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Biology

Nitroreduktase/Metronidazol-vermittelte Ablation und eine MATLAB-Plattform (RpEGEN) zur Untersuchung der Regeneration des Zebrafisch-Netzhautpigmentepithels

Published: March 2, 2022 doi: 10.3791/63658
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Ophthalmology, Louis J. Fox Center for Vision Restoration, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Earth Research Institute, University of California, Santa Barbara, 3Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur genetischen Ablation des retinalen Pigmentepithels (RPE) unter Verwendung eines transgenen Zebrafischmodells. Die Anpassung des Protokolls an die Modulation des Signalwegs unter Verwendung pharmakologischer Verbindungen ist ausführlich beschrieben. Eine MATLAB-Plattform zur Quantifizierung der RPE-Regeneration auf Basis von Pigmentierung wurde entwickelt und wird vorgestellt und diskutiert.

Abstract

Das retinale Pigmentepithel (RPE) befindet sich im hinteren Teil des Auges und erfüllt Funktionen, die für die Aufrechterhaltung der Gesundheit und Integrität benachbarter Netzhaut- und Gefäßgewebe unerlässlich sind. Gegenwärtig hat die begrenzte Reparationskapazität von RPE für Säugetiere, die auf kleine Verletzungen beschränkt ist, Fortschritte beim Verständnis der regenerativen Prozesse von RPE in vivo behindert. Hier wird eine detaillierte Methodik bereitgestellt, um die Untersuchung der In-vivo-RPE-Reparatur unter Verwendung des Zebrafisches zu erleichtern, einem Wirbeltiermodell, das in der Lage ist, eine robuste Geweberegeneration durchzuführen. Dieses Protokoll beschreibt ein transgenes Nitroreduktase/Metronidazol (NTR/MTZ)-vermitteltes Verletzungsparadigma (rpe65a:nfsB-eGFP), das nach 24-stündiger Behandlung mit MTZ zu einer Ablation der zentralen zwei Drittel der RPE mit anschließender Gewebewiederherstellung führt. Der Schwerpunkt liegt auf RPE-Ablationen in Larvenzebrafischen und es werden auch Methoden zur Prüfung der Auswirkungen pharmakologischer Verbindungen auf die RPE-Regeneration beschrieben. Die Generierung und Validierung von RpEGEN, einem MATLAB-Skript, das zur Automatisierung der Quantifizierung der RPE-Regeneration auf der Grundlage der Pigmentierung erstellt wurde, wird ebenfalls diskutiert. Über aktive RPE-Reparaturmechanismen hinaus kann dieses Protokoll auf Studien zu RPE-Degenerations- und Verletzungsreaktionen sowie zu den Auswirkungen von RPE-Schäden auf benachbarte Netzhaut- und Gefäßgewebe sowie auf andere zelluläre und molekulare Prozesse ausgeweitet werden. Dieses Zebrafischsystem ist vielversprechend bei der Identifizierung von Genen, Netzwerken und Prozessen, die die RPE-Regeneration und RPE-Krankheitsmechanismen vorantreiben, mit dem langfristigen Ziel, dieses Wissen auf Säugetiersysteme und letztendlich auf die therapeutische Entwicklung anzuwenden.

Introduction

Die hierin beschriebene Methodik beschreibt ein Protokoll zur genetischen Ablation des retinalen Pigmentepithels (RPE) unter Verwendung von Larvenzebrafischen. Die RPE erstreckt sich über den Augenhintergrund und befindet sich zwischen den geschichteten Schichten der neuronalen Netzhaut und der Gefäßschicht, aus der die Aderhaut besteht. Trophische Unterstützung, Absorption von phototoxischem Licht und Aufrechterhaltung von Proteinen des visuellen Zyklus sind nur einige der kritischen Funktionen, die das RPE ausübt, die für die Aufrechterhaltung der Gesundheit und Integrität dieser benachbarten Gewebe unerlässlichsind 1. Schäden an der RPE von Säugetieren sind reparierbar, wenn die Läsionen klein sind2; Schäden, die durch größere Verletzungen oder fortschreitende degenerative Erkrankungen erlitten werden, sind jedoch irreversibel. Beim Menschen führen degenerative RPE-Erkrankungen (z. B. altersbedingte Makuladegeneration (AMD) und Stargardt-Krankheit) zu einem dauerhaften Sehverlust und, da nur wenige Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung stehen, zu einer verminderten Lebensqualität der Patienten. Die begrenzte Fähigkeit von Säugetier-RPE, sich selbst zu reparieren, hat eine Wissenslücke im Bereich der regenerativen RPE-Prozesse geschaffen. Angesichts der robusten Regenerationsfähigkeit des Zebrafisches über viele verschiedene Gewebetypen hinweg wurde dieses Protokoll entwickelt, um ein In-vivo-Wirbeltiersystem zu etablieren, um Studien zur intrinsischen Regeneration von RPE zu erleichtern und Mechanismen aufzudecken, die diese Reaktion antreiben. Unter Verwendung des hier beschriebenen Ablationsparadigmas wurden der kanonische Wnt-Signalweg3, der mTOR-Signalweg4 und die immunbezogenen Reaktionen5 als kritische Mediatoren der RPE-Regeneration identifiziert, wahrscheinlich mit überlappenden Funktionen.

In diesem genetischen Ablationsparadigma exprimieren Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3-Zebrafische das bakteriell abgeleitete Nitroreduktase-Gen (NTR/nfsB)6, das unter Kontrolle des RPE-Enhancer-Elements rpe65a7 mit eGFP verschmolzen ist. Die Ablation wird durch Zugabe des Prodrugs, Metronidazol (MTZ), zu Systemwasser erreicht, das Zebrafische beherbergt. Die intrazelluläre Aktivierung von MTZ durch Nitroreduktase führt zu DNA-Vernetzung und Apoptose in NTR/nfsB-exprimierenden Zellen 8,9. Diese Technologie wurde häufig in Zebrafischen verwendet, um Zellen der Netzhaut10,11,12,13 und anderer Gewebe8 abzutragen. Zusammen ermöglichen diese Elemente die gezielte Expression (rpe65a) einer induzierbaren Zellablationsmethodik (NTR/MTZ)8,9 und eines fluoreszierenden Markers (eGFP) zur Visualisierung.

Es gibt auch andere interessante In-vivo-Modelle, mit denen das regenerative Potenzial des RPE14 untersucht werden kann. Diese sind breit gefächert und umfassen die RPE-zu-Retina-Transdifferenzierung nach der Retinektomie bei Amphibien, bei der RPE-Zellen, die durch das Nachwachsen der Netzhaut verloren gehen,ersetzt werden 15,16; RPE-Wiederherstellung nach der Verletzung in der "super heilenden" MRL/MpJ-Maus17; und exogene Stimulation der RPE-Proliferation in einem Rattenmodell von spontaner RPE und Netzhautdegeneration18, unter anderem. In-vitro-Modelle wie adulte humane RPE-Stammzellen (RPESCs)19 wurden ebenfalls entwickelt. Diese Modelle sind allesamt wertvolle Werkzeuge, um die zellulären Prozesse im Zusammenhang mit der RPE-Regeneration aufzudecken (z. B. Proliferation, Differenzierung usw.); Der Zebrafisch ist jedoch einzigartig in seiner Fähigkeit zur intrinsischen RPE-Reparatur nach der Ablation.

Während die Methodik hier geschrieben wurde, um sich auf das Verständnis der Mechanismen zu konzentrieren, die die RPE-Regeneration antreiben, könnten die Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) -Linie und dieses genetische Ablationsprotokoll verwendet werden, um andere zelluläre Prozesse wie RPE-Apoptose, RPE-Degeneration und die Auswirkungen von RPE-Verletzungen auf benachbarte Netzhaut- und Gefäßgewebe zu untersuchen. Das Ablationsprotokoll kann auch modifiziert werden, um pharmakologische Manipulation einzubeziehen, was eine bequeme Vorstrategie zum Screening von Signalwegen von Interesse ist. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass die Blockierung des kanonischen Wnt-Signalwegs mit Inhibitor of Wnt Response-1 (IWR-1)20 die RPE-Regenerationbeeinträchtigt 3. Dies wurde hier wiederholt, um Benutzer durch ein pharmakologisches Manipulationsexperiment zu führen und als Proof-of-Concept zu dienen, um ein MATLAB-Skript (RpEGEN) zu validieren, das zur Quantifizierung der RPE-Regeneration basierend auf der Wiederherstellung der Pigmentierung erstellt wurde. Wie das transgene Linien- und Ablationsprotokoll sind die RpEGEN-Skripte anpassungsfähig und könnten verwendet werden, um andere Marker / zelluläre Prozesse innerhalb der RPE zu quantifizieren.

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Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden entsprechen dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Pittsburgh.

1. Vorbereitung vor der Entnahme von Zebrafischembryonen

  1. Stellen Sie den Embryo-Inkubator auf 28,5 ° C ein.
  2. Es wird eine 25-fache Stammlösung des Melanogenesehemmers N-Phenylthioharnstoff (PTU)21,22 hergestellt. Diese Stammlösung wird nach einem gängigen Rezeptskaliert 22 und 1x entspricht 0,003% Gewicht pro Volumen (% w / v) (z. B. 0,003 g PTU-Pulver in 100 ml flüssiges Lösungsmittel).
    1. Um eine große 25-fache PTU-Stammlösung herzustellen, fügen Sie 0,75 g PTU-Pulver zu 1 L gereinigtem entionisiertem Wasser (im Folgenden als dH2O bezeichnet) hinzu und mischen Sie gründlich bei Raumtemperatur (~ 25 ° C) mit einem Rührstab und einer Rührplatte. Bis zu 3 Monate lichtgeschützt bei 4°C lagern.
      HINWEIS: Es ist schwierig, PTU in wässrige Lösung zu bringen, und ein längeres Rühren über Nacht kann erforderlich sein.
      VORSICHT: PTU ist gefährlich und es sollte darauf geachtet werden, dass die Einnahme, das Einatmen und / oder der Kontakt mit der Haut oder den Augen verhindert wird. PTU-Pulver und alle hierin beschriebenen flüssigen PTU-Derivate müssen je nach staatlichen und institutionellen Vorschriften möglicherweise als chemischer Abfall entsorgt werden. Eine Bestätigung der ordnungsgemäßen PTU-Abfallentsorgungsmethoden, falls vorhanden, wird vor der Verwendung empfohlen.
    2. Um eine 1,5-fache PTU-Arbeitslösung (im Folgenden als 1,5-fache PTU bezeichnet) herzustellen, fügen Sie 60 ml 25-fache PTU-Stammlösung zu 940 ml Wasser der Zebrafisch-Haltungseinrichtung hinzu (im Folgenden als Systemwasser bezeichnet). Optimale Wasserqualitätsparameter für Zebrafische wurden beschrieben23 und Aquaristikeinrichtungen sollten über Standard-Wasserüberwachungsverfahren verfügen. 1,5x PTU bei 28,5°C für 1-2 Wochen lichtgeschützt lagern.
      HINWEIS: Dieses Protokoll wird routinemäßig unter Verwendung der in Schritt 1.2 beschriebenen PTU-Konzentrationen, Lösungsmittel und Lagerparameter durchgeführt. Als Vorsichtsmaßnahme sollten Embryonen / Larven alle 1-2 Tage während der PTU beobachtet werden, um die Wirksamkeit zu bestätigen und eine anhaltende Depigmentierung zu bestätigen. Die Auflösungs- und/oder Lagerbedingungen sollten optimiert werden, wenn eine Abnahme der PTU-Löslichkeit/Wirksamkeit vermutet wird.
  3. Bereiten Sie eine Stammlösung von 0,05% w/v Methylenblau, einem Pilzwachstumshemmer, vor, indem Sie 0,05 g Methylenblaupulver zu 100 ml dH2O hinzufügen. Bei 4°C lagern.
  4. Bereiten Sie Pipetten für die Manipulation von Embryonen / Larven vor (z. B. Bewegen von Embryonen / Larven zwischen Petrischalen, Trennen von Larven während des Fluoreszenzscreenings, Sammeln von eingeschläferten Larven in Mikrozentrifugenröhrchen zur Fixierung usw.), indem Sie das sich verjüngende Ende einer Pasteur-Pipette aus Glas mit einem Diamantspitzen-Ritzstift zurückschneiden. Ätzen Sie den Umfang der Pipette mit dem Diamantstift und ziehen oder schnappen Sie das Ende vorsichtig ab, um einen sauberen Bruch zu machen.
    HINWEIS: Der Mund der Pipette sollte glatt und breit genug sein, um einen Embryo leicht aufzunehmen, der sich noch im Chorion befindet, ohne zu scheren. Verwenden Sie alternativ eine Bulb Draw Transfer Pipette. Vorbereitete Pipetten können auch verwendet werden, um Flüssigkeit während des Wasserwechsels (anstatt beim Gießen) zu entfernen, um den Verlust von Embryonen / Larven zu minimieren.
  5. Bereiten Sie eine 4%ige Paraformaldehyd (PFA)-Lösung in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor (z. B. fügen Sie 10 ml 16% PFA zu 4 ml 10x PBS und 26 ml dH 2 O hinzu). Bei 4°C bis zu 4 Wochen lichtgeschützt lagern.
    ACHTUNG: Paraformaldehyd ist eine gefährliche Chemikalie und sollte in einem chemischen Abzug gehandhabt und ordnungsgemäß entsorgt werden. Vorsicht ist geboten und persönliche Schutzausrüstung (PSA) sollte getragen werden, um die Einnahme, das Einatmen und / oder den Kontakt mit der Haut oder den Augen zu verhindern.

2. Entnahme und Pflege von Zebrafischembryonen vor der genetischen Ablation (0-5 Tage nach der Befruchtung)

  1. Pflegen Sie erwachsene Zebrafische wie zuvor beschrieben 3,4,5. Am Nachmittag/Abend vor der Embryonenentnahme trennen Sie erwachsene Zebrafische zum Laichen in Brutbecken.
  2. Am nächsten Morgen (0 Tage nach der Befruchtung (dpf)) sammeln Sie Embryonen in Petrischalen mit einem Durchmesser von 10 cm in Systemwasser und entfernen alle nicht lebensfähigen oder unbefruchteten Eier, die undurchsichtig erscheinen und / oder unregelmäßiges Zytoplasma und fehlgeschlagene Spaltung aufweisen24.
    HINWEIS: Normale Spaltungs- und Entwicklungsstadionsereignisse werden bei gesunden Embryonen wie beschriebenauftreten 25. Petrischalen sollten während des gesamten Protokolls zu drei Vierteln gefüllt gehalten werden (~ 30 ml für eine Schale mit einem Durchmesser von 10 cm).
    1. Fügen Sie zwei Tropfen 0,05% w / v Methylenblau zu jeder Petrischale hinzu, mischen Sie vorsichtig und lagern Sie die Embryonen bei 28,5 ° C für den Rest des Protokolls.
  3. Um 6 h nach der Befruchtung (hpf)4,5,26 Systemwasser in Embryo-Petrischalen durch 1,5x PTU (Arbeitslösung in Schritt 1.2.2) ersetzen und Methylenblau auffüllen.
    HINWEIS: PTU muss den Embryonen vor Beginn der Pigmentierung (d. h. vor 24 hpf)25 zugesetzt werden, da bereits pigmentiertes Gewebe bei Zugabe von PTU21 nicht depigmentiert wird. Es sollte jedoch beachtet werden, dass bei PTU-behandelten Zebrafischen27,28,29 eine reduzierte Augengröße, okuläre und kraniofaziale Defizite und Störungen einiger Signalwege (z. B. Schilddrüsensignalisierung) berichtet wurden. Die Entwicklungstoxizität von PTU scheint von der Konzentration und dem Zeitpunkt der PTU-Addition abhängig zu sein27,29. Wie oben zur Validierung der PTU-Wirksamkeit (Schritt 1.2) erwähnt, sollten auch die Anzeichen einer PTU-Toxizität sorgfältig überwacht werden, und bei Verdacht sollten die Arbeitskonzentration und/oder der Zeitpunkt der PTU-Zugabe optimiert werden.
  4. Auf 2-3 dpf dechorionierte Embryonen mit frisch hergestellter Pronasenlösung.
    1. Pronase in 1,5x PTU in einer Konzentration von 2 mg/ml durch Vortexing auflösen.
      ACHTUNG: Pronase ist als sehr feines Pulver verpackt und reizend. Ergreifen Sie Maßnahmen, um das Einatmen und/oder den Kontakt mit Haut, Augen usw. zu vermeiden.
    2. Trennen Sie geschlüpfte Embryonen von nicht geschlüpften Embryonen und behandeln Sie nur nicht geschlüpfte Embryonen.
    3. Ersetzen Sie 1,5x PTU durch 2 mg/ml Pronasenlösung, die in Schritt 2.4.1 hergestellt wurde, und lassen Sie ungeschlüpfte Embryonen für 4-5 min mit sanftem Rühren (z. B. auf einem Tischrotator / Schüttler oder durch manuelles Schwenken).
    4. Gießen Sie die Pronase-Lösung ab und spülen Sie sie sofort mit frischen 1,5x PTU ab. Spülen Sie vorsichtig 1,5x PTU über Embryonen mit einer Bulb-Draw-Transferpipette.
    5. Wiederholen Sie eine zweite 1,5-fache PTU-Spülung, um alle Chorionablagerungen zu entsorgen, und füllen Sie dann die 1,5-fache PTU für die Wartung auf.
      HINWEIS: Embryonen können auch manuell mit einer Pinzette mit feiner Spitze dechorioniert werden. In diesem Fall sollten Chorionablagerungen entfernt und 1,5x PTU nach manueller Dechorionierung wieder aufgefüllt werden.
  5. Überwachen Sie die Gesundheit von Embryonen / Larven und füllen Sie alle 1-2 Tage 1,5x PTU auf. Embryonen/Larven werden in 1,5x PTU bis zur Ablation bei 5 dpf gehalten.
    HINWEIS: Die Bedeutung der Schritte 2.3 und 2.4 wird im Abschnitt "Diskussion" näher erläutert.

3. Screening von Zebrafischlarven auf rpe65a:nfsB-eGFP und genetische Ablation des retinalen Pigmentepithels (5-6 Tage nach der Befruchtung)

  1. Machen Sie eine frische 10 mM Metronidazol (MTZ) Lösung auf 5 dpf (Tag der Ablation). Dieser Vorgang dauert 2 Stunden.
    1. MTZ-Pulver in Systemwasser ohne PTU geben und durch kräftiges Schütteln (z. B. 250 Umdrehungen pro Minute) für 1 h bei 37 °C gründlich mischen.
    2. Kühlen Sie die 10 mM MTZ-Lösung für weitere 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Tischrotator / Shaker ab und sorgen Sie für eine vollständige Auflösung, bevor Sie Petrischalen mit Larven hinzufügen.
      HINWEIS: Das Fluoreszenz-Screening und die Trennung von eGFP+ -Larven (Schritt 3.2) können während der 37 °C- und Raumtemperatur-Inkubationen durchgeführt werden.
      VORSICHT: MTZ ist gefährlich und es sollte darauf geachtet werden, dass die Einnahme, das Einatmen und / oder der Kontakt mit der Haut oder den Augen verhindert wird. MTZ-Pulver und alle hier beschriebenen flüssigen Derivate müssen je nach staatlichen und institutionellen Vorschriften möglicherweise als chemischer Abfall entsorgt werden. Eine Bestätigung der ordnungsgemäßen MTZ-Abfallentsorgungsmethoden, falls vorhanden, wird vor der Verwendung empfohlen.
  2. Zebrafischlarven auf das transgene rpe65a:nfsB-eGFP screenen.
    1. Anästhesieren Sie Larven mit 0,168 g/L Tricain (MS-222) und trennen Sie transgene (eGFP+) Larven (Abbildung 1) aus nicht-transgenen (eGFP-) Larven mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop mit einem 488 nm Anregungslaser/-filter.
      HINWEIS: Tricain sollte zu 1,5x PTU und / oder pharmakologischen Verbindungslösungen hinzugefügt werden, da Larven in die Behandlung eingetaucht bleiben sollten, während sie auf eGFP untersucht werden. Inkubieren Sie Larven in Tricain nur für die Dauer des Screenings (z. B. ≤10 min für eine einzelne 10 cm Petrischale mit 50 Larven).
    2. Wake Screened Larven sofort durch Pipettieren direkt in eine Petrischale mit frischem 1,5x PTU ohne Tricain.
    3. Nach Abschluss des Screenings trennen Sie die eGFP+-Larven weiter in zwei Gruppen von Petrischalen auf: eine Gruppe, die eine MTZ-Behandlung erhält (ablatiert / MTZ +) und eine Gruppe, die die unverminderte (MTZ-) Kontrolle sein soll.
  3. Tragen Sie das retinale Pigmentepithel ab.
    1. Entfernen Sie 1,5x PTU aus dem unverminderten (MTZ) Kontrollgeschirr und fügen Sie frisches Systemwasser ohne PTU hinzu.
    2. Entfernen Sie 1,5x PTU aus dem abgetragenen (MTZ+) Behandlungsgeschirr und fügen Sie die frisch zubereitete 10 mM MTZ-Lösung hinzu (Schritt 3.1.).
    3. Entfernen Sie die 10 mM MTZ-Lösung nach genau 24 Stunden (1 Tag nach der Verletzung (dpi)) und fügen Sie frisches Systemwasser ohne PTU hinzu. Wechseln Sie das frische Systemwasser ohne PTU auf der/den MTZ-Schüssel (n). Larven werden für den Rest des Protokolls nicht mehr PTU ausgesetzt.
      HINWEIS: Es kann schwierig sein, alle 1,5x PTU (Schritte 3.3.1 und 3.3.2) oder 10 mM MTZ (Schritt 3.3.3) zwischen dem Lösungsaustausch ohne Larvenverlust zu pipettieren oder auszugießen, da die Tiere aktiv herumschwimmen. In diesem Fall können Waschungen von Systemwasser ohne PTU hinzugefügt werden, um einen erfolgreichen Lösungsaustausch zu gewährleisten.

4. Larvenerhaltung nach genetischer Ablation (6+ Tage nach der Befruchtung)

  1. Überprüfen Sie die Larven und füllen Sie das Systemwasser ohne PTU täglich bis zur Euthanasie auf (Schritt 5.6) oder kehren Sie zur Zebrafisch-Haltungseinrichtung zurück.
  2. Überwachen Sie den Erfolg und das Ausmaß der Ablation in vivo auf 2 dpi (7 dpf) mit Durchlichtbeleuchtung auf einem Stereomikroskop (Abbildung 2).

5. Einbeziehung der pharmakologischen Behandlung in das retinale Pigmentablationsprotokoll des Zebrafisches

HINWEIS: Wie bereitsdurchgeführt 3, wird hier eine Behandlung mit 15 μM IWR-1 oder volumenangepasster Dimethylsulfoxid (DMSO) Fahrzeugkontrolle ab 4 dpf als Beispielexperiment zum Testen von RpEGEN beschrieben. Konzentrationen und Zeitpläne können mit verschiedenen pharmakologischen Verbindungen variieren, und Empfehlungen für die Dosis-Wirkungs-Validierung, die Behandlungsdauer, das Screening und andere Aspekte des experimentellen Designs für pharmakologische Manipulationsstudien werden im Diskussionsabschnitt behandelt. Führen Sie die Schritte 6 und 7 aus, wenn eine Bildanalyse erforderlich ist.

  1. Sammeln und pflegen Sie Embryonen wie in Schritt 2 beschrieben. Dechorionat-Embryonen auf 2 dpf.
  2. Screenen Sie eGFP+- Larven auf 4 dpf, wie in Schritt 3.2 beschrieben. Anstelle von Petrischalen legen Sie eGFP+ -Larven in 6-Well-Platten mit einer Dichte von n ≤ 10 Larven pro 6-Well zur pharmakologischen Behandlung. Bezeichnen Sie separate 6-Well-Platten für Larven, die nicht abgetragen werden (MTZ-) und Larven, die abgetragen werden (MTZ+).
    HINWEIS: Das eGFP-Signal ist bei 4 dpf sichtbar, erscheint aber bei 5 dpf dunkler als die Signalintensität.
  3. Pretreat 4 dpf eGFP+ Larven mit 15 μM IWR-1 oder volumenangepasster DMSO-Fahrzeugsteuerung für genau 24 h vor der genetischen Ablation mit 10 mM MTZ-Lösung.
    HINWEIS: Oft wird sehr wenig Verbindung für pharmakologische Behandlungsexperimente benötigt. Um das Wiegen kleiner Mengen IWR-1-Pulvers zu vermeiden, wird diese pharmakologische Verbindung bereits in DMSO-Lösung in einer Konzentration von 25 mM gekauft und bei der Ankunft in kleinere Mengen aliquotiert, um wiederholte Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden.
    1. Bestimmen Sie das Volumen der erforderlichen pharmakologischen und fahrzeugkontrollierenden Behandlungen und aliquotieren Sie 1,5x PTU entsprechend in konische Röhrchen. Ein Volumen von 5 ml/Well einer 6-Well-Platte wird empfohlen.
    2. IWR-1-Material zu 1,5x PTU hinzufügen, um eine Endkonzentration von 15 μM IWR-1 zu erhalten (z. B. 3 μL von 25 mM IWR-1 pro 5 ml von 1,5x PTU). Fügen Sie ein abgestimmtes Volumen des DMSO-Bestands zu 1,5x PTU hinzu (z. B. 3 μL ≥ 99,7 % DMSO pro 5 ml 1,5x PTU). Hier führt dies zu einer Endkonzentration von 0,06% Volumen / Volumen (% v / v) DMSO. Mischen Sie gut durch Vortexen und bestätigen Sie visuell die Auflösung von Verbindungen.
      ACHTUNG: DMSO, IWR-1 und andere pharmakologische Verbindungen und Lösungsmittel müssen je nach staatlichen und institutionellen Vorschriften möglicherweise als chemischer Abfall entsorgt werden. Es wird empfohlen, die Gefahrenstufe und die ordnungsgemäßen Abfallentsorgungsmethoden für diese Verbindungen, falls vorhanden, vor der Verwendung zu bestätigen.
    3. Entfernen Sie 1,5x PTU aus den eGFP+ -Larven in 6-Well-Platten und fügen Sie 5 ml/Well frisch hergestellte 0,06% v/v DMSO- oder 15 μM IWR-1-Behandlungen aus Schritt 5.3.2 hinzu.
  4. Bei 5 dpf den RPE ablegen. Zusätzlich zur 24-stündigen Vorbehandlung (Schritt 5.3) bleiben die Larven während der 24-stündigen genetischen Ablation mit 10 mM MTZ und während der Erholung nach der Ablation bis zur Fixierung (z. B. von 4-9 dpf) in pharmakologische und fahrzeugkontrollierende Behandlungen eingetaucht.
    1. 10 mM MTZ-Lösung 2 Stunden vor der Durchführung der genetischen Ablation (Schritt 3.1).
    2. Bestimmen Sie das Volumen der pharmakologischen und fahrzeugkontrollierenden Behandlungen, die sowohl für unablatierte (MTZ-) als auch für abgetragene (MTZ+) 6-Well-Platten erforderlich sind, und aliquot geeignete Mengen an Frischwasser ohne PTU (MTZ-) oder 10 mM MTZ-Lösung (MTZ+) in konische Röhrchen. Dies führt zu vier Behandlungsbedingungen: 1) 0,06% v/v DMSO, MTZ-; 2) 15 μM IWR-1, MTZ-; 3) 0,06% v / v DMSO, MTZ +; und 4) 15 μM IWR-1, MTZ+.
    3. Fügen Sie IWR-1- und DMSO-Stammlösungen zu den jeweiligen konischen Rohren hinzu, wie in Schritt 5.3.2 ausgeführt. Mischen Sie gut durch Vortexen und bestätigen Sie visuell die Auflösung von Verbindungen.
    4. Entfernen Sie 0,06% v/v DMSO- und 15 μM IWR-1-Behandlungen in 1,5x PTU (Schritt 5.3.2) aus ausgewiesenen unablierten (MTZ-) und abgetragenen (MTZ+) 6-Well-Platten und füllen Sie sie mit den entsprechenden Behandlungen in Schritt 5.4.3 auf.
    5. Entfernen Sie 0,06% v/v DMSO- und 15 μM IWR-1-Behandlungen in 10 mM MTZ-Lösung nach genau 24 h und füllen Sie sie mit Behandlungen in frischem Systemwasser ohne PTU auf. Füllen Sie 0,06% v/v DMSO- und 15 μM IWR-1-Behandlungen in frischem Systemwasser ohne PTU auf der/den unverminderten (MTZ-) 6-Well-Platte(n) auf.
  5. Befolgen Sie die Larvenerhaltung nach der Ablation, wie in Schritt 4 beschrieben, und füllen Sie täglich 0,06% v/v DMSO- oder 15 μM IWR-1-Behandlungen in Systemwasser ohne PTU auf.
  6. Euthanasieren Sie Larven auf 9 dpf (4 dpi für altersangepasste MTZ-behandelte Geschwister), indem Sie die Tiere in 0,3 g/L Tricainlösung (tödliche Überdosierung) in Verbindung mit schnellem Abkühlen (z. B. Petrischalen auf Eis legen) für mindestens 20 min30 eintauchen. Stellen Sie sicher, dass Larven nicht auf Berührung reagieren und sich in 4% PFA (Schritt 1.5) für 3 h bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C über Nacht fixieren.
  7. Verarbeiten Sie Larvengewebe nach der Fixierung für die Z-Stack-Bildaufnahme auf einem konfokalen Mikroskop, wie zuvor 5,31 beschrieben und hier im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse. Die Analyse in den Schritten 6 und 7 erfordert mindestens die Erfassung von Kernmarker- (z. B. DAPI) und Hellfeld-Z-Stack-Bildern.

6. Konfokalmikroskop Z-Stack Bildvorverarbeitung in FIDSCHI (ImageJ)

  1. Importieren und formatieren Sie konfokale Mikroskop-Z-Stack-Bilder mit FIJI32.
    1. Öffnen Sie Mikroskopbilder mit den Bioformat-Importoptionen , die auf Stapel anzeigen mit: Hyperstack und Farbmodus: Graustufen eingestellt sind.
    2. Erzeugen Sie eine maximale Intensität der Projektion des importierten Mikroskopbildes, indem Sie Bild | wählen Stapel | Z-Projekt. Legen Sie im ZProjection-Fenster Start Slice und Stop Slice so fest, dass alle Slices für dieses Bild enthalten sind. Legen Sie beispielsweise Start Slice: 1 und Stop Slice: 18 für einen Z-Stack mit insgesamt 18 Slices fest. Wählen Sie Projektionstyp: Maximale Intensität und klicken Sie auf OK.
    3. Konvertieren Sie die Projektionsdatei mit maximaler Intensität in ein 8-Bit-Bild (falls nicht bereits), indem Sie Bild | auswählen Typ | 8-Bit.
    4. Richten Sie das Bild so aus, dass die dorsale Seite oben und distal (d. h. das Objektiv) belassen wird, indem Sie Bild | auswählen | transformieren Horizontal spiegeln (wählen Sie für den letzten Befehl die Option aus, die der für dieses Bild erforderlichen Direktionalität am besten entspricht). Für ein Mehrkanalbild klicken Sie im Process Stack auf Yes (Ja). Fenster, um alle Kanäle neu auszurichten.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist kritisch, aber nicht erforderlich, wenn sich das Bild bereits in der dorsalen, distalen linken Ausrichtung befindet. In Abbildung 3A-D und Abbildung 4 finden Sie Bilder mit Augen in der richtigen Direktionalität für die Verarbeitung.
    5. Speichern Sie die Projektion mit maximaler 8-Bit-Intensität als TIF-Datei (Tagged Image File Format), indem Sie Datei | auswählen Als | speichern Tiff....
  2. Generieren Sie RPE Region of Interest (ROI) mit FIDSCHI.
    1. Öffnen Sie ein 8-Bit-TIF-Bild, das wie in Schritt 6.1 beschrieben generiert wurde. Starten Sie den ROI-Manager, indem Sie | analysieren auswählen Tools | ROI-Manager.
    2. Bild | verwenden Zoomen und Umschalten zwischen den DAPI- und Hellfeldkanälen, um die Punkte zu identifizieren, an denen die apikale Seite des RPE an die Spitze der äußeren Grenzmembran (OLM) angrenzt (Abbildung 3B', B", D', D"; blaue Pfeilspitzen). Verwenden Sie diesen anatomischen Meilenstein als Ausgangspunkt für den ROI.
    3. Erstellen Sie den RPE-ROI mit dem Werkzeug Polygonauswahl (in der FIJI-Symbolleiste) mit den DAPI- und Hellfeld-Bildkanälen und der Zoomfunktion (Image | Zoom), um apikale und basale RPE-Grenzen zu identifizieren. Bringen Sie die dorsalen und ventralen Enden des ROI (d. h. wo der ROI von der apikalen zur basalen Seite des RPE übergeht) auf einen scharfen Punkt, anstatt abzustumpfen oder abzurunden (Abbildung 3B', B", D', D"; magentafarbene Linien).
      HINWEIS: Das Erstellen eines spitzen ROI-Endes ist ein kritischer Schritt zur Optimierung der Endpunkterkennung mit RpEGEN und wird im Abschnitt Diskussion behandelt.
    4. Fügen Sie den ROI hinzu, indem Sie im ROI-Manager auf Hinzufügen klicken. Passen Sie den ROI nach Bedarf an und klicken Sie im ROI-Manager auf Aktualisieren .
    5. Speichern Sie die ROI-Datei, indem Sie Mehr auswählen>> | Retten... innerhalb des ROI-Managers. Verwenden Sie identische Namen für übereinstimmende ROI- und TIF-Bilddateien (z. B. [Dateiname].tif und [Dateiname].roi).
  3. Kombinieren Sie 8-Bit-TIF- und ROI-Dateien für jede Bedingung in einem einzigen Ordner. Beispielsweise enthält der Ordner DMSO_9dpf alle übereinstimmenden TIF- und ROI-Dateien für die 9 dpf unablated (MTZ-) 0,06% v/v DMSO-behandelte Larvengruppe.

7. Quantifizierung und Visualisierung der RPE-Regeneration mittels RpEGEN-Skripten

  1. Installieren und bereiten Sie RpEGEN-Skripte vor.
    1. Laden Sie die neuesten RpEGEN-Skripte aus dem GitHub-Repository (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) herunter, indem Sie auf Code | klicken Laden Sie ZIP herunter.
    2. Entpacken Sie den Ordner und legen Sie ihn am gewünschten Arbeitsplatz (z. B. Desktop) ab.
    3. Öffnen Sie MATLAB.
    4. Navigieren Sie zum Ordner RpEGEN im Bereich Aktueller Ordner (normalerweise auf der linken Seite).
    5. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Ordner RpEGEN und wählen Sie Add to Path | Ausgewählte Ordner und Unterordner. Dadurch wird der Ordner dem MATLAB-Pfad hinzugefügt, sodass alle Skripts im Ordner automatisch gefunden und ausgeführt werden können.
    6. Doppelklicken Sie im Bereich Aktueller Ordner auf den Ordner RpEGEN, um alle Unterordner und M-Dateien anzuzeigen.
    7. Doppelklicken Sie auf die Datei RpEGEN.m , um sie im Editor-Bereich zu öffnen.
    8. Geben Sie im Abschnitt BENUTZERDEFINIERTE VARIABLEN der Datei RpEGEN.m die Verzeichnisspeicherorte für die Ordner ein, die die ROI-Dateien (.roi), Bilddateien (.tif) enthalten und in denen die Ausgabedateien gespeichert werden sollen. Geben Sie den Gruppennamen für die zu exportierende .mat-Datei ein (z. B. DMSO_9dpf, DMSO_4dpi usw.) und die Position des Hellfeldkanals im TIF-Bildstapel (z. B. 3, wenn das Hellfeld der dritte Kanal in einem Bildstapel ist). Wenn die Bilddatei nur das Hellfeldbild enthält, sollte dies gleich 1 sein.
  2. Führen Sie das Skript RpEGEN.m aus und überprüfen Sie die Ergebnisse.
    HINWEIS: Für RpEGEN müssen die Image Processing Toolbox, die Curve Fitting Toolbox und die Statistics and Machine Learning Toolbox auf der MATLAB-Benutzerlizenz aktiviert sein. Darüber hinaus wird die frei verfügbare ReadImageJROI Toolbox33 benötigt, um FIJI-ROIs in MATLAB zu importieren; Es wird jedoch im RpEGEN-Ordner zusammen mit anderen Funktionen M-Dateien bereitgestellt, die keine Aktivierung erfordern.
    1. Führen Sie das Skript aus, indem Sie oben in MATLAB im Menü Editor auf die Schaltfläche Ausführen klicken.
      HINWEIS: Nach der Initiierung liefert das Befehlsfenster eine ausführliche Ausgabe, die den Fortschritt des Skripts angibt. Nach dem Speichern der MAT-Datei, die die extrahierten Daten enthält, wird eine dreiteilige Abbildung angezeigt, die für jeden Bildlauf als PDF im Ausgabeverzeichnis gespeichert wird. Dies sind Qualitätskontrollzahlen (QC), um sicherzustellen, dass alles ordnungsgemäß gelaufen ist, und beinhalten: 1) das vom ROI überlagerte Hellfeldbild (Abbildung 4A); 2) den ROI mit Mittellinie und zugehörigem Winkelabstand (Grad) (Abbildung 4G); und 3) der ROI mit den mittleren Medianintensitätswerten (0-255, 8-Bit-Farbskala) (Abbildung 4H). Warten Sie, bis die QC-PDFs im Ausgabeordner gespeichert wurden und die letzte Abbildung verschwunden ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
    2. Öffnen Sie die einzelnen PDF-Dateien, die in den Ausgabeordner exportiert wurden, in einem beliebigen PDF-Viewer und überprüfen Sie, ob alle ROIs mit den Hellfeldbildern übereinstimmen, dass die Mittellinienwerte angemessene Annäherungen an den Mittelpunkt der ROIs sind und dass die Medianintensitätswerte angemessen mit Daten gefüllt sind (d. h. nicht alle den gleichen Wert über die gesamte Mittellinie).
      HINWEIS: Eine detaillierte Beschreibung und Struktur jeder von RpEGEN.m in der MAT-Datei gespeicherten Variablen finden Sie in Tabelle 1.
  3. Führen Sie das Skript RpEGEN_PermPlot.m aus.
    HINWEIS: Das Skript RpEGEN_PermPlot.m verwendet die Ausgabe von RpEGEN.m, um statistische Vergleiche mit einer Permutationssimulation der Mediane zweier Gruppen durchzuführen, und stellt auch den Code für die Reproduktion der Diagramme in diesem Artikel mit der frei verfügbaren GRAMM-Toolbox34 bereit, die ebenfalls im RpEGEN-Ordner enthalten ist.
    1. Doppelklicken Sie auf die Datei RpEGEN_PermPlot.m , um sie in einer neuen Editor-Registerkarte zu öffnen.
    2. Geben Sie unter ABSCHNITT 1 - BENUTZERDEFINIERTE VARIABLEN in der Datei RpEGEN_PermPlot.m den Verzeichnisspeicherort für den Ausgabeordner ein, der die MAT-Dateien aus RpEGEN.m enthält, und geben Sie jeden zu ladenden MAT-Dateinamen ein (z. B. DMSO_4dpi.mat, IWR1_4dpi.mat).
    3. Führen Sie diesen Abschnitt des Skripts aus, indem Sie oben in MATLAB auf die Schaltfläche Abschnitt ausführen im Menü Editor klicken.
    4. Geben Sie in Abschnitt 2 die Namen der beiden Gruppen für den statistischen Vergleich in den Variablen data_A und data_B ein (dies sind die Gruppen, aus denen die Mediane mit der Permutationssimulation abgeleitet werden). Geben Sie in der Variablen bin_sz die Anzahl der Grad ein, über die die Medianintensitätswerte für die Datasets integriert werden sollen (Standardwert sind 1-Grad-Ablagen).
      HINWEIS: Die Variable reps gibt die Anzahl der Permutationen an, die zum Erstellen einer Wahrscheinlichkeitsverteilung verwendet werden sollen, und kann auf eine beliebige Zahl gesetzt werden (Standardwert ist 20.000). Im Allgemeinen wird eine höhere Anzahl von Wiederholungen statistisch robuster sein, aber die Verarbeitungszeit erhöhen.
    5. Führen Sie diesen Abschnitt des Skripts aus, indem Sie oben in MATLAB auf die Schaltfläche Abschnitt ausführen im Menü Editor klicken. Dieser Abschnitt kann je nach Anzahl der angegebenen Wiederholungen einige Zeit in Anspruch nehmen, bietet jedoch eine fortlaufende Statusaktualisierung im Befehlsfenster.
    6. Führen Sie die Abschnitte HEATMAP FIGURE und GROUP RESULTS AND P-VALUES unabhängig voneinander aus, indem Sie die Schaltfläche Abschnitt ausführen verwenden. Bearbeiten Sie Datenvariablen in allen Abschnitten, die mit "HIER DATEN EINGEBEN" kommentiert werden. PDFs dieser Abbildungen werden automatisch für jede Datei gespeichert und können in jeder Vektorsoftware-Nachbearbeitung leicht geändert werden.
      HINWEIS: Die in der Datei RpEGEN_PermPlot.m generierten Diagramme sind ad hoc und erfordern wahrscheinlich Änderungen, die auf den spezifischen Daten- und Visualisierungsanforderungen jedes Benutzers basieren. Die Zahlen bieten jedoch eine solide Grundlage, die sowohl über MATLAB- als auch über GRAMM-Websites leicht individualisiert werden kann.

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Representative Results

Es ist bekannt, dass die Hemmung des kanonischen Wnt-Signalwegs die RPE-Regeneration von Zebrafischen unter Verwendung des genetischen Ablationsparadigmas (rpe65a:nfsB-eGFP) und der pharmakologischen Manipulationsmethodik (IWR-1), die im Protokoll3 beschrieben sind, signifikant beeinträchtigt. Dieses Experiment wurde hier wiederholt, um eine automatisierte Methode zur Quantifizierung der RPE-Regeneration von Zebrafischen basierend auf Pigmentierung zu validieren. Die im Folgenden zusammengefassten Ergebnisse umfassten alle Schritte des Protokolls, vom Tag der Befruchtung (0 dpf) bis zur Quantifizierung der RPE-Regeneration mit RpEGEN.

Implementierung des RPE-Ablationsprotokolls (mit pharmakologischer Manipulation) bei Larvenzebrafischen
Embryonen, die aus drei verschiedenen Elterngruppen (N = 3) entnommen wurden, begannen die Behandlung mit 1,5x PTU um 6 hpf und das Fehlen einer Pigmentierung in den RPE- und Oberflächenmelanozyten wurde auf 1 dpf visuell bestätigt. Die Embryonen wurden unter Verwendung von 2 mg/ml Pronase enzymatisch dechorioniert (Schritt 2.4). Auf 4 dpf wurden die Larven mit Tricain (MS-222) betäubt und mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop auf eGFP untersucht (Schritte 3.2 und 5.2). eGFP+ -Larven wurden in 6-Well-Platten (n = 10 Larven/Well) bewegt und entweder mit 0,06% v/v DMSO (Fahrzeugkontrolle) oder 15 μM IWR-1 (Schritt 5.3) behandelt. Die hier berichtete Larvendichte basierte zunächst auf der Annäherung an 1 Larve/cm2 Wachstumsfläche und wurde durch sorgfältige Gesundheitsüberwachung (z. B. Entwicklung der Schwimmblase) im Laufe der Zeit validiert. Die Intensität von eGFP erschien auf 4 dpf gedämpft, so dass Larven auf 5 dpf erneut gescreent wurden, um die helle eGFP-Expression zu bestätigen (Abbildung 1). RPE65 (rpe65a in Zebrafischen) ist ein Marker für reife RPE7 und in Teleostfischen werden Netzhaut- und RPE-Zellen kontinuierlich aus der ziliären Randzone (CMZ) erzeugt, einer Stammzellnische an der distalen Spitze der Netzhaut, neben derLinse 35. So existieren in der transgenen Linie rpe65a:nfsB-eGFP die unreiferen RPE an der Peripherie und erscheinen eGFP- (etwa ein Drittel des gesamten RPE-Gewebes), während die reifen, zentralen zwei Drittel der RPE eGFP exprimieren (Abbildung 1B; weiße Pfeilspitzen). Das Transgen war auch in der Zirbeldrüse sichtbar (Abbildung 1A; gelbe Pfeilspitze), was erwartet wurde, da rpe65a die Zirbeldrüsenexpression in Zebrafisch36 zeigt. Vergleichsweise gedämpfte oder eGFP-Larven wurden aus 6-Well-Platten gezogen und auf 5 dpf eingeschläfert. Bei exakt 24 h Nachbehandlung mit DMSO oder IWR-1 wurden 5 dpf-Larven mit 10 mM MTZ behandelt, um die RPE abzutragen (Schritte 3.1, 3.3 und 5.4). MTZ wurde nach genau 24 h (d.h. auf 6 dpf/1 dpi) ausgewaschen, um eine RPE-Regeneration zu ermöglichen.

Larven wurden täglich auf einem Stereomikroskop mit Durchlichtbeleuchtung von 6 dpf/1 dpi bis zum Zeitpunkt der Euthanasie auf 9 dpf/4 dpi beobachtet. Der Erfolg der genetischen Ablation wurde in vivo auf 2 dpi durch das Fehlen von Pigment in den zentralen zwei Dritteln des Auges bei MTZ+-Larven (Abbildung 2B; rote Pfeilspitzen) im Vergleich zu 7 dpf-MTZ-Kontrollgeschwistern (Abbildung 2A) (Schritt 4.2) bestätigt. Wie erwartet, erschien der Bereich ohne Pigment auf 2 dpi analog zu dem Bereich der rpe65a:nfsB-eGFP-Transgenexpression, der auf 5 dpf beobachtet wurde (Abbildung 1B). Die Beurteilung wurde an 2 dpi und nicht früher durchgeführt, da RPE nach Entfernung der PTU einer Repigmentierung unterzogen wurde und abhängig vom Zeitpunkt der Beobachtung in vivo ein deutlicher Unterschied zwischen dem abgetragenen zentralen RPE und dem verschonten (unablasierten) peripheren RPE schwer zu erkennen ist, wenn letzteres nicht vollständig repigmentiert wurde. Trotz der Möglichkeit makroskopischer Mehrdeutigkeit wurde zuvor gezeigt, dass die RPE-Ablation bei 1 dpi in geschnittenem Gewebe leicht sichtbar ist, was einen Verlust der zentralen RPE- und äußeren Kernschicht (ONL; d.h. Photorezeptor) Gewebeintegrität zusammen mit Hinweisen auf Zelltod (pyknotische Kerne) zeigt (Abbildung 5)3. Im Gegensatz zum Gewebeverlust wurde im Zebrafischmodell 3 rpe65a:nfsB-eGFP eine robuste Proliferation als Schlüsselfaktor bei der Geweberegenerationfestgestellt. Sowohl die frühe apoptotische Reaktion, bei der die RPE-Ablation zur Degeneration benachbarter Gewebe führt (z. B. Photorezeptoren und Bruch-Membran; Abbildung 6A-C) und die anschließende periphere bis zentrale proliferative Reaktion, die zu heterogenen Regenerations-"Zonen" führt, die sich nach innen in die Verletzungsstelle bewegen (Abbildung 6D-F), wurden zuvor ausführlich charakterisiert und diskutiert 3.

Gewebepräparation, konfokale Bildaufnahme und Bildvorverarbeitung zur automatisierten Quantifizierung auf Basis der RPE-Pigmentierung mittels RpEGEN
Auf 9 dpf/4 dpi wurden DMSO- und IWR-1-behandelte Larven durch Tricain-Überdosierung eingeschläfert und in 4% PFA für 3 h bei Raumtemperatur fixiert (Schritt 5,6). Vier Larven aus jeder unabhängigen Elterngruppe wurden nach dem Zufallsprinzip für die anschließende Gewebeverarbeitung ausgewählt (N = 3; n = 12 Larven pro Behandlung). Kryoprotektion, Kryosektion (bei 12 μm Dicke), nukleare Gegenfärbung mit DAPI und Deckglasmontage wurden wie in Schritt 5.7 5,31 beschrieben durchgeführt. Ein zentraler Ausschnitt mit sichtbarem Sehnerv von jeder Larve wurde auf einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit einem 40-fachen Öl-Tauchobjektiv (numerische Apertur = 1,30) aufgenommen, um 512 x 512-Pixel-Z-Stack-Bilder mit einem Z-Schritt-Intervall von 1 μm aufzunehmen. Jedes Bild enthielt Daten aus drei Kanälen: Kanal 1 = 405 nm Anregung für DAPI, Kanal 2 = 488 nm Anregung für eGFP, Kanal 3 = Durchlicht für Hellfeld. Da die Pixelintensität in Hellfeldbildern quantifiziert wurde, wurden die Spannungseinstellungen der Durchlichtlampe konstant gehalten und alle für statistische Vergleiche gesammelten Daten am selben Tag abgebildet.

Konfokalmikroskop-Z-Stack-Bilder wurden für die automatisierte Quantifizierung vorverarbeitet, wie in Schritt 6 beschrieben, unter Verwendung von FIJI. Bilder wurden von der Vorverarbeitung und Quantifizierung ausgeschlossen, wenn das Gewebe in einer Weise beeinträchtigt wurde, die die ROI-Generierung erschweren würde (z. B. durch Reißen (Abbildung 7A; Magenta-Pfeilspitzen) oder Landmark-Obstruktion (Abbildung 7B; Magenta-Ovale)) oder Skew-ROI-Intensitätsmessungen (z. B. durch Faltung (Abbildung 7C; Magenta-Ovale)). Trotz des Weglassens einiger Larven mit diesen Ausschlusskriterien stellen alle Datensätze hier N = 3 mit der folgenden Anzahl biologischer Replikate (Larven) dar: n = 11, DMSO MTZ-; n = 10, IWR-1 MTZ-; n = 11, DMSO MTZ+; n = 12, IWR-1 MTZ+. Unter Verwendung des DAPI-Kanals wurden RPE-ROIs initiiert, indem zunächst der Punkt identifiziert wurde, an dem die dorsale apikale Seite des RPE (retina-facing) direkt an die dorsale Spitze des OLM angrenzte (Abbildung 3B',D'; blaue Pfeilspitzen) (Schritt 6.2.2). Da die distale RPE-Erweiterung zwischen den Abschnitten variieren kann, wurde das OLM als anatomischer Meilenstein verwendet, um RPE-ROI-Endpunkte zu standardisieren und Winkelabstandsmessungen in MATLAB zu normalisieren (wobei 0° = dorsaler ROI-Endpunkt und 180° = ventraler ROI-Endpunkt). Bei der Durchführung von RPE-Ablationen mit pharmakologischer Manipulation oder in einem mutierten Hintergrund sollte vor der Vorverarbeitung und Quantifizierung ein anatomischer Meilenstein identifiziert und validiert werden. Hier war das OLM in allen quantifizierten Larven sichtbar und wurde nicht durch Reißen beeinträchtigt (wie in Abbildung 7B) oder Behandlung mit DMSO oder IWR-1. Nach der Identifizierung des dorsalen Ausgangspunkts wurden ROIs nach der apikalen Seite des RPE (dorsal-to-ventral) generiert, bis der Punkt neben der Spitze des ventralen OLM erreicht war (Abbildung 3B",D"; B. blaue Pfeilspitzen). Anschließend wurde ein ventraler ROI-Endpunkt zwischen der apikalen und der basalen (nach Aderhaut zugewandten) Seite des RPE hergestellt, wie in Schritt 6.2.3 (Abbildung 3B",D"; Magenta-Linie). Der ROI wurde fortgesetzt, indem er der basalen Seite des RPE (ventral-to-dorsal) folgte, bis die basale Seite neben dem Startpunkt am dorsalen OLM erreicht wurde. Der ROI wurde dann durch die Schaffung eines spitzen dorsalen Endes (Abbildung 3B',D'; Magenta-Linie) wie ventral durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass die genetische Ablation zu einem Verlust der zentralen eGFP-Expression führt, die im Laufe der Regeneration wiederhergestellt wird (zusammengefasst in Abbildung 6)3; Abhängig vom Ausmaß der Regeneration und der Intensität von eGFP zum Zeitpunkt des Interesses kann der eGFP-Kanal daher nur für die ROI-Generierung im MTZ nützlich sein.- Gruppe. Während konfokale Aufnahmen auch eGFP-Kanalbilder enthielten, wurde die ROI-Generierung mit den DAPI- und Hellfeldkanälen abgeschlossen, wie in Schritt 6.2.3 erwähnt. Die RPE-ROI-Generierung war in DMSO- und IWR-1-behandelten MTZ unkompliziert- Larvengruppen und umschlossene Regionen mit sichtbar pigmentierten apikalen Mikrovilli (Abbildung 3B; B. rote Pfeilspitze) zusammen mit den prominent pigmentierten Zellkörpern. Die gleichen Parameter wurden auf MTZ angewendet+ Larvengruppen (Abbildung 3D; rote Pfeilspitze); Aufgrund des verbleibenden beschädigten Gewebes innerhalb der Verletzungsstelle waren apikale Mikrovilli und Pigmentierungsgrenzen jedoch in einigen Fällen im Hellfeldkanal allein schwer abzugrenzen. In diesen Bereichen wurde der DAPI-Kanal auch verwendet, um Zelltrümmer innerhalb der RPE-Verletzungsstelle zu identifizieren, die in den ROI einbezogen wurden (Abbildung 3C,D; Beispiele für an der Verletzungsstelle lokalisierte Zelltrümmer sind mit cyanfarbenen Pfeilspitzen gekennzeichnet). Immunfärbend mit Markern für unreife/reife RPE (z. B. ZPR2; Abbildung 6D,E)37 und/oder Photorezeptoren (z.B. ZPR1)37,38 könnte auch eingesetzt werden, um die Darstellung von RPE-ROIs in ablatierten Larven zu erleichtern.

Zuvor zeigten ablatierte Larven, die mit IWR-1 von 4 dpf bis 4 dpi behandelt wurden, eine signifikante Beeinträchtigung der RPE-Regeneration im Vergleich zu DMSO-behandelten Geschwisterkontrollen (Abbildung 8C)3. Dies wurde als Prozentsatz der zentralen Pigmentrückgewinnung angegeben, was erhebliche vorherige Erfahrungen mit dem Modell und manuellen Messungen des Winkelabstands erforderte, um Regenerationsgrenzen zu bestimmen (Abbildung 8B; schwarze Pfeilspitzen). RpEGEN wurde entwickelt, um die Quantifizierung der RPE-Regeneration zu automatisieren und intrinsische Verzerrungen zu reduzieren. Nicht nur das, RpEGEN ermöglichte auch die Generierung von hochgradig robusten Datensätzen; Beispielsweise wurden bisher 10 Datenpunkte aus der manuellen Quantifizierung von n = 10 DMSO-behandelten MTZ+-Larven generiert (Abbildung 8C; % Pigmentrückgewinnung pro Schnittmessungen)3, während hier 174.801 Datenpunkte aus n = 11 DMSO-behandelten MTZ+-Larven/ROIs mittels RpEGEN generiert wurden (Abbildung 9C; Pixelintensitätsmessungen).

RpEGEN wurde entwickelt, um regionale Veränderungen der Pigmentierung über die gesamte RPE inkrementell zu bewerten, indem eine skelettierte Mittellinie (1-Pixel-Breite) aus dem ursprünglichen ROI abgeleitet wird, der mit FIJI generiert wurde (Abbildung 4A, B). Um alle Pixel innerhalb des ROI für die Analyse zu integrieren (d. h. nicht nur die Mittellinienpixel), wurde für jedes Pixel von der Mittellinie aus eine euklidische Abstandstransformation durchgeführt, um eine Karte des nächstgelegenen Mittellinienindex für jedes Pixel in der ROI-Maske zu erstellen. Diese Karte der Indizes ermöglichte es, jedes Pixel außerhalb der Mittellinie einem einzelnen Mittellinienpixel zuzuordnen, wodurch ein umfassender Datensatz über die gesamte RPE für jede Larve erstellt wurde (Abbildung 4E). Die dorsale bis ventrale Länge der RPE wurde durch den Winkelabstand (Abbildung 4G; 0-180°) im Gegensatz zum normalisierten Pixelabstand (Abbildung 4F; 0-1 beliebige Einheiten) dargestellt, da dies auf der Grundlage früherer Messungen der RPE-Regeneration 3,4,5 und der Tatsache, dass der Winkelabstand nicht mit morphologischen Unterschieden variiert, intuitiver war. Die aus 5-Grad-Behältern abgeleiteten Medianintensitäten waren die Metrik, die ausgewählt wurde, um großräumige Trends hervorzuheben und die in den 1-Grad-Binned-Daten beobachtete Hochfrequenzvariabilität zu minimieren (Tabelle 1, Abbildung 10A). Die Permutationssimulation wurde gewählt, um die Nullhypothese zu testen, um festzustellen, ob die Mediane der beiden Behandlungsgruppen (hier DMSO MTZ+ und IWR-1 MTZ+ (beide 4 dpi), Abbildung 10B) ähnlichsind 39. Dieser Resampling-Technik fehlen strenge Annahmen über die Verteilung der Daten und sie kann für eine Reihe von Teststatistiken (z. B. Mittelwert, Median usw.) verwendet werden, um robuste p-Wertschätzungen zu generieren. Eine Reihe dieser Parameter (z. B. Behältergröße von Roh- und Mediandaten, Wiederholungen der Permutationssimulation usw.) können an die Benutzeranforderungen angepasst und modifiziert werden. Für letzteres wurden 20.000 Wiederholungen ausgewählt, um einen statistisch robusten Vergleich zu generieren, jedoch sollte darauf geachtet werden, die Recheneffizienz mit der statistischen Robustheit in Einklang zu bringen, da zu wenige Wiederholungen zu fehlerhaften p-Wertschätzungen führen können. Es wird empfohlen, mehrere Wiederholungswerte auszuführen (10.000, 20.000 usw.), um sicherzustellen, dass die p-Wertverteilung und die Werte relativ stabil sind, bevor mit der Interpretation begonnen wird. Zunehmende Permutationswiederholungen erhöhen die statistische Aussagekraft (dauern aber auch länger), was für einige Datensätze von Vorteil sein kann.

Konfokale Bilddatensätze wurden mit RpEGEN quantifiziert, wie in Schritt 7 beschrieben. Die kommentierten RpEGEN- und Support-Skripte sind bei GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) zusammen mit dem 8-Bit-TIF und den entsprechenden ROI-Dateien für interessierte Benutzer zum Testen verfügbar. Heatmaps mit Rohdaten von MTZ-Larven-ROIs zeigten eine Gesamtverteilung dunklerer Pixelintensitäten (wobei 0 = Schwarz und 255 = Weiß, 8-Bit-Farbskala), die die dorsale (0°) bis ventrale (180°) Länge der RPE umfassten, unabhängig von der Behandlung mit 0,06% v/v DMSO oder 15 μM IWR-1 (Abbildung 9A,B). Die Darstellung der mittleren Pixelintensitäten erleichterte die Visualisierung zwischen allen Gruppen und zeigte Ähnlichkeiten zwischen den MTZ-Gruppen über die RPE hinweg (Abbildung 10A; schwarze und graue Linien). Diese Daten unterstützten das Vorhandensein einer intakten pigmentierten RPE-Monoschicht (Abbildung 9E,F) und lieferten Median-Pixelintensitätswerte (d. h. unter 150) für unverminderte RPE (Abbildung 10A; schwarze und graue Linien). Im Vergleich dazu zeigten Rohdaten (Abbildung 9C,D) und Median (Abbildung 10A; blaue und rote Linien) von MTZ+ Larven-ROIs eine Gesamtverteilung der helleren Pixelintensitäten im zentralen RPE, wiederum unabhängig vom Behandlungszustand. Abgetragene DMSO-behandelte Larven zeigten eine zentralisierte Verteilung der Lichtpixel bei etwa 100° (± 15°) (Abbildung 9C; orange-rote Behälter). Dies entsprach einer sichtbaren Abwesenheit von Pigmentierung an der zentralen RPE-Verletzungsstelle in/um den Sehnerv (Abbildung 9G; blaue Pfeilspitzen). Ablatierte IWR-1-behandelte Larven zeigten auch eine zentralisierte Verteilung von Lichtpixeln, die sowohl dorsal (auf etwa 50°) als auch ventral (um ca. 5°) im Vergleich zu MTZ+ DMSO-behandelten Geschwisterkontrollen erweitert wurden (Abbildung 9D; orange-rote Behälter). Das Vorhandensein einer erweiterten Verletzungsstelle war im geschnittenen Gewebe deutlich sichtbar (Abbildung 9H; blaue Pfeilspitzen). Mit Ausnahme von zwei 1-Grad-Bins war der beobachtete Unterschied zwischen den MTZ+-Gruppen im zentralen RPE statistisch signifikant (Abbildung 10B; hellblau schattierter Bereich zwischen ~40-140°; p-Wert ≤ 0,05), was auf eine signifikant geringere zentrale RPE-Pigmentierung in MTZ+ IWR-1-behandelten Larven im Vergleich zu MTZ+ DMSO-behandelten Geschwisterkontrollen hinweist. Die Interpretation dieser rohen (Abbildung 9C,D) und medianen (Abbildung 10A) Daten mit statistischem Vergleich (Abbildung 10B) unter Verwendung von RpEGEN wurde nicht nur durch die Beobachtung von geschnittenem Gewebe (Abbildung 9G,H) validiert, sondern unterstützte auch frühere Erkenntnisse aus der manuellen Quantifizierung (Abbildung 8)3.

Figure 1
Abbildung 1: rpe65a:nfsB-eGFP-Transgenexpression an 5 Tagen nach der Befruchtung. (A-C) Wholemount-Bilder einer PTU-behandelten 5-dpf-Larve, die eine schwache Transgenexpression in der Zirbeldrüse (A; gelbe Pfeilspitze) und eine helle Transgenexpression in der RPE (B,C) zum Zeitpunkt des Screenings auf genetische Ablation zeigt. (B) Die Transgenexpression ist sichtbar auf die zentralen zwei Drittel der RPE lokalisiert, und weiße Pfeilspitzen markieren die Grenze zwischen peripherer (unreifer) und zentraler (reifer) RPE. Grün = eGFP. Anterior ist oben. Maßstabsstäbe = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Nachweis einer erfolgreichen genetischen Ablation des RPE in vivo. Wholemount-Bilder von (A) drei unablierten (MTZ-) 7 dpf-Larven, die RPE-Pigmentierung im gesamten Auge zeigen, und (B) drei abgetragenen (MTZ+) 2-dpi-Larven, die eine Ablationszone zeigen, in der in den zentralen zwei Dritteln der RPE (rote Pfeilspitzen) kein Pigment vorhanden ist. Anterior ist oben. Maßstabsstäbe = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: RPE-Regionen von Interesse (ROIs) für die automatisierte Quantifizierung mit RpEGEN. Querkryosektionen von (A,B) einer unablierten (MTZ-) 9 dpf Larve und (C,D) einer ablatierten (MTZ+) 4 dpi-Larve mit hervorgehobenen RPE-ROIs in Magenta. (B,D) Rote Pfeilspitzen markieren Regionen, in denen sichtbar pigmentierte apikale Mikrovilli in den ROI einbezogen wurden. (C,D) Cyan-Pfeilspitzen weisen auf Beispielbereiche von an der Verletzungsstelle lokalisierten DAPI+-Trümmern hin, die verwendet wurden, um RPE-Zelltrümmer in den ROI einzubeziehen. (B',B",D',D") Digitale Zooms sowohl des dorsalen als auch des ventralen ROI-Bereichs (schwarz gepunktete Kästchen in B und D) zeigen vorgeschlagene ROI-Startpunkte (blaue Pfeilspitzen) und die spitzen ROI-Enden, die für die Endpunkterkennung in MATLAB entscheidend sind. Hellfeldbilder sind auch in Abbildung 9E,G dargestellt. Weiß/Grau = Kerne. Dorsal ist oben und distal ist übrig. (A-D) Maßstabsstäbe = 40 μm. (B',B",D',D") Maßstabsstäbe = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: RpEGEN-Verarbeitungsworkflow. (A) Beispiel für ein richtig ausgerichtetes 8-Bit-Hellfeldbild und einen FIJI-generierten ROI (rot), der in MATLAB importiert wurde. Dorsal ist oben und distal ist übrig. Der Farbbalken stellt 8-Bit-Graustufenintensitätswerte dar, wobei 0 = Schwarz und 255 = Weiß ist. (B) Anfängliche binäre Skelettierung (weiß) der ROI-Maske (rot), die das Vorhandensein fehlerhafter Sporen und die Abgrenzung der Start- und Endpunkte für die geodätische Pixelentfernungsabgrenzung wie in (C) gezeigt zeigt. Der Farbbalken in (C) stellt den euklidischen Pixelabstand dar. (D) Sporne werden mit einem vereinfachten Least-Cost-Pfad vom Endpixel zurück zum Startpixel entfernt, was zu einer kontinuierlichen Mittellinie ohne Sporen (rot) führt. (E) Nächstgelegene lineare Mittellinienindizes, die auf einer Abstandstransformation zwischen allen Pixeln in der ROI-Maske und den Mittellinienpixeln (weiß) basieren. Mit diesen Indexwerten kann jedes Bildpixel innerhalb der ROI-Maske zur Analyse dem nächstgelegenen Mittellinienpixel zugewiesen werden. Der Farbbalken stellt die linearen Mittellinien-Pixelindexwerte dar. (F) Ein Beispiel für den normalisierten Pixelabstand entlang der Mittellinie, wobei 0 (blaues, distalstes dorsales Pixel) das Startpixel und 1 (rotes, distalstes ventrales Pixel) das Endpixel ist. (G) Ähnlich wie (F), aber unter Verwendung des Winkelabstands, wobei 0 Grad (blau) das Startpixel und 180 Grad (rot) das Endpixel ist. (H) Beispiel für die mittleren Pixelintensitätswerte, die für jedes Mittellinienpixel berechnet werden. Der Farbbalken stellt den mittleren Graustufenintensitätswert aller ROI-Pixel dar, die zu jedem gegebenen Mittellinienpixel beitragen. Diese Abbildung zeigt Bilder aus einem Testdatensatz und nicht Larven aus den 0,06% v/v DMSO oder 15 μM IWR-1 Behandlungsgruppen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Nachweis von RPE-Ablation und Photorezeptordegeneration. (A) Querkryosektionen einer unablierten 6 dpf Larve. (A,A') Nach der Exposition gegenüber PTU ist die Transgenexpression auf reife RPE-Zellen beschränkt, wobei die hellste Expression auf die zentralen zwei Drittel der RPE beschränkt ist. Pfeilspitzen zeigen apikale Mikrovilli an. (A) DIC-Bilder (Differential Interference Contrast) zeigen die normale Architektur der äußeren Kernschicht (ONL; d.h. Photorezeptor). (B,B') Transversale Kryosektionen einer 1 dpi-Larve zeigen eine signifikante Störung der eGFP+-Zellmorphologie und Desorganisation bei der ONL-Laminierung. Pfeile zeigen delaminierte und pyknotische Kerne an. (B) DIC-Bilder zeigen die deutliche Disruption der ONL-Architektur. Grün = eGFP, blau = Kerne, gelb = ONL. Dorsal ist oben und distal ist übrig. Der Maßstabsbalken in (A) entspricht 40 μm und kann auf (B) angewendet werden. Der Maßstabsbalken in (A') entspricht 40 μm und kann auf (A",B',B") angewendet werden. Dieser Abbildungs- und Abbildungslegendentext wurde von Hanovice et al. 2019 geändert (Abbildung 1)3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Modell der RPE-Regeneration bei Larvenzebrafischen . (A) nfsB-eGFP wird in reifen RPE in den zentralen zwei Dritteln des Auges exprimiert. (B) Die Anwendung von MTZ führt zu Apoptose (TUNEL, rot) von RPE und Photorezeptoren. (C) Die RPE-Ablation führt zur Degeneration der Photorezeptoren und der Bruch-Membran (gepunktete Linie). (D) Unverminderte RPE in der Peripherie beginnen sich zu vermehren und dehnen sich in die Verletzungsstelle aus (blau). (E) Da regenerierte eGFP+ RPE in der Peripherie erscheinen, kann der RPE in vier Zonen unterteilt werden: periphere RPE (pRPE), differenzierte RPE (dRPE), Übergangszone (TZ) und Verletzungsstelle (IS). (E, Einschub) Regenerierte differenzierte RPE (grün) erscheint in der Peripherie proximal zur unverminderten peripheren RPE und enthält proliferative Zellen neben der Übergangszone. Die Übergangszone besteht aus noch differenzierenden RPE-Zellen (ZPR2, rot) und proliferativen Zellen (blau). Die Verletzungsstelle besteht aus unpigmentierten proliferativen Zellen, die keine RPE-Differenzierungsmarker exprimieren. (F) Die Regeneration einer funktionellen RPE-Schicht und der Bruch-Membran ist um 14 dpi abgeschlossen. Dieser Abbildungs- und Abbildungslegendentext wurde gegenüber Hanovice et al. 2019 geändert (Abbildung 14)3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Kompromittierte Gewebeschnitte, die von der Bildanalyse ausgeschlossen sind. (A-C) Transversale Kryosektionen von Larven aus den 0,06% v/v DMSO- und 15 μM IWR-1-Datensätzen, die die Ausschlusskriterien erfüllten. Eine Larve zeigt dorsale RPE-Geweberisse (A; Magenta-Pfeilspitzen) und zwei weitere Larven zeigen eine Gewebefaltung, die entweder ein anatomisches Wahrzeichen (dorsales OLM) im DAPI-Kanal (B; magenta-gepunktete Ovale) blockiert oder RPE-Intensitätsmessungen aus dem Hellfeldkanal (C; magenta-gepunktete Ovale) verzerrt. Weiß/Grau = Kerne. Dorsal ist oben und distal ist übrig. Maßstabsbalken = 40 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 8
Abbildung 8: Pharmakologische Hemmung mit IWR-1 beeinträchtigt die RPE-Regeneration. Querkryosektionen von abgetragenen (MTZ+) 4 dpi-Larven aus (A) 0,06% v/v DMSO- und (B) 15 μM IWR-1-Behandlungsgruppen. Hellfeldbilder (A,B) und die Quantifizierung der prozentualen RPE-Erholung/des Abschnitts (C) zeigen eine signifikante Verzögerung bei der Wiederherstellung einer pigmentierten Monoschicht in IWR-1-behandelten Larven (Student's unpaired t-test, *** p < 0,0001). (B) Schwarze Pfeilspitzen zeigen den mittelgrößten Rand des regenerierenden RPE an. Dorsal ist oben und distal ist übrig. Der Maßstabsbalken in (B) entspricht 40 μm und kann auf (A) angewendet werden. Dieser Abbildungs- und Figurlegendentext wurde von Hanovice et al. geändert. 2019 (Abbildung 13)3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 9
Abbildung 9: Rohdatenausgabe aus der automatisierten Quantifizierung der RPE-Regeneration in RpEGEN. (A-D) Heatmaps mit Hellfeld-Pixelintensitätsverteilungen, die aus der gesamten RPE-ROI-Region zusammengestellt wurden, von dorsal (x-Achsen; Winkelabstand = 0°) bis ventral (x-Achsen; Winkelabstand = 180°), für alle Larven in jedem Datensatz: (A) n = 11, DMSO MTZ-; (B) n = 10, IWR-1 MTZ-; (C) n = 11, DMSO MTZ+; (D) n = 12, IWR-1 MTZ+ (aus drei unabhängigen Elterngruppen, N = 3). Beispielsweise zeigt (A) Daten von 177.460 Pixeln über 11 ROIs an. Auf den y-Achsen wird die Pixelintensität basierend auf einer 8-Bit-Farbskala angezeigt, wobei 0 = Schwarz und 255 = Weiß ist. Rohdaten werden in 5-Grad-Behältern (x-Achse) mit 5-8-Bit-Intensitätswert (y-Achse) angezeigt, wobei rot = maximale Behälteranzahl und dunkelblau = minimale Behälteranzahl ist. (E-H) Querkryosektionen von repräsentativen (E,F) unablierten (MTZ-) 9 dpf Larven und (G,H) abgetragenen (MTZ+) 4 dpi-Larven aus 0,06% v/v DMSO- und 15 μM IWR-1 Behandlungsgruppen. RPE-ROIs werden in Magenta hervorgehoben und Winkelabstandsextreme angezeigt (0° = dorsal, 180° = ventral). Im Großen und Ganzen zeigen diese Daten die Verteilung dunklerer Pixel (Intensitätswerte zwischen 0-150) in (A,B,E,F) unverminderten ROIs im Vergleich zu (C,D,G,H) ablatierten ROIs, unabhängig von der Behandlung. Daten aus ablatierten ROIs zeigen (C,G) eine zentralisierte (100° ± 15°) Verteilung leichterer Pixel (Intensitätswerte zwischen 150-250) in der DMSO-Behandlungsgruppe, die sich (D,H) dorsal (auf ~50°) und leicht ventral (um ~5°) in IWR-1-behandelten Larven ausdehnt. (G,H) Diese zentralen Ablationszonen ohne Pigment werden durch blaue Pfeilspitzen hervorgehoben. Schwarze Pfeile zeigen die Lage des Sehnervs an. Bilder von DMSO-behandelten Larven sind ebenfalls in Abbildung 3 dargestellt. Maßstabsbalken = 40 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 10
Abbildung 10: Gruppenergebnisse und statistischer Vergleich, abgeleitet aus der automatisierten Quantifizierung der RPE-Regeneration in RpEGEN. (A) 5-Grad-Bined-Medianwerte und 95%-Konfidenzhüllen, die aus den Rohdaten für jede Gruppe abgeleitet wurden. Die Handlung zeigt Ähnlichkeiten zwischen den MTZ-Gruppen (schwarze und graue Linien) über die dorsale (0°) bis ventrale (180°) Länge der RPE mit bemerkenswerten Unterschieden zwischen und zwischen den MTZ+-Gruppen (blaue und rote Linien) im zentralen RPE (hellblau schattierter Bereich zwischen ~40-140°). Insbesondere die mittlere Pixelintensität erscheint im IWR-1 MTZ+ 4 dpi im Vergleich zu jeder anderen Behandlungsgruppe heller (0 = schwarz und 255 = weiß), was einer verminderten zentralen RPE-Pigmentierung entspricht. (B) Ein statistischer Vergleich der Medianwerte, die aus 1-Grad-Behältern über die dorsale (0°) bis ventrale (180°) Länge des RPE für DMSO MTZ+ 4 dpi und IWR-1 MTZ+ 4 dpi abgeleitet wurden, verstärkt die Beobachtung in (A). p-Werte wurden mit einer Permutationssimulation mit 20.000 Wiederholungen und einem zweiseitigen Test für jeden 1-Grad-Behälter berechnet. Unter der Nullhypothese, dass die beiden Gruppen ähnliche Medianwerte für jeden entsprechenden 1-Grad-Behälter haben, zeigt ein p-Wert ≤ 0,05 einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den Gruppenmedianen an (gestrichelte schwarze Linie = 95% Konfidenzintervall (CI)). Das Vorhandensein von p-Werten ≤ 0,05 über die zentrale RPE (hellblau schattierter Bereich zwischen ~ 40-140 °) weist auf eine signifikant geringere Pigmentierung bei abgetragenen (MTZ +) IWR-1-behandelten Larven im Vergleich zu abgetragenen (MTZ +) DMSO-behandelten Geschwisterkontrollen hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Beschreibung der aus dem Skript RpEGEN.m in die MAT-Datei exportierten Variablen. Die Definitionen lauten wie folgt: ROI(s) = Region(en) von Interesse; TIF = getaggtes Bilddateiformat.

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Discussion

Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur genetischen Abrundung der RPE und zur Untersuchung von Degenerations- und Regenerationsmechanismen bei larvengealterten Zebrafischen. Dieses Protokoll wurde auch bei erwachsenenZebrafischen 3 erfolgreich durchgeführt, jedoch mit weniger umfangreicher Charakterisierung, weshalb Larven hier im Mittelpunkt stehen. Zu den kritischen Aspekten dieses Teils des Protokolls (Schritte 1-4) gehören: 1) Zugabe von 1,5x PTU zu Embryonen vor Beginn der Melanogenese, 2) Dechorionierung von PTU-behandelten Embryonen auf 2-3 dpf, 3) sorgfältiges Screening auf eGFP und 4) Timing von Wasserveränderungen während der genetischen Ablation mit MTZ. PTU hemmt die Melaninsynthese21,22 und wurde in diesem RPE-Ablationsparadigma verwendet, um das Screening auf rpe65a:nfsB-eGFP-Transgenexpression zu erleichtern und die Charakterisierung von RPE-degenerativen und regenerativen Prozessen basierend auf der Abwesenheit bzw. anschließenden Rückkehr von pigmentiertem Gewebezu ermöglichen 3. Da PTU die weitere Pigmentierung hemmt, aber nicht das Gewebe depigmentiert, sobald die Melanogenese begonnen hat21, muss PTU vor Beginn der Pigmentierung hinzugefügt werden, die bei Zebrafisch25 um 24 hpf beginnt. Hier und in früheren Studien4,5 wurde PTU bei etwa 6 hpf26 zugegeben, um die Hemmung vor Beginn der Melaninsynthese sicherzustellen. Während PTU die Visualisierung wichtiger Protokollschritte ermöglicht, kann die PTU-Behandlung einige Aspekte der Entwicklung beeinflussen (wie in Schritt 2.3 beschrieben) und das Schlüpfen von Embryonen beeinträchtigen. Der letztgenannte Prozess kann, wenn er zu lange verzögert wird, zu Morphologie- und Motilitätsdefiziten führen und die Lebensfähigkeit beeinträchtigen40; Daher ist das Dechorionieren (Schlüpfen) von Embryonen entweder enzymatisch mit Pronase oder manuell mit einer Pinzette auf 2-3 DPF wichtig, um die Larvengesundheit vor der genetischen Ablation zu erhalten und zu standardisieren. Eine weitere wichtige Überlegung, um Probleme mit der Gesundheit und Lebensfähigkeit älterer Larven (unabhängig von der PTU-Behandlung) zu vermeiden, ist, dass Larven mit standardisierten Fütterungsschemata beginnen sollten, wenn sie außerhalb eines aquatischen Einrichtungssystems über 9 dpf / 4 dpi für Experimente41 bleiben.

Wie bereits erläutert, treibt rpe65a die Transgenexpression bei reifer RPE in den zentralen zwei Dritteln des hinteren Auges an. Die Expression von eGFP in PTU-behandelten 5-dpf-Larven ist normalerweise leicht nachweisbar und sichtbar intensiv (hell), wie in Abbildung 1 dargestellt. Larven, die eGFP bei 5 dpf im Vergleich zu Geschwistern mit heller Expression schwach exprimieren, können ebenfalls beobachtet werden. Variationen in den Expressionsintensitätsverhältnissen (dh hell vs. dunkel) zwischen den Generationen können ebenfalls bestehen, wobei einige Generationen schwächere Larven exprimieren als andere. In jedem Fall stellen Larven mit schwachem eGFP-Ausdruck in der Regel eine Minderheit der Tiere in jedem Gelege dar. Während es unbekannt ist, ob schwach exprimierende Larven weniger schwere RPE-Verletzungsphänotypen zeigen, wurden Ablationen in der hellen eGFP + -Kohorte von jeder Kupplung durchgeführt und vergleichsweise schwache Geschwister wurden beim Screening eingeschläfert und von der Analyse ausgeschlossen. In ähnlicher Weise wurde eine umfangreiche Charakterisierung der Zebrafisch-RPE-Ablations- und Regenerations-Phänotypen bei Larven heterozygot für das rpe65a:nfsB-eGFP-Transgen durchgeführt, indem rpe65a:nfsB-eGFP heterozygote Erwachsene zu Wildtyp-Erwachsenen 3 überkreuztwurden. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass nicht bekannt ist, ob Larven homozygot für rpe65a:nfsB-eGFP schwerere Ablationsphänotypen zeigen. Weitere Bestrebungen zur Standardisierung des Ablationsprotokolls umfassen die Zugabe von gleichen, gemessenen Volumina (z. B. 30 ml pro 10 cm Petrischale) zu MTZ- und MTZ+-Schalen während der 24-stündigen genetischen Ablationsperiode. Ebenso haben Larven in pharmakologischen Behandlungsschalen gleiche, gemessene Volumina (z. B. 5 ml pro 6-Well) und rechtzeitigen Nachschub an frischen Verbindungen (z. B. alle 24 h) erhalten. Beim Umgang mit Geschirr mit verschiedenen MTZ- und/oder pharmakologischen Mischungsbehandlungen sollten sorgfältige Maßnahmen ergriffen werden, um ein Verschütten und eine versehentliche Kreuzkontamination während des Transports und des Wasserwechsels zu verhindern.

Das Zebrafisch-RPE-Ablationsprotokoll kann modifiziert werden, um eine pharmakologische Manipulation einzuschließen (Schritt 5). Dies wurde zuvor getan, um Immunantwort5, mTOR4 und Wnt3 Signalwege als kritische Regulatoren der RPE-Regeneration zu identifizieren; Letzteres hat sich hier als wiederholbar erwiesen und wurde zur Validierung von RpEGEN verwendet. Neben der Beleuchtung kritischer RPE-Regenerationswege wurde die pharmakologische Manipulation häufig für Zebrafisch-Netzhautregenerationsstudien 10,42,43,44,45,46,47 eingesetzt. Vor der Aufnahme in das RPE-Ablationsprotokoll sollten pharmakologische Wirkstoffe streng auf Toxizität, Wirksamkeit und Behandlungsdauer geprüft werden. Dies kann geschehen durch: Durchführung von Dosis-Wirkungs-Experimenten zur Beurteilung der Toxizität48; Bewertung der Expression bekannter Zielgene/-proteine 4,5; und Bewertung bekannter funktioneller Konsequenzen pharmakologischer Manipulation, z. B. Erschöpfung der Leukozyten mit PLX3397-Behandlung 48,49,50,51. Hier wurden DMSO (Fahrzeugkontrolle) und IWR-1 24 h vor der genetischen Ablation zugegeben und Larven unmittelbar vor der pharmakologischen Vorbehandlung auf 4 dpf untersucht. Während eGFP+-Larven von eGFP-Larven auf 4 dpf unterscheidbar sind, kann die Intensität von eGFP ziemlich schwach erscheinen, weshalb Larven auf eGFP-Expression auf 5 dpf (Representative Results) erneut untersucht wurden. Das Screening auf eGFP vor 4 dpf kann schwierig sein, da die Expression so niedrig sein kann, dass sie für das Auge nicht nachweisbar ist. So kann eine Vorbehandlung mit pharmakologischen Wirkstoffen vor 4 dpf (d.h. auf 2 dpf)4 zu ungescreenten Larven hinzugefügt werden, die auf 5 dpf getrennt werden, wenn eGFP deutlich sichtbar ist. In jedem Szenario, in dem Larven manipuliert werden müssen (z. B. während des Screenings, Einbettung für die Bildgebung usw.), sollten pharmakologische Behandlungsbedingungen aufrechterhalten werden, und unabhängig vom Screening-Alter sollte RPE mit MTZ auf 5 dpf abgetragen werden.

Neben dem genetischen Ablationsprotokoll werden Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die konfokale Mikroskopbildvorverarbeitung und die automatisierte Quantifizierung der RPE-Regeneration mit RpEGEN skizziert (Schritte 6-7). RpEGEN wurde entwickelt, um die RPE-Regenerationsquantifizierung benutzerübergreifend zu standardisieren und die Robustheit des Ausgabedatensatzes zu erhöhen und gleichzeitig intrinsische Verzerrungen zu minimieren, die mit der mühsamen manuellen Quantifizierung einhergehen können. Kritische Aspekte dieses Teils des Protokolls werden während der ROI-Generierung ausgeführt (Schritt 6). Zunächst muss sich das Bild/Auge in der dorstalen, distalen Linksausrichtung befinden (z.B. Abbildung 3A-D, Abbildung 4), da RpEGEN für diese Direktionalität optimiert wurde. Es ist auch wichtig, dass sich die dorsalen und ventralen terminalen Enden der RPE-ROIs zu einer spitzen Spitze verjüngen, wie in Abbildung 3B',B",D',D" (Magenta-Linien) gezeigt. Wenn diese Enden stattdessen quadriert oder abgerundet werden, kann das RpEGEN-Skript Schwierigkeiten haben, die Start- und Endpixel des Mittellinienskeletts zu bestimmen, und möglicherweise Sporen an den ROI-Enden des Terminals anstelle einer zentralen Linie erzeugen (Abbildung 4B). Sporne an den ROI-Enden des Terminals könnten zu einer Verkürzung der Mittellinie während des De-Spurrings führen (Abbildung 4D) und/oder zu Problemen mit Winkelabstandsmessungen in der peripheren RPE (Abbildung 4G). Identische Benennungssysteme für die TIF- und ROI-Dateien, die jeder einzelnen Larve entsprechen, sind ebenfalls ein wichtiger Schritt und unerlässlich, um die 8-Bit-TIF-Datei mit dem richtigen ROI in RpEGEN zu paaren. Nicht übereinstimmende TIF- und ROI-Dateinamen führen dazu, dass der im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse beschriebene RpEGEN-Verarbeitungsworkflow (Abbildung 4) nicht generiert werden kann, und verhindern letztendlich die Quantifizierung der RPE-Regeneration mithilfe dieses Skripts.

Insgesamt enthält dieses Protokoll Anweisungen zur erfolgreichen Ablation der RPE in Larvenzebrafischen, zur Manipulation von Signalwegen, die vor, während oder nach der RPE-Verletzung von Interesse sein könnten, und zur Quantifizierung der RPE-Regeneration auf standardisierte Weise mit begrenzten inhärenten Verzerrungen. Im Kontext verfügbarer In-vivo- und In-vitro-Modelle, in denen das regenerative Potenzial des RPE untersucht werden kann, ist der Zebrafisch einzigartig in seiner Fähigkeit zur intrinsischen RPE-Regeneration 14. Dies ist jedoch ein akutes Modell der RPE-Verletzung, nicht chronisch, wie es bei den degenerativen RPE-Erkrankungen für die therapeutische Entwicklung (z. B. AMD) der Fall ist. Während dies eine Einschränkung des Modells ist, bleibt es eine ausgezeichnete Plattform, um die Mechanismen der RPE-Regeneration zu untersuchen, die weitgehend unbekannt sind und in Zukunft angepasst werden können, um chronische Verletzungen und Krankheiten zu untersuchen. Die hier beschriebenen Werkzeuge und Methoden sind vielseitig und könnten auch auf Studien zellulärer Prozesse angewendet werden, die an der degenerativen Reaktion beteiligt sind, und auf die Untersuchung des Schicksals von RPE-benachbarten Geweben nach der Ablation. Ebenso könnte das RpEGEN-Skript an die Anforderungen der Benutzerdatenausgabe angepasst werden. Zum Beispiel, um räumliche Analysen anderer Marker als Pigmente durchzuführen (z. B. In-situ-Hybridisierungssonden, Proteinexpression usw.).

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Disclosures

L.L.L. ist Miterfinder des US-Patents #9,458,428, das eine beschleunigte Methode zur Gewinnung von retinalem Pigmentepithel aus humanen pluripotenten Stammzellen beschreibt; Dies steht in keinem Zusammenhang mit dem hierin enthaltenen Inhalt. J.M.G. und G.B.F. haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Die hierin beschriebenen Arbeiten wurden von den National Institutes of Health (RO1-EY29410 bis J.M.G. und NIH CORE Grant P30-EY08098 an die Abteilung für Augenheilkunde) unterstützt; das UPMC Immune Transplant & Therapy Center (zu L.L.L. und J.M.G.); und der E. Ronald Salvitti Lehrstuhl für Ophthalmologie Forschung (an J.M.G.). Zusätzliche Unterstützung erhielt die Wiegand Fellowship in Ophthalmology (an L.L.L.), die Eye & Ear Foundation of Pittsburgh und ein uneingeschränktes Stipendium von Research to Prevent Blindness, New York, NY. Die Autoren danken auch Amanda Platt für die technische Unterstützung und Dr. Hugh Hammer und den Aquatics-Mitarbeitern für die hervorragende Unterstützung der Tierpflege.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) Millipore Sigma D9542
6-well plates Fisher Scientific 07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 05-539-13 Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing pen Fisher Scientific 50-254-51 Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % Fisher Scientific BP231 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large) Fisher Scientific 3720A
Embryo incubator (mini/tabletop) Labnet I5110A
Fluorescence stereo microscope Zeiss Axio Zoom.V16 Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-4 Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo Millipore Sigma 5.04462 Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder) Fisher Scientific BP117-100 Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ) Millipore Sigma M3761 Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU) Millipore Sigma P7629 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free Fisher Scientific AA433689M Chemical waste, proper disposal required
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712 10 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets) Millipore Sigma P3813 Used to make 10 X PBS stock
Pronase Millipore Sigma PRON-RO
Shaking incubator Benchmark H2010 Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscope Leica S9i Or similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forceps Fine Science Tools 91150-20 Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shaker Scilogex SK-D1807-E
Transfer pipette Millipore Sigma Z135003 3.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Pentair TRS1, TRS2, TRS5 Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ) FIJI (Fiji is Just ImageJ) https://imagej.net/software/fiji/ Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tos MathWorks https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB support MathWorks https://www.mathworks.com/support.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Biologie Ausgabe 181 Zebrafisch retinales Pigmentepithel Nitroreduktase Metronidazol genetische Ablation Regeneration Pigmentierung pharmakologische Verbindungen RpEGEN
Nitroreduktase/Metronidazol-vermittelte Ablation und eine MATLAB-Plattform (RpEGEN) zur Untersuchung der Regeneration des Zebrafisch-Netzhautpigmentepithels
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Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross,… More

Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross, J. M. Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (181), e63658, doi:10.3791/63658 (2022).

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