N x 9 | 包含 5 度装箱数据和使用RAW_data数据统计的表 | ||
| BIN_10_deg_all | 桌子 | N x 9 | 包含 10 度装箱数据和使用RAW_data数据统计的表 | ||
表 1：从 RpEGEN.m 脚本导出到 MAT 文件的变量的说明。 定义如下：ROI =感兴趣的区域;TIF = 标记的图像文件格式。
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Discussion
该协议描述了对RPE进行遗传消融的方法，并研究了幼体年龄斑马鱼的变性和再生机制。该方案也已在成年斑马鱼3 中成功实施，但表征范围较小，这就是为什么幼虫是这里的重点。方案这一部分的关键方面（步骤1-4）包括：1）在黑色素发生开始之前向胚胎添加1.5倍PTU，2）以2-3 dpf对PTU处理的胚胎进行去壳化，3）仔细筛查eGFP，以及4）MTZ基因消融期间水的变化时间。PTU抑制黑色素合成21，22 ，并且已用于该RPE消融范式中，以促进筛选 rpe65a：nfsB-eGFP转基因表达，并能够分别基于色素组织的缺失和随后的返回来表征RPE退行性和再生过程3。由于PTU会抑制进一步的色素沉着，但一旦黑色素生成开始21，就不会使组织脱色，因此必须在色素沉着发作之前添加PTU，这在斑马鱼25中开始约为24 hpf。在这里，在先前的研究4，5中，PTU以大约6 hpf26 添加，以确保在黑色素合成开始之前的抑制作用。虽然PTU可以可视化关键方案步骤，但PTU治疗可能会影响发育的某些方面（如步骤2.3中所述）并损害胚胎孵化。后一过程，如果延迟太久，可导致形态和运动缺陷并影响生存能力40;因此，用促酶酶酶解（孵化）胚胎或手动使用2-3 dpf的镊子对于在遗传消融之前维持和标准化幼虫健康非常重要。避免老年幼虫健康和生存能力问题（与PTU处理无关）的另一个重要考虑因素是，如果实验41的幼虫被排除在水生设施系统之外，超过9 dpf / 4 dpi，幼虫应开始标准化的摄食方案。
如前所述，rpe65a驱动后眼中央三分之二的成熟RPE中的转基因表达。eGFP在PTU处理的5 dpf幼虫中的表达通常很容易被检测到并且明显强烈（明亮），如图1所示。与具有明亮表达的兄弟姐妹相比，还可以观察到在5 dpf下微弱表达eGFP的幼虫。代际之间也可能存在表达强度比（即明亮与暗淡）的差异，某些世代的表达幼虫比其他世代更暗淡。无论如何，eGFP表达模糊的幼虫通常代表每个离合器中的少数动物。虽然尚不清楚表达不明确的幼虫是否显示不太严重的RPE损伤表型，但已在每个离合器的明亮eGFP +队列中进行了消融，并且相对昏暗的兄弟姐妹在筛查时被安乐死并排除在分析之外。同样，通过在rpe65a：nfsB-eGFP杂合子中将rpe65a：nfsB-eGFP杂合子的成虫杂交到野生型成虫3，对斑马鱼RPE消融和再生表型进行了广泛的表征。然而，不太可能不知道rpe65a：nfsB-eGFP的幼虫纯合子是否表现出更严重的消融表型。标准化消融方案的其他努力包括在24小时的遗传消融期间向MTZ和MTZ +培养皿添加相等的测量体积（例如，每10厘米培养皿30 mL）。同样，药物处理培养皿中的幼虫已获得相等的测量体积（例如，每6孔5 mL）和及时补充新鲜化合物（例如，每24小时）。在处理具有不同MTZ和/或药理复合处理的培养皿时，应采取谨慎措施，以防止在运输和换水过程中溢出和无意交叉污染。
斑马鱼RPE消融方案可以修改，以包括药理学操作（步骤5）。以前已经这样做过，以鉴定免疫反应5，mTOR4和Wnt3 信号通路作为RPE再生的关键调节因子;后者已被证明是可重复的，并用于验证RpEGEN。除了阐明关键的RPE再生途径外，药理学操作已被广泛用于斑马鱼视网膜再生研究10，42，43，44，45，46，47。在纳入 RPE 消融方案之前，应严格评估药物的毒性、疗效和治疗持续时间。这可以通过以下方式完成：进行剂量反应实验以评估毒性48;评估已知靶基因/蛋白4，5的表达;并评估药理学操作的已知功能后果，例如，PLX3397治疗白细胞的消耗48，49，50，51。在这里，在基因消融前24小时加入DMSO（载体对照）和IWR-1，并在4 dpf药物预处理前立即筛选幼虫。虽然eGFP + 幼虫在4 dpf上与eGFP- 幼虫有区别，但eGFP的强度可能看起来很暗淡，这就是为什么在5 dpf上重新筛选幼虫的eGFP表达（代表性结果）。在 4 dpf 之前筛查 eGFP 可能很困难，因为表达可能太低，以至于眼睛无法检测到。因此，在4 dpf（即2 dpf）4之前用药理学药物进行预处理可以添加到未筛选的幼虫中，当eGFP清晰可见时，将在5 dpf上分离。在需要对幼虫进行操作的任何情况下（例如，在筛查期间、包埋成像等过程中），应维持药物治疗条件，并且无论筛查年龄如何，都应使用 MTZ 在 5 dpf 时消融 RPE。
除了基因消融方案外，还概述了共聚焦显微镜图像预处理和使用RpEGEN自动定量RPE再生的分步说明（步骤6-7）。RpEGEN的创建是为了标准化用户之间的RPE再生定量，并提高输出数据集的稳健性，同时最大限度地减少以前完成的繁琐手动定量可能带来的固有偏差。协议的这一部分的关键方面在ROI生成期间执行（步骤6）。首先，图像/眼睛必须位于背朝上，远端左方向（例如，图3A-D，图4），因为RpEGEN已针对这种方向性进行了优化。同样重要的是，RPE ROIs的背端和腹侧末端逐渐变细至尖尖，如图3B'，B“，D'，D”（洋红色线）所示。如果这些末端是平方或四舍五入的，RpEGEN脚本可能难以确定中心线骨架开始和结束像素，并且可能在终端ROI末端而不是中心线处产生杂散（图4B）。终端ROI端的杂散可能导致去杂散期间中心线缩短（图4D）和/或外设RPE中角距离测量的问题（图4G）。对应于每个幼虫的TIF和ROI文件的相同命名系统也是将8位TIF文件与RpEGEN中的正确ROI配对的重要步骤和必要条件。不匹配的 TIF 和 ROI 文件名将导致无法生成“代表性结果”部分（图 4）中概述的 RpEGEN 处理工作流，并最终阻止使用此脚本进行 RPE 再生量化。
总的来说，该协议提供了成功消融斑马鱼幼虫RPE的指令，操纵RPE损伤前，期间或后可能感兴趣的信号通路，并以标准化的方式量化RPE再生，具有有限的固有偏差。在研究RPE再生潜力的现有 体内 和 体外 模型的背景下，斑马鱼的独特之处在于其内在RPE再生的能力14。然而，这是RPE损伤的急性模型，而不是慢性的RPE退行性疾病，用于治疗发展（例如AMD）。虽然这是该模型的局限性，但它仍然是研究RPE再生机制的绝佳平台，这些机制在很大程度上是未知的，并且将来可能适应研究慢性损伤和疾病。本文描述的工具和方法是通用的，也可以应用于研究参与退行性反应的细胞过程，以及研究消融后RPE邻近组织的命运。同样，可以修改RpEGEN脚本以适应用户数据输出需求;例如，对色素以外的标记物进行空间分析（例如， 原位 杂交探针、蛋白表达等）。
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Disclosures
L.L.L.是美国专利#9，458，428的共同发明人，该专利描述了一种从人类多能干细胞中提取视网膜色素上皮的快速方法;这与此处的内容无关。J.M.G.和G.B.F.没有什么可披露的。
Acknowledgments
此处描述的工作得到了美国国立卫生研究院的支持（RO1-EY29410至J.M.G，NIH CORE Grant P30-EY08098至眼科）;UPMC 免疫移植和治疗中心（L.L.L. 和 J.M.G.）;和E. Ronald Salvitti眼科研究主席（致J.M.G.）。此外，还获得了韦根眼科奖学金（L.L.L）、匹兹堡眼耳基金会（Eye & Ear Foundation of Pittsburgh）的额外支持，以及纽约州纽约预防失明研究的无限制资助。作者还要感谢Amanda Platt的技术援助，以及Hugh Hammer博士和水上运动人员提供的出色动物护理支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab Material/Equipment | |||
| 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) | Millipore Sigma | D9542 | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | Catalog number is for 50 mL tubes |
| Diamond tip scribing pen | Fisher Scientific | 50-254-51 | Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % | Fisher Scientific | BP231 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
| Embryo incubator (large) | Fisher Scientific | 3720A | |
| Embryo incubator (mini/tabletop) | Labnet | I5110A | |
| Fluorescence stereo microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | Or similar, with 488 nm excitation laser/filter |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-4 | Manufactured by Corning, non-sterile |
| InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo | Millipore Sigma | 5.04462 | Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements |
| Methylene blue (powder) | Fisher Scientific | BP117-100 | Also available as a premade aqeuous solution |
| Metronidazole (MTZ) | Millipore Sigma | M3761 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
| N-phenylthiourea (PTU) | Millipore Sigma | P7629 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
| Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free | Fisher Scientific | AA433689M | Chemical waste, proper disposal required |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 10 cm diameter |
| Phosphate buffered saline (powder packets) | Millipore Sigma | P3813 | Used to make 10 X PBS stock |
| Pronase | Millipore Sigma | PRON-RO | |
| Shaking incubator | Benchmark | H2010 | Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius |
| Stereo microscope | Leica | S9i | Or similar, with transmitted light illumination |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Fine-tipped forceps for manual dechorionation |
| Tabletop rotator/shaker | Scilogex | SK-D1807-E | |
| Transfer pipette | Millipore Sigma | Z135003 | 3.2 mL bulb draw, non-sterile |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Pentair | TRS1, TRS2, TRS5 | Also available from Fisher Scientific (NC0342409) |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Software Material | |||
| FIJI (Fiji is Just ImageJ) | FIJI (Fiji is Just ImageJ) | https://imagej.net/software/fiji/ | Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats |
| GRAMM examples and how-tos | MathWorks | https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like. | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox |
| MATLAB support | MathWorks | https://www.mathworks.com/support.html |
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