Ablation médiée par la nitroréductase/métronidazole et une plate-forme MATLAB (RpEGEN) pour l’étude de la régénération de l’épithélium pigmentaire rétinien du poisson-zèbre

Summary

Ce protocole décrit la méthodologie pour ablation génétique de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à l’aide d’un modèle transgénique de poisson-zèbre. L’adaptation du protocole pour incorporer la modulation de la voie de signalisation à l’aide de composés pharmacologiques est très détaillée. Une plate-forme MATLAB pour quantifier la régénération RPE basée sur la pigmentation a été développée et est présentée et discutée.

Abstract

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) réside à l’arrière de l’œil et remplit des fonctions essentielles au maintien de la santé et de l’intégrité des tissus rétiniens et vasculaires adjacents. À l’heure actuelle, la capacité réparatrice limitée de l’EPR des mammifères, qui se limite aux petites blessures, a entravé les progrès dans la compréhension des processus de régénération de l’EPR in vivo . Ici, une méthodologie détaillée est fournie pour faciliter l’étude de la réparation in vivo de l’EPR à l’aide du poisson-zèbre, un modèle de vertébré capable d’une régénération tissulaire robuste. Ce protocole décrit un paradigme de lésion transgénique médié par la nitroréductase / métronidazole (NTR / MTZ) (rpe65a: nfsB-eGFP), qui entraîne l’ablation des deux tiers centraux de l’EPR après un traitement de 24 heures par MTZ, avec récupération tissulaire ultérieure. L’accent est mis sur les ablations de l’EPR chez les larves de poisson-zèbre et les méthodes de test des effets des composés pharmacologiques sur la régénération de l’EPR sont également décrites. La génération et la validation de RpEGEN, un script MATLAB créé pour automatiser la quantification de la régénération RPE basée sur la pigmentation, sont également abordées. Au-delà des mécanismes actifs de réparation de l’EPR, ce protocole peut être étendu aux études de la dégénérescence de l’EPR et des réponses aux blessures, ainsi que des effets des lésions de l’EPR sur les tissus rétiniens et vasculaires adjacents, entre autres processus cellulaires et moléculaires. Ce système de poisson-zèbre est très prometteur dans l’identification des gènes, des réseaux et des processus qui stimulent la régénération de l’EPR et les mécanismes liés à la maladie de l’EPR, dans le but à long terme d’appliquer ces connaissances aux systèmes mammifères et, en fin de compte, au développement thérapeutique.

Introduction

La méthodologie décrite ici détaille un protocole pour ablation génétique de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à l’aide de larves de poisson-zèbre. L’EPR s’étend sur l’arrière de l’œil et réside entre les couches stratifiées de la rétine neurale et la couche de vascularisation constituant la choroïde. Le soutien trophique, l’absorption de la lumière phototoxique et le maintien des protéines du cycle visuel ne sont que quelques-unes des fonctions critiques de l’EPR qui sont essentielles au maintien de la santé et de l’intégrité de ces tissus adjacents¹. Les dommages causés à l’EPR chez les mammifères sont réparables lorsque les lésions sont petites²; cependant, les dommages subis par des blessures plus importantes ou une maladie dégénérative progressive sont irréversibles. Chez l’homme, les maladies dégénératives de l’EPR (p. ex., la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) et la maladie de Stargardt) entraînent une perte de vision permanente et, avec peu d’options de traitement disponibles, une diminution de la qualité de vie des patients. La capacité limitée des RPE des mammifères à s’auto-réparer a créé un manque de connaissances dans le domaine des processus de régénération des EPR. Compte tenu de la capacité de régénération robuste du poisson-zèbre dans de nombreux types de tissus différents, ce protocole a été développé pour établir un système de vertébrés in vivo afin de faciliter les études sur l’EPR à régénération intrinsèque et de découvrir les mécanismes qui déterminent cette réponse. En utilisant le paradigme d’ablation décrit ici, la voie de signalisation canonique Wnt³, la voie mTOR⁴ et les réponses immunitaires⁵ ont été identifiées comme des médiateurs critiques de la régénération de l’EPR, probablement avec des fonctions qui se chevauchent.

Dans ce paradigme d’ablation génétique, le poisson-zèbre Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)³ exprime le gène⁶ de la nitroréductase dérivée de bactéries (NTR/nfsB) fusionné à l’eGFP sous le contrôle de l’élément amplificateur RPE, rpe65a⁷. L’ablation est obtenue en ajoutant le promédicament, le métronidazole (MTZ), à l’eau du système abritant le poisson-zèbre. L’activation intracellulaire de MTZ par la nitroréductase entraîne la réticulation de l’ADN et l’apoptose dans les cellules exprimant NTR/nfsB ^8,9. Cette technologie a été largement utilisée chez le poisson-zèbre pour ablation des cellules de la rétine ^10,11,12,13 et d’autres tissus 8. Ensemble, ces éléments permettent l’expression ciblée (rpe65a) d’une méthodologie d’ablation cellulaire inductible (NTR/MTZ)^{8,9 et d’un} marqueur fluorescent (eGFP) pour la visualisation.

Il existe également d’autres modèles in vivo intéressants qui peuvent être utilisés pour étudier le potentiel de régénération de l’EPR¹⁴. Ceux-ci sont larges et comprennent la transdifférenciation de l’EPR à la rétine après la rétinbectomie chez les amphibiens, dans laquelle les cellules d’EPR perdues par la repousse rétinienne sont remplacées^15,16; Restauration de l’EPR après une blessure chez la souris LMR/MpJ « super cicatrisante »¹⁷; et stimulation exogène de la prolifération de l’EPR chez un modèle de rat d’EPR spontanée et de dégénérescence rétinienne¹⁸, entre autres. Des modèles in vitro, tels que les cellules souches EPR humaines adultes (CSP)¹⁹ ont également été mis au point. Ces modèles sont tous des outils précieux qui permettent de découvrir les processus cellulaires liés à la régénération de l’EPR (p. ex., prolifération, différenciation, etc.); cependant, le poisson-zèbre est unique dans sa capacité de réparation intrinsèque de l’EPR après l’ablation.

Bien que la méthodologie ici soit écrite pour se concentrer sur la compréhension des mécanismes à l’origine de la régénération de l’EPR, la lignée Tg(rpe65a:nfsB-eGFP) et ce protocole d’ablation génétique pourraient être utilisés pour étudier d’autres processus cellulaires tels que l’apoptose de l’EPR, la dégénérescence de l’EPR et l’effet des lésions de l’EPR sur les tissus rétiniens et vasculaires adjacents. Le protocole d’ablation peut également être modifié pour inclure la manipulation pharmacologique, qui est une stratégie préliminaire pratique pour dépister les voies de signalisation d’intérêt. Par exemple, il a été démontré que le blocage de la voie Wnt canonique à l’aide de l’inhibiteur de la réponse Wnt-1 (IWR-1)²⁰ altère la régénération de^{l’EPR 3}. Cela a été répété ici pour guider les utilisateurs à travers une expérience de manipulation pharmacologique et servir de preuve de concept pour valider un script MATLAB (RpEGEN) créé pour quantifier la régénération RPE basée sur la récupération de la pigmentation. Comme la lignée transgénique et le protocole d’ablation, les scripts RpEGEN sont adaptables et pourraient être utilisés pour quantifier d’autres marqueurs / processus cellulaires au sein de l’EPR.

Protocol

Toutes les méthodologies décrites dans le présent document sont conformes à l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Pittsburgh.

1. Préparation avant la collecte d’embryons de poisson zèbre

1. Réglez l’incubateur d’embryons à 28,5 °C.
2. Préparer une solution mère 25x de l’inhibiteur de la mélanogenèse, la N-phénylthiourée (PTU)^21,22. Cette solution mère est mise à l’échelle à partir d’une recette commune²² et 1x est égale à 0,003% de poids par volume (% p / v) (par exemple, 0,003 g de poudre de PTU dans 100 mL de solvant liquide).
   1. Pour obtenir une grande solution mère de PTU 25x, ajouter 0,75 g de poudre de PTU à 1 L d’eau désionisée purifiée (ci-après dénommée dH₂O) et bien mélanger à température ambiante (~25 °C) à l’aide d’un agitateur et d’une plaque à agiter. Conserver à 4°C jusqu’à 3 mois à l’abri de la lumière.
      REMARQUE: Il est difficile d’obtenir PTU pour aller dans la solution aqueuse et une agitation prolongée pendant la nuit peut être nécessaire.
      ATTENTION : La PTU est dangereuse et des précautions doivent être prises pour prévenir l’ingestion, l’inhalation et/ou le contact avec la peau ou les yeux. La poudre de PTU et tous les dérivés liquides de PTU décrits dans le présent document peuvent devoir être éliminés en tant que déchets chimiques en fonction des réglementations étatiques et institutionnelles. La confirmation des méthodes appropriées d’élimination des déchets de PTU, le cas échéant, est recommandée avant utilisation.
   2. Pour obtenir une solution de travail 1,5x PTU (ci-après dénommée 1,5x PTU), ajouter 60 mL de solution mère 25x PTU à 940 mL d’eau d’installation de logement de poisson zèbre (ci-après dénommée eau de système). Des paramètres optimaux de qualité de l’eau pour le poisson-zèbre ont été décrits²³ et les installations aquatiques devraient avoir des procédures normalisées de surveillance de l’eau. Conservez 1,5x PTU à 28,5 °C pendant 1 à 2 semaines à l’abri de la lumière.
      REMARQUE : Ce protocole est exécuté régulièrement à l’aide des concentrations de PTU, des solvants et des paramètres de stockage décrits à l’étape 1.2. Par mesure de précaution, les embryons / larves doivent être observés tous les 1-2 jours pendant qu’ils sont dans la PTU pour valider l’efficacité et confirmer une dépigmentation soutenue. Les conditions de dissolution et/ou de stockage doivent être optimisées si l’on soupçonne une diminution de la solubilité et de l’efficacité de la PTU.
3. Préparer une solution mère de 0,05 % p/v de bleu de méthylène, un inhibiteur de croissance fongique, en ajoutant 0,05 g de poudre de bleu de méthylène à 100 mL de dH₂O. Mélanger soigneusement à l’aide d’un agitateur et d’une plaque à remuer. Conserver à 4°C.
4. Préparer les pipettes pour la manipulation des embryons et des larves (p. ex., déplacement d’embryons ou de larves entre les boîtes de Pétri, séparation des larves pendant le dépistage par fluorescence, collecte des larves euthanasiées dans des tubes de microcentrifugation pour les fixer, etc.) en coupant l’extrémité effilée d’une pipette Pasteur en verre à l’aide d’un stylo à pointe de diamant. Gravez autour de la circonférence de la pipette avec le stylo diamant et tirez doucement ou enclenchez l’extrémité pour faire une pause nette.
   REMARQUE: La bouche de la pipette doit être lisse et assez large pour prendre facilement un embryon encore à l’intérieur du chorion sans cisaillement. Utilisez une pipette de transfert de tirage d’ampoule comme alternative. Les pipettes préparées peuvent également être utilisées pour éliminer le liquide lors des changements d’eau (plutôt que de verser) afin de minimiser la perte d’embryons / larves.
5. Préparer une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (p. ex., ajouter 10 mL de PFA à 16 % à 4 mL de 10x PBS et 26 mL de dH₂O). Conserver à 4°C jusqu’à 4 semaines à l’abri de la lumière.
   ATTENTION : Le paraformaldéhyde est un produit chimique dangereux et doit être manipulé dans une hotte chimique et éliminé correctement. Des précautions doivent être prises et un équipement de protection individuelle (EPI) doit être porté pour éviter l’ingestion, l’inhalation et/ou le contact avec la peau ou les yeux.

2. Collecte et entretien des embryons de poisson-zèbre avant l’ablation génétique (0 à 5 jours après la fécondation)

1. Maintenir le poisson-zèbre adulte comme décrit précédemment ^3,4,5. L’après-midi et la soirée précédant la collecte des embryons, séparez les poissons-zèbres adultes dans des bassins d’élevage pour le frai.
2. Le lendemain matin (0 jour après la fécondation (dpf)), prélever les embryons dans des boîtes de Petri de 10 cm de diamètre dans de l’eau du système et retirer tous les ovules non viables ou non fécondés, qui apparaîtront opaques et/ou présenteront un cytoplasme irrégulier et un clivage raté²⁴.
   REMARQUE: Des événements normaux de clivage et de stadification du développement seront apparents chez les embryons sains tels que décrits²⁵. Les boîtes de Petri doivent être maintenues pleines aux trois quarts (~30 mL pour une boîte de 10 cm de diamètre) tout au long du protocole.
   1. Ajouter deux gouttes de 0,05 % p/v de bleu de méthylène dans chaque boîte de Pétri, mélanger doucement et conserver les embryons à 28,5 °C pour le reste du protocole.
3. Environ 6 h après la fécondation (hpf)^4,5,26, remplacez l’eau du système dans les boîtes de Petri embryonnaires par 1,5x PTU (solution de travail faite à l’étape 1.2.2) et reconstituez le bleu de méthylène.
   REMARQUE: La PTU doit être ajoutée aux embryons avant le début de la pigmentation (c.-à-d. avant 24 hpf)²⁵ car les tissus déjà pigmentés ne se dépigmenteront pas lors de l’ajout de PTU²¹. Il convient toutefois de noter qu’une réduction de la taille des yeux, des déficits oculaires et craniofaciaux et une perturbation de certaines voies de signalisation (par exemple, la signalisation thyroïdienne) ont été rapportés chez le poisson-zèbre traité par PTU 27,28,29. La toxicité de la PTU pour le développement semble dépendre de la concentration et du moment de l’ajout de PTU^27,29. Comme mentionné ci-dessus pour valider l’efficacité de la PTU (étape 1.2), les signes de toxicité de la PTU doivent également être surveillés attentivement et, en cas de suspicion, la concentration de travail et / ou le temps d’ajout de PTU doivent être optimisés.
4. Sur 2-3 dpf, déséchorionater les embryons à l’aide d’une solution de pronase fraîchement préparée.
   1. Dissoudre la pronase dans 1,5x PTU à une concentration de 2 mg/mL par vortex.
      ATTENTION: La pronase est emballée sous forme de poudre très fine et est irritante. Prendre des mesures pour éviter l’inhalation et/ou le contact avec la peau, les yeux, etc.
   2. Séparez les embryons éclos des embryons non éclos et ne traitez que les embryons non éclos.
   3. Remplacer 1,5x PTU par une solution de pronase de 2 mg/mL faite à l’étape 2.4.1 et laisser sur des embryons non éclos pendant 4-5 min avec une agitation douce (par exemple, sur un rotateur/agitateur de table ou par tourbillon manuel).
   4. Versez la solution de pronase et rincez immédiatement avec 1,5x PTU frais. Triturer délicatement 1,5x PTU rincer sur les embryons avec une pipette de transfert à tirage d’ampoule.
   5. Répétez un deuxième rinçage PTU 1,5x pour éliminer tous les débris de chorion, puis reconstituez 1,5x PTU pour l’entretien.
      REMARQUE: Les embryons peuvent également être déconionnés manuellement à l’aide de pinces à pointe fine. Dans ce cas, les débris de chorion doivent être enlevés et 1,5x PTU réapprovisionné après la déschorionation manuelle.
5. Surveillez la santé des embryons / larves et reconstituez 1,5 fois la PTU tous les 1 à 2 jours. Les embryons/larves sont conservés dans 1,5x PTU jusqu’à l’ablation à 5 dpf.
   REMARQUE : L’importance des étapes 2.3 et 2.4 est abordée plus en détail dans la section Discussion.

3. Dépistage des larves de poisson zèbre pour rpe65a:nfsB-eGFP et ablation génétique de l’épithélium pigmentaire rétinien (5-6 jours après la fécondation)

1. Faire une solution fraîche de métronidazole (MTZ) de 10 mM sur 5 dpf (jour d’ablation). Ce processus prend 2 h à compléter.
   1. Ajouter la poudre de MTZ à l’eau du système sans PTU et bien mélanger en agitant vigoureusement (par exemple, 250 rotations par min) pendant 1 h à 37 °C.
   2. Refroidir la solution MTZ de 10 mM pendant 1 h supplémentaire à température ambiante sur un rotateur/agitateur de table et assurer une dissolution complète avant d’ajouter aux boîtes de Pétri avec des larves.
      REMARQUE: Le criblage par fluorescence et la séparation des larves d’eGFP⁺ (étape 3.2) peuvent être effectués pendant les incubations à 37 °C et à température ambiante.
      ATTENTION : La MTZ est dangereuse et des précautions doivent être prises pour prévenir l’ingestion, l’inhalation et/ou le contact avec la peau ou les yeux. La poudre de MTZ et tous les dérivés liquides décrits dans le présent document peuvent devoir être éliminés en tant que déchets chimiques en fonction des réglementations étatiques et institutionnelles. La confirmation des méthodes appropriées d’élimination des déchets MTZ, le cas échéant, est recommandée avant utilisation.
2. Filtrer les larves de poisson zèbre pour le transgène rpe65a:nfsB-eGFP.
   1. Anesthésier les larves avec 0,168 g/L de tricaïne (MS-222) et séparer les larves transgéniques (eGFP⁺) (Figure 1) des larves non transgéniques (eGFP^-) à l’aide d’un stéréomicroscope à fluorescence avec un laser/filtre à excitation de 488 nm.
      REMARQUE: La tricaïne doit être ajoutée à 1,5x PTU et / ou à des solutions de composés pharmacologiques, car les larves doivent rester immergées dans le traitement pendant le dépistage de l’eGFP. Incuber les larves dans la tricaïne uniquement pendant la durée du dépistage (p. ex., ≤10 min pour une seule boîte de Pétri de 10 cm contenant 50 larves).
   2. Réveillez immédiatement les larves filtrées en pipetant directement dans une boîte de Pétri avec 1,5x PTU frais sans tricaïne.
   3. Une fois le dépistage terminé, séparez davantage les larves d’eGFP⁺ en deux groupes de boîtes de Pétri : un groupe pour recevoir un traitement MTZ (ablation/MTZ⁺) et un groupe pour être le témoin non atténué (MTZ^-).
3. Ablation de l’épithélium pigmentaire rétinien.
   1. Retirez 1,5 fois le PTU des plats de contrôle non atténués (MTZ^-) et ajoutez de l’eau fraîche du système sans PTU.
   2. Retirer 1,5x PTU des plats de traitement ablés (MTZ⁺) et ajouter la solution de MTZ 10 mM fraîchement préparée (étape 3.1.).
   3. Retirez la solution MTZ de 10 mM après exactement 24 h (désigné 1 jour après la blessure (dpi)) et ajoutez de l’eau douce du système sans PTU. Changez l’eau fraîche du système sans PTU sur le(s) plat(x⁾ MTZ. Les larves ne seront plus exposées à la PTU pour le reste du protocole.
      REMARQUE: Il peut être difficile de pipeter ou de verser tous les 1,5x PTU (étapes 3.3.1 et 3.3.2) ou 10 mM MTZ (étape 3.3.3) entre les échanges de solution sans perte larvaire car les animaux nagent activement. Dans ce cas, un lavage de l’eau du système sans PTU peut être ajouté pour assurer un échange de solution réussi.

4. Entretien larvaire post-ablation génétique (6+ jours après la fécondation)

1. Vérifiez les larves et reconstituez l’eau du système sans UTP tous les jours jusqu’à l’euthanasie (étape 5.6) ou retournez à l’installation d’hébergement du poisson-zèbre.
2. Surveiller le succès et l’étendue de l’ablation in vivo sur 2 dpi (7 dpf) à l’aide de l’éclairage lumineux transmis sur un stéréomicroscope (Figure 2).

5. Intégration d’un traitement pharmacologique dans le protocole d’ablation de l’épithélium pigmentaire rétinien du poisson-zèbre

REMARQUE: Comme effectué précédemment³, le traitement avec un IWR-1 de 15 μM ou un contrôle de véhicule de diméthylsulfoxyde de méthyle (DMSO) apparié en fonction du volume à partir de 4 dpf est décrit ici à titre d’exemple d’expérience pour tester RpEGEN. Les concentrations et les délais peuvent varier selon les différents composés pharmacologiques et les recommandations pour la validation dose-réponse, la durée du traitement, le dépistage et d’autres aspects de la conception expérimentale pour les études de manipulation pharmacologique sont abordées dans la section Discussion. Suivez les étapes 6 et 7 si une analyse d’image est requise.

1. Prélever et conserver les embryons comme décrit à l’étape 2. Déséchorionates embryons sur 2 dpf.
2. Dépister les larves eGFP⁺ sur 4 dpf comme décrit à l’étape 3.2. Plutôt que des boîtes de Pétri, placez les larves d’eGFP⁺ dans des plaques de 6 puits à une densité de n ≤ 10 larves par 6 puits pour un traitement pharmacologique. Désignez des plaques séparées de 6 puits pour les larves qui seront non abrées (MTZ^-) et les larves qui seront ablées (MTZ⁺).
   REMARQUE: Le signal eGFP est visible sur 4 dpf mais apparaît plus faible que l’intensité du signal sur 5 dpf.
3. Prétraitez 4 larves dpf eGFP⁺ avec 15 μM d’IWR-1 ou un contrôle de véhicule DMSO en fonction du volume pendant exactement 24 h avant l’ablation génétique avec une solution de MTZ de 10 mM.
   REMARQUE: Souvent, très peu de composé est nécessaire pour les expériences de traitement pharmacologique. Pour éviter de peser de petites quantités de poudre d’IWR-1, ce composé pharmacologique est acheté déjà en solution de DMSO, à une concentration de 25 mM, et alicité en plus petits volumes à l’arrivée pour éviter les cycles répétés de gel-dégel.
   1. Déterminer le volume des traitements pharmacologiques et de contrôle du véhicule nécessaires et aliquote 1,5x PTU dans les tubes coniques en conséquence. Un volume de 5 mL/puits d’une plaque de 6 puits est recommandé.
   2. Ajouter la souche IWR-1 à 1,5x PTU pour une concentration finale de 15 μM IWR-1 (p. ex., 3 μL de 25 mM IWR-1 par 5 mL de 1,5x PTU). Ajoutez un volume correspondant de stock de DMSO à 1,5x PTU (par exemple, 3 μL ≥ 99,7% de DMSO par 5 mL de 1,5x PTU). Ici, cela finira par donner une concentration finale de 0,06% volume / volume (% v / v) DMSO. Bien mélanger par vortex et confirmer visuellement la dissolution des composés.
      ATTENTION: Le DMSO, l’IWR-1 et d’autres composés et solvants pharmacologiques peuvent devoir être éliminés en tant que déchets chimiques en fonction des réglementations étatiques et institutionnelles. La confirmation de la niveau de danger et des méthodes appropriées d’élimination des déchets pour ces composés, le cas échéant, est recommandée avant utilisation.
   3. Retirer 1,5x PTU des larves eGFP⁺ dans des plaques à 6 puits et ajouter 5 mL/puits de traitements DMSO à 0,06 % v/v fraîchement préparés ou 15 μM iWR-1 à partir de l’étape 5.3.2.
4. Sur 5 dpf, ablation du RPE. En plus du prétraitement de 24 heures (étape 5.3), les larves resteront immergées dans des traitements pharmacologiques et de contrôle des véhicules pendant 24 heures d’ablation génétique avec 10 mM de MTZ et pendant la récupération post-ablation, jusqu’à la fixation (par exemple, de 4 à 9 dpf).
   1. Faire une solution de MTZ de 10 mM 2 h avant d’effectuer une ablation génétique (étape 3.1).
   2. Déterminer le volume des traitements pharmacologiques et de contrôle du véhicule nécessaires pour les plaques de 6 puits non agglomérées (MTZ^-) et ablées (MTZ⁺) et aliquoter les volumes appropriés d’eau douce du système sans PTU (MTZ^-) ou de solution de MTZ de 10 mM (MTZ⁺) dans des tubes coniques. Cela donnera quatre conditions de traitement: 1) 0,06% v / v DMSO, MTZ^-; 2) 15 μM IWR-1, MTZ^-; 3) 0,06 % v/v DMSO, MTZ⁺; et 4) 15 μM IWR-1, MTZ⁺.
   3. Ajouter des solutions mères IWR-1 et DMSO aux tubes coniques respectifs comme indiqué à l’étape 5.3.2. Bien mélanger par vortex et confirmer visuellement la dissolution des composés.
   4. Retirer 0,06 % v/v de DMSO et 15 μM d’IWR-1 dans 1,5x PTU (étape 5.3.2) des plaques désignées à 6 puits non ablées (MTZ^-) et ablées (MTZ⁺) et reconstituer avec les traitements appropriés effectués à l’étape 5.4.3.
   5. Retirer 0,06 % v/v de DMSO et 15 μM d’IWR-1 dans une solution de MTZ de 10 mM après exactement 24 h et reconstituer avec des traitements dans de l’eau douce du système sans PTU. Reconstituer les traitements DMSO à 0,06 % v/v et IWR-1 de 15 μM dans de l’eau douce du système sans PTU sur la ou les plaques non agglomérées (MTZ^-) à 6 puits.
5. Suivez l’entretien larvaire après l’ablation comme indiqué à l’étape 4 et reconstituez quotidiennement les traitements de 0,06 % v/v de DMSO ou d’IWR-1 de 15 μM dans l’eau du système sans UTP.
6. Euthanasier les larves sur 9 dpf (4 dpi pour les frères et sœurs traités par MTZ appariés à l’âge) en immergeant les animaux dans une solution de tricaïne à 0,3 g/L (surdosage mortel) couplé à un refroidissement rapide (par exemple, placer des boîtes de Petri sur de la glace) pendant au moins 20 min³⁰. Vérifiez que les larves ne répondent pas au toucher et fixez-les à 4 % de PFA (étape 1.5) pendant 3 h à température ambiante ou à 4 °C pendant la nuit.
7. Traiter le tissu larvaire post-fixation pour l’acquisition d’images z-stack sur un microscope confocal comme décrit précédemment ^5,31 et ici dans la section Résultats représentatifs. L’analyse des étapes 6 et 7 nécessitera, au minimum, l’acquisition d’images de marqueurs nucléaires (p. ex., DAPI) et d’images z-stack en champ clair.

6. Prétraitement d’images z-stack au microscope confocal dans FIJI (ImageJ)

1. Importez et formatez des images z-stack de microscope confocal à l’aide de FIJI³².
   1. Ouvrez des images de microscope à l’aide des options d’importation des bioformats définies sur Afficher la pile avec : Hyperstack et mode Couleur : Niveaux de gris.
   2. Générez une projection d’intensité maximale de l’image de microscope importée en choisissant Image | Piles | Projet Z. Dans la fenêtre ZProjection , définissez Start Slice et Stop Slice pour inclure toutes les tranches de cette image. Par exemple, définissez Start Slice: 1 et Stop Slice: 18 pour une pile z qui a un total de 18 tranches. Choisissez Type de projection: Intensité maximale et cliquez sur OK.
   3. Convertissez le fichier de projection d’intensité maximale en une image 8 bits (si ce n’est pas déjà fait) en choisissant Image | Type | 8 bits.
   4. Réorientez l’image de sorte que la face dorsale soit vers le haut et que la partie distale (c’est-à-dire l’objectif) soit laissée en choisissant Image | Transformez | Inverser horizontalement (pour la dernière commande, choisissez l’option qui convient le mieux à la directionnalité nécessaire pour cette image). Pour une image multicanal, cliquez sur Oui dans la pile de processus? pour réorienter tous les canaux.
      REMARQUE: Cette étape est critique, mais pas nécessaire si l’image est déjà dans l’orientation gauche dorsale vers le haut, distale. Reportez-vous à la Figure 3A-D et à la Figure 4 pour les images avec des yeux dans la directionnalité correcte pour le traitement.
   5. Enregistrez la projection d’intensité maximale 8 bits en tant que fichier TIF (Tagged Image File Format) en choisissant Fichier | Enregistrer sous | Tiff....
2. Générez la région d’intérêt (ROI) RPE à l’aide de FIJI.
   1. Ouvrez une image TIF 8 bits générée comme décrit à l’étape 6.1. Démarrez le gestionnaire de retour sur investissement en choisissant Analyser | Outils | Gestionnaire de retour sur investissement.
   2. Utiliser l’image | Zoomez et basculez entre les canaux DAPI et Brightfield pour identifier le ou les points auxquels le côté apical du RPE est adjacent à l’extrémité de la membrane limitante externe (OLM) (Figure 3B', B », D', D »; pointes de flèche bleues). Utilisez ce repère anatomique comme point de départ du retour sur investissement.
   3. Créez le retour sur investissement RPE à l’aide de l’outil Sélections de polygones (dans la barre d’outils FIJI) à l’aide des couches d’image DAPI et de champ clair et de la fonction de zoom (Image | Zoom) pour identifier les limites apicales et basales de l’EPR. Amenez les extrémités dorsale et ventrale du ROI (c’est-à-dire où le ROI passe du côté apical au côté basal de l’EPR) à un point pointu plutôt que de l’émousser ou de l’arrondir (Figure 3B', B », D', D »; lignes magenta).
      REMARQUE : La création d’une fin de retour sur investissement pointue est une étape critique pour optimiser la détection des points de terminaison à l’aide de RpEGEN et est abordée dans la section Discussion.
   4. Ajoutez le ROI en cliquant sur Ajouter dans le Gestionnaire de ROI. Ajustez le retour sur investissement si nécessaire et cliquez sur Mettre à jour dans le gestionnaire de retour sur investissement.
   5. Enregistrez le fichier ROI en choisissant Plus>> | Sauvegarder... dans le gestionnaire de retour sur investissement. Utilisez des noms identiques pour les fichiers image ROI et TIF correspondants (par exemple, [nom du fichier].tif et [nom du fichier].roi).
3. Combinez les fichiers TIF et ROI 8 bits pour chaque condition dans un seul dossier. Par exemple, le dossier, DMSO_9dpf, contiendra tous les fichiers TIF et ROI correspondants pour le groupe larvaire traité DMSO à 9 dpf non abrégé (MTZ^-) à 0,06 % v/v.

7. Quantification et visualisation de la régénération RPE à l’aide de scripts RpEGEN

1. Installez et préparez des scripts RpEGEN.
   1. Téléchargez les derniers scripts RpEGEN depuis le référentiel GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) en cliquant sur Code | Télécharger ZIP.
   2. Décompressez le dossier et placez-le dans l’emplacement d’espace de travail souhaité (par exemple, Bureau).
   3. Ouvrez MATLAB.
   4. Accédez au dossier RpEGEN dans le volet Dossier actif (généralement sur le côté gauche).
   5. Faites un clic droit sur le dossier RpEGEN et choisissez Ajouter au chemin d’accès | Dossiers et sous-dossiers sélectionnés. Cela ajoute le dossier au chemin MATLAB afin qu’il puisse automatiquement rechercher et exécuter tous les scripts du dossier.
   6. Double-cliquez sur le dossier RpEGEN dans le volet Dossier actuel pour afficher tous les sous-dossiers et les fichiers M.
   7. Double-cliquez sur le fichier RpEGEN.m pour l’ouvrir dans le volet Éditeur .
   8. Dans la section VARIABLES DÉFINIES PAR L’UTILISATEUR du fichier RpEGEN.m, entrez les emplacements des répertoires des dossiers contenant les fichiers ROI (.roi), les fichiers image (.tif) et l’emplacement d’enregistrement des fichiers de sortie. Entrez le nom du groupe pour le fichier .mat à exporter (par exemple, DMSO_9dpf, DMSO_4dpi, etc.) et l’emplacement du canal de fond clair dans la pile d’images TIF (par exemple, 3, si le champ lumineux est le troisième canal d’une pile d’images). Si le fichier image ne contient que l’image en fond clair, celle-ci doit être égale à 1.
2. Exécutez le script RpEGEN.m et validez les résultats.
   REMARQUE : RpEGEN nécessite que la boîte à outils de traitement d’image, la boîte à outils d’ajustement de courbe et la boîte à outils de statistiques et d’apprentissage automatique soient activées sur la licence MATLAB de l’utilisateur pour pouvoir s’exécuter. En outre, la boîte à outils ReadImageJROI³³ disponible gratuitement est nécessaire pour importer des retours sur investissement FIJI dans MATLAB ; cependant, il est fourni dans le dossier RpEGEN avec d’autres fichiers de fonction M qui ne nécessitent aucune activation.
   1. Exécutez le script en cliquant sur le bouton Exécuter dans le menu Éditeur en haut de MATLAB.
      REMARQUE: Une fois lancée, la fenêtre Commande fournira une sortie détaillée indiquant la progression du script. Après avoir enregistré le fichier MAT contenant les données extraites, une figure à trois panneaux apparaîtra et sera enregistrée au format PDF dans le répertoire de sortie pour chaque exécution d’image. Ce sont des chiffres de contrôle de la qualité (QC) pour s’assurer que tout a fonctionné correctement et comprennent: 1) l’image en fond clair superposée par le retour sur investissement (Figure 4A); 2) le retour sur investissement avec le trait d’axe et la distance angulaire associée (degrés) (Figure 4G); et 3) le retour sur investissement avec les valeurs d’intensité médiane de l’axe médian (0-255, échelle de couleurs 8 bits) (Figure 4H). Attendez que les FICHIERS PDF QC aient été enregistrés dans le dossier de sortie et que le dernier chiffre ait disparu avant de passer à l’étape suivante.
   2. Ouvrez les fichiers PDF individuels exportés vers le dossier de sortie dans n’importe quelle visionneuse PDF et vérifiez que tous les rois correspondent aux images en champ clair, que les valeurs de ligne médiane sont des approximations raisonnables du centre des rois et que les valeurs d’intensité médiane sont correctement remplies avec des données (c’est-à-dire pas toutes la même valeur sur l’ensemble du trait d’ordre).
      REMARQUE : Une description détaillée et la structure de chaque variable enregistrée dans le fichier MAT par RpEGEN.m se trouvent dans le tableau 1.
3. Exécutez le script RpEGEN_PermPlot.m.
   REMARQUE: Le script RpEGEN_PermPlot.m utilise la sortie de RpEGEN.m pour exécuter des comparaisons statistiques à l’aide d’une simulation de permutation des médianes de deux groupes et fournit également le code pour reproduire les graphiques de ce document à l’aide de la boîte à outils GRAMM³⁴ disponible gratuitement, qui a également été incluse dans le dossier RpEGEN.
   1. Double-cliquez sur le fichier RpEGEN_PermPlot.m pour l’ouvrir dans un nouvel onglet Éditeur .
   2. Sous SECTION 1 - VARIABLES DÉFINIES PAR L’UTILISATEUR dans le fichier RpEGEN_PermPlot.m, entrez l’emplacement du répertoire du dossier de sortie contenant les fichiers MAT de l’exécution de RpEGEN.m et entrez chaque nom de fichier MAT à charger (par exemple, DMSO_4dpi.mat, IWR1_4dpi.mat).
   3. Exécutez cette section du script en cliquant sur le bouton Exécuter la section dans le menu Éditeur en haut de MATLAB.
   4. Dans la section 2, entrez les noms des deux groupes pour la comparaison statistique dans les data_A et data_B variables (ce sont les groupes à partir desquels les médianes seront dérivées à l’aide de la simulation de permutation). Dans la variable bin_sz , entrez le nombre de degrés sur lesquels intégrer les valeurs d’intensité médiane des jeux de données (la valeur par défaut est des bacs à 1 degré).
      REMARQUE : La variable reps indique le nombre de permutations à utiliser pour créer une distribution de probabilité et peut être définie sur n’importe quel nombre (la valeur par défaut est 20 000). En général, un nombre plus élevé de répétitions sera plus robuste statistiquement, mais augmentera le temps de traitement.
   5. Exécutez cette section du script en cliquant sur le bouton Exécuter la section dans le menu Éditeur en haut de MATLAB. Cette section peut prendre un certain temps en fonction du nombre de répétitions spécifiées, mais fournit une mise à jour continue de l’état dans la fenêtre de commande.
   6. Exécutez les sections FIGURE DE CARTE THERMIQUE et RÉSULTATS DU GROUPE ET VALEURS P indépendamment à l’aide du bouton Exécuter la section . Modifiez les variables de données dans toutes les sections commentées avec « ENTREZ LES DONNÉES ICI ». Les PDF de ces figures sont automatiquement enregistrés pour chacune et peuvent être facilement modifiés dans n’importe quel logiciel vectoriel de post-traitement.
      REMARQUE : Les tracés générés dans le fichier RpEGEN_PermPlot.m sont ad hoc et nécessiteront probablement des modifications en fonction des besoins spécifiques de chaque utilisateur en matière de données et de visualisation. Cependant, les chiffres fournissent une base solide qui peut être facilement individualisée à l’aide des sites Web MATLAB et GRAMM.

Representative Results

L’inhibition de la voie canonique de signalisation Wnt est connue pour nuire de manière significative à la régénération de l’EPR du poisson-zèbre en utilisant le paradigme d’ablation génétique (rpe65a:nfsB-eGFP) et la méthodologie de manipulation pharmacologique (IWR-1) décrite dans le protocole³. Cette expérience a été répétée ici pour valider une méthode automatisée de quantification de la régénération RPE du poisson-zèbre basée sur la pigmentation. Les résultats résumés ci-dessous englobaient toutes les étapes du protocole, du jour de la fécondation (0 dpf) à la quantification de la régénération de l’EPR à l’aide de RpEGEN.

Mise en œuvre du protocole d’ablation RPE (avec manipulation pharmacologique) chez les larves de poisson-zèbre
Les embryons prélevés dans trois groupes parents distincts (N = 3) ont commencé le traitement avec 1,5x PTU autour de 6 hpf et l’absence de pigmentation dans l’EPR et les mélanocytes de surface a été confirmée visuellement sur 1 dpf. Les embryons ont été décholonisés enzymatiquement sur 2 dpf à l’aide de 2 mg/mL de pronase (étape 2.4). Sur 4 dpf, les larves ont été anesthésiées à l’aide de tricaïne (MS-222) et dépistées pour l’eGFP à l’aide d’un stéréomicroscope à fluorescence (étapes 3.2 et 5.2). Les larves d’eGFP⁺ ont été déplacées dans des plaques de 6 puits (n = 10 larves/puits) et ont été traitées avec 0,06 % v/v de DMSO (contrôle du véhicule) ou 15 μM IWR-1 (étape 5.3). La densité larvaire rapportée ici était initialement basée sur l’approximation de 1 larve/cm² de surface de croissance et a été validée par une surveillance attentive de la santé (p. ex. développement de la vessie natatoire) au fil du temps. L’intensité de l’eGFP semblait faible sur 4 dpf, de sorte que les larves ont été re-dépistées sur 5 dpf pour confirmer l’expression lumineuse de l’eGFP (Figure 1). RPE65 (rpe65a chez le poisson-zèbre) est un marqueur de l’EPR⁷ mature et, chez les poissons téléostéens, les cellules rétiniennes et RPE sont continuellement générées à partir de la zone marginale ciliaire (CMZ), une niche de cellules souches à l’extrémité distale de la rétine, adjacente au cristallin³⁵. Ainsi, dans la lignée transgénique rpe65a:nfsB-eGFP, les EPR les plus immatures existent à la périphérie et apparaissent eGFP^- (environ un tiers du tissu RPE total) tandis que les deux tiers centraux matures de l’EPR expriment l’eGFP (Figure 1B ; pointes de flèches blanches). Le transgène était également visible dans la glande pinéale (figure 1A; pointe de flèche jaune), ce qui était attendu car rpe65a montre une expression pinéale chez le poisson-zèbre³⁶. Des larves relativement sombres ou eGFP^- ont été extraites de plaques de 6 puits et euthanasiées sur 5 dpf. Exactement 24 heures après le traitement par DMSO ou IWR-1, 5 larves de dpf ont été traitées avec 10 mM de MTZ pour ablation de l’EPR (étapes 3.1, 3.3 et 5.4). Le MTZ a été lavé après exactement 24 h (c’est-à-dire sur 6 dpf/1 dpi) pour permettre la régénération de l’EPR.

Les larves ont été observées quotidiennement au stéréomicroscope en utilisant un éclairage lumineux transmis de 6 dpf/1 dpi au moment de l’euthanasie sur 9 dpf/4 dpi. Le succès de l’ablation génétique a été confirmé in vivo sur 2 dpi par l’absence de pigment dans les deux tiers centraux de l’œil chez les larves de MTZ⁺ (Figure 2B; pointes de flèches rouges) par rapport à 7 frères et sœurs ^témoins MTZ dpf (Figure 2A) (étape 4.2). Comme prévu, la zone dépourvue de pigment sur 2 dpi est apparue analogue à la région de rpe65a:nfsB-eGFP expression transgénique observée sur 5 dpf (Figure 1B). L’évaluation a été effectuée sur 2 dpi et non plus tôt car les EPR subissent une repigmentation après l’ablation de la PTU et, selon le moment de l’observation in vivo, une différence marquée entre l’EPR centrale ablée et l’EPR périphérique atténué (non atténué) peut être difficile à discerner si cette dernière n’a pas complètement réactivé. Malgré la possibilité d’ambiguïté macroscopique, l’ablation de l’EPR à 1 dpi s’est déjà avérée facilement apparente dans les tissus sectionnés, révélant une perte d’intégrité tissulaire de l’EPR centrale et de la couche nucléaire externe (ONL, c.-à-d. photorécepteur) ainsi que des signes de mort cellulaire (noyaux pyknotiques) (figure 5)³. Contre la perte de tissus, une prolifération robuste a été déterminée comme un facteur clé lors de la régénération tissulaire dans le modèle³ du poisson-zèbre rpe65a:nfsB-eGFP. La réponse apoptotique précoce, où l’ablation de l’EPR entraîne une dégénérescence des tissus adjacents (par exemple, les photorécepteurs et la membrane de Bruch; Figure 6A-C), et la réponse proliférative périphérique-centrale qui suit, qui donne des « zones » de régénération hétérogènes se déplaçant vers l’intérieur du site de la blessure (Figure 6D-F), ont été largement caractérisés et discutés précédemment³.

Préparation tissulaire, acquisition d’images confocales et prétraitement d’images pour une quantification automatisée basée sur la pigmentation RPE à l’aide de RpEGEN
Sur 9 dpf/4 dpi, les larves traitées au DMSO et à l’IWR-1 ont été euthanasiées par surdosage de tricaïne et fixées dans un PFA à 4 % pendant 3 h à température ambiante (étape 5.6). Quatre larves de chaque groupe de parents indépendants ont été choisies au hasard pour le traitement ultérieur des tissus (N = 3; n = 12 larves par traitement). La cryoprotection, la cryosection (à 12 μm d’épaisseur), le contre-confinement nucléaire avec DAPI et le montage par couvercle ont été effectués comme indiqué à l’étape 5.7 ^5,31. Une section centrale, avec nerf optique visible, de chaque larve a été imagée sur un microscope confocal à balayage laser à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile 40x (ouverture numérique = 1,30) pour acquérir des images z-stack de 512 x 512 pixels avec un intervalle z-step de 1 μm. Chaque image contenait des données provenant de trois canaux : canal 1 = excitation de 405 nm pour DAPI, canal 2 = excitation de 488 nm pour eGFP, canal 3 = lumière transmise pour le champ lumineux. Comme l’intensité des pixels a été quantifiée dans les images en champ clair, les réglages de tension de la lampe lumineuse transmise ont été maintenus constants et toutes les données recueillies pour les comparaisons statistiques ont été imagées le même jour.

Les images z-stack du microscope confocal ont été prétraitées pour une quantification automatisée comme décrit à l’étape 6, en utilisant FIJI. Les images étaient exclues du prétraitement et de la quantification si le tissu était compromis d’une manière qui rendrait difficile la génération de retour sur investissement (p. ex., par déchirure (Graphique 7A; pointes de flèche magenta) ou obstruction de repère (Graphique 7B; ovales magenta)) ou des mesures d’intensité de retour sur investissement biaisées (p. ex., à partir du pliage (Graphique 7C; ovales magenta)). Malgré l’omission de quelques larves avec ces critères d’exclusion, tous les ensembles de données ici représentent N = 3 avec le nombre suivant de répliques biologiques (larves): n = 11, DMSO MTZ^-; n = 10, IWR-1 MTZ^-; n = 11, DMSO MTZ⁺; n = 12, IWR-1 MTZ⁺. À l’aide du canal DAPI, les ROE RPE ont été initiés en identifiant d’abord le point auquel la face apicale dorsale de l’EPR (face à la rétine) était directement adjacente à la pointe dorsale de l’OLM (Graphique 3B',D'; pointes de flèches bleues) (étape 6.2.2). Comme l’extension distale de l’EPR peut varier d’une section à l’autre, l’OLM a été utilisé comme point de repère anatomique pour normaliser les paramètres de retour sur investissement de l’EPR et normaliser les mesures de distance angulaire dans MATLAB (où 0° = point de terminaison du retour sur investissement dorsal et 180 ° = point final du retour sur investissement ventral). Lors de l’exécution d’ablations EPR avec manipulation pharmacologique ou dans un fond mutant, un repère anatomique doit être identifié et validé avant le prétraitement et la quantification. Ici, l’OLM était apparent chez toutes les larves quantifiées et n’était pas compromis par la déchirure (comme dans Graphique 7B) ou un traitement par DMSO ou IWR-1. Après avoir identifié le point de départ dorsal, des ROI ont été générés en suivant la face apicale de l’EPR (dorsale à ventrale) jusqu’à ce que le point adjacent à la pointe de l’OLM ventral soit atteint (Graphique 3B",D"; pointes de flèches bleues). Ensuite, un paramètre de retour sur investissement ventral a été établi entre les côtés apical et basal (face à la choroïde) de l’EPR, comme indiqué à l’étape 6.2.3 (Graphique 3B",D"; ligne magenta). Le ROI a été poursuivi, suivant le côté basal de l’EPR (ventral-dorsal) jusqu’à atteindre le côté basal adjacent au point de départ à l’OLM dorsal. Le roi a ensuite été fermé en créant une extrémité dorsale pointue (Graphique 3B',D'; ligne magenta) comme fait ventralement. Il a été démontré que l’ablation génétique entraîne une perte de l’expression centrale de l’eGFP qui est récupérée au fur et à mesure que la régénération se poursuit (résumée dans Graphique 6)³; ainsi, en fonction de l’étendue de la régénération et de l’intensité de l’eGFP au point d’intérêt temporel, le canal eGFP peut n’être utile que pour la génération de RETOUR SUR INVESTISSEMENT dans le MTZ^- groupe. Par conséquent, alors que les acquisitions confocales contenaient également des images de canaux eGFP, la génération de retour sur investissement a été réalisée à l’aide des canaux DAPI et brightfield, comme mentionné à l’étape 6.2.3. La génération du retour sur investissement RPE a été simple dans les MTZ traités DMSO et IWR-1^- groupes larvaires et régions englobées avec des microvillosités apicales visiblement pigmentées (Graphique 3B; pointe de flèche rouge) avec les corps cellulaires bien pigmentés. Les mêmes paramètres ont été appliqués à MTZ⁺ groupes larvaires (Figure 3D; pointe de flèche rouge); cependant, en raison des tissus endommagés résiduels à l’intérieur du site de la blessure, les microvillosités apicales et les limites de la pigmentation étaient difficiles à délimiter dans le canal du champ lumineux seul dans certains cas. Dans ces zones, le canal DAPI a également été utilisé pour identifier les débris cellulaires à l’intérieur du site de la blessure RPE, qui a été inclus dans le retour sur investissement (Graphique 3C,D; des exemples de débris cellulaires localisés sur le site de la blessure sont indiqués par des pointes de flèche cyan). Immunocoloration avec des marqueurs de l’EPR immature/mature (p. ex., ZPR2; Figure 6D,E)³⁷ et/ou des photorécepteurs (p. ex., ZPR1)^37,38 pourrait également être utilisé pour faciliter la description des ROI RPE chez les larves ablées.

Auparavant, les larves ablées traitées par IWR-1 de 4 dpf à 4 dpi présentaient une altération significative de la régénération de l’EPR par rapport aux témoins frères et sœurs traités par DMSO (Figure 8C)³. Ce pourcentage de récupération du pigment central a été rapporté, ce qui nécessitait une expérience préalable substantielle avec le modèle et les mesures manuelles de la distance angulaire pour désigner les limites de régénération (Figure 8B; pointes de flèches noires). RpEGEN a été créé pour automatiser la quantification de la régénération RPE et réduire les biais intrinsèques. Non seulement cela, RpEGEN a également permis la génération d’ensembles de données très robustes; par exemple, 10 points de données ont déjà été générés à partir de la quantification manuelle de n = 10 larves MTZ⁺ traitées au DMSO (Figure 8C; % de récupération pigmentaire par mesure de section)³, tandis que 174 801 points de données ont été générés à partir de n = 11 larves/ROI MTZ⁺ traités au DMSO ici à l’aide de RpEGEN (Figure 9C; mesures de l’intensité des pixels).

RpEGEN a été développé pour évaluer progressivement les changements régionaux de pigmentation sur l’ensemble de l’EPR en dérivant une ligne médiane squelettée (largeur de 1 pixel) du retour sur investissement original généré à l’aide de FIJI (Figure 4A, B). Pour incorporer tous les pixels dans le retour sur investissement à des fins d’analyse (c’est-à-dire pas seulement les pixels du trait d’axe), une transformation de distance euclidienne a été effectuée sur chaque pixel du trait d’axe pour créer une carte de l’index de trait le plus proche pour chaque pixel du masque de retour sur investissement. Cette carte d’indices a permis d’attribuer chaque pixel en dehors de la ligne médiane à un seul pixel d’axe, créant ainsi un ensemble de données complet sur l’ensemble de l’EPR pour chaque larve (Figure 4E). La longueur dorsale-ventrale de l’EPR était représentée par la distance angulaire (Figure 4G; 0-180°) par opposition à la distance normalisée en pixels (Figure 4F; unités arbitraires 0-1), car cela était plus intuitif sur la base des mesures précédentes de la régénération RPE ^3,4,5 et du fait que la distance angulaire ne varie pas avec les différences morphologiques. Les intensités médianes dérivées des bacs à 5 degrés ont été choisies pour mettre en évidence les tendances à grande échelle et minimiser la variabilité à haute fréquence observée dans les données binées à 1 degré (tableau 1, figure 10A). La simulation de permutation a été choisie pour tester l’hypothèse nulle afin de voir si les médianes des deux groupes de traitement (ici, DMSO MTZ⁺ et IWR-1 MTZ⁺ (tous deux 4 dpi), Figure 10B) sont similaires³⁹. Cette technique de rééchantillonnage ne comporte pas d’hypothèses strictes sur la distribution des données et peut être utilisée sur une gamme de statistiques de test (par exemple, moyenne, médiane, etc.) pour générer des estimations robustes de la valeur de p. Un certain nombre de ces paramètres (p. ex., la taille du bac des données brutes et médianes, les répétitions de simulation de permutation, etc.) peuvent être adaptés et modifiés pour répondre aux besoins des utilisateurs. Pour ces derniers, 20 000 répétitions ont été choisies pour générer une comparaison statistiquement robuste, mais il faut veiller à équilibrer l’efficacité informatique avec la robustesse statistique, car trop peu de répétitions peuvent produire des estimations erronées de la valeur de p. Il est recommandé d’exécuter plusieurs valeurs de répétition (10 000, 20 000, etc.) pour s’assurer que la distribution et les valeurs de la valeur de p sont relativement stables avant de commencer les interprétations. L’augmentation des répétitions de permutation augmentera la puissance statistique (mais prendra également plus de temps à exécuter), ce qui peut être bénéfique pour certains ensembles de données.

Les ensembles de données d’images confocales ont été quantifiés à l’aide de RpEGEN comme décrit à l’étape 7. Les scripts RpEGEN et de support annotés sont disponibles sur GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) avec le TIF 8 bits et les fichiers ROI correspondants pour les utilisateurs intéressés à tester. Les cartes thermiques affichant les données brutes des ^{ROI larvaires} MTZ ont montré une distribution globale des intensités de pixels plus sombres (où 0 = noir et 255 = blanc, échelle de couleurs 8 bits) couvrant la longueur dorsale (0°) à ventrale (180°) de l’EPR, quel que soit le traitement avec 0,06 % v/v DMSO ou 15 μM IWR-1 (Figure 9A, B). Le traçage de l’intensité médiane des pixels a facilité la visualisation entre tous les groupes et a montré des similitudes entre ^{les groupes} MTZ à travers le RPE (Figure 10A; lignes noires et grises). Ces données ont confirmé la présence d’une monocouche RPE pigmentée intacte (Figure 9E,F) et ont fourni des valeurs médianes de base de l’intensité des pixels (c.-à-d. inférieures à 150) pour les RPE non atténuées (Figure 10A; lignes noires et grises). Comparativement, les données brutes (Figure 9C,D) et médianes (Figure 10A; lignes bleues et rouges) provenant des ROI larvaires MTZ⁺ ont montré une distribution globale des intensités de pixels plus légères dans l’EPR centrale, encore une fois, quelle que soit l’condition de traitement. Les larves ablées traitées au DMSO ont montré une distribution centralisée des pixels lumineux à environ 100° (± 15°) (Figure 9C; bacs rouge orangé). Cela correspondait à une absence visible de pigmentation dans le site central de la lésion RPE à l’intérieur/ autour du nerf optique (Figure 9G; pointes de flèche bleues). Les larves ablées traitées par IWR-1 ont également montré une distribution centralisée des pixels lumineux qui ont été étendus à la fois dorsalement (à environ 50 °) et ventralement (d’environ 5 °) par rapport aux témoins frères et sœurs traités par MTZ⁺ DMSO (Figure 9D; bacs rouge orangé). La présence d’un site de blessure élargi était clairement visible dans les tissus sectionnés (figure 9H; pointes de flèches bleues). À l’exception de deux bacs de 1 degré, la différence observée entre les groupes MTZ⁺ était statistiquement significative dans l’EPR central (figure 10B; zone ombragée bleu clair entre ~40-140°; La valeur de p ≤ 0,05), ce qui indique une pigmentation RPE centrale significativement plus faible chez les larves traitées par MTZ⁺ IWR-1 par rapport aux témoins frères et sœurs traités par MTZ⁺ DMSO. L’interprétation de ces données brutes (Figure 9C,D) et médianes (Figure 10A) avec comparaison statistique (Figure 10B) à l’aide de RpEGEN a été validée non seulement par l’observation de tissus sectionnés (Figure 9G,H), mais a également étayé les résultats antérieurs de la quantification manuelle (Figure 8)³.

Figure 1 : rpe65a:expression du transgène nfsB-eGFP 5 jours après la fécondation. (A-C) Images complètes d’une larve de 5 dpf traitée par PTU montrant une faible expression transgénique dans la glande pinéale (A; pointe de flèche jaune) et une expression transgénique brillante dans l’EPR (B, C) au moment du dépistage de l’ablation génétique. (B) L’expression transgénique est visiblement localisée aux deux tiers centraux de l’EPR, et les pointes de flèches blanches mettent en évidence la frontière entre l’EPR périphérique (immature) et l’EPR central (mature). Vert = eGFP. L’antérieur est en haut. Barres d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2 : Vérification de l’ablation génétique réussie de l’EPR in vivo. Images en monture complète de (A) trois larves non atablées (MTZ^-) de 7 dpf montrant une pigmentation RPE dans tout l’œil et (B) trois larves ablées (MTZ⁺) 2 dpi montrant une zone d’ablation où il y a une absence de pigment dans les deux tiers centraux de l’EPR (pointes de flèche rouge). L’antérieur est en haut. Barres d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3 : Régions d’intérêt RPE (ROI) pour la quantification automatisée à l’aide de RpEGEN. Cryosections transversales d’une larve non agglomérée (MTZ^-) de 9 dpf et (C,D) d’une larve ablée (MTZ⁺) de 4 dpi avec les ROI RPE mis en évidence en magenta. (B,D) Les pointes de flèches rouges mettent en évidence les régions où des microvillosités apicales visiblement pigmentées ont été incluses dans le retour sur investissement. (C,D) Les pointes de flèche cyan indiquent des exemples de régions de débris DAPI⁺ localisés sur le site de la blessure, qui ont été utilisés pour inclure les débris de cellules RPE dans le retour sur investissement. (B',B »,D',D ») Les zooms numériques des régions de retour sur investissement dorsale et ventrale (cases pointillées noires en B et D) montrent les points de départ suggérés du retour sur investissement (pointes de flèche bleues) et les extrémités pointues du retour sur investissement qui sont essentielles pour la détection des points de terminaison dans MATLAB. Les images en fond clair sont également illustrées à la Figure 9E,G. Blanc/gris = noyaux. Dorsal est en haut et distal est laissé. (A-D) Barres d’échelle = 40 μm. (B',B »,D',D ») Barres d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Flux de travail de traitement RpEGEN. (A) Exemple d’une image en champ clair 8 bits correctement orientée et d’un retour sur investissement généré par FIJI (rouge) importé dans MATLAB. Dorsal est en haut et distal est laissé. La barre de couleur représente des valeurs d’intensité en niveaux de gris 8 bits où 0 = noir et 255 = blanc. (B) Squelette binaire initial (blanc) du masque ROI (rouge) montrant la présence d’éperons erronés et la délimitation des points de départ et d’arrivée pour la délimitation de la distance des pixels géodésiques comme indiqué en (C). La barre de couleur en (C) représente la distance des pixels euclidiens. (D) Les éperons sont supprimés à l’aide d’une voie simplifiée à moindre coût du pixel d’extrémité au pixel de départ, ce qui donne une ligne médiane continue dépourvue d’éperons (rouge). (E) Indices d’axe linéaire les plus proches basés sur une transformation de distance entre tous les pixels du masque ROI et les pixels d’axe (blanc). Ces valeurs d’index permettent d’affecter chaque pixel d’image du masque ROI au pixel d’axe le plus proche pour analyse. La barre de couleur représente les valeurs d’index de pixel du trait d’axe linéaire. (F) Un exemple de la distance de pixel normalisée le long de la ligne médiane, où 0 (bleu, pixel dorsal le plus distal) est le pixel de départ et 1 (rouge, pixel ventral le plus distal) est le pixel de fin. (G) Semblable à (F) mais en utilisant la distance angulaire, où 0 degré (bleu) est le pixel de début et 180 degrés (rouge) est le pixel de fin. (H) Exemple des valeurs médianes d’intensité des pixels calculées pour chaque pixel d’axe. La barre de couleur représente la valeur médiane d’intensité en niveaux de gris de tous les pixels ROI contribuant à chaque pixel de ligne médiane donné. Cette figure montre des images provenant d’un ensemble de données de test et non des larves des groupes de traitement DMSO à 0,06 % v/v ou IWR-1 à 15 μM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Preuve d’ablation de l’EPR et de dégénérescence des photorécepteurs. (A) Cryosections transversales d’une larve non affligée de 6 dpf. (A,A') Après l’exposition à la PTU, l’expression transgénique est limitée aux cellules RPE matures, l’expression la plus brillante étant confinée aux deux tiers centraux de l’EPR. Les pointes de flèche indiquent des microvillosités apicales. (A ») Les images de contraste d’interférence différentielle (DIC) révèlent une architecture normale de la couche nucléaire externe (ONL, c’est-à-dire photorécepteur). (B,B') Les cryosections transversales d’une larve de 1 dpi révèlent une perturbation significative de la morphologie des cellules eGFP⁺ et une désorganisation dans le laminage ONL. Les flèches indiquent les noyaux délaminés et pyknotiques. (B ») Les images DIC révèlent en outre la perturbation marquée de l’architecture ONL. Vert = eGFP, bleu = noyaux, jaune = ONL. Dorsal est en haut et distal est laissé. La barre d’échelle en (A) représente 40 μm et peut être appliquée à (B). La barre d’échelle en (A') représente 40 μm et peut être appliquée à (A »,B',B »). Cette figure et le texte de la légende de la figure ont été modifiés à partir de Hanovice et al. 2019 (Figure 1)³. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Modèle de régénération de l’EPR chez les larves de poisson-zèbre. (A) nfsB-eGFP est exprimé en EPR mature dans les deux tiers centraux de l’œil. (B) L’application de MTZ entraîne l’apoptose (TUNEL, rouge) de l’EPR et des photorécepteurs. (C) L’ablation de l’EPR entraîne une dégénérescence des photorécepteurs et de la membrane de Bruch (ligne pointillée). (D) Les EPR non atténués à la périphérie commencent à proliférer et à s’étendre jusqu’au site de la blessure (bleu). (E) Au fur et à mesure que les EPR eGFP⁺ régénérés apparaissent à la périphérie, les EPR peuvent être divisés en quatre zones : RPE périphérique (pRPE), RPE différencié (dRPE), zone de transition (TZ) et site de blessure (IS). (E, encadré) L’EPR différencié régénéré (vert) apparaît dans la périphérie proximale de l’EPR périphérique non amblé et contient des cellules prolifératives adjacentes à la zone de transition. La zone de transition se compose de cellules RPE encore différenciantes (ZPR2, rouge) et de cellules prolifératives (bleues). Le site de la lésion comprend des cellules prolifératives non pigmentées qui n’expriment aucun marqueur de différenciation rpE. (F) La régénération d’une couche RPE fonctionnelle et de la membrane de Bruch est complète de 14 dpi. Cette figure et le texte de la légende de la figure ont été modifiés par rapport à Hanovice et al. 2019 (Figure 14)³. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Coupes de tissus compromises exclues de l’analyse d’images. (A-C) Cryosections transversales de larves à partir des ensembles de données DMSO à 0,06 % v/v et IWR-1 de 15 μM qui répondaient aux critères d’exclusion. Une larve montre une déchirure du tissu RPE dorsal (A; pointes de flèche magenta) et deux autres larves montrent un repliement tissulaire qui obstrue un repère anatomique (OLM dorsal) dans le canal DAPI (B; ovales en pointillés magenta) ou peut fausser les mesures d’intensité RPE du canal en champ clair (C; ovales en pointillés magenta). Blanc/gris = noyaux. Dorsal est en haut et distal est laissé. Barres d’échelle = 40 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : L’inhibition pharmacologique à l’aide de l’IWR-1 nuit à la régénération de l’EPR. Cryosections transversales de larves ablées (MTZ⁺) de 4 dpi provenant de (A) groupes de traitement DMSO à 0,06 % v/v et (B) 15 μM IWR-1. Les images en champ clair (A, B) et la quantification du pourcentage de récupération/section rpe (C) montrent un retard significatif dans la récupération d’une monocouche pigmentée chez les larves traitées par IWR-1 (test t non apparié de Student, *** p < 0,0001). (B) Les pointes de flèches noires indiquent le bord le plus central de l’EPR en régénération. Dorsal est en haut et distal est laissé. La barre d’échelle en (B) représente 40 μm et peut être appliquée à (A). Cette figure et le texte de la légende de la figure ont été modifiés à partir de Hanovice et al. 2019 (figure 13)³. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Sortie de données brutes provenant de la quantification automatisée de la régénération RPE dans RpEGEN. (A-D) Heatmaps montrant les distributions d’intensité des pixels en champ lumineux compilées à partir de l’ensemble de la région RPE ROI, de dorsale (axes x; distance angulaire = 0°) à ventrale (axes x; distance angulaire = 180°), pour toutes les larves de chaque ensemble de données: (A) n = 11, DMSO MTZ^-; (B) n = 10, IWR-1 MTZ^-; (C) n = 11, DMSO MTZ⁺; (D) n = 12, IWR-1 MTZ⁺ (de trois groupes parents indépendants, N = 3). Par exemple, (A) affiche des données de 177 460 pixels sur 11 rois. Sur les axes y, l’intensité des pixels est indiquée sur une échelle de couleurs de 8 bits où 0 = noir et 255 = blanc. Les données brutes sont affichées dans des bacs à 5 degrés (axe des x) par des bacs de valeur d’intensité de 5 à 8 bits (axe des y) où rouge = nombre maximal de bacs et bleu foncé = nombre de bacs minimum. (E-H) Cryosections transversales de larves représentatives (E,F) non atablées (MTZ^-) 9 dpf et (G,H) ablées (MTZ⁺) 4 larves dpi à partir de groupes de traitement DMSO à 0,06 % v/v et IWR-1 à 15 μM. Les ROI RPE sont mis en évidence en magenta et les distances angulaires extrêmes sont indiquées (0° = dorsale, 180° = ventrale). De manière générale, ces données montrent la distribution des pixels plus sombres (valeurs d’intensité comprises entre 0 et 150) dans les ROI non ablés (A, B, E, F) par rapport aux ROI ablés (C, D, G, H), quel que soit le traitement. Les données des ROI ablés montrent une distribution centralisée (C,G) centralisée (100° ± 15°) des pixels plus clairs (valeurs d’intensité entre 150-250) dans le groupe de traitement DMSO qui (D,H) se dilate dorsalement (à ~50°) et légèrement ventralement (d’environ 5°) chez les larves traitées par IWR-1. (G,H) Ces zones d’ablation centrale sans pigment sont mises en évidence par des pointes de flèches bleues. Des flèches noires indiquent l’emplacement du nerf optique. Des images de larves traitées au DMSO sont également montrées à la figure 3. Barres d’échelle = 40 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Figure 10 : Résultats de groupe et comparaison statistique dérivée de la quantification automatisée de la régénération rpE dans RpEGEN. (A) Valeurs médianes groupées à 5 degrés et enveloppes de confiance à 95 % dérivées des données brutes pour chaque groupe. Le graphique montre une similitude entre ^{les groupes} MTZ (lignes noires et grises) à travers la longueur dorsale (0°) à ventrale (180°) de l’EPR avec des différences notables entre et parmi les groupes MTZ⁺ (lignes bleues et rouges) dans l’EPR central (zone ombragée bleu clair entre ~40-140°). Plus précisément, l’intensité médiane des pixels semble plus légère (0 = noir et 255 = blanc) dans l’IWR-1 MTZ⁺ 4 dpi par rapport à tout autre groupe de traitement, ce qui correspond à une diminution de la pigmentation centrale RPE. (B) Une comparaison statistique des valeurs médianes dérivées des bacs de 1 degré à travers la longueur dorsale (0°) à ventrale (180°) de l’EPR pour DMSO MTZ⁺ 4 dpi et IWR-1 MTZ⁺ 4 dpi renforce l’observation en (A). Les valeurs p ont été calculées à l’aide d’une simulation de permutation avec 20 000 répétitions et un test bilatéral pour chaque bac de 1 degré. Dans l’hypothèse nulle que les deux groupes ont des valeurs médianes similaires pour tout bac correspondant à 1 degré, une valeur de p ≤ 0,05 indique une différence statistiquement significative entre les médianes du groupe (ligne noire pointillée = intervalle de confiance (IC) à 95 %). La présence de valeurs de p ≤ de 0,05 dans l’ENSEMBLE DER central (zone ombragée bleu clair entre ~40-140°) indique une pigmentation significativement moindre chez les larves traitées par IWR-1 ablée (MTZ⁺) par rapport aux témoins frères et sœurs ablés (MTZ⁺) traités par DMSO. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Nom de la variable	Variable Type	Taille variable	Variable Description
ROIname	Cellule	{N x 1}	Noms des fichiers ROI traités
ROIxy	Cellule	{N x 1}	Sommets ROI pour chaque fichier ROI traité
IMGname	Cellule	{N x 1}	Noms des fichiers image TIF traités
IMG (en anglais seulement)	Cellule	{N x 1}	Données d’image en champ clair 8 bits pour chaque TIF traité
ROIBW	Cellule	{N x 1}	Masque roi logique (0 ou 1) avec les mêmes dimensions que les images IMG
Cline	Cellule avec tableaux	{N x 1} (n x 16)	Données d’axe pour les images individuelles, y compris x, y, distance, angle, index, nombre de points et statistiques
CIdx	Cellule	{N x 1}	Les données de l’indice de ligne centrale relatives au masque ROI pointent vers le point d’axe le plus proche pour le calcul de CLine
CLineBW	Cellule	{N x 1}	Matrice logique (0 ou 1) avec les mêmes dimensions que les images IMG indiquant l’emplacement du trait d’axe (=1)
RAW_data	Table	N x 3	Tableau combinant toutes les données brutes pour chaque pixel dans les ROI sur toutes les différentes images IMG
BIN_1_deg_all	Table	N x 9	Tableau contenant des données et des statistiques groupées à 1 degré utilisant les données de RAW_data
BIN_5_deg_all	Table	N x 9	Tableau contenant des données et des statistiques groupées à 5 degrés utilisant les données de RAW_data
BIN_10_deg_all	Table	N x 9	Tableau contenant des données et des statistiques regroupées à 10 degrés utilisant les données de RAW_data

Tableau 1 : Description des variables exportées du script RpEGEN.m vers le fichier MAT. Les définitions sont les suivantes : ROI=région(s) d’intérêt; TIF = format de fichier image balisé.

Discussion

Ce protocole décrit la méthodologie pour ablation génétique de l’EPR et étudie les mécanismes de dégénérescence et de régénération chez les poissons-zèbres d’âge larvaire. Ce protocole a également été réalisé avec succès chez le poisson-zèbre adulte³, mais avec une caractérisation moins étendue, c’est pourquoi les larves sont au centre de l’attention ici. Les aspects critiques de cette partie du protocole (étapes 1 à 4) comprennent: 1) l’ajout de 1,5x PTU aux embryons avant le début de la mélanogenèse, 2) la déséchorionation des embryons traités par PTU sur 2-3 dpf, 3) un dépistage minutieux de l’eGFP et 4) le moment des changements d’eau pendant l’ablation génétique avec MTZ. La PTU inhibe la synthèse de la mélanine^21,22 et a été utilisée dans ce paradigme d’ablation RPE pour faciliter le dépistage de l’expression transgénique rpe65a:nfsB-eGFP et pour permettre la caractérisation des processus dégénératifs et régénératifs rpE basés sur l’absence et le retour ultérieur, respectivement, du tissu pigmenté³. Comme la PTU inhibera la pigmentation ultérieure, mais pas les tissus dépigmentés une fois que la mélanogenèse a commencé²¹, la PTU doit être ajoutée avant le début de la pigmentation, qui commence autour de 24 hpf chez le poisson zèbre²⁵. Ici, et dans des études antérieures ^4,5, la PTU a été ajoutée à environ 6 hpf²⁶ pour assurer l’inhibition avant le début de la synthèse de la mélanine. Alors que la PTU permet de visualiser les étapes clés du protocole, le traitement de la PTU peut affecter certains aspects du développement (comme discuté à l’étape 2.3) et nuire à l’éclosion des embryons. Ce dernier processus, s’il est retardé trop longtemps, peut entraîner des déficits de morphologie et de motilité et affecter la viabilité⁴⁰; ainsi, la déséchorionation (éclosion) des embryons soit enzymatiquement avec de la pronase, soit manuellement à l’aide de pinces sur 2-3 dpf est importante pour maintenir et normaliser la santé larvaire avant l’ablation génétique. Une autre considération importante pour éviter les problèmes de santé et de viabilité des larves plus âgées (sans rapport avec le traitement PTU) est que les larves devraient commencer des régimes d’alimentation normalisés si elles restent hors d’un système d’installation aquatique au-delà de 9 dpf/4 dpi pour les expériences⁴¹.

Comme expliqué, rpe65a entraîne l’expression transgénique dans l’EPR mature dans les deux tiers centraux de l’œil postérieur. L’expression de l’eGFP chez les larves de 5 dpf traitées par PTU est normalement facilement détectée et visiblement intense (brillante), comme le montre la figure 1. Des larves qui expriment faiblement l’eGFP à 5 dpf par rapport aux frères et sœurs avec une expression brillante peuvent également être observées. Il peut également y avoir des variations dans les rapports d’intensité d’expression (c.-à-d. brillant ou faible) entre les générations, certaines générations ayant des larves plus faiblement exprimant que d’autres. Dans tous les cas, les larves avec une faible expression d’eGFP représentent généralement une minorité des animaux dans chaque couvée. Bien qu’on ne sache pas si les larves faiblement exprimant présentent des phénotypes de lésions RPE moins graves, des ablations ont été effectuées dans la cohorte eGFP⁺ brillante de chaque couvée et des frères et sœurs relativement sombres ont été euthanasiés lors du dépistage et exclus de l’analyse. De même, une caractérisation approfondie des phénotypes d’ablation et de régénération de l’EPR du poisson-zèbre a été réalisée chez les larves hétérozygotes pour le transgène rpe65a:nfsB-eGFP, en croisant rpe65a:nfsB-eGFP hétérozygotes adultes à des adultes de type sauvage³. Il est peu probable, cependant, que l’on ne sache pas si les larves homozygotes pour rpe65a:nfsB-eGFP présentent des phénotypes d’ablation plus sévères. D’autres efforts pour normaliser le protocole d’ablation comprennent l’ajout de volumes mesurés égaux (p. ex., 30 mL par boîte de Petri de 10 cm) aux boîtes ^{MTZ et} MTZ⁺ pendant la période d’ablation génétique de 24 heures. De même, les larves dans les boîtes de traitement pharmacologique ont reçu des volumes mesurés égaux (p. ex., 5 mL par 6 puits) et un réapprovisionnement en temps opportun de composés frais (p. ex., toutes les 24 h). Lors de la manipulation de plats avec différents traitements MTZ et/ou composés pharmacologiques, des mesures prudentes doivent être prises pour éviter les déversements et la contamination croisée accidentelle pendant le transport et les changements d’eau.

Le protocole d’ablation de l’EPR du poisson-zèbre peut être modifié pour inclure la manipulation pharmacologique (étape 5). Cela a déjà été fait pour identifier les voies de signalisation de la réponse immunitaire⁵, mTOR⁴ et Wnt³ en tant que régulateurs critiques de la régénération de l’EPR; ce dernier s’est avéré reproductible ici et a été utilisé pour valider RpEGEN. En plus d’éclairer les voies critiques de régénération de l’EPR, la manipulation pharmacologique a été largement utilisée pour les études de régénération rétinienne du poisson-zèbre 10,42,43,44,45,46,47. Avant d’être incorporés dans le protocole d’ablation de l’EPR, les agents pharmacologiques doivent faire l’objet d’une évaluation rigoureuse de leur toxicité, de leur efficacité et de la durée du traitement. Cela peut être fait en effectuant des expériences dose-réponse pour évaluer la toxicité⁴⁸; évaluer l’expression des gènes/protéines cibles connus ^4,5; et évaluer les conséquences fonctionnelles connues de la manipulation pharmacologique, par exemple, l’épuisement des leucocytes avec le traitement PLX3397 ^48,49,50,51. Ici, le DMSO (contrôle du véhicule) et l’IWR-1 ont été ajoutés 24 heures avant l’ablation génétique et les larves ont été dépistées immédiatement avant le prétraitement pharmacologique sur 4 dpf. Alors que les larves d’eGFP⁺ se distinguent des larves d’eGFP ^sur 4 dpf, l’intensité de l’eGFP peut sembler assez faible, c’est pourquoi les larves ont été rééquipées pour l’expression de l’eGFP sur 5 dpf (résultats représentatifs). Le dépistage de l’eGFP avant 4 dpf peut être difficile car l’expression peut être si faible qu’elle est indétectable à l’œil. Ainsi, un prétraitement avec des agents pharmacologiques avant 4 dpf (c.-à-d. sur 2 dpf)⁴ peut être ajouté aux larves non criblées qui seront séparées sur 5 dpf lorsque l’eGFP est clairement visible. Dans tous les scénarios où les larves doivent être manipulées (p. ex., pendant le dépistage, l’intégration pour l’imagerie, etc.), les conditions de traitement pharmacologique doivent être maintenues et, quel que soit l’âge du dépistage, l’EPR doit être ablation avec MTZ sur 5 dpf.

En plus du protocole d’ablation génétique, des instructions étape par étape pour le prétraitement d’images au microscope confocal et la quantification automatisée de la régénération rpE à l’aide de RpEGEN sont décrites (étapes 6 à 7). RpEGEN a été créé pour normaliser la quantification de la régénération RPE parmi les utilisateurs et augmenter la robustesse de l’ensemble de données de sortie, tout en minimisant les biais intrinsèques qui peuvent provenir de la quantification manuelle fastidieuse effectuée précédemment. Les aspects critiques de cette partie du protocole sont effectués lors de la génération du retour sur investissement (étape 6). Tout d’abord, l’image/l’œil doit être dans la dorsale vers le haut, orientation gauche distale (par exemple, Figure 3A-D, Figure 4) car RpEGEN a été optimisé pour cette directionnalité. Il est également essentiel que les extrémités terminales dorsales et ventrales des ROI RPE se réduisent à une pointe pointue, comme le montre la figure 3B',B »,D',D » (lignes magenta). Si ces extrémités sont plutôt carrées ou arrondies, le script RpEGEN peut avoir du mal à déterminer les pixels de début et de fin du squelette de ligne médiane et peut générer des éperons aux extrémités du retour sur investissement du terminal plutôt qu’une ligne centralisée (Figure 4B). Les éperons aux extrémités du retour sur investissement du terminal peuvent entraîner un raccourcissement de l’axe pendant le décollement (Figure 4D) et/ou des problèmes avec les mesures de distance angulaire dans le RPE périphérique (Figure 4G). Des systèmes de dénomination identiques pour les fichiers TIF et ROI correspondant à chaque larve individuelle sont également une étape importante et impérative pour coupler le fichier TIF 8 bits avec le ROI correct dans RpEGEN. Les noms de fichiers TIF et ROI incompatibles entraîneront l’échec de la génération du flux de travail de traitement RpEGEN décrit dans la section Résultats représentatifs (Figure 4) et, en fin de compte, empêcheront la quantification de la régénération RPE à l’aide de ce script.

Collectivement, ce protocole fournit des instructions pour éliminer avec succès l’EPR chez les larves de poisson-zèbre, pour manipuler les voies de signalisation qui peuvent présenter un intérêt avant, pendant ou après une blessure à l’EPR, et pour quantifier la régénération de l’EPR de manière normalisée avec des biais inhérents limités. Dans le contexte des modèles in vivo et in vitro disponibles pour étudier le potentiel de régénération de l’EPR, le poisson-zèbre est unique dans sa capacité de régénération intrinsèque de l’EPR¹⁴. Cependant, il s’agit d’un modèle aigu de lésion de l’EPR, et non chronique comme le sont les maladies dégénératives de l’EPR ciblées pour le développement thérapeutique (p. ex., DMLA). Bien qu’il s’agisse d’une limitation du modèle, il reste une excellente plate-forme pour étudier les mécanismes de régénération de l’EPR, qui sont largement inconnus, et pourraient être adaptables à l’avenir pour étudier les blessures et les maladies chroniques. Les outils et la méthodologie décrits ici sont polyvalents et pourraient également être appliqués à l’étude des processus cellulaires impliqués dans la réponse dégénérative et à l’étude du sort des tissus adjacents à l’EPR après l’ablation. De même, le script RpEGEN pourrait être modifié pour répondre aux besoins de sortie des données utilisateur ; par exemple, pour effectuer des analyses spatiales de marqueurs autres que les pigments (p. ex., sondes d’hybridation in situ , expression des protéines, etc.).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)	Millipore Sigma	D9542
6-well plates	Fisher Scientific	07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-539-13	Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing pen	Fisher Scientific	50-254-51	Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 %	Fisher Scientific	BP231	Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large)	Fisher Scientific	3720A
Embryo incubator (mini/tabletop)	Labnet	I5110A
Fluorescence stereo microscope	Zeiss	Axio Zoom.V16	Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-4	Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo	Millipore Sigma	5.04462	Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder)	Fisher Scientific	BP117-100	Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ)	Millipore Sigma	M3761	Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU)	Millipore Sigma	P7629	Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free	Fisher Scientific	AA433689M	Chemical waste, proper disposal required
Petri dishes	Fisher Scientific	FB0875712	10 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets)	Millipore Sigma	P3813	Used to make 10 X PBS stock
Pronase	Millipore Sigma	PRON-RO
Shaking incubator	Benchmark	H2010	Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscope	Leica	S9i	Or similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	91150-20	Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shaker	Scilogex	SK-D1807-E
Transfer pipette	Millipore Sigma	Z135003	3.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222)	Pentair	TRS1, TRS2, TRS5	Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ)	FIJI (Fiji is Just ImageJ)	https://imagej.net/software/fiji/	Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tos	MathWorks	https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html	Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB support	MathWorks	https://www.mathworks.com/support.html