Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ניטרורדוקטאז/אבלציה בתיווך מטרונידזול ופלטפורמת MATLAB (RpEGEN) לחקר התחדשות של אפיתל פיגמנט הרשתית של דג הזברה

Published: March 2, 2022 doi: 10.3791/63658
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Ophthalmology, Louis J. Fox Center for Vision Restoration, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Earth Research Institute, University of California, Santa Barbara, 3Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה להסרה גנטית של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) באמצעות מודל של דגי זברה מהונדסים. התאמת הפרוטוקול לשילוב אפנון מסלול איתות באמצעות תרכובות פרמקולוגיות מפורטת בהרחבה. פלטפורמת MATLAB לכימות התחדשות RPE המבוססת על פיגמנטציה פותחה והוצגה ונדונה.

Abstract

אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) שוכן בחלק האחורי של העין ומבצע פונקציות החיוניות לשמירה על בריאותן ושלמותן של רקמות הרשתית וכלי הדם הסמוכות. נכון לעכשיו, יכולת התיקון המוגבלת של RPE של יונקים, המוגבלת לפציעות קטנות, עיכבה את ההתקדמות להבנת תהליכי התחדשות in vivo RPE. כאן, מתודולוגיה מפורטת מסופקת כדי להקל על המחקר של תיקון in vivo RPE תוך שימוש בדגי הזברה, מודל של בעלי חוליות המסוגל להתחדשות רקמות חזקה. פרוטוקול זה מתאר פרדיגמת פציעה מהונדסת בתיווך ניטרורדוקטאז/מטרונידזול (NTR/MTZ) (rpe65a:nfsB-eGFP), אשר גורמת לאבלציה של שני השלישים המרכזיים של ה-RPE לאחר טיפול של 24 שעות ב-MTZ, עם התאוששות רקמות לאחר מכן. הפוקוס מושם על אבלציות RPE בדגי זברה זחליים ומתווות גם שיטות לבדיקת ההשפעות של תרכובות פרמקולוגיות על התחדשות RPE. כמו כן נדון ביצירה ובאימות של RpEGEN, סקריפט MATLAB שנוצר כדי להפוך את הכימות של התחדשות RPE לאוטומטית המבוססת על פיגמנטציה. מעבר למנגנוני תיקון RPE פעילים, ניתן להרחיב פרוטוקול זה למחקרים על ניוון RPE ותגובות פציעה, כמו גם על ההשפעות של נזקי RPE על רקמות רשתית וכלי דם סמוכות, בין תהליכים תאיים ומולקולריים אחרים. מערכת דגי זברה זו טומנת בחובה הבטחה משמעותית בזיהוי גנים, רשתות ותהליכים המניעים התחדשות RPE ומנגנונים הקשורים למחלות RPE, במטרה ארוכת טווח ליישם ידע זה על מערכות יונקים, ובסופו של דבר, לקראת התפתחות טיפולית.

Introduction

המתודולוגיה המתוארת כאן מפרטת פרוטוקול להפחתה גנטית של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) תוך שימוש בדגי זברה זחליים. ה-RPE משתרע על גב העין ושוכן בין השכבות המרובדות של הרשתית העצבית לבין שכבת כלי הדם המרכיבה את הכורואיד. תמיכה טרופית, ספיגת אור פוטוטוקסי ושמירה על חלבוני מחזור הראייה הם רק חלק מהפונקציות הקריטיות שה-RPE מבצע, החיוניות לשמירה על הבריאות והשלמות של הרקמות הסמוכות הללו1. נזק ל- RPE של יונקים ניתן לתיקון כאשר הנגעים קטנים2; עם זאת, נזק שנגרם על ידי פציעות גדולות יותר או מחלה ניוונית מתקדמת הוא בלתי הפיך. בבני אדם, מחלות ניווניות RPE (למשל, ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD) ומחלת סטארגרדט) מובילות לאובדן ראייה קבוע, ועם מעט אפשרויות טיפול זמינות, ירידה באיכות החיים של המטופלים. היכולת המוגבלת של יונקים RPE לתקן את עצמם יצרה פער ידע בתחום התהליכים הרגנרטיביים של RPE. בהתחשב ביכולת ההתחדשות החזקה של דגי הזברה בסוגי רקמות רבים ושונים, פרוטוקול זה פותח כדי להקים מערכת חוליות in vivo כדי להקל על מחקרים על RPE מתחדש במהותו ולחשוף מנגנונים המניעים תגובה זו. באמצעות פרדיגמת האבלציה המתוארת כאן, מסלול האיתות הקנוני Wnt3, מסלול mTOR4 ותגובות הקשורות למערכת החיסון5 זוהו כמתווכים קריטיים של התחדשות RPE, ככל הנראה עם פונקציות חופפות.

בפרדיגמה זו של אבלציה גנטית, Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 דגי זברה מבטאים את הגן nitroreductase שמקורו בחיידקים (NTR/nfsB)6 שהתמזג עם eGFP תחת שליטה של אלמנט משפר RPE, rpe65a7. אבלציה מושגת על ידי הוספת הפרודרוג, metronidazole (MTZ), למערכת מים המאכלסת דגי זברה. הפעלה תוך-תאית של MTZ על-ידי ניטרו-רדוקטאז גורמת להצלבת דנ"א ולאפופטוזיס בתאים המבטאים NTR/nfsB 8,9. טכנולוגיה זו נמצאת בשימוש נרחב בדגי זברה כדי לנטרל תאים של הרשתית 10,11,12,13 ורקמות אחרות 8. יחד, רכיבים אלה מאפשרים ביטוי ממוקד (rpe65a) של מתודולוגיית אבלציה של תאים אינדוקטיביים (NTR/MTZ)8,9 וסמן פלואורסצנטי (eGFP) להדמיה.

קיימים גם מודלים מעניינים אחרים של in vivo שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את הפוטנציאל הרגנרטיבי של RPE14. אלה הם רחבים וכוללים טרנסדיפרנציה של RPE לרשתית לאחר כריתת רטין בדו-חיים, שבה תאי RPE שאבדו לצמיחה מחדש של הרשתית מוחלפיםב-15,16; שחזור RPE לאחר פציעה בעכבר MRL /MpJ "סופר מרפא"17; וגירוי אקסוגני של התפשטות RPE במודל חולדות של RPE ספונטני וניוון רשתית18, בין היתר. כמו כן פותחו מודלים במבחנה, כגון תאי גזע RPE אנושיים בוגרים (RPESCs)19. מודלים אלה הם כולם כלים חשובים הפועלים לחשיפת התהליכים התאיים הקשורים להתחדשות RPE (למשל, התפשטות, התמיינות וכו '); עם זאת, דג הזברה הוא ייחודי ביכולתו לתקן RPE פנימי לאחר אבלציה.

בעוד שהמתודולוגיה כאן נכתבה כדי להתמקד בהבנת המנגנונים המניעים את התחדשות ה-RPE, ניתן להשתמש בקו Tg(rpe65a:nfsB-eGFP) ובפרוטוקול אבלציה גנטי זה כדי לחקור תהליכים תאיים אחרים כגון אפופטוזיס RPE, ניוון RPE והשפעת פגיעה ב-RPE על רקמות רשתית וכלי דם סמוכות. ניתן גם לשנות את פרוטוקול האבלציה כך שיכלול מניפולציה פרמקולוגית, שהיא אסטרטגיה ראשונית נוחה לסינון מסלולי איתות מעניינים. לדוגמה, חסימת מסלול Wnt הקנוני באמצעות מעכב של Wnt Response-1 (IWR-1)20, הוכחה כפגיעה בהתחדשות RPE3. זה חזר על עצמו כאן כדי להדריך משתמשים בניסוי מניפולציה פרמקולוגית ולשמש הוכחת היתכנות לאימות סקריפט MATLAB (RpEGEN) שנוצר כדי לכמת התחדשות RPE בהתבסס על שחזור של פיגמנטציה. בדומה לקו המהונדס ולפרוטוקול האבלציה, סקריפטי RpEGEN ניתנים להתאמה וניתן להשתמש בהם כדי לכמת סמנים/תהליכים תאיים אחרים בתוך ה-RPE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל המתודולוגיות המפורטות כאן תואמות את הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת פיטסבורג.

1. הכנה לפני איסוף עוברים של דגי זברה

  1. הגדר את חממת העוברים ל-28.5 מעלות צלזיוס.
  2. הכינו תמיסת מלאי פי 25 של מעכב המלנוגנזה, N-פנילתיאוריאה (PTU)21,22. תמיסת מלאי זו משתנה ממתכון נפוץ22 ו-1x שווה ל-0.003% משקל לנפח (% w/v) (לדוגמה, 0.003 גרם אבקת PTU ל-100 מ"ל של ממס נוזלי).
    1. כדי ליצור תמיסת PTU גדולה של 25x, הוסיפו 0.75 גרם של אבקת PTU ל-1 ליטר של מים שעברו דה-יוניזציה מטוהרים (להלן dH2O) וערבבו היטב בטמפרטורת החדר (כ-25 מעלות צלזיוס) באמצעות מוט ערבוב וצלחת ערבוב. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לתקופה של עד 3 חודשים מוגנים מפני אור.
      הערה: קשה לגרום ל- PTU להיכנס לתמיסה מימית וייתכן שיהיה צורך בערבוב ממושך בן לילה.
      אזהרה: PTU הוא מסוכן, ויש להקפיד על מניעת בליעה, שאיפה ו/או מגע עם העור או העיניים. אבקת PTU וכל הנגזרות הנוזליות של PTU המתוארות כאן עשויות להיות מסולקות כפסולת כימית בהתאם לתקנות המדינה והמוסדיים. אישור על שיטות סילוק פסולת PTU נאותות, אם בכלל, מומלץ לפני השימוש.
    2. כדי ליצור תמיסת עבודה של 1.5x PTU (להלן 1.5x PTU), הוסיפו 60 מ"ל של תמיסת מלאי PTU של 25x ל-940 מ"ל של מי מתקן לשיכון דגי זברה (להלן מי מערכת). תוארו23 פרמטרים אופטימליים לאיכות המים עבור דגי זברה, ומתקנים ימיים צריכים לכלול נהלי ניטור מים סטנדרטיים. אחסן 1.5x PTU בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס למשך שבוע-שבועיים מוגן מפני אור.
      הערה: פרוטוקול זה מבוצע באופן שגרתי באמצעות ריכוזי PTU, ממסים ופרמטרים של אחסון המתוארים בשלב 1.2. כאמצעי זהירות, יש לצפות בעוברים/זחלים כל 1-2 ימים בזמן שהם נמצאים ב-PTU כדי לאמת את היעילות ולאשר דפיגמנטציה מתמשכת. יש לייעל את תנאי הפירוק ו/או האחסון אם יש חשד לירידה במסיסות/יעילות PTU.
  3. הכינו תמיסת מלאי של 0.05% w/v מתילן כחול, מעכב גדילה פטרייתי, על ידי הוספת 0.05 גרם של אבקת מתילן כחולה ל-100 מ"ל של dH2O. ערבבו היטב באמצעות מוט ערבוב וערבוב צלחת. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  4. הכינו פיפטות למניפולציה של עוברים/זחלים (למשל, הזזת עוברים/זחלים בין צלחות פטרי, הפרדת זחלים במהלך סריקה פלואורסצנטית, איסוף זחלים מורדמים לצינורות מיקרוצנטריפוגה לקיבוע וכו') על ידי חיתוך הקצה המחודד של פיפטת פסטר זכוכית באמצעות עט שרבוט קצה יהלום. חרטו סביב היקף הפיפטה עם עט היהלומים ומשכו או הצמדו בעדינות את הקצה כדי לבצע הפסקה נקייה.
    הערה: הפה של הפיפטה צריך להיות חלק ורחב מספיק כדי לקלוט בקלות עובר שעדיין נמצא בתוך המקהלה מבלי לגזוז. השתמש בפיפטת העברת משיכה של נורה כחלופה. פיפטות מוכנות יכולות לשמש גם להסרת נוזלים במהלך החלפת מים (במקום לשפוך) כדי למזער את אובדן העובר/זחל.
  5. הכינו תמיסת 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-1x תמיסת מלח ביציאת פוספט (PBS) (למשל, הוסיפו 10 מ"ל של 16% PFA ל-4 מ"ל של 10x PBS ו-26 מ"ל של dH2O). יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שבועות מוגנים מפני אור.
    אזהרה: Paraformaldehyde הוא כימיקל מסוכן ויש לטפל בו במכסה אדים כימי ולהיפטר ממנו כראוי. יש להקפיד, וללבוש ציוד מגן אישי (PPE), כדי למנוע בליעה, שאיפה ו/או מגע עם העור או העיניים.

2. איסוף ותחזוקה של עוברים של דגי זברה לפני אבלציה גנטית (0-5 ימים לאחר ההפריה)

  1. שמור על דגי זברה בוגרים כפי שתואר קודם לכן 3,4,5. בשעות אחר הצהריים/ערב שלפני איסוף העוברים, מפרידים בין דגי זברה בוגרים למכלי רבייה להשרצה.
  2. למחרת בבוקר (0 ימים לאחר ההפריה (dpf)), לאסוף עוברים לתוך צלחות פטרי בקוטר 10 ס"מ במי המערכת ולהסיר את כל הביציות שאינן ניתנות להשגה או לא מופרות, אשר ייראו אטומות ו/או יציגו ציטופלסמה לא סדירה וביקוע כושל24.
    הערה: אירועי ביקוע והיערכות התפתחותית תקינים יתבררו בעוברים בריאים כמתואר25. יש לשמור על צלחות פטרי מלאות בשלושה רבעים (כ-30 מ"ל למנה בקוטר 10 ס"מ) לאורך כל הפרוטוקול.
    1. מוסיפים שתי טיפות של 0.05% w/v מתילן כחול לכל צלחת פטרי, מערבבים בעדינות ומאחסנים עוברים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס למשך שארית הפרוטוקול.
  3. כ-6 שעות לאחר הפריה (hpf) 4,5,26, החליפו את מי המערכת בצלחות פטרי עובריות ב-1.5x PTU (תמיסת עבודה שנעשתה בשלב 1.2.2) ומלאו מחדש את מתילן בכחול.
    הערה: יש להוסיף PTU לעוברים לפני הופעת הפיגמנטציה (כלומר, לפני 24 כ"ס)25 מכיוון שרקמות פיגמנטיות שכבר אינן מתפרקות עם הוספת PTU21. עם זאת, יש לציין כי ירידה בגודל העיניים, ליקויים בעיניים ובקרניופציאליים, ושיבושים של מסלולי איתות מסוימים (למשל, איתות בלוטת התריס) דווחו בדגי זברה שטופלו ב-PTU 27,28,29. נראה כי הרעילות ההתפתחותית של PTU תלויה בריכוז ובתזמון של תוספת PTU27,29. כפי שצוין לעיל לצורך אימות יעילות PTU (שלב 1.2), יש גם לעקוב בקפידה אחר סימנים של רעילות PTU, ואם יש לחשוד, יש לייעל את ריכוז העבודה ו/או את זמן הוספת ה-PTU.
  4. על 2-3 dpf, dechorionate עוברים באמצעות תמיסת פרונאז טרי.
    1. ממיסים את הפרונאז ב-1.5x PTU בריכוז של 2 מ"ג/מ"ל על ידי מערבולת.
      אזהרה: Pronase ארוז כאבקה עדינה מאוד והוא מגרה. יש לנקוט באמצעים למניעת שאיפה ו/או מגע עם העור, העיניים וכו'.
    2. הפרד את העוברים הבוקעים מעוברים שלא נקעו, וטפל רק בעוברים שלא נקעו.
    3. החלף 1.5x PTU בתמיסת פרונאז של 2 מ"ג/מ"ל המיוצרת בשלב 2.4.1 והשאר על עוברים לא מרוסקים למשך 4-5 דקות עם תסיסה עדינה (למשל, על רוטציה/שייקר שולחנית או על ידי מערבולת ידנית).
    4. יוצקים את תמיסת הפרונאז ושוטפים מיד עם PTU טרי של 1.5x. טריטורציה עדינה של 1.5x PTU לשטוף את העוברים עם פיפטת העברת נורה למשוך.
    5. חזור על שטיפת PTU שנייה של 1.5x כדי להשליך את כל פסולת הכוריאון, ולאחר מכן מלא 1.5x PTU לצורך תחזוקה.
      הערה: ניתן גם להפריד את העוברים באופן ידני באמצעות מלקחיים עדינים. במקרה זה, יש להסיר פסולת כוריון ולחדש 1.5x PTU לאחר dechorionation ידני.
  5. עקוב אחר בריאות העובר/הזחל ומלא את מלאי ה-PTU פי 1.5 כל 1-2 ימים. עוברים/זחלים נשמרים ב-PTU פי 1.5 עד אבלציה ב-5 dpf.
    הערה: החשיבות של שלבים 2.3 ו- 2.4 מטופלת בהמשך בסעיף הדיון.

3. בדיקת זחלי דגי זברה עבור rpe65a:nfsB-eGFP ובלציה גנטית של אפיתל פיגמנט הרשתית (5-6 ימים לאחר ההפריה)

  1. הכינו תמיסה טרייה של 10 mM metronidazole (MTZ) ב-5 dpf (יום של אבלציה). תהליך זה לוקח 2 שעות להשלים.
    1. הוסיפו אבקת MTZ למי המערכת ללא PTU וערבבו היטב על ידי רעידות נמרצות (למשל, 250 סיבובים לדקה) במשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.
    2. תמיסת MTZ קירור 10 מ"מ לשעה נוספת בטמפרטורת החדר על מסובב/שייקר שולחני ותבטיחו פירוק מלא לפני הוספת כלי פטרי עם זחלים.
      הערה: סינון פלואורסצנטי והפרדת זחלי eGFP+ (שלב 3.2) יכולים להתבצע במהלך דגירות של 37 מעלות צלזיוס וטמפרטורת החדר.
      אזהרה: MTZ הוא מסוכן, ויש להקפיד על מניעת בליעה, שאיפה ו/או מגע עם העור או העיניים. ייתכן שיהיה צורך להשליך את אבקת MTZ ואת כל נגזרות הנוזלים המתוארות כאן כפסולת כימית בהתאם לתקנות המדינה והמוסדות. אישור על שיטות סילוק פסולת MTZ מתאימות, אם בכלל, מומלץ לפני השימוש.
  2. זחלי דג זברה מסך עבור rpe65a:nfsB-eGFP טרנסג'ין.
    1. מרדימים זחלים עם 0.168 גרם/ליטר של טריקאין (MS-222) וזחלים מהונדסים נפרדים (eGFP+) (איור 1) מזחלים לא מהונדסים (eGFP-) באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי עם לייזר/מסנן עירור של 488 ננומטר.
      הערה: יש להוסיף טריקאין לתמיסות PTU ו/או תרכובות פרמקולוגיות של 1.5x, שכן הזחלים צריכים להישאר שקועים בטיפול בזמן שהם נבדקים ל-eGFP. דגירה של זחלים בטרקאין רק למשך ההקרנה (למשל, ≤10 דקות לצלחת פטרי אחת בקוטר 10 ס"מ המכילה 50 זחלים).
    2. הזחלים המוקרנים התעוררו מיד על ידי צנרת ישירות לתוך צלחת פטרי עם PTU טרי של 1.5x ללא טריקאין.
    3. עם השלמת ההקרנה, מפרידים עוד יותר את הזחלים eGFP+ לשתי קבוצות של צלחות פטרי: קבוצה אחת שתקבל טיפול MTZ (אבלציה/MTZ+) וקבוצה אחת שתהיה השליטה הבלתי מעורערת (MTZ-).
  3. ביטול אפיתל פיגמנט הרשתית.
    1. יש להסיר 1.5x PTU מכלי הבקרה ללא הפרעה (MTZ-) ולהוסיף מי מערכת מתוקים ללא PTU.
    2. יש להסיר 1.5x PTU ממנות הטיפול באבלציה (MTZ+) ולהוסיף את תמיסת ה-10 mM MTZ הטרייה (שלב 3.1).
    3. הסר את תמיסת MTZ של 10 mM לאחר 24 שעות בדיוק (המיועדת ליום אחד לאחר הפציעה (dpi)) והוסף מים מתוקים למערכת ללא PTU. החליפו את מי המערכת המתוקה ללא PTU ב-MTZ- dish(es). הזחלים לא ייחשפו שוב ל-PTU למשך שארית הפרוטוקול.
      הערה: ייתכן שיהיה קשה לטפטף או לשפוך את כל 1.5x PTU (שלבים 3.3.1 ו- 3.3.2) או 10 mM MTZ (שלב 3.3.3) בין חילופי תמיסות ללא אובדן זחלים מכיוון שבעלי חיים שוחים באופן פעיל מסביב. במקרה זה, ניתן להוסיף שטיפות של מי מערכת ללא PTU כדי להבטיח חילופי פתרונות מוצלחים.

4. תחזוקת הזחל לאחר אבלציה גנטית (6+ ימים לאחר ההפריה)

  1. בדקו את הזחלים וחידשו את מי המערכת ללא PTU מדי יום עד להמתת חסד (שלב 5.6) או חזרו למתקן הדיור של דגי הזברה.
  2. עקוב אחר ההצלחה וההיקף של אבלציה in vivo ב- 2 dpi (7 dpf) באמצעות תאורת אור המועברת במיקרוסקופ סטריאו (איור 2).

5. שילוב טיפול תרופתי בפרוטוקול אבלציה של פיגמנט הרשתית של דגי זברה

הערה: כפי שבוצע בעבר3, טיפול בבקרת רכב 15 μM IWR-1 או דימתיל סולפוקסיד (DMSO) תואמת נפח המתחילה ב- 4 dpf מתואר כאן כניסוי לדוגמה לבדיקת RpEGEN. הריכוזים ולוחות הזמנים עשויים להשתנות עם תרכובות פרמקולוגיות שונות והמלצות לאימות מינון-תגובה, משך הטיפול, הקרנה והיבטים אחרים של תכנון ניסיוני למחקרי מניפולציה פרמקולוגית מטופלות בפרק הדיון. בצע את השלבים 6 ו- 7 אם נדרש ניתוח תמונה.

  1. לאסוף ולתחזק עוברים כמתואר בשלב 2. נקה עוברים על 2 dpf.
  2. זחלי eGFP+ מסך על 4 dpf כמתואר בשלב 3.2. במקום צלחות פטרי, הכניסו את הזחלים eGFP+ לתוך צלחות של 6 בארות בצפיפות של n ≤ 10 זחלים לכל 6-באר לטיפול תרופתי. ייעדו לוחות נפרדים בני 6 בארות לזחלים שלא יבוטלו (MTZ-) וזחלים שיהיו אבלים (MTZ+).
    הערה: האות eGFP נראה ב- 4 dpf אך נראה עמום יותר מעוצמת האות ב- 5 dpf.
  3. Pretreat 4 dpf eGFP+ זחלים עם 15 μM IWR-1 או בקרת רכב DMSO תואמת נפח במשך 24 שעות בדיוק לפני אבלציה גנטית עם תמיסת MTZ 10 mM.
    הערה: לעתים קרובות, מעט מאוד תרכובת נדרשת לניסויים טיפוליים פרמקולוגיים. כדי להימנע משקולת כמויות קטנות של אבקת IWR-1, תרכובת פרמקולוגית זו נרכשת כבר בתמיסת DMSO, בריכוז של 25 מ"מ, ומועברת לנפחים קטנים יותר עם ההגעה כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים.
    1. קבעו את נפח הטיפולים הפרמקולוגיים והבקרה ברכב הדרושים והכניסו 1.5x PTU לצינורות חרוטיים בהתאם. מומלץ להשתמש בנפח של 5 מ"ל/באר של צלחת בעלת 6 בארות.
    2. הוסף מלאי IWR-1 ל- 1.5x PTU לריכוז סופי של 15 μM IWR-1 (לדוגמה, 3 μL של 25 mM IWR-1 לכל 5 מ"ל של 1.5x PTU). הוסף נפח תואם של מלאי DMSO ל- 1.5x PTU (לדוגמה, 3 μL ≥ 99.7% DMSO לכל 5 מ"ל של 1.5x PTU). כאן, זה יניב בסופו של דבר ריכוז סופי של 0.06% נפח / נפח (% v / v) DMSO. מערבבים היטב על ידי מערבולות ומאשרים חזותית פירוק של תרכובות.
      אזהרה: ייתכן שיהיה צורך להיפטר מ-DMSO, IWR-1 ותרכובות וממסים פרמקולוגיים אחרים כפסולת כימית בהתאם לתקנות המדינה והמוסדיים. אישור רמת הסיכון ושיטות פינוי פסולת נאותות לתרכובות אלה, אם ישנן, מומלץ לפני השימוש.
    3. הסר 1.5x PTU מהזחלים eGFP+ בצלחות של 6 בארות והוסף 5 מ"ל / באר של 0.06% v / v DMSO טריים או 15 μM IWR-1 טיפולים משלב 5.3.2.
  4. ב-5 dpf, בטלו את ה-RPE. בנוסף לטיפול המקדים של 24 שעות (שלב 5.3), הזחלים יישארו שקועים בטיפולים פרמקולוגיים ובקרת כלי רכב במהלך 24 שעות של אבלציה גנטית עם 10 mM MTZ ובמהלך התאוששות לאחר אבלציה, עד לקיבוע (למשל, מ-4-9 dpf).
    1. צור תמיסת MTZ של 10 mM 2 שעות לפני ביצוע אבלציה גנטית (שלב 3.1).
    2. קבעו את נפח הטיפולים הפרמקולוגיים והבקרה ברכב הדרושים הן עבור לוחות 6-בארות ללא ספיגה (MTZ-) והן עבור לוחות 6-בארות (MTZ+) ונפחים מתאימים של מי מערכת מתוקים ללא PTU (MTZ-) או תמיסת MTZ של 10 mM MTZ (MTZ+) לתוך צינורות חרוטיים. זה יניב ארבעה מצבי טיפול: 1) 0.06% v/v DMSO, MTZ-; 2) 15 מיקרומטר IWR-1, MTZ-; 3) 0.06% v/v DMSO, MTZ+; ו-4) 15 μM IWR-1, MTZ+.
    3. הוסף פתרונות מלאי IWR-1 ו- DMSO לצינורות החרוטיים המתאימים כפי שבוצעו בשלב 5.3.2. מערבבים היטב על ידי מערבולות ומאשרים חזותית פירוק של תרכובות.
    4. הסר 0.06% v/v DMSO ו-15 μM IWR-1 טיפולים ב-1.5x PTU (שלב 5.3.2) מצלחות ייעודיות ללא הפרעה (MTZ-) ו-Ablated (MTZ+) 6-well וחדש עם הטיפולים המתאימים שנעשו בשלב 5.4.3.
    5. הסר 0.06% v/v DMSO ו- 15 μM IWR-1 טיפולים בתמיסת 10 mM MTZ לאחר 24 שעות בדיוק ומלא את חידוש הטיפולים במים מתוקים של המערכת ללא PTU. מלאו 0.06% v/v טיפולים ב-DMSO ו-15 μM IWR-1 במים מתוקים של המערכת ללא PTU על צלחות הבאר (MTZ-) הבלתי מעורערות (MTZ-) בעלות 6 הבארות.
  5. עקוב אחר תחזוקת הזחל לאחר אבלציה כמתואר בשלב 4 ומלא 0.06% v /v DMSO או 15 μM IWR-1 טיפולים מדי יום במי מערכת ללא PTU.
  6. המתת זחלים על 9 dpf (4 dpi עבור אחים שטופלו ב-MTZ המותאם לגיל) על ידי טבילת בעלי חיים בתמיסת טריקאין 0.3 גרם/ל' (מנת יתר קטלנית) יחד עם צינון מהיר (למשל, הניחו צלחות פטרי על קרח) למשך 20 דקות לפחות30 דקות. בדוק כדי לוודא שהזחלים אינם מגיבים למגע ולתקן ב-4% PFA (שלב 1.5) למשך 3 שעות בטמפרטורת החדר או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.
  7. לעבד רקמת זחל לאחר קיבוע לרכישת תמונה z-stack במיקרוסקופ קונפוקלי כפי שתואר קודם לכן 5,31 וכאן בסעיף תוצאות מייצגות. ניתוח בשלבים 6 ו-7 ידרוש, לכל הפחות, רכישה של סמן גרעיני (לדוגמה, DAPI) ותמונות z-stack של Brightfield.

6. מיקרוסקופ קונפוקלי z-stack עיבוד תמונה מקדים בפיג'י (ImageJ)

  1. ייבוא ועיצוב תמונות z-stack של מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות FIJI32.
    1. פתח תמונות מיקרוסקופ באמצעות אפשרויות ייבוא ביו-פורמטים המוגדרות לתצוגת מחסנית עם: מצב Hyperstack ו - Color: גווני אפור.
    2. צור הקרנה בעוצמה מרבית של תמונת המיקרוסקופ המיובאת על ידי בחירה בתמונה | ערימות | פרויקט Z. בחלון ZProjection , הגדר התחל פרוסה ו-Stop Slice כך שיכללו את כל הפרוסות עבור תמונה זו. לדוגמה, הגדר התחל פרוסה: 1 ו - Stop Slice: 18 עבור מחסנית z הכוללת בסך הכל 18 פרוסות. בחר סוג הקרנה: עוצמה מרבית ולחץ על אישור.
    3. המרת קובץ ההקרנה בעוצמה המרבית לתמונה של 8 סיביות (אם עדיין לא כבר) על-ידי בחירה בתמונה | סוג | 8 סיביות.
    4. כיוון מחדש את התמונה כך שהצד הגבי יהיה למעלה ודיסטלי (כלומר, העדשה) יישאר על ידי בחירה בתמונה | שינוי | הפוך אופקית (עבור הפקודה האחרונה, בחר את האפשרות המתאימה ביותר לכיווניות הדרושה לתמונה זו). לקבלת תמונה רב-ערוצית, לחץ על כן במחסנית התהליכים? חלון כדי לכוון מחדש את כל הערוצים.
      הערה: שלב זה הוא קריטי, אך אינו נחוץ אם התמונה כבר נמצאת בכיוון הגב למעלה, הדיסטלי השמאלי הדיסטלי. ראו איור 3A-D ואיור 4 לתמונות עם עיניים בכיוון הנכון לעיבוד.
    5. שמור את ההקרנה בעוצמה המרבית של 8 סיביות כקובץ בתבנית קובץ תמונה מתויגת (TIF) על-ידי בחירה בקובץ | שמור כ| טיף....
  2. צור אזור עניין RPE (ROI) באמצעות FIJI.
    1. פתח תמונת TIF של 8 סיביות שנוצרה כמתואר בשלב 6.1. התחל את מנהל ההחזר על ההשקעה על-ידי בחירה באפשרות נתח | כלים | מנהל החזר ההשקעה.
    2. שימוש | תמונה התקרבו והתחלפו בין תעלות ה-DAPI לתעלות השדה הבהיר כדי לזהות את הנקודות שבהן הצד האפי של ה-RPE צמוד לקצה הממברנה המגבילה החיצונית (OLM) (איור 3B', B", D', D"; ראשי חץ כחולים). השתמש בנקודת ציון אנטומית זו כנקודת ההתחלה של החזר ההשקעה.
    3. צור את החזר ההשקעה של RPE באמצעות הכלי בחירות מצולעים (בסרגל הכלים של FIJI) באמצעות ערוצי התמונה DAPI ו- Brightfield ופונקציית הזום (תמונה | Zoom) לזיהוי גבולות RPE אפיים ובסיסיים. הביאו את הקצוות הגביים והגחוניים של ההחזר על ההשקעה (כלומר, כאשר ההחזר על ההשקעה עובר מהצד האפי לבסיסי של ה-RPE) לנקודה חדה במקום להקהות או לעגל (איור 3B', B", D', D', D"; קווי מג'נטה).
      הערה: יצירת קצה ROI מחודד היא שלב קריטי למיטוב זיהוי נקודות הקצה באמצעות RpEGEN והיא מטופלת במקטע הדיון.
    4. הוסף את ההחזר על ההשקעה על-ידי לחיצה על הוסף את מנהל ההחזר על ההשקעה. התאם את ההחזר על ההשקעה לפי הצורך ולחץ על עדכן במנהל ההחזר על ההשקעה.
    5. שמור את קובץ ההחזר על ההשקעה על-ידי בחירה באפשרות 'עוד>> | שמר... בתוך מנהל ההחזר על ההשקעה. השתמש בשמות זהים עבור קבצי תמונה תואמים של ROI ו- TIF (לדוגמה, [שם הקובץ].tif ו-[שם הקובץ].roi).
  3. שלב קבצי TIF ו- ROI של 8 סיביות עבור כל תנאי בתיקיה אחת. לדוגמה, התיקיה, DMSO_9dpf, תכיל את כל קבצי ה- TIF וה- ROI התואמים עבור קבוצת הזחלים 9 dpf ללא הבחנה (MTZ-) 0.06% v/v שטופלה ב- DMSO.

7. כימות והדמיה של התחדשות RPE באמצעות סקריפטים של RpEGEN

  1. התקן והכן סקריפטים של RpEGEN.
    1. הורד את הסקריפטים האחרונים של RpEGEN ממאגר GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) על ידי לחיצה על קוד | הורד את ZIP.
    2. פתח את התיקיה והצב אותה במיקום הרצוי של סביבת העבודה (לדוגמה, שולחן עבודה).
    3. פתח את MATLAB.
    4. נווט אל התיקיה RpEGEN בחלונית התיקיה הנוכחית (בדרך כלל בצד שמאל).
    5. לחץ לחיצה ימנית על התיקיה RpEGEN ובחר הוסף לנתיב | תיקיות ותיקיות משנה נבחרות. פעולה זו מוסיפה את התיקיה לנתיב MATLAB כך שהיא יכולה למצוא ולהפעיל באופן אוטומטי את כל קבצי ה- Script בתיקייה.
    6. לחץ פעמיים על התיקיה RpEGEN בחלונית התיקיה הנוכחית כדי להציג את כל תיקיות המשנה וקבצי M.
    7. לחץ פעמיים על הקובץ RpEGEN.m כדי לפתוח בחלונית העורך .
    8. תחת המקטע משתנים המוגדרים על-ידי המשתמש בקובץ RpEGEN.m, הזן את מיקומי הספריות עבור התיקיות המכילות את קבצי ההחזר על ההשקעה ( .roi ), קבצי התמונה (.tif) והיכן יש לשמור קבצי פלט. הזן את שם הקבוצה עבור קובץ ה- .mat לייצוא (לדוגמה, DMSO_9dpf, DMSO_4dpi וכו ') ואת המיקום של ערוץ brightfield במחסנית התמונות של TIF (לדוגמה, 3, אם brightfield הוא הערוץ השלישי בערימת תמונות). אם קובץ התמונה מכיל רק את תמונת השדה הבהיר, אז זה צריך להיות שווה ל-1.
  2. הפעל את סקריפט RpEGEN.m ואמת את התוצאות.
    הערה: RpEGEN דורש שארגז הכלים לעיבוד תמונה, ארגז הכלים להתאמת עקומה וארגז הכלים לסטטיסטיקה ולמידת מכונה יופעלו ברישיון MATLAB למשתמש כדי לפעול. בנוסף, ארגז הכלים ReadImageJROI הזמין באופן חופשי33 נדרש לייבא FIJI ROIs לתוך MATLAB; עם זאת, הוא מסופק בתיקיית RpEGEN יחד עם קבצי M פונקציה אחרים שאינם דורשים כל הפעלה.
    1. הפעל את הסקריפט על-ידי לחיצה על לחצן הפעלה בתפריט העורך בחלק העליון של MATLAB.
      הערה: לאחר ההפעלה, חלון הפקודה יספק פלט מילולי המציין את התקדמות קובץ ה- Script. לאחר שמירת קובץ MAT המכיל את הנתונים שחולצו, יופיע איור בן שלושה פאנלים וישמר כקובץ PDF בספריית הפלט עבור כל הפעלת תמונה. אלה הם נתוני בקרת איכות (QC) כדי לוודא שהכל פועל כראוי וכוללים: 1) תמונת Brightfield שמעליית ה-ROI (איור 4A); 2) ההחזר על ההשקעה עם קו האמצע והמרחק הזוויתי המשויך (מעלות) (איור 4G); ו-3) ההחזר על ההשקעה עם ערכי העוצמה החציונית של קו האמצע (0-255, סולם צבעים של 8 סיביות) (איור 4H). המתן עד שמסמכי PDF QC יישמרו בתיקיית הפלט והנתון האחרון ייעלם לפני שתמשיך לשלב הבא.
    2. פתחו את מסמכי PDF בודדים המיוצאים לתיקיית הפלט בכל מציג PDF וודאו שכל ה-ROIs תואמים לתמונות הבהירות, שערכי קו האמצע הם קירובים סבירים של מרכז ה-ROIs, ושהערכים בעוצמה החציונית מאוכלסים כראוי בנתונים (כלומר, לא כולם באותו ערך לאורך כל קו האמצע).
      הערה: תיאור ומבנה מפורטים של כל משתנה שנשמר בקובץ MAT על-ידי RpEGEN.m ניתן למצוא בטבלה 1.
  3. הפעל את הסקריפט RpEGEN_PermPlot.m.
    הערה: סקריפט RpEGEN_PermPlot.m משתמש בפלט של RpEGEN.m כדי להריץ השוואות סטטיסטיות באמצעות סימולציית תמורה של החציון של שתי קבוצות וגם מספק את הקוד לשחזור העלילות במאמר זה באמצעות ארגז הכלים GRAMM34 הזמין באופן חופשי, שנכלל גם בתיקיית RpEGEN.
    1. לחץ פעמיים על הקובץ RpEGEN_PermPlot.m כדי לפתוח בכרטיסייה עורך חדש.
    2. תחת סעיף 1 - משתנים המוגדרים על-ידי המשתמש בקובץ RpEGEN_PermPlot.m, הזן את מיקום הספרייה עבור תיקיית הפלט המכילה את קבצי ה- MAT מהפעלת RpEGEN.m והזן כל שם קובץ MAT לטעינה (לדוגמה, DMSO_4dpi.mat, IWR1_4dpi.mat).
    3. הפעל מקטע זה של קובץ ה- Script על-ידי לחיצה על לחצן הפעל מקטע בתפריט העורך בחלק העליון של MATLAB.
    4. בסעיף 2, הזן את שמות שתי הקבוצות לצורך השוואה סטטיסטית במשתנים data_A data_B (אלה הקבוצות שמהן ייגזרו החציון באמצעות סימולציית התמורות). במשתנה bin_sz, הזן את מספר המעלות שבהן ניתן לשלב את ערכי העוצמה החציונית עבור מערכי הנתונים (ברירת המחדל היא סלים של מעלה אחת).
      הערה: משתנה החזרות מציין את מספר התמורות שיש להשתמש בהן לבניית התפלגות הסתברות וניתן להגדירו לכל מספר (ערך ברירת המחדל הוא 20,000). באופן כללי, מספר גבוה יותר של חזרות יהיה חזק יותר מבחינה סטטיסטית אך יגדיל את זמן העיבוד.
    5. הפעל מקטע זה של קובץ ה- Script על-ידי לחיצה על לחצן הפעל מקטע בתפריט העורך בחלק העליון של MATLAB. השלמת מקטע זה עשויה להימשך זמן מה בהתאם למספר החזרות שצוינו, אך היא מספקת עדכון מצב רציף בחלון הפקודה.
    6. הפעל את המקטעים 'איור מפת חום' ו'תוצאות קבוצתיות' ו'ערכי P' באופן עצמאי באמצעות לחצן 'הפעל מקטע '. ערוך משתני נתונים בכל מקטעי ההערה עם "הזן נתונים כאן". מסמכי PDF של נתונים אלה נשמרים באופן אוטומטי עבור כל אחד מהם וניתן לשנותם בקלות בכל עיבוד של תוכנה וקטורית לאחר עיבוד.
      הערה: החלקות שנוצרו בקובץ RpEGEN_PermPlot.m הן אד-הוק וסביר להניח שידרשו שינויים בהתבסס על הנתונים הספציפיים של כל משתמש וצרכי ההדמיה. עם זאת, הנתונים מספקים בסיס איתן שניתן להתאים אותו אישית בקלות באמצעות אתרי MATLAB ו-GRAMM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עיכוב מסלול האיתות הקנוני של Wnt ידוע כפוגע באופן משמעותי בהתחדשות RPE של דגי זברה באמצעות פרדיגמת האבלציה הגנטית (rpe65a:nfsB-eGFP) ומתודולוגיית המניפולציה הפרמקולוגית (IWR-1) המתוארת בפרוטוקול3. ניסוי זה חזר על עצמו כאן כדי לאמת שיטה אוטומטית לכימות התחדשות RPE של דגי זברה המבוססת על פיגמנטציה. התוצאות המסוכמות להלן הקיפו את כל שלבי הפרוטוקול, מיום ההפריה (0 dpf) ועד לכימות התחדשות RPE באמצעות RpEGEN.

יישום פרוטוקול האבלציה RPE (עם מניפולציה פרמקולוגית) בדגי זברה זחליים
עוברים שנאספו משלוש קבוצות הורים נפרדות (N = 3) החלו בטיפול עם 1.5x PTU סביב 6 hpf והיעדר פיגמנטציה ב- RPE ובמלנוציטים על פני השטח אושר חזותית ב- 1 dpf. העוברים הורדו באופן אנזימטי ב-2 dpf באמצעות 2 מ"ג/מ"ל של פרונאז (שלב 2.4). ב-4 dpf, הזחלים הורדמו באמצעות טריקאין (MS-222) והוקרנו עבור eGFP באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי (שלבים 3.2 ו-5.2). זחלי eGFP+ הועברו ל-6 לוחות באר (n = 10 זחלים/באר) וטופלו ב-0.06% v/v DMSO (בקרת רכב) או ב-15 μM IWR-1 (שלב 5.3). צפיפות הזחלים שדווחה כאן התבססה בתחילה על קירוב של אזור צמיחה של זחל אחד/ס"מ2 ואומתה באמצעות ניטור בריאותי זהיר (למשל, התפתחות שלפוחית השתן בשחייה) לאורך זמן. עוצמת ה-eGFP נראתה עמומה ב-4 dpf, כך שהזחלים הוקרנו מחדש ב-5 dpf כדי לאשר ביטוי eGFP בהיר (איור 1). RPE65 (rpe65a בדג זברה) הוא סמן של RPE7 בוגר , ובדגי טלוסט, תאי הרשתית וה-RPE נוצרים ללא הרף מאזור השוליים הציליאריים (CMZ), גומחת תאי גזע בקצה הדיסטלי של הרשתית, בצמוד לעדשה35. לפיכך, בקו המהונדס rpe65a:nfsB-eGFP, ה-RPE הלא בוגר יותר קיים בפריפריה ומופיע eGFP- (כשליש מסך רקמת ה-RPE) בעוד ששני השלישים הבוגרים והמרכזיים של ה-RPE מבטאים eGFP (איור 1B; ראשי חץ לבנים). הטרנסגן נראה גם בבלוטת האצטרובל (איור 1A; ראש חץ צהוב), שהיה צפוי מכיוון ש-rpe65a מראה ביטוי אצטרובל בדגי זברה36. זחלים עמומים יחסית או eGFP נמשכו מלוחות של 6 בארות והומתו על 5 dpf. בשעה 24 שעות בדיוק לאחר הטיפול ב-DMSO או ב-IWR-1, טופלו 5 זחלי dpf ב-10 mM MTZ כדי לבטל את ה-RPE (שלבים 3.1, 3.3 ו-5.4). MTZ נשטף החוצה לאחר 24 שעות בדיוק (כלומר, על 6 dpf/1 dpi) כדי לאפשר התחדשות RPE להתרחש.

הזחלים נצפו מדי יום במיקרוסקופ סטריאו באמצעות תאורת אור משודרת מ-6 dpf/1 dpi לזמן המתת החסד ב-9 dpf/4 dpi. הצלחת האבלציה הגנטית אושרה ב-in vivo ב-2 dpi על ידי היעדר פיגמנט בשני השלישים המרכזיים של העין בזחלי MTZ+ (איור 2B; ראשי חץ אדומים) בהשוואה ל-7 אחים לבקרת dpf MTZ (איור 2A) (שלב 4.2). כצפוי, האזור נטול הפיגמנט ב-2 dpi נראה מקביל לאזור של rpe65a:nfsB-eGFP ביטוי טרנסגני שנצפה ב-5 dpf (איור 1B). ההערכה בוצעה ב-2 dpi ולא מוקדם יותר כאשר RPE עובר החלפה מחדש לאחר הסרת PTU ובהתאם לזמן התצפית ב-vivo, הבדל ניכר בין ה-RPE המרכזי האבלציה לבין ה-RPE ההיקפי החוסך (ללא הבחנה) עשוי להיות קשה להבחנה אם האחרון לא חזר על עצמו במלואו. למרות האפשרות לעמימות מקרוסקופית, אבלציה של RPE ב-1 dpi הוכחה בעבר כנראה בקלות ברקמה מחולקת, מה שחושף אובדן של RPE מרכזי ושל שלמות השכבה הגרעינית החיצונית (ONL; כלומר, פוטורצפטור) יחד עם עדויות למוות תאי (גרעינים פיקנוטיים) (איור 5)3. נגד אובדן רקמות, התפשטות חזקה נקבעה כגורם מפתח במהלך התחדשות רקמות במודל3 של דגי זברה rpe65a:nfsB-eGFP. הן התגובה האפופטוטית המוקדמת, שבה אבלציה RPE מובילה לניוון של רקמות סמוכות (למשל, פוטורצפטורים והממברנה של ברוך; איור 6A-C), ותגובת ההתפשטות ההיקפית-מרכזית שבאה בעקבותיה, המניבה "אזורי" התחדשות הטרוגניים הנעים פנימה אל תוך אתר הפציעה (איור 6D-F), אופיינו בהרחבה ונדונו בעבר3.

הכנת רקמות, רכישת תמונה קונפוקלית ועיבוד מקדים של תמונה לכימות אוטומטי המבוסס על פיגמנטציה של RPE באמצעות RpEGEN
ב-9 dpf/4 dpi, הזחלים שטופלו ב-DMSO ו-IWR-1 הומתו על ידי מנת יתר של טריקאין ותוקנו ב-4% PFA למשך 3 שעות בטמפרטורת החדר (שלב 5.6). ארבעה זחלים מכל קבוצת אב עצמאית נבחרו באקראי לעיבוד רקמות עוקב (N = 3; n = 12 זחלים לכל טיפול). הגנה על ההקפאה, קריו-אקטציה (בעובי של 12 מיקרומטר), צביעה נגדית גרעינית עם DAPI והרכבת כיסויים בוצעו כפי שמצוין בשלב 5.7 5,31. קטע מרכזי, עם עצב ראייה נראה לעין, מכל זחל צולם במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי באמצעות מטרת טבילת שמן של פי 40 (מפתח צמצם מספרי = 1.30) כדי לרכוש תמונות z-stack בגודל 512 x 512 x 512 פיקסלים עם מרווח של 1 μm z-step. כל תמונה הכילה נתונים משלושה ערוצים: ערוץ 1 = עירור של 405 ננומטר עבור DAPI, ערוץ 2 = עירור של 488 ננומטר עבור eGFP, ערוץ 3 = אור משודר עבור שדה בהיר. כאשר עוצמת הפיקסלים כומתה בתמונות שדה בהיר, הגדרות מתח מנורת האור שהועברו נשמרו קבועות וכל הנתונים שנאספו לצורך השוואות סטטיסטיות צולמו באותו יום.

תמונות מיקרוסקופ קונפוקליות z-stack עובדו מראש עבור כימות אוטומטי כמתואר בשלב 6, באמצעות FIJI. תמונות לא נכללו בעיבוד מקדים וכימות אם הרקמה נפגעה באופן שיקשה על יצירת ROI (למשל, מקרע (תרשים 7א; ראשי חץ מג'נטה) או חסימה של ציון דרך (תרשים 7B; magenta ovals)) או מדידות עוצמת ROI מוטות (למשל, מקיפול (תרשים 7ג; magenta ovals)). למרות השמטת כמה זחלים עם קריטריוני הרחקה אלה, כל מערכי הנתונים כאן מייצגים N = 3 עם המספר הבא של שכפולים ביולוגיים (זחלים): n = 11, DMSO MTZ-; n = 10, IWR-1 MTZ-; n = 11, DMSO MTZ+; n = 12, IWR-1 MTZ+. באמצעות ערוץ DAPI, ROIS RPE הונעו על ידי זיהוי ראשוני של הנקודה שבה הצד האפיאלי הגבי של ה- RPE (הפונה לרשתית) היה צמוד ישירות לקצה הגבי של ה- OLM (איור 3B',ד'; ראשי חץ כחולים) (שלב 6.2.2). מכיוון שהרחבת RPE דיסטלית יכולה להשתנות בין מקטעים, ה-OLM שימש כנקודת ציון אנטומית כדי לתקנן נקודות קצה של RPE ROI ולנרמל מדידות מרחק זוויתי ב-MATLAB (כאשר 0° = נקודת קצה של ROI על הגב ו- 180° = נקודת קצה של ROI גחוני). בעת ביצוע אבלציות RPE עם מניפולציה פרמקולוגית או על רקע מוטנטי, יש לזהות ולאמת נקודת ציון אנטומית לפני עיבוד מקדים וכימות. כאן, ה-OLM היה ניכר בכל הזחלים שכומתו ולא נפגע על ידי קריעה (כמו ב תרשים 7B) או טיפול עם DMSO או IWR-1. לאחר זיהוי נקודת ההתחלה הגבית, נוצרו ROIs בעקבות הצד האפי של ה-RPE (הגב-לגחון) עד שהגיעו לנקודה הסמוכה לקצה ה-OLM הגחוני (איור 3B",D"; ראשי חץ כחולים). לאחר מכן, נוצרה נקודת קצה של ROI גחוני בין הצד האפי והבסיסי (הפונה לכורואיד) של ה-RPE כפי שנדון בשלב 6.2.3 (איור 3B",D"; קו מג'נטה). ההחזר על ההשקעה נמשך, תוך מעקב אחר הצד הבסיסי של ה-RPE (גחון-אל-גב) עד שהגיע לצד הבסיסי הסמוך לנקודת ההתחלה ב-OLM הגבי. לאחר מכן הוקף ההחזר על ההשקעה על ידי יצירת קצה גבי מחודד (איור 3B',D'; קו מג'נטה) כפי שנעשה בגחון. הודגם כי אבלציה גנטית גורמת לאובדן ביטוי eGFP מרכזי שמתאושש עם התקדמות ההתחדשות (מסוכמת ב- תרשים 6)3; לפיכך, בהתאם להיקף ההתחדשות ועוצמת ה- eGFP בנקודת הזמן של העניין, ערוץ eGFP עשוי להיות שימושי רק ליצירת ROI ב- MTZ- קבוצה. לכן, בעוד שרכישות קונפוקליות הכילו גם תמונות של ערוצי eGFP, יצירת ROI הושלמה באמצעות ערוצי DAPI וברייטפילד כאמור בשלב 6.2.3. יצירת ההחזר על ההשקעה של RPE הייתה פשוטה ב-MTZ שטופל ב-DMSO וב-IWR-1- קבוצות זחלים ואזורים מוקפים עם מיקרוווילי אפיקלי פיגמנטי בעליל (איור 3B; ראש חץ אדום) יחד עם גופי התאים בעלי הפיגמנטים הבולטים. אותם פרמטרים הוחלו על MTZ+ קבוצות זחלים (איור 3D; ראש חץ אדום); עם זאת, בשל שאריות של רקמות פגומות בתוך אתר הפציעה, היה קשה להגדיר את גבולות המיקרוווילי והפיגמנטציה האפיקליים בתעלת השדה הבהיר בלבד במקרים מסוימים. באזורים אלה, ערוץ ה-DAPI שימש גם לזיהוי פסולת סלולרית בתוך אתר הפגיעה ב-RPE, שנכלל בהחזר ההשקעה (איור 3ג,D; דוגמאות של פסולת תאית מקומית באתר פציעה מסומנות בראשי חץ ציאן). חיסון עם סמנים של RPE לא בוגר/בוגר (למשל, ZPR2; איור 6Dה)37 ו/או פוטורצפטורים (למשל, ZPR1)37,38 יכול לשמש גם כדי להקל על התוויית ROIs RPE בזחלים אבלים.

בעבר, זחלי אבלציה שטופלו ב-IWR-1 מ-4 dpf ל-4 dpi הראו פגיעה משמעותית בהתחדשות RPE בהשוואה לבקרת אחים שטופלה ב-DMSO (איור 8C)3. זה דווח כאחוז ההתאוששות של פיגמנט מרכזי, שדרש ניסיון מוקדם משמעותי עם המודל ומדידות ידניות של מרחק זוויתי כדי לייעד גבולות התחדשות (איור 8B; ראשי חץ שחורים). RpEGEN נוצר כדי להפוך את הכימות של התחדשות RPE לאוטומטית ולהפחית הטיות פנימיות. לא רק זה, RpEGEN גם אפשרה יצירת מערכי נתונים חזקים במיוחד; לדוגמה, 10 נקודות נתונים נוצרו בעבר מכימות ידני של n = 10 זחלי MTZ+ שטופלו ב-DMSO (איור 8C; % שחזור פיגמנטים לכל מדידות סעיף)3, בעוד ש-174,801 נקודות נתונים נוצרו מ-n = 11 זחלי MTZ+ /ROIs שטופלו ב-DMSO כאן באמצעות RpEGEN (איור 9C; מדידות עוצמת פיקסלים).

RpEGEN פותח כדי להעריך בהדרגה שינויים אזוריים בפיגמנטציה על פני כל ה-RPE על ידי הפקת קו מרכז שלד (רוחב של פיקסל אחד) מה-ROI המקורי שנוצר באמצעות FIJI (איור 4A,B). כדי לשלב את כל הפיקסלים בתוך החזר ההשקעה לניתוח (כלומר, לא רק את הפיקסלים של קו האמצע), בוצעה התמרת מרחק אוקלידית בכל פיקסל מקו האמצע כדי ליצור מפה של אינדקס קו האמצע הקרוב ביותר עבור כל פיקסל במסיכת ההחזר על ההשקעה. מפת מדדים זו אפשרה לייחס כל פיקסל מחוץ לקו האמצע לפיקסל אחד של קו האמצע, ויצרה מערך נתונים מקיף על פני כל ה-RPE עבור כל זחל (איור 4E). האורך הגבי-לגחוני של ה-RPE היה מיוצג על-ידי מרחק זוויתי (איור 4G; 0-180°) בניגוד למרחק פיקסלים מנורמל (איור 4F; 0-1 יחידות שרירותיות), מכיוון שזה היה אינטואיטיבי יותר בהתבסס על מדידות קודמות של התחדשות RPE 3,4,5 והעובדה שהמרחק הזוויתי אינו משתנה עם הבדלים מורפולוגיים. העוצמות החציוניות הנגזרות מפחים של 5 מעלות היו המדד שנבחר כדי להדגיש מגמות בקנה מידה גדול ולמזער את השונות בתדרים הגבוהים שנצפו בנתונים של 1 מעלות (טבלה 1, איור 10A). סימולציית פרמוטציה נבחרה כדי לבחון את השערת האפס כדי לראות אם החציון של שתי קבוצות הטיפול (כאן, DMSO MTZ+ ו-IWR-1 MTZ+ (שניהם 4 dpi), איור 10B) דומיםל-39. טכניקת דגימה מחדש זו חסרה הנחות קפדניות לגבי התפלגות הנתונים וניתן להשתמש בה במגוון סטטיסטיקות בדיקה (למשל, ממוצע, חציון וכו ') כדי ליצור אומדני ערך p חזקים. ניתן להתאים ולשנות מספר פרמטרים אלה (לדוגמה, גודל סל של נתונים גולמיים וחציוניים, חזרות על סימולציות פרמוטציה וכו') כך שיתאימו לצרכי המשתמש. עבור האחרונים, 20,000 חזרות נבחרו כדי ליצור השוואה חזקה סטטיסטית, עם זאת, יש להקפיד לאזן בין יעילות חישובית לבין חוסן סטטיסטי מכיוון שמעט מדי חזרות עלולות לייצר אומדני ערך p שגויים. מומלץ להריץ ערכי חזרה מרובים (10,000, 20,000 וכו') כדי להבטיח שהתפלגות ערכי ה-p והערכים יהיו יציבים יחסית לפני תחילת הפרשנויות. הגדלת החזרות על פרמוטציות תגדיל את העוצמה הסטטיסטית (אך גם תיקח זמן רב יותר לרוץ), מה שעשוי להועיל עבור מערכי נתונים מסוימים.

מערכי נתוני תמונה קונפוקליים כומתו באמצעות RpEGEN כמתואר בשלב 7. RpEGEN המבואר וסקריפטי התמיכה זמינים ב- GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) יחד עם קבצי TIF של 8 סיביות וקבצי ROI תואמים למשתמשים המעוניינים בכך. מפות חום המציגות נתונים גולמיים מ-MTZ- זחל ROIs הראו התפלגות כוללת של עוצמות פיקסלים כהות יותר (כאשר 0 = שחור ו-255 = לבן, סולם צבעים של 8 סיביות) המשתרע על פני אורך הגב (0°) עד הגחון (180°) של ה-RPE, ללא קשר לטיפול ב-0.06% v/v DMSO או 15 μM IWR-1 (איור 9A,B). התוויית עוצמות הפיקסלים החציוניים אפשרה הדמיה בין כל הקבוצות והראתה קווי דמיון בין קבוצות ה-MTZ לאורך ה-RPE (איור 10A; קווים שחורים ואפורים). נתונים אלה תמכו בנוכחותו של מונו-שכבת RPE פיגמנטי שלם (איור 9E,F) וסיפקו ערכי עוצמת פיקסלים חציוניים בסיסיים (כלומר, מתחת ל-150) עבור RPE ללא הפרעה (איור 10A; קווים שחורים ואפורים). באופן השוואתי, נתונים גולמיים (איור 9C,D) וחציון (איור 10A; קווים כחולים ואדומים) מ-ROIs של זחלי MTZ+ הראו התפלגות כוללת של עוצמות פיקסלים קלות יותר במרכז RPE, שוב, ללא קשר למצב הטיפול. זחלים שטופלו ב-DMSO הראה התפלגות ריכוזית של פיקסלי אור בכ-100° (± 15°) (איור 9C; פחים כתומים-אדומים). זה תאם את ההיעדר הנראה לעין של פיגמנטציה באתר הפגיעה המרכזי של RPE בעצב הראייה ובסביבתו (איור 9G; ראשי חץ כחולים). הזחלים שטופלו ב-IWR-1 הפגינו גם התפלגות ריכוזית של פיקסלי אור שהורחבו הן באופן הגבי (לכ-50 מעלות) והן בגחון (בכ-5°) בהשוואה לבקרות אחים שטופלו ב-MTZ+ DMSO (איור 9D; פחים כתומים-אדומים). נוכחותו של אתר פציעה מורחב נראתה בבירור ברקמה החתוכה (איור 9H; ראשי חץ כחולים). למעט שני סלים של מעלה אחת, ההבדל שנצפה בין קבוצות ה-MTZ+ היה מובהק סטטיסטית ב-RPE המרכזי (איור 10B; שטח מוצלל בכחול בהיר בין כ-40-140°; ערך p ≤ 0.05), מה שמצביע על פיגמנטציה של RPE פחות מרכזית באופן משמעותי בזחלים שטופלו ב-MTZ+ IWR-1 בהשוואה לבקרת אחים שטופלה ב-MTZ+ DMSO. הפרשנות של הנתונים הגולמיים האלה (איור 9C,D) והחציון (איור 10A) עם השוואה סטטיסטית (איור 10B) באמצעות RpEGEN אומתה לא רק על ידי התבוננות ברקמה שנחתכה (איור 9G,H), אלא גם תמכה בממצאים קודמים מכימות ידני (איור 8)3.

Figure 1
איור 1: rpe65a:nfsB-eGFP ביטוי טרנסגני ב-5 ימים לאחר ההפריה. (א-ג) תמונות שלמות של זחל 5 dpf שטופל ב-PTU מראות ביטוי טרנסגני עמום בבלוטת האצטרובל (A; ראש חץ צהוב) וביטוי טרנסגני בהיר ב-RPE (B,C) בזמן ההקרנה לאיתור אבלציה גנטית. (B) ביטוי טרנסג'ן מותאם באופן גלוי לשני השלישים המרכזיים של ה-RPE, וראשי חץ לבנים מדגישים את הגבול בין RPE היקפי (לא בוגר) למרכזי (בוגר). ירוק = eGFP. קדמי הוא למעלה. סרגלי קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: אימות של אבלציה גנטית מוצלחת של ה-RPE in vivo. תמונות שלמות של (A) שלושה זחלי dpf ללא הבחנה (MTZ-) 7 dpf מראים פיגמנטציה של RPE בכל העין ו-(B) שלושה זחלים עם אבלציה (MTZ+) 2 dpi מראים אזור אבלציה שבו יש היעדר פיגמנט בשני השלישים המרכזיים של ה-RPE (ראשי חץ אדומים). קדמי הוא למעלה. סרגלי קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: אזורי עניין RPE (ROIs) לכימות אוטומטי באמצעות RpEGEN. קריוזקציות רוחביות של (A,B) זחל dpf לא מלוטש (MTZ-) 9 ו-(C,D) זחל בעל 4 dpi אבלציה (MTZ+) עם חבלי RPE מודגשים במג'נטה. (ב,ד) ראשי חץ אדומים מדגישים אזורים שבהם מיקרוווילי אפיקלי פיגמנטי בעלי פיגמנטים נראים לעין נכללו ב-ROI. (ג,ד) ראשי חץ ציאן מצביעים על אזורים לדוגמה של פסולת DAPI+ מקומית באתר פציעה, ששימשה להכללת פסולת תאי RPE בהחזר ההשקעה. (ב',ב',ד',ד',ד'))', זומים דיגיטליים של אזורי ההחזר על ההשקעה הגביים והגחוניים (תיבות מנוקדות שחורות ב-B וב-D) מראים נקודות התחלה מוצעות של ROI (ראשי חץ כחולים) ואת קצוות ההחזר על ההשקעה המחודדים שהם קריטיים לזיהוי נקודות קצה ב-MATLAB. תמונות ברייטפילד מוצגות גם באיור 9E,G. לבן/אפור = גרעינים. הגב למעלה והדיסטלי נשאר. (א-ד) סרגלי קנה מידה = 40 μm. (B',B",D',D") סרגלי קנה מידה = 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: זרימת עבודה של עיבוד RpEGEN. (A) דוגמה לתמונת שדה בהיר של 8 סיביות בכיוון תקין ו- ROI (אדום) שנוצר על ידי FIJI המיובאים ל- MATLAB. הגב למעלה והדיסטלי נשאר. סרגל הצבע מייצג ערכי עוצמת גווני אפור של 8 סיביות כאשר 0 = שחור ו- 255 = לבן. (B) שלד בינארי ראשוני (לבן) של מסיכת ROI (אדום) המציג את נוכחותם של דורבנים שגויים ואת התיחום של נקודות ההתחלה והסיום עבור תיחום מרחק פיקסלים גיאודזי כפי שמוצג ב- (C). סרגל הצבעים ב- (C) מייצג מרחק פיקסלים אוקלידי. (D) Spurs מוסרים באמצעות מסלול פשוט בעלות מינימלית מפיקסל הקצה בחזרה לפיקסל ההתחלה, והתוצאה היא קו מרכז רציף נטול דורבנים (אדום). (E) מדדי קו האמצע הליניארי הקרובים ביותר המבוססים על המרת מרחק בין כל הפיקסלים במסיכת ROI לבין הפיקסלים של קו האמצע (לבן). ערכי אינדקס אלה מאפשרים לכל פיקסל תמונה בתוך מסיכת ההחזר על ההשקעה להיות מוקצה לפיקסל קו האמצע הקרוב ביותר לצורך ניתוח. סרגל הצבעים מייצג את ערכי אינדקס הפיקסלים הליניאריים של קו האמצע. (F) דוגמה למרחק הפיקסל המנורמל לאורך קו האמצע, כאשר 0 (הפיקסל הגבי הכחול, הדיסטלי ביותר) הוא פיקסל ההתחלה ו-1 (הפיקסל הגחוני האדום, הדיסטלי ביותר) הוא פיקסל הקצה. (G) בדומה ל- (F) אך באמצעות המרחק הזוויתי, כאשר 0 מעלות (כחול) הוא פיקסל ההתחלה ו- 180 מעלות (אדום) הוא פיקסל הקצה. (H) דוגמה לערכי עוצמת הפיקסלים החציוניים המחושבים עבור כל פיקסל בקו האמצע. סרגל הצבעים מייצג את ערך עוצמת גווני האפור החציוניים של כל פיקסלי ההחזר על ההשקעה, מה שתורם לכל פיקסל נתון של קו מרכז. איור זה מציג תמונות מתוך מערך נתוני בדיקה ולא זחלים מקבוצות הטיפול 0.06% v/v DMSO או 15 μM IWR-1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: עדויות לאבלציה של RPE ולניוון פוטורצפטורים. (A) קריוזות רוחביות של זחל 6 dpf ללא פגע. (א,א') לאחר חשיפה ל-PTU, ביטוי טרנסג'ן מוגבל לתאי RPE בוגרים, כאשר הביטוי הבהיר ביותר מוגבל לשני השלישים המרכזיים של ה-RPE. ראשי חץ מצביעים על מיקרוווילי אפיקלי. (א") תמונות של ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות (DIC) חושפות את ארכיטקטורת השכבה הגרעינית החיצונית הרגילה (ONL; כלומר, פוטורצפטור). (ב,ב') קריוזות רוחביות של זחל באורך 1 dpi חושפות שיבוש משמעותי במורפולוגיה של תאי eGFP+ וחוסר ארגון בלמינציה של ONL. חצים מצביעים על גרעינים מדולדלים ופיקנוטיים. (ב") תמונות DIC חושפות עוד יותר את ההפרעה המסומנת של ארכיטקטורת ONL. ירוק = eGFP, כחול = גרעינים, צהוב = ONL. הגב למעלה והדיסטלי נשאר. סרגל קנה מידה ב- (A) מייצג 40 מיקרומטר וניתן להחיל אותו על (B). סרגל קנה מידה ב- (A') מייצג 40 מיקרומטר וניתן להחיל אותו על (A",B',B',B"). איור זה וטקסט מקרא דמות שונו מ-Hanovice et al. 2019 (איור 1)3. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: מודל של התחדשות RPE בדגי זברה זחליים. (A) nfsB-eGFP מתבטא ב-RPE בוגר בשני השלישים המרכזיים של העין. (B) יישום של MTZ מוביל לאפופטוזיס (TUNEL, אדום) של RPE ופוטורצפטורים. (C) אבלציה RPE מובילה לניוון של פוטורצפטורים ושל הממברנה של ברוך (קו מקווקו). (D) RPE בלתי מרוסן בפריפריה מתחיל להתרבות ולהתרחב לתוך אתר הפציעה (כחול). (E) כאשר eGFP+ RPE מתחדש מופיע בפריפריה, ניתן לחלק את ה-RPE לארבעה אזורים: RPE היקפי (pRPE), RPE מובחן (dRPE), אזור מעבר (TZ) ואתר פציעה (IS). (E, inset) RPE מובחן מחודש (ירוק) מופיע בפריפריה פרוקסימלית ל-RPE ההיקפי הבלתי מרוסן, ומכיל תאים מתרבים הסמוכים לאזור המעבר. אזור המעבר מורכב מתאי RPE שעדיין מתמיינים (ZPR2, אדום) ותאים מתרבים (כחולים). אתר הפציעה מורכב מתאי התפשטות לא פיגמנטיים שאינם מבטאים סמני התמיינות RPE כלשהם. (F) התחדשות של שכבת RPE פונקציונלית והממברנה של ברוך הושלמה ב-14 dpi. איור זה וטקסט מקרא דמות זה שונו מ-Hanovice et al. 2019 (איור 14)3. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: מקטעי רקמות פגועים שאינם נכללים בניתוח תמונה. (A-C) קריוזקטיקות רוחביות של זחלים ממערכי הנתונים v/v DMSO של 0.06% ו-15 μM IWR-1 שעמדו בקריטריוני ההחרגה. זחל אחד מראה קריעת רקמת RPE גבית (A; ראשי חץ מג'נטה) ושני זחלים אחרים מראים קיפול רקמות שחוסם נקודת ציון אנטומית (OLM הגבי) בתעלת DAPI (B; אליפסות מנוקדות במג'נטה) או עשוי להטות את מדידות עוצמת ה-RPE מערוץ השדה הבהיר (C; אליפסות מנוקדות במג'נטה). לבן/אפור = גרעינים. הגב למעלה והדיסטלי נשאר. סרגלי קנה מידה = 40 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 8
איור 8: עיכוב פרמקולוגי באמצעות IWR-1 פוגע בהתחדשות RPE. קריוזות רוחביות של זחלי אבלציה (MTZ+) 4 dpi מ-(A) 0.06% v/v DMSO ו-(B) 15 μM IWR-1 קבוצות טיפול. תמונות ברייטפילד (A,B) וכימות אחוזי התאוששות/מקטע RPE (C) מראים עיכוב משמעותי בהתאוששות של חד-שכבתי פיגמנטי בזחלים שטופלו ב-IWR-1 (מבחן t לא מזווג של התלמיד, *** p < 0.0001). (B) ראשי חץ שחורים מציינים את הקצה המרכזי ביותר של ה-RPE המתחדש. הגב למעלה והדיסטלי נשאר. סרגל קנה המידה ב- (B) מייצג 40 מיקרומטר וניתן להחיל אותו על (A). דמות זו וטקסט מקרא הדמות שונו מ-Hanovice et al. 2019 (איור 13)3. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 9
איור 9: פלט נתונים גולמיים מכימות אוטומטי של התחדשות RPE ב-RpEGEN. מפות חום (A-D) המציגות התפלגויות של עוצמת פיקסלים בשדה בהיר שהורכבו מכל אזור ה-ROI של RPE, החל מגב (x-צירים; מרחק זוויתי = 0°) ועד לגחון (x-צירים; מרחק זוויתי = 180°), עבור כל הזחלים בכל מערך נתונים: (A) n = 11, DMSO MTZ-; (B) n = 10, IWR-1 MTZ-; (C) n = 11, DMSO MTZ+; (D) n = 12, IWR-1 MTZ+ (משלוש קבוצות אב עצמאיות, N = 3). לדוגמה, (A) מציג נתונים מ- 177,460 פיקסלים על פני 11 ROIs. בצירי y, עוצמת הפיקסלים מוצגת על סמך סולם צבעים של 8 סיביות שבו 0 = שחור ו- 255 = לבן. נתונים גולמיים מוצגים בסלים של 5 מעלות (ציר x) על ידי 5-8 סיביות של ערך עוצמה (y-axis) כאשר אדום = ספירת סלים מקסימלית וכחול כהה = ספירת סל מינימלית. (ה-ה) קריוזות רוחביות של זחלים מייצגים (E,F) ללא הבחנה (MTZ-) 9 dpf ו-(G,H) אבלציה (MTZ+) של זחל 4 dpi מ-0.06% v/v DMSO ו-15 μM IWR-1 קבוצות טיפול. חבלי RPE מודגשים במג'נטה ומצוין קצוות מרחק זוויתי (0° = הגב, 180° = גחון). באופן כללי, נתונים אלה מראים התפלגות של פיקסלים כהים יותר (ערכי עוצמה בין 0 ל-150) ב-(A,B,E,F) של ROIs לא מרוסנים בהשוואה ל-ROIs (C,D,G,H) עם אבלים, ללא קשר לטיפול. נתונים מ-ROIs עם אבלציה מראים (C,G) התפלגות ריכוזית (100° ± 15°) של פיקסלים בהירים יותר (ערכי עוצמה בין 150-250) בקבוצת הטיפול ב-DMSO, אשר (D,H) מתרחבת באופן דורסלי (ל~50°) ומעט גחונית (בכ-5°) בזחלים שטופלו ב-IWR-1. (ז,ח) אזורי אבלציה מרכזיים אלה נעדרים פיגמנט מודגשים על ידי ראשי חץ כחולים. חצים שחורים מציינים את מיקום עצב הראייה. תמונות מזחלים שטופלו ב-DMSO מוצגות גם באיור 3. סרגלי קנה מידה = 40 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 10
איור 10: תוצאות קבוצתיות והשוואה סטטיסטית הנגזרות מכימות אוטומטי של התחדשות RPE ב-RpEGEN. (A) ערכים חציוניים של 5 מעלות ו-95% מעטפות ביטחון הנגזרות מהנתונים הגולמיים של כל קבוצה. העלילה מראה דמיון בין קבוצות ה-MTZ (קווים שחורים ואפורים) לאורך הגב (0°) לגחון (180°) של ה-RPE עם הבדלים בולטים בין ובין קבוצות ה-MTZ+ (קווים כחולים ואדומים) במרכז RPE (אזור מוצלל בכחול בהיר בין כ-40-140°). באופן ספציפי, עוצמת הפיקסלים החציונית נראית בהירה יותר (0 = שחור ו- 255 = לבן) ב- IWR-1 MTZ + 4 dpi בהשוואה לכל קבוצת טיפול אחרת, המתאימה לירידה בפיגמנטציה המרכזית של RPE. (B) השוואה סטטיסטית של הערכים החציוניים הנגזרים מפחים של 1 מעלות לאורך הגב (0°) לגחון (180°) של ה-RPE עבור DMSO MTZ+ 4 dpi ו-IWR-1 MTZ+ 4 dpi מחזקת את התצפית ב-(A). ערכי p חושבו באמצעות סימולציית פרמוטציה עם 20,000 חזרות ומבחן דו-צדדי עבור כל סל של 1 מעלות. תחת השערת האפס שלשתי הקבוצות יש ערכים חציוניים דומים עבור כל סל מקביל של 1 מעלות, ערך p ≤ 0.05 מציין הבדל מובהק סטטיסטית בין החציון הקבוצתי (קו שחור מקווקו = רווח בר-סמך של 95% (CI)). נוכחותם של ערכי p ≤ 0.05 על פני ה-RPE המרכזי (אזור מוצלל בכחול בהיר בין כ-40-140°) מצביעה על פחות פיגמנטציה משמעותית בזחלים שטופלו ב-IWR-1 עם אבלציה (MTZ+) בהשוואה לבקרות אחים שטופלו ב-DMSO עם אבלציה (MTZ+). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

שם משתנה סוג משתנה גודל משתנה תיאור משתנה
ROIname תא {N x 1} שמות של קבצי ההחזר על ההשקעה המעובדים
ROIXY תא {N x 1} קודקודי ROI עבור כל קובץ ROI המעובד
IMGname תא {N x 1} שמות קבצי התמונה של TIF מעובדים
IMG תא {N x 1} נתוני תמונה של 8 סיביות בשדה בהיר עבור כל TIF מעובד
ROIBW תא {N x 1} מסכת ROI לוגית (0 או 1) באותם ממדים כמו תמונות IMG
קליין תא עם טבלאות {N x 1} (n x 16) נתוני קו האמצע עבור תמונות בודדות, כולל x, y, מרחק, זווית, אינדקס, # של נקודות וסטטיסטיקות
CIdx תא {N x 1} נתוני מדדי Centerline המתייחסים לנקודות מסיכת ROI לנקודת קו האמצע הקרובה ביותר לחישוב CLine
CLineBW תא {N x 1} מטריצה לוגית (0 או 1) עם אותם ממדים כמו תמונות IMG המציינות את מיקום קו האמצע (=1)
RAW_data שולחן N x 3 טבלה המשלבת את כל הנתונים הגולמיים עבור כל פיקסל ב- ROIs בכל תמונות IMG השונות
BIN_1_deg_all שולחן N x 9 טבלה המכילה נתונים וסטטיסטיקות משולבים של מעלה אחת באמצעות הנתונים של RAW_data
BIN_5_deg_all שולחן N x 9 טבלה המכילה נתונים וסטטיסטיקות של 5 מעלות באמצעות הנתונים RAW_data
BIN_10_deg_all שולחן N x 9 טבלה המכילה נתונים וסטטיסטיקות של 10 מעלות באמצעות הנתונים RAW_data

טבלה 1: תיאור של משתנים המיוצאים מסקריפט RpEGEN.m לקובץ MAT. ההגדרות הן כדלקמן: ROI(s) = אזורים בעלי עניין; TIF = תבנית קובץ תמונה מתויגת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה להפחתה גנטית של ה-RPE וחקר מנגנונים של התנוונות והתחדשות בדגי זברה בגיל הזחל. פרוטוקול זה בוצע בהצלחה גם בדגי זברה בוגרים3 אך עם אפיון פחות נרחב, ולכן הזחלים הם המוקד כאן. היבטים קריטיים של חלק זה של הפרוטוקול (שלבים 1-4) כוללים: 1) הוספת 1.5x PTU לעוברים לפני הופעת מלנוגנזה, 2) דה-מיון עוברים שטופלו ב-PTU ב-2-3 dpf, 3) סינון קפדני ל-eGFP, ו-4) תזמון של שינויי מים במהלך אבלציה גנטית עם MTZ. PTU מעכב את סינתזת המלנין21,22 ונעשה בו שימוש בפרדיגמת אבלציה זו של RPE כדי להקל על ההקרנה של ביטוי טרנסג'ן rpe65a:nfsB-eGFP ולאפשר אפיון של תהליכים ניווניים ורגנרטיביים של RPE בהתבסס על היעדר וחזרה לאחר מכן, בהתאמה, של רקמה פיגמנטרית3. מכיוון ש-PTU יעכב פיגמנטציה נוספת, אך לא רקמות פיגמנטציה לאחר שהמלנוגנזה החלהב-21, יש להוסיף PTU לפני תחילת הפיגמנטציה, שמתחילה בסביבות 24 כ"ס בדגי זברה25. כאן, ובמחקרים קודמים 4,5, PTU נוסף בערך 6 hpf26 כדי להבטיח עיכוב לפני תחילת סינתזת המלנין. בעוד ש-PTU מאפשר הדמיה של שלבי פרוטוקול מרכזיים, טיפול ב-PTU יכול להשפיע על היבטים מסוימים של ההתפתחות (כפי שנדון בשלב 2.3) ולפגוע בבקיעה של העוברים. התהליך האחרון, אם מתעכב זמן רב מדי, יכול להוביל לליקויים במורפולוגיה ובתנועתיות ולהשפיע על הכדאיות40; לפיכך, טיהור (בקיעה) של עוברים באופן אנזימטי עם פרונאז או שימוש ידני במלקחיים על 2-3 dpf חשוב לשמירה וסטנדרטיזציה של בריאות הזחל לפני אבלציה גנטית. שיקול חשוב נוסף כדי למנוע בעיות עם בריאות הזחלים הישנים יותר וכדאיותם (שאינם קשורים לטיפול ב-PTU), הוא שהזחלים צריכים להתחיל במשטרי האכלה סטנדרטיים אם הם נשארים מחוץ למערכת מתקנים ימית מעבר ל-9 dpf/4 dpi לניסויים41.

כפי שהוסבר, rpe65a מניע ביטוי טרנסג'יני ב-RPE בוגר בשני השלישים המרכזיים של העין האחורית. ביטוי של eGFP בזחלי 5 dpf המטופלים ב-PTU מזוהה בדרך כלל בקלות ואינטנסיבי בעליל (בהיר), כפי שמוצג באיור 1. ניתן להבחין גם בזחלים המבטאים במעומעם eGFP ב-5 dpf בהשוואה לאחים עם ביטוי בהיר. שונות ביחסי עוצמת הביטוי (כלומר, בהיר לעומת עמום) בין דורות עשויה להתקיים גם היא, כאשר לדורות מסוימים יש זחלים בעלי ביטוי עמום יותר מאחרים. בכל מקרה, זחלים עם ביטוי eGFP עמום מייצגים בדרך כלל מיעוט של בעלי החיים בכל מצמד. אמנם לא ידוע אם זחלים בעלי ביטוי עמום מראים פנוטיפים פחות חמורים של פגיעות RPE, אך אבלציות בוצעו בקבוצת eGFP+ הבהירה מכל מצמד ואחים עמומים יחסית הומתו בהקרנה והודרו מהניתוח. באופן דומה, אפיון נרחב של האבלציה של דג הזברה RPE ופנוטיפים של התחדשות בוצע בזחלים הטרוזיגוטיים עבור הטרנסג'ן rpe65a:nfsB-eGFP, על ידי התפשטות rpe65a:nfsB-eGFP heterozygous בוגרים לבוגרים ברטיפ3. עם זאת, לא ידוע אם זחלים הומוזיגוטיים עבור rpe65a:nfsB-eGFP מראים פנוטיפים חמורים יותר של אבלציה. מאמצים אחרים לתקנן את פרוטוקול האבלציה כוללים הוספה של נפחים שווים ומדודים (למשל, 30 מ"ל לכל 10 ס"מ צלחת פטרי) למנות MTZ ו-MTZ+ במהלך תקופת האבלציה הגנטית של 24 שעות. כמו כן, הזחלים במנות הטיפול הפרמקולוגי קיבלו נפחים שווים ומדודים (למשל, 5 מ"ל לכל 6-באר) וחידוש בזמן של תרכובות טריות (למשל, כל 24 שעות). בעת טיפול בכלים עם טיפולים שונים ב-MTZ ו/או בתרכובות פרמקולוגיות, יש לנקוט באמצעים זהירים כדי למנוע שפיכה וזיהום צולב בשוגג במהלך תחבורה ושינויים במים.

ניתן לשנות את פרוטוקול האבלציה RPE של דג הזברה כך שיכלול מניפולציה פרמקולוגית (שלב 5). זה נעשה בעבר כדי לזהות את מסלולי האיתות של תגובה חיסונית5, mTOR4 ו-Wnt3 כמווסתים קריטיים של התחדשות RPE; האחרון הוכח כניתן לחזרה כאן ושימש לאימות RpEGEN. בנוסף להארת מסלולי התחדשות קריטיים של RPE, נעשה שימוש נרחב במניפולציה פרמקולוגית עבור מחקרי התחדשות רשתית של דגי זברה 10,42,43,44,45,46,47. לפני ההשתלבות בפרוטוקול האבלציה של RPE, יש להעריך בקפדנות את החומרים הפרמקולוגיים עבור רעילות, יעילות ומשך הטיפול. זה יכול להיעשות על ידי: ביצוע ניסויי תגובה במינון כדי להעריך רעילות48; הערכת ביטוי של גני מטרה/חלבונים ידועים 4,5; והערכת השלכות תפקודיות ידועות של מניפולציה פרמקולוגית, למשל, דלדול של לויקוציטים עם טיפול PLX3397 48,49,50,51. כאן, DMSO (בקרת רכב) ו- IWR-1 נוספו 24 שעות לפני אבלציה גנטית וזחלים נבדקו מיד לפני טיפול פרמקולוגי ב- 4 dpf. בעוד שזחלי eGFP+ נבדלים מ-eGFP- זחלים ב-4 dpf, עוצמת ה-eGFP יכולה להיראות עמומה למדי, ולכן הזחלים נבדקו מחדש לביטוי eGFP ב-5 dpf (תוצאות מייצגות). סינון עבור eGFP לפני 4 dpf עשוי להיות קשה מכיוון שהביטוי עשוי להיות כה נמוך עד שאינו ניתן לגילוי לעין. לפיכך, ניתן להוסיף טיפול מקדים עם חומרים פרמקולוגיים לפני 4 dpf (כלומר, על 2 dpf)4 לזחלים לא מסוננים שיופרדו ב- 5 dpf כאשר eGFP נראה בבירור. בכל תרחיש שבו יש לתמרן את הזחלים (למשל, במהלך ההקרנה, ההטבעה להדמיה וכו'), יש לשמור על תנאי טיפול תרופתיים, וללא קשר לגיל ההקרנה, יש לאבל את RPE עם MTZ ב-5 dpf.

בנוסף לפרוטוקול האבלציה הגנטית, מתוארות הוראות שלב אחר שלב לעיבוד מקדים של תמונת מיקרוסקופ קונפוקלי וכימות אוטומטי של התחדשות RPE באמצעות RpEGEN (שלבים 6-7). RpEGEN נוצר כדי לתקנן את כימות ההתחדשות של RPE בקרב המשתמשים ולהגביר את החוסן של מערך נתוני הפלט, תוך מזעור הטיות פנימיות שעשויות לבוא עם הכימות הידני המייגע שנעשה בעבר. היבטים קריטיים של חלק זה של הפרוטוקול מבוצעים במהלך יצירת ROI (שלב 6). ראשית, התמונה/העין חייבת להיות בכיוון הגבי למעלה, הדיסטלי השמאלי הדיסטלי (לדוגמה, איור 3A-D, איור 4) מכיוון ש-RpEGEN עבר אופטימיזציה לכיווניות זו. חשוב גם שקצוות הטרמינל הגבי והגחוני של חבלי ה-RPE יתחדדו לקצה מחודד כפי שמוצג באיור 3B',B",D',D',D" (קווי מג'נטה). אם קצוות אלה יהיו בריבוע או מעוגלים במקום זאת, ייתכן שסקריפט RpEGEN יתקשה לקבוע את הפיקסלים של השלד המרכזי של התחלה וסיום, והוא עשוי ליצור דורבנות בקצוות ROI של קצה במקום שורה מרכזית (איור 4B). דורבנות בקצוות ה-ROI של הטרמינל עלולות להוביל לקיצור קו האמצע במהלך ה-de-spurring (איור 4D) ו/או לבעיות במדידות מרחק זוויתי ב-RPE ההיקפי (איור 4G). מערכות שמות זהות עבור קבצי TIF ו- ROI המתאימים לכל זחל בודד הוא גם צעד משמעותי והכרחי עבור זיווג קובץ ה- TIF של 8 סיביות עם ההחזר על ההשקעה הנכון ב- RpEGEN. שמות קבצים לא תואמים של TIF ו- ROI יגרמו לכישלון ביצירת זרימת העבודה של עיבוד RpEGEN המתוארת בסעיף תוצאות מייצגות (איור 4), ובסופו של דבר, ימנעו כימות התחדשות RPE באמצעות קובץ Script זה.

באופן קולקטיבי, פרוטוקול זה מספק הוראות כדי לנטרל בהצלחה את ה-RPE בדגי זברה זחליים, לתפעל מסלולי איתות שעשויים לעניין לפני, במהלך או אחרי פציעת RPE, ולכמת את התחדשות ה-RPE באופן סטנדרטי עם הטיות מובנות מוגבלות. בהקשר של מודלים זמינים in vivo ו - in vitro שבהם ניתן לחקור את הפוטנציאל הרגנרטיבי של ה- RPE, דג הזברה הוא ייחודי ביכולתו להתחדשות RPEפנימית 14. עם זאת, זהו מודל חריף של פגיעה ב-RPE, שאינו כרוני וכך גם המחלות הניווניות של RPE המיועדות להתפתחות טיפולית (למשל, AMD). אמנם זוהי מגבלה של המודל, אך הוא נותר פלטפורמה מצוינת לחקור את המנגנונים של התחדשות RPE, שאינם ידועים במידה רבה, ועשויים להיות ניתנים להתאמה בעתיד לחקר פציעה כרונית ומחלות. הכלים והמתודולוגיה המתוארים כאן הם רב-תכליתיים וניתן ליישם אותם גם במחקרים על תהליכים תאיים המעורבים בתגובה הניוונית ולחקור את גורלן של רקמות סמוכות ל-RPE לאחר אבלציה. כמו כן, ניתן לשנות את סקריפט RpEGEN כך שיתאים לצרכי פלט נתוני המשתמש; לדוגמה, לבצע ניתוחים מרחביים של סמנים שאינם פיגמנט (למשל, בדיקות הכלאה באתרן , ביטוי חלבונים וכו ').

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

L.L.L. הוא הממציא השותף של פטנט אמריקאי #9,458,428, המתאר שיטה מזורזת להפקת אפיתל פיגמנט רשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים; זה לא קשור לתוכן כאן. ל-J.M.G ול-G.B.F אין מה לחשוף.

Acknowledgments

העבודה המתוארת כאן נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (RO1-EY29410 ל- J.M.G, ומענק הליבה של NIH P30-EY08098 למחלקה לרפואת עיניים); המרכז להשתלות וטיפול חיסוני UPMC (ל- L.L.L. ו- J.M.G.); והקתדרה ע"ש א. רונלד סלוויטי לחקר רפואת עיניים (ל-J.M.G.). תמיכה נוספת התקבלה ממלגת ויגנד ברפואת עיניים (ל-L.L.L), מקרן העין והאוזניים של פיטסבורג, ומענק בלתי מוגבל ממחקר למניעת עיוורון, ניו יורק, ניו יורק. המחברים רוצים גם להודות לאמנדה פלאט על הסיוע הטכני ולד"ר יו האמר ולצוות האקוואטיקה על תמיכה מצוינת בטיפול בבעלי חיים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) Millipore Sigma D9542
6-well plates Fisher Scientific 07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 05-539-13 Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing pen Fisher Scientific 50-254-51 Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % Fisher Scientific BP231 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large) Fisher Scientific 3720A
Embryo incubator (mini/tabletop) Labnet I5110A
Fluorescence stereo microscope Zeiss Axio Zoom.V16 Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-4 Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo Millipore Sigma 5.04462 Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder) Fisher Scientific BP117-100 Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ) Millipore Sigma M3761 Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU) Millipore Sigma P7629 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free Fisher Scientific AA433689M Chemical waste, proper disposal required
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712 10 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets) Millipore Sigma P3813 Used to make 10 X PBS stock
Pronase Millipore Sigma PRON-RO
Shaking incubator Benchmark H2010 Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscope Leica S9i Or similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forceps Fine Science Tools 91150-20 Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shaker Scilogex SK-D1807-E
Transfer pipette Millipore Sigma Z135003 3.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Pentair TRS1, TRS2, TRS5 Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ) FIJI (Fiji is Just ImageJ) https://imagej.net/software/fiji/ Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tos MathWorks https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB support MathWorks https://www.mathworks.com/support.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Grierson, I., et al. repair and regeneration of the retinal pigment epithelium. Eye. 8 (2), 255-262 (1994).
  3. Hanovice, N. J., et al. Regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium after widespread genetic ablation. PLoS Genetics. 15 (1), 1007939 (2019).
  4. Lu, F., Leach, L. L., Gross, J. M. mTOR activity is essential for retinal pigment epithelium regeneration in zebrafish. bioRxiv. , (2021).
  5. Leach, L. L., Hanovice, N. J., George, S. M., Gabriel, A. E., Gross, J. M. The immune response is a critical regulator of zebrafish retinal pigment epithelium regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (21), (2021).
  6. Zenno, S., Koike, H., Tanokura, M., Saigo, K. Gene cloning, purification, and characterization of nfsb, a minor oxygen-insensitive nitroreductase from escherichia coli, similar in biochemical properties to frase I, the major flavin reductase in vibrio fischeri. The Journal of Biochemistry. 120 (4), 736-744 (1996).
  7. Hamel, C. P., et al. Molecular cloning and expression of rpe65, a novel retinal pigment epithelium-specific microsomal protein that is post-transcriptionally regulated in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15751-15757 (1993).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
  10. White, D. T., et al. Immunomodulation-accelerated neuronal regeneration following selective rod photoreceptor cell ablation in the zebrafish retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 3719-3728 (2017).
  11. Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590 (2016).
  12. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. The Journal of Comparative Neurology. 518 (6), 800-814 (2010).
  13. Hagerman, G. F., et al. Rapid recovery of visual function associated with blue cone ablation in zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0166932 (2016).
  14. George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).
  15. Chiba, C., et al. Visual cycle protein rpe65 persists in new retinal cells during retinal regeneration of adult newt. The Journal of Comparative Neurology. 495 (4), 391-407 (2006).
  16. Yoshii, C., Ueda, Y., Okamoto, M., Araki, M. Neural retinal regeneration in the anuran amphibian xenopus laevis post-metamorphosis: Transdifferentiation of retinal pigmented epithelium regenerates the neural retina. Developmental Biology. 303 (1), 45-56 (2007).
  17. Xia, H., Krebs, M. P., Kaushal, S., Scott, E. W. Enhanced retinal pigment epithelium regeneration after injury in mrl/mpj mice. Experimental Eye Research. 93 (6), 862-872 (2011).
  18. McGill, T. J., et al. Subretinal transplantation of human central nervous system stem cells stimulates controlled proliferation of endogenous retinal pigment epithelium. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 43 (2019).
  19. Salero, E., et al. Adult human rpe can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
  20. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nature Chemical Biology. 5 (2), 100-107 (2009).
  21. Whittaker, J. R. An analysis of melanogenesis in differentiating pigment cells of ascidian embryos. Developmental Biology. 14 (1), 1-39 (1966).
  22. Westerfield, M. Zebrafish Book, 5th Edition; A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregon, USA. (2007).
  23. Hammer, H. S. Water quality for zebrafish culture in The Zebrafish in Biomedical Research. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. 321-335 (2020).
  24. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  25. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  26. Camp, E., Lardelli, M. Tyrosinase gene expression in zebrafish embryos. Development Genes and Evolution. 211 (3), 150-153 (2001).
  27. Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
  28. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PloS One. 7 (6), 40132 (2012).
  29. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and igf signaling. PLoS One. 6 (8), 22991 (2011).
  30. Leary, S., et al. Avma Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , American veterinary medical association. Schaumburg, Illinois, USA. (2020).
  31. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on cryosections from embryonic and adult zebrafish eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, 4779 (2007).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Muir, D. GitHub - ReadImageJROI. , Available from: https://github.com/DylanMuir/ReadImageJROI (2021).
  34. Morel, P. Gramm: Grammar of graphics plotting in matlab. Journal of Open Source Software. 3 (23), 568 (2018).
  35. Reinhardt, R., et al. Sox2, tlx, gli3, and her9 converge on rx2 to define retinal stem cells in vivo. The EMBO Journal. 34 (11), 1572-1588 (2015).
  36. Schonthaler, H. B., et al. Evidence for rpe65-independent vision in the cone-dominated zebrafish retina. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1940-1949 (2007).
  37. Yazulla, S., Studholme, K. M. Neurochemical anatomy of the zebrafish retina as determined by immunocytochemistry. Journal of Neurocytology. 30 (7), 551-592 (2001).
  38. Larison, K. D., Bremiller, R. Early onset of phenotype and cell patterning in the embryonic zebrafish retina. Development. 109 (3), 567-576 (1990).
  39. Dwass, M. Modified randomization tests for nonparametric hypotheses. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (1), 181-187 (1957).
  40. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: A refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  41. Hernandez, R. E., Galitan, L., Cameron, J., Goodwin, N., Ramakrishnan, L. Delay of initial feeding of zebrafish larvae until 8 days postfertilization has no impact on survival or growth through the juvenile stage. Zebrafish. 15 (5), 515-518 (2018).
  42. Meyers, J. R., et al. Β-catenin/wnt signaling controls progenitor fate in the developing and regenerating zebrafish retina. Neural Development. 7, 30 (2012).
  43. Tappeiner, C., et al. Inhibition of the tgfβ pathway enhances retinal regeneration in adult zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0167073 (2016).
  44. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, o-phospho-l-serine, suppresses müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Experimental Eye Research. 91 (5), 601-612 (2010).
  45. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (38), 15858-15863 (2011).
  46. Lemmens, K., et al. Matrix metalloproteinases as promising regulators of axonal regrowth in the injured adult zebrafish retinotectal system. The Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1472-1493 (2016).
  47. Elsaeidi, F., Bemben, M. A., Zhao, X. F., Goldman, D. Jak/stat signaling stimulates zebrafish optic nerve regeneration and overcomes the inhibitory actions of socs3 and sfpq. The Journal of Neuroscience. 34 (7), 2632-2644 (2014).
  48. Van Dyck, A., et al. Müller glia-myeloid cell crosstalk accelerates optic nerve regeneration in the adult zebrafish. Glia. 69 (6), 1444-1463 (2021).
  49. Conedera, F. M., Pousa, A. M. Q., Mercader, N., Tschopp, M., Enzmann, V. Retinal microglia signaling affects müller cell behavior in the zebrafish following laser injury induction. Glia. 67 (6), 1150-1166 (2019).
  50. Chen, S., Lathrop, K. L., Kuwajima, T., Gross, J. M. Retinal ganglion cell survival after severe optic nerve injury is modulated by crosstalk between jak/stat signaling and innate immune responses in the zebrafish retina. Development. 149 (8), (2022).
  51. de Preux Charles, A. S., Bise, T., Baier, F., Marro, J., Jaźwińska, A. Distinct effects of inflammation on preconditioning and regeneration of the adult zebrafish heart. Open Biology. 6 (7), 160102 (2016).

Tags

ביולוגיה גיליון 181 דגי זברה אפיתל פיגמנט רשתית ניטרורדוקטאז מטרונידזול אבלציה גנטית התחדשות פיגמנטציה תרכובות פרמקולוגיות RpEGEN
ניטרורדוקטאז/אבלציה בתיווך מטרונידזול ופלטפורמת MATLAB (RpEGEN) לחקר התחדשות של אפיתל פיגמנט הרשתית של דג הזברה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross,… More

Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross, J. M. Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (181), e63658, doi:10.3791/63658 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter