Summary
이 프로토콜은 형질전환 제브라피쉬 모델을 사용하여 망막 색소 상피(RPE)를 유전적으로 제거하는 방법론을 기술한다. 약리학적 화합물을 이용한 신호전달 경로 조절을 통합하도록 프로토콜을 적응시키는 것은 광범위하게 상세하다. 색소침착을 기반으로 RPE 재생을 정량화하기 위한 MATLAB 플랫폼이 개발되어 발표되고 논의됩니다.
Abstract
망막 색소 상피 (RPE)는 눈 뒤쪽에 상주하며 인접한 망막 및 혈관 조직의 건강과 무결성을 유지하는 데 필수적인 기능을 수행합니다. 현재, 작은 부상으로 제한되는 포유류 RPE의 제한된 회복 능력은 생체 내 RPE 재생 과정을 이해하는 데 진전을 방해했습니다. 여기에서, 강력한 조직 재생이 가능한 척추동물 모델인 제브라피쉬를 활용한 생체내 RPE 복구의 연구를 용이하게 하기 위한 상세한 방법론이 제공된다. 이 프로토콜은 트랜스제닉 니트로환원효소/메트로니다졸(NTR/MTZ) 매개 손상 패러다임(rpe65a:nfsB-eGFP)을 기술하며, 이는 MTZ로 24시간 치료 후 RPE의 중앙 2분의 2를 절제하고 후속 조직 회복을 초래합니다. 유충 제브라 피쉬의 RPE 절제술에 중점을두고 RPE 재생에 대한 약리학 적 화합물의 효과를 테스트하는 방법도 요약되어 있습니다. 색소침착을 기반으로 RPE 재생의 정량화를 자동화하기 위해 만들어진 MATLAB 스크립트인 RpEGEN의 생성 및 검증도 논의됩니다. 활성 RPE 복구 메카니즘을 넘어, 이 프로토콜은 RPE 변성 및 손상 반응에 대한 연구뿐만 아니라 다른 세포 및 분자 과정 중에서도 인접한 망막 및 혈관 조직에 대한 RPE 손상의 영향으로 확장될 수 있다. 이 제브라피쉬 시스템은 RPE 재생 및 RPE 질병 관련 메커니즘을 유도하는 유전자, 네트워크 및 프로세스를 식별하는 데 중요한 약속을 가지고 있으며,이 지식을 포유류 시스템에 적용하고 궁극적으로 치료 개발에 적용하는 장기적인 목표를 가지고 있습니다.
Introduction
본원에 기재된 방법론은 유충 제브라피쉬를 이용하는 망막 색소 상피(RPE)를 유전적으로 절제하기 위한 프로토콜을 상세히 기술한다. RPE는 눈 뒤쪽으로 확장되어 신경 망막의 층층과 맥락막을 구성하는 혈관 구조 층 사이에 있습니다. 영양 지원, 광독성 광의 흡수 및 시각 주기 단백질의 유지는 RPE가 수행하는 중요한 기능 중 일부에 불과하며, 이는 이러한 인접한 조직의 건강 및 완전성을 유지하는 데 필수적인1. 포유동물 RPE에 대한 손상은 병변이 작을 때 회복가능하다2; 그러나 더 큰 부상이나 진행성 퇴행성 질환으로 인한 손상은 돌이킬 수 없습니다. 인간에서 RPE 퇴행성 질환 (예를 들어, 연령 관련 황반 변성 (AMD) 및 Stargardt 질환)은 영구적 인 시력 상실을 초래하고 사용 가능한 치료 옵션이 거의 없기 때문에 환자의 삶의 질을 떨어 뜨립니다. 포유류 RPE가 자체 복구 할 수있는 제한된 능력은 RPE 재생 프로세스 분야에서 지식 격차를 창출했습니다. 다양한 조직 유형에 걸쳐 제브라피쉬의 강력한 재생 능력을 감안할 때,이 프로토콜은 본질적으로 재생 RPE에 대한 연구를 용이하게하고 그 반응을 유도하는 메커니즘을 밝히기 위해 생체 내 척추 동물 시스템을 구축하기 위해 개발되었습니다. 여기에 요약된 절제 패러다임을 사용하여, 정준 Wnt 신호전달 경로(3), mTOR 경로(4), 및 면역-관련 반응(5 )이 RPE 재생의 중요한 매개체로서 확인되었으며, 아마도 중첩된 기능을 갖는다.
이 유전자 절제 패러다임에서, Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 제브라피쉬는 RPE 인핸서 요소인 rpe65a7의 제어하에 eGFP에 융합된 박테리아 유래 니트로리덕타제(NTR/nfsB) 유전자 6을 발현한다. 절제술은 전구 약물 인 메트로니다졸 (MTZ)을 시스템 수거용 제브라 피쉬에 첨가함으로써 달성됩니다. 니트로리덕타제에 의한 MTZ의 세포내 활성화는 NTR/nfsB 발현 세포 8,9에서 DNA 가교결합 및 아폽토시스를 초래한다. 이 기술은 망막10,11,12,13 및 기타 조직8의 세포를 제거하기 위해 제브라 피쉬에서 널리 사용되었습니다. 함께, 이들 요소들은 유도성 세포 절제 방법론(NTR/MTZ)8,9 및 시각화를 위한 형광 마커(eGFP)의 표적화된 발현(rpe65a)을 가능하게 한다.
RPE14의 재생 잠재력을 연구하는데 사용될 수 있는 다른 흥미로운 생체내 모델도 존재한다. 이들은 광범위하며 양서류에서 RPE-망막으로의 전분화 후 망막 절제술을 포함하며, 여기서 망막 재성장으로 손실된 RPE 세포는15,16으로 대체된다; RPE 회복 후 부상 후 "슈퍼 치유" MRL/MpJ 마우스17; 및 자발적 RPE 및 망막 변성의 래트 모델에서 RPE 증식의 외인성 자극및 18, 그 중에서도. 성체 인간 RPE 줄기 세포 (RPESCs)19와 같은 시험관내 모델도 또한 개발되었다. 이러한 모델은 RPE 재생과 관련된 세포 과정(예를 들어, 증식, 분화 등)을 밝히기 위해 작용하는 모든 유용한 도구이다; 그러나 제브라 피쉬는 절제 후 고유 한 RPE 수리 용량이 독특합니다.
여기의 방법론은 RPE 재생을 유도하는 메커니즘을 이해하는 데 초점을 맞추기 위해 작성되었지만 Tg (rpe65a : nfsB-eGFP) 라인과이 유전 적 절제 프로토콜은 RPE 아폽토시스, RPE 변성 및 인접한 망막 및 혈관 조직에 대한 RPE 손상의 효과와 같은 다른 세포 과정을 연구하는 데 활용 될 수 있습니다. 절제 프로토콜은 또한 약리학적 조작을 포함하도록 변형될 수 있으며, 이는 관심 있는 신호전달 경로를 스크리닝하기 위한 편리한 예비 전략이다. 예를 들어, Wnt Response-1 (IWR-1)20의 억제제를 사용하여 정준 Wnt 경로를 차단하면, RPE 재생3을 손상시키는 것으로 나타났다. 이것은 약리학 적 조작 실험을 통해 사용자를 안내하고 색소 침착의 회복을 기반으로 RPE 재생을 정량화하기 위해 생성 된 MATLAB 스크립트 (RpEGEN)를 검증하기위한 개념 증명 역할을하기 위해 여기에서 반복되었습니다. 트랜스제닉 라인 및 절제 프로토콜과 마찬가지로 RpEGEN 스크립트는 적응이 가능하며 RPE 내의 다른 마커/세포 프로세스를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 방법론은 피츠버그 대학의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)를 준수합니다.
1. 제브라피쉬 배아 채취 전의 제조
- 배아 배양기를 28.5°C로 설정합니다.
- 멜라닌 생성 억제제인 N-페닐티오우레아(PTU)21,22의 25x 원액을 제조하였다. 이 원액은 일반적인 레시피22로부터 스케일링되고, 1x는 부피당 0.003% 중량%(% w/v)와 같다(예를 들어, 100mL의 액체 용매 내로 PTU 분말 0.003g).
- 큰 25x PTU 원액을 만들기 위해, 정제된 탈이온수 1 L(이하, dH2O라고 함)에 PTU 분말 0.75 g을 첨가하고, 교반 막대 및 교반 플레이트를 사용하여 실온(~25°C)에서 충분히 혼합한다. 4°C에서 최대 3개월 동안 보관하여 빛으로부터 보호하십시오.
참고 : PTU를 수용액으로 들어가는 것은 어렵고 하룻밤 사이에 연장 된 교반이 필요할 수 있습니다.
주의: PTU는 위험하므로 섭취, 흡입 및/또는 피부나 눈과의 접촉을 방지하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 본원에 기재된 PTU 분말 및 모든 PTU 액체 유도체는 주 및 기관 규정에 따라 화학 폐기물로서 폐기될 필요가 있을 수 있다. 적절한 PTU 폐기물 처리 방법(있는 경우)을 사용하기 전에 확인하는 것이 좋습니다. - 1.5x PTU 작업 용액(이하 1.5x PTU라고 함)을 만들려면 60mL의 25x PTU 원액을 940mL의 제브라피쉬 하우징 시설 물(이하 시스템 물)에 첨가합니다. 제브라피쉬에 대한 최적의 수질 파라미터는23 기술되었으며 수생 시설에는 표준 수질 모니터링 절차가 마련되어 있어야합니다. 1.5x PTU를 28.5°C에서 1-2주 동안 보관하여 빛으로부터 보호하십시오.
참고: 이 프로토콜은 단계 1.2에서 설명한 PTU 농도, 용매 및 저장 매개 변수를 사용하여 일상적으로 수행됩니다. 예방 조치로, 배아 / 유충은 효능을 검증하고 지속적인 탈색을 확인하기 위해 PTU에있는 동안 1-2 일마다 관찰되어야합니다. 용해 및/또는 저장 조건은 PTU 용해도/효능의 감소가 의심되는 경우 최적화되어야 한다.
- 큰 25x PTU 원액을 만들기 위해, 정제된 탈이온수 1 L(이하, dH2O라고 함)에 PTU 분말 0.75 g을 첨가하고, 교반 막대 및 교반 플레이트를 사용하여 실온(~25°C)에서 충분히 혼합한다. 4°C에서 최대 3개월 동안 보관하여 빛으로부터 보호하십시오.
- 진균 성장 억제제인 메틸렌 블루 분말 0.05g을dH2O. 100mL에 첨가하여 0.05% w/v 메틸렌 블루의 원액을 준비하고, 교반 막대와 교반 플레이트를 사용하여 완전히 혼합한다. 4°C에서 보관하십시오.
- 다이아몬드 팁 스크라이빙 펜을 사용하여 유리 파스퇴르 피펫의 테이퍼 끝을 절단하여 배아 / 유충 조작 (예 : 페트리 접시 사이에 배아 / 애벌레 이동, 형광 스크리닝 중 유충 분리, 고정을 위해 안락사 된 유충을 마이크로 원심 분리기 튜브로 수집 등)을위한 피펫을 준비하십시오. 다이아몬드 펜으로 피펫 둘레를 에칭하고 끝을 부드럽게 당기거나 스냅하여 깨끗하게 휴식을 취하십시오.
참고 : 피펫의 입은 전단없이 chorion 내부에 남아있는 배아를 쉽게 차지할 수있을만큼 부드럽고 넓어야합니다. 전구 드로우 전송 피펫을 대안으로 사용하십시오. 준비된 피펫은 배아 / 유충 손실을 최소화하기 위해 물 변화 (쏟아지는 것이 아닌) 동안 액체를 제거하는 데에도 사용할 수 있습니다. - 1x 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 중의 4% 파라포름알데히드 (PFA) 용액을 제조하였다 (예를 들어, 10 mL의 10x PBS 및 26 mL의dH2O에 4 mL의 16% PFA를 첨가함). 빛으로부터 보호되는 최대 4주 동안 4°C에서 보관하십시오.
주의: 파라포름알데히드는 위험한 화학 물질이므로 화학 흄 후드에서 취급하고 적절하게 폐기해야 합니다. 섭취, 흡입 및 / 또는 피부 나 눈과의 접촉을 방지하기 위해 개인 보호 장비 (PPE)를 착용해야합니다.
2. 유전자 절제 전 제브라피쉬 배아 수집 및 유지 보수 (수정 후 0-5 일)
- 앞서 설명한바와 같이 성인 제브라피쉬를 유지 3,4,5. 배아 수집 전 오후 / 저녁에는 성인 제브라 피쉬를 산란을 위해 번식 탱크로 분리하십시오.
- 다음날 아침 (수정 후 0 일 (dpf)), 배아를 시스템 물에 직경 10cm 페트리 접시로 모으고 불투명 해 보이거나 불규칙한 세포질과 실패한 절단24를 나타내는 모든 생존 불가능하거나 수정되지 않은 난자를 제거합니다.
참고: 정상적인 절단 및 발달 스테이징 사건은25에 기술된 바와 같이 건강한 배아에서 명백할 것이다. 페트리 요리는 프로토콜 전반에 걸쳐 3-네 번째 전체 (직경 10cm 접시의 경우 ~ 30mL)로 보관해야합니다.- 각 페트리 접시에 0.05 % w / v 메틸렌 블루 두 방울을 넣고 부드럽게 섞은 다음 나머지 프로토콜을 위해 28.5 ° C에서 배아를 보관하십시오.
- 수정 후 약 6 시간 (hpf) 4,5,26, 배아 페트리 접시의 시스템 물을 1.5x PTU (1.2.2 단계에서 만든 작업 용액)로 교체하고 메틸렌 블루를 보충하십시오.
참고: PTU는 색소침착이 시작되기 전(즉, 24hpf 이전)25 배아에 첨가되어야 하는데, 이미 색소화된 조직은 PTU21을 첨가할 때 탈색되지 않기 때문이다. 그러나 안구 크기 감소, 안구 및 두개골 안면 결핍 및 일부 신호 전달 경로의 붕괴 (예 : 갑상선 신호 전달)가 PTU 처리 된 제브라 피쉬27,28,29에서보고되었다는 점에 유의해야합니다. PTU의 발달 독성은 PTU 첨가27,29의 농도 및 타이밍에 의존하는 것으로 보인다. PTU 효능을 검증하기 위해 위에서 언급 한 바와 같이 (1.2 단계), PTU 독성의 징후도주의 깊게 모니터링해야하며 의심되는 경우 PTU 첨가의 작동 농도 및 / 또는 시간을 최적화해야합니다. - 2-3 dpf에서, 갓 만든 pronase 용액을 사용하여 배아를 데코리오네이트하십시오.
- 볼텍싱을 통해 1.5x PTU에 프로나제를 2mg/mL의 농도로 녹입니다.
주의: 프로나제는 매우 미세한 분말로 포장되어 있으며 자극제입니다. 흡입 및 / 또는 피부, 눈 등과의 접촉을 피하기위한 조치를 취하십시오. - 부화되지 않은 배아와 부화 된 배아를 분리하고 부화되지 않은 배아 만 pronase로 치료하십시오.
- 1.5x PTU를 2.4.1 단계에서 만든 2mg/mL 프로나제 용액으로 교체하고 부드러운 교반(예: 탁상 회전기/쉐이커 또는 수동 소용돌이)으로 4-5분 동안 부화되지 않은 배아에 둡니다.
- 프로나제 용액을 붓고 즉시 신선한 1.5x PTU로 헹구십시오. 전구 그리기 전달 피펫으로 배아 위에 1.5x PTU를 부드럽게 헹구십시오.
- 두 번째 1.5x PTU 헹굼을 반복하여 모든 chorion 파편을 버린 다음 유지 보수를 위해 1.5x PTU를 보충하십시오.
참고 : 배아는 미세 팁이 달린 포셉을 사용하여 수동으로 데코리온화 할 수도 있습니다. 이 경우 chorion 파편을 제거하고 수동 dechorionation을 한 후에 1.5x PTU를 보충해야합니다.
- 볼텍싱을 통해 1.5x PTU에 프로나제를 2mg/mL의 농도로 녹입니다.
- 배아 / 애벌레 건강을 모니터링하고 1-2 일마다 1.5x PTU를 보충하십시오. 배아 / 유충은 5 dpf에서 절제 될 때까지 1.5x PTU에 보관됩니다.
참고: 2.3단계와 2.4단계의 중요성은 토론 섹션에서 자세히 설명합니다.
3. rpe65a에 대한 제브라 피쉬 유충 스크리닝 : nfsB-eGFP 및 망막 색소 상피의 유전 적 절제 (수정 후 5-6 일)
- 신선한 10 mM 메트로니다졸 (MTZ) 용액을 5 dpf (절제 당일)에 만드십시오. 이 프로세스를 완료하는 데 2시간이 걸립니다.
- MTZ 분말을 PTU가 없는 시스템 물에 첨가하고, 37°C에서 1시간 동안 격렬한 진탕(예를 들어, 분당 250회 회전)에 의해 완전히 혼합한다.
- 10mM MTZ 용액을 탁상 회전기/쉐이커에서 실온에서 추가로 1시간 동안 식히고 유충이 있는 페트리 접시에 첨가하기 전에 완전한 용해를 보장합니다.
참고: eGFP+ 유충의 형광 스크리닝 및 분리(단계 3.2)는 37°C 및 실온 인큐베이션 동안 수행될 수 있다.
주의: MTZ는 위험하므로 섭취, 흡입 및/또는 피부나 눈과의 접촉을 방지하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 본원에 기재된 MTZ 분말 및 모든 액체 유도체는 주 및 기관 규정에 따라 화학 폐기물로서 폐기될 필요가 있을 수 있다. 사용 전에 적절한 MTZ 폐기물 처리 방법(있는 경우)을 확인하는 것이 좋습니다.
- rpe65a:nfsB-eGFP 전이유전자에 대한 제브라피쉬 유충을 선별한다.
- 0.168 g/L의 트리카인(MS-222)과 488nm 여기 레이저/필터가 있는 형광 스테레오 현미경을 사용하여 비형질전환(eGFP-) 유충으로부터 분리된 트랜스제닉 (eGFP+) 유충(그림 1)을 가진 유충을 마취시킨다.
참고 : 트리카인은 1.5x PTU 및 / 또는 약리학 적 화합물 용액에 첨가되어야하며, 유충은 eGFP를 검사하는 동안 치료에 잠겨 있어야합니다. 유충을 스크리닝 기간 동안만 트리카인에서 인큐베이션한다(예를 들어, 50마리의 유충을 함유하는 단일 10cm 페트리 접시에 대해 ≤10분). - 트리카인이없는 신선한 1.5x PTU가있는 페트리 접시에 직접 피펫팅하여 즉시 선별 된 유충을 깨우십시오.
- 스크리닝이 완료되면 eGFP+ 유충을 페트리 접시의 두 그룹으로 더 분리한다: 한 그룹은 MTZ 처리(절제/MTZ+)를 받고 한 그룹은 미제거(MTZ-) 대조군이 될 것이다.
- 0.168 g/L의 트리카인(MS-222)과 488nm 여기 레이저/필터가 있는 형광 스테레오 현미경을 사용하여 비형질전환(eGFP-) 유충으로부터 분리된 트랜스제닉 (eGFP+) 유충(그림 1)을 가진 유충을 마취시킨다.
- 망막 색소 상피를 절제하십시오.
- 절제되지 않은 (MTZ-) 제어 접시에서 1.5x PTU를 제거하고 PTU없이 신선한 시스템 물을 넣으십시오.
- 절제된(MTZ+) 처리 접시에서 1.5x PTU를 제거하고 새로 만든 10mM MTZ 용액을 첨가한다(단계 3.1).
- 정확히 24시간 후에 10mM MTZ 용액(부상 후 1일(dpi)으로 지정됨)을 제거하고 PTU가 없는 담수액을 첨가하십시오. MTZ- 접시에 PTU가없는 신선한 시스템 물을 교체하십시오. 유충은 프로토콜의 나머지 부분 동안 PTU에 다시 노출되지 않습니다.
참고: 동물이 활발히 헤엄치고 있기 때문에 유충 손실 없이 용액 교환 사이에 모든 1.5x PTU(단계 3.3.1 및 3.3.2단계) 또는 10mM MTZ(3.3.3단계)를 피펫으로 붓거나 붓는 것은 어려울 수 있습니다. 이 경우 PTU가 없는 시스템 물의 세척을 추가하여 성공적인 용액 교환을 보장할 수 있습니다.
4. 유전 적 절제 후 유충 유지 (수정 후 6 일 이상)
- 안락사 (5.6 단계)까지 유충을 확인하고 PTU없이 매일 시스템 물을 보충하거나 제브라 피쉬 주거 시설로 돌아갑니다.
- 스테레오 현미경으로 전송된 조명 조명을 사용하여 2dpi(7dpf) 에서 생체 내 절제의 성공 여부와 정도를 모니터링합니다(그림 2).
5. 제브라피쉬 망막 색소 상피 절제 프로토콜에 약리학적 치료 통합
참고: 이전에 수행된바와 같이, 4dpf에서 시작하는 15 μM IWR-1 또는 부피 정합된 디메틸설폭사이드(DMSO) 비히클 제어에 의한 처리는 RpEGEN을 시험하기 위한 예시적인 실험으로서 여기에 요약되어 있다. 농도 및 일정은 약리학적 화합물에 따라 다를 수 있으며, 용량-반응 검증, 치료 기간, 스크리닝 및 약리학적 조작 연구를 위한 실험 설계의 다른 측면에 대한 권장 사항은 토론 섹션에서 다루어집니다. 이미지 분석이 필요한 경우 6단계와 7단계를 수행합니다.
- 단계 2에 기재된 바와 같이 배아를 수집하고 유지한다. 2 dpf에 배아를 데코리오네이트하십시오.
- 단계 3.2에 기재된 바와 같이 4 dpf 상에서 eGFP+ 유충을 스크린한다. 페트리 접시 대신 eGFP + 유충을 약리학 적 치료를 위해 6 웰 당 n ≤ 10 마리의 유충의 밀도로 6 웰 플레이트에 넣으십시오. 절제되지 않을 유충 (MTZ-)과 절제 될 유충 (MTZ +)에 대해 별도의 6 웰 플레이트를 지정하십시오.
참고: eGFP 신호는 4dpf에서 볼 수 있지만 5dpf의 신호 강도보다 더 어둡게 나타납니다. - 4 dpf eGFP+ 유충을 15 μM IWR-1 또는 부피 매칭 DMSO 비히클 대조군으로 10 mM MTZ 용액으로 유전자 절제 전에 정확히 24시간 동안 전처리한다.
참고 : 종종 약리학 적 치료 실험에 거의 화합물이 필요하지 않습니다. 소량의 IWR-1 분말을 칭량하는 것을 피하기 위해이 약리학 적 화합물은 이미 DMSO 용액에서 25mM의 농도로 구입하고 반복적 인 동결 - 해동 사이클을 피하기 위해 도착시 더 작은 부피로 분취됩니다.- 필요한 약리학 적 및 비히클 제어 치료의 부피를 결정하고 그에 따라 원뿔형 튜브에 1.5x PTU를 분취하십시오. 6웰 플레이트의 부피는 5mL/웰인 것이 좋습니다.
- IWR-1 스톡을 15 μM IWR-1의 최종 농도에 대해 1.5x PTU에 첨가한다 (예를 들어, 1.5x PTU의 5 mL 당 25 mM IWR-1의 3 μL). 매칭된 부피의 DMSO 스톡을 1.5x PTU (예를 들어, 3 μL ≥ 1.5x PTU의 5 mL 당 99.7% DMSO)에 첨가한다. 여기서, 이것은 결국 0.06% 부피/부피(% v/v) DMSO의 최종 농도를 산출할 것이다. 볼텍싱으로 잘 섞어서 화합물의 용해를 육안으로 확인하십시오.
주의: DMSO, IWR-1 및 기타 약리학적 화합물 및 용매는 주 및 기관 규정에 따라 화학 폐기물로 처리해야 할 수 있습니다. 이러한 화합물에 대한 위험 수준 확인 및 적절한 폐기물 처리 방법(있는 경우)은 사용 전에 권장됩니다. - 6웰 플레이트의 eGFP+ 유충에서 1.5x PTU를 제거하고 5.3.2단계에서 갓 만든 0.06% v/v DMSO 또는 15μM IWR-1 처리 5mL/웰을 추가합니다.
- 5dpf에서 RPE를 제거합니다. 24시간 전처리 (단계 5.3) 이외에, 유충은 10 mM MTZ로 유전자 절제술의 24 h 동안 및 절제 후 회복 동안, 고정될 때까지(예를 들어, 4-9 dpf로부터) 약리학적 및 비히클 대조 치료에 침지된 채로 남아있을 것이다.
- 유전자 절제를 수행하기 2시간 전에 10mM MTZ 용액을 만든다(단계 3.1).
- 비하블레이션(MTZ-) 및 절제(MTZ+) 6-웰 플레이트 모두에 필요한 약리학적 및 비히클 제어 처리의 부피를 결정하고 PTU(MTZ-) 또는 10mM MTZ 용액(MTZ+)이 없는 담체계 물을 원뿔형 튜브에 적절한 부피로 분취합니다. 이것은 네 가지 처리 조건을 산출할 것이다: 1) 0.06% v/v DMSO, MTZ-; 2) 15 μM IWR-1, MTZ-; 3) 0.06% v/v DMSO, MTZ+; 및 4) 15 μM IWR-1, MTZ+.
- IWR-1 및 DMSO 스톡 솔루션을 5.3.2단계에서 수행한 대로 각 원뿔형 튜브에 추가합니다. 볼텍싱으로 잘 섞어서 화합물의 용해를 육안으로 확인하십시오.
- 지정된 비절제(MTZ-) 및 절제(MTZ+) 6-웰 플레이트에서 1.5x PTU(단계 5.3.2)에서 0.06% v/v DMSO 및 15μM IWR-1 처리를 제거하고 5.4.3단계에서 만들어진 적절한 처리로 보충하십시오.
- 정확히 24시간 후에 10mM MTZ 용액에서 0.06% v/v DMSO 및 15μM IWR-1 처리를 제거하고 PTU가 없는 담수에서 처리하여 보충하십시오. 0.06% v/v DMSO 및 15μM IWR-1 처리를 PTU가 없는 담체계 물에 보충하여 절제되지 않은(MTZ-) 6웰 플레이트에 보충하십시오.
- 4 단계에 설명 된대로 절제 후 유충 유지 보수를 따르고 PTU가없는 시스템 물에 매일 0.06 % v / v DMSO 또는 15 μM IWR-1 처리를 보충하십시오.
- 9 dpf (연령 일치 MTZ 처리 형제의 경우 4dpi)에서 유충을 안락사시켜 동물을 0.3 g / L 트리카인 용액 (치명적인 과다 복용)에 담그고 빠른 냉각과 함께 (예 : 페트리 접시를 얼음 위에 놓으십시오) 적어도 20 분 동안30 분 동안 안락사시킵니다. 유충이 실온에서 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 4 % PFA (1.5 단계)에서 3 시간 동안 만지고 고정되는 것에 반응하지 않는지 확인하십시오.
- Z-스택 이미지 획득을 위한 고정 후 애벌레 조직을 공초점 현미경 상에서 이전에 기술된 바와 같이 5,31 및 여기에 대표적인 결과 섹션에서 처리한다. 단계 6 및 7에서의 분석은 최소한 핵 마커(예를 들어, DAPI) 및 브라이트필드 z-스택 이미지의 획득을 필요로 할 것이다.
6. FIJI의 공초점 현미경 z 스택 이미지 전처리 (ImageJ)
- FIJI32를 사용하여 공초점 현미경 z-스택 이미지를 가져오고 포맷합니다.
- 스택 보기로 설정된 Bio-Formats 가져오기 옵션을 사용하여 현미경 이미지를 엽니다: 하이퍼스택 및 색상 모드: 회색조.
- 이미지 |을 선택하여 가져온 현미경 이미지의 최대 강도 투영을 생성합니다. 스택 | Z 프로젝트. ZProjection 창에서 슬라이스 시작 및 슬라이스 중지를 설정하여 해당 이미지의 모든 슬라이스를 포함합니다. 예를 들어, 총 18개의 슬라이스가 있는 z-스택에 대해 시작 슬라이스: 1 및 슬라이스 중지: 18을 설정합니다. 투영 유형: 최대 강도를 선택하고 확인을 클릭합니다.
- 이미지 |를 선택하여 최대 강도 프로젝션 파일을 8비트 이미지(아직 없는 경우)로 변환 유형 | 8비트.
- 이미지 |를 선택하여 등쪽 측면이 위쪽이고 원위 (즉, 렌즈)가 남도록 이미지의 방향을 바꿉 | 변환 가로로 대칭 이동(마지막 명령의 경우 해당 이미지에 필요한 방향성에 가장 적합한 옵션을 선택). 다중 채널 이미지의 경우 프로세스 스택 에서 예를 클릭하십시오. 모든 채널의 방향을 바꾸는 창입니다.
참고: 이 단계는 중요하지만 이미지가 이미 등쪽 위쪽, 원위 왼쪽 방향에 있는 경우에는 필요하지 않습니다. 처리를 위해 올바른 방향성으로 눈이 있는 이미지에 대해서는 그림 3A-D 및 그림 4를 참조하십시오. - 파일 연결을 선택하여 8비트 최대 강도 프로젝션을 태그가 지정된 TIF(이미지 파일 형식) 파일로 저장 | |한 이름으로 저장 티프....
- FIJI를 사용하여 RPE 관심 영역(ROI)을 생성합니다.
- 6.1단계에서 설명한 대로 생성된 8비트 TIF 이미지를 엽니다. | 분석을 선택하여 ROI 관리자를 시작하십시오 . 도구 | ROI 관리자.
- 이미지 | 사용 DAPI와 브라이트필드 채널 사이를 확대 및 토글하여 RPE의 정점 측면이 외부 제한 멤브레인(OLM)의 팁에 인접한 지점을 식별합니다(그림 3B', B", D', D"; 파란색 화살표 헤드). 이 해부학적 랜드마크를 ROI 시작점으로 사용하십시오.
- DAPI 및 브라이트필드 이미지 채널과 줌 기능을 모두 사용하여 다각형 선택 도구(FIJI 도구 모음)를 사용하여 RPE ROI를 생성합| Zoom)을 사용하여 정점 및 기본 RPE 경계를 식별합니다. ROI의 등쪽 및 복부 끝(즉, ROI가 RPE의 정점에서 기저면으로 전환되는 경우)을 둔화하거나 반올림하는 대신 날카로운 지점으로 가져옵니다(그림 3B', B", D', D"; 마젠타 선).
참고: 뾰족한 ROI 끝을 만드는 것은 RpEGEN을 사용하여 끝점 검색을 최적화하는 데 중요한 단계이며 토론 섹션에서 설명합니다. - ROI 관리자에서 추가를 클릭하여 ROI 를 추가합니다 . 필요에 따라 ROI를 조정하고 ROI 관리자에서 업데이트를 클릭하십시오.
- 더보기를 선택하여 ROI 파일을 저장합 >> | 구해내다... ROI 관리자 내에서. 일치하는 ROI 및 TIF 이미지 파일(예: [파일 이름].tif 및 [파일 이름].roi)에 대해 동일한 이름을 사용합니다.
- 각 조건에 대한 8비트 TIF 및 ROI 파일을 단일 폴더로 결합합니다. 예를 들어, 폴더DMSO_9dpf는 9dpf 비절제(MTZ-) 0.06% v/v DMSO 처리 유충 그룹에 대해 일치하는 모든 TIF 및 ROI 파일을 포함합니다.
7. RpEGEN 스크립트를 사용한 RPE 재생성의 정량화 및 시각화
- RpEGEN 스크립트를 설치하고 준비합니다.
- 코드 https://github.com/burchfisher/RpEGEN 을 클릭하여 GitHub 리포지토리(|)에서 최신 RpEGEN 스크립트를 다운로드합니다 . ZIP을 다운로드하십시오.
- 폴더의 압축을 풀고 원하는 작업 공간 위치(예: 데스크톱)에 배치합니다.
- MATLAB을 엽니다.
- 현재 폴더 창에서 RpEGEN 폴더 로 이동합니다(일반적으로 왼쪽).
- RpEGEN 폴더를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 경로에 추가 | 선택한 폴더 및 하위 폴더. 이렇게 하면 폴더가 MATLAB 경로에 추가되므로 폴더의 스크립트를 자동으로 찾아 실행할 수 있습니다.
- 현재 폴더 창에서 RpEGEN 폴더를 두 번 클릭하여 모든 하위 폴더와 M 파일을 표시합니다.
- RpEGEN.m 파일을 두 번 클릭하여 편집기 창에서 엽니다.
- RpEGEN.m 파일의 사용자 정의 변수 섹션 아래에 ROI 파일(.roi), 이미지 파일(.tif)이 포함된 폴더의 디렉토리 위치 및 출력 파일을 저장해야 하는 위치를 입력합니다. 내보낼 .mat 파일의 그룹 이름(예: DMSO_9dpf, DMSO_4dpi 등)과 TIF 이미지 스택에서 brightfield 채널의 위치(예: brightfield가 이미지 스택의 세 번째 채널인 경우 3)를 입력합니다. 이미지 파일에 brightfield 이미지만 포함된 경우 이 값은 1과 같아야 합니다.
- RpEGEN.m 스크립트를 실행하고 결과의 유효성을 검사합니다.
참고: RpEGEN을 실행하려면 이미지 처리 도구 상자, 곡선 피팅 도구 상자, 통계 및 기계 학습 도구 상자를 사용자 MATLAB 라이선스에서 활성화해야 합니다. 또한, 자유롭게 이용가능한 ReadImageJROI 툴박스(33 )는 FIJI ROI들을 MATLAB으로 임포트하기 위해 요구된다; 그러나 활성화가 필요하지 않은 다른 함수 M 파일과 함께 RpEGEN 폴더에 제공됩니다.- MATLAB의 맨 위에 있는 편집기 메뉴에서 실행 단추를 클릭하여 스크립트를 실행합니다.
참고: 일단 시작되면 명령 창은 스크립트의 진행률을 나타내는 자세한 출력을 제공합니다. 추출 된 데이터가 포함 된 MAT 파일을 저장하면 세 개의 패널 그림이 나타나고 각 이미지 실행의 출력 디렉토리에 PDF로 저장됩니다. 이들은 모든 것이 제대로 실행되었는지 확인하기 위한 품질 관리(QC) 수치이며, 여기에는 1) ROI에 의해 오버레이된 브라이트필드 이미지(그림 4A)가 포함됩니다. 2) 중심선 및 관련 각도 거리 (도)가있는 ROI (그림 4G); 3) 중심선 중앙값 강도 값(0-255, 8비트 색상 척도)을 사용한 ROI(그림 4H). 다음 단계로 진행하기 전에 QC PDF가 출력 폴더에 저장되고 마지막 그림이 사라질 때까지 기다리십시오. - 모든 PDF 뷰어의 출력 폴더로 내보낸 개별 PDF를 열고 모든 ROI가 밝은 필드 이미지와 일치하는지, 중심선 값이 ROI 중심의 합리적인 근사치인지, 중간 강도 값이 데이터로 적절하게 채워져 있는지 확인합니다(즉, 전체 중심선에서 모두 동일한 값은 아님).
참고: RpEGEN.m에 의해 MAT 파일에 저장된 각 변수에 대한 자세한 설명과 구조는 표 1에서 찾을 수 있습니다.
- MATLAB의 맨 위에 있는 편집기 메뉴에서 실행 단추를 클릭하여 스크립트를 실행합니다.
- RpEGEN_PermPlot.m 스크립트를 실행합니다.
참고: RpEGEN_PermPlot.m 스크립트는 RpEGEN.m의 출력을 사용하여 두 그룹의 중앙값에 대한 순열 시뮬레이션을 사용하여 통계적 비교를 실행하며, 또한 RpEGEN 폴더에도 포함된 자유롭게 사용 가능한 GRAMM 도구 상자(34)를 사용하여 이 백서의 플롯을 재생하기 위한 코드를 제공합니다.- RpEGEN_PermPlot.m 파일을 두 번 클릭하여 새 편집기 탭에서 엽니다.
- RpEGEN_PermPlot.m 파일의 섹션 1 - 사용자 정의 변수 아래에 실행 중인 MAT 파일이 포함된 출력 폴더의 디렉토리 위치를 입력하고 로드할 각 MAT 파일 이름(예: DMSO_4dpi.mat, IWR1_4dpi.mat)을 입력합니다.
- MATLAB의 맨 위에 있는 편집기 메뉴에서 섹션 실행 단추를 클릭하여 스크립트의 이 섹션을 실행합니다.
- 섹션 2에서 data_A과 data_B 변수에 통계적 비교를 위해 두 그룹의 이름을 입력합니다(이들은 순열 시뮬레이션을 사용하여 중앙값이 파생될 그룹입니다). bin_sz 변수에 데이터 세트의 중간 강도 값을 통합할 각도 수를 입력합니다(기본값은 1도 빈임).
참고: reps 변수는 확률 분포를 작성하는 데 사용할 순열 수를 나타내며 임의의 숫자로 설정할 수 있습니다(기본값은 20,000임). 일반적으로 반복 횟수가 많을수록 통계적으로 더 강력하지만 처리 시간이 늘어납니다. - MATLAB의 맨 위에 있는 편집기 메뉴에서 섹션 실행 단추를 클릭하여 스크립트의 이 섹션을 실행합니다. 이 섹션은 지정된 반복 횟수에 따라 완료하는 데 다소 시간이 걸릴 수 있지만 명령 창에 지속적인 상태 업데이트를 제공합니다.
- 히트 맵 그림 및 그룹 결과 및 P-값 섹션을 실행 섹션 단추를 사용하여 독립적으로 실행합니다. "여기에 데이터 입력"이 주석이 달린 모든 섹션의 데이터 변수를 편집하십시오. 이 그림의 PDF는 각각에 대해 자동으로 저장되며 모든 벡터 소프트웨어 사후 처리에서 쉽게 수정할 수 있습니다.
참고: RpEGEN_PermPlot.m 파일에서 생성된 플롯은 임시 파일이며 각 사용자의 특정 데이터 및 시각화 요구 사항에 따라 수정해야 할 수 있습니다. 그러나 수치는 MATLAB 및 GRAMM 웹 사이트를 모두 사용하여 쉽게 개별화 할 수있는 견고한 기반을 제공합니다.
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Representative Results
정준 Wnt 신호전달 경로를 억제하는 것은 프로토콜3에 기재된 유전자 절제 패러다임(rpe65a:nfsB-eGFP) 및 약리학적 조작 방법론(IWR-1)을 사용하여 제브라피쉬 RPE 재생을 유의하게 손상시키는 것으로 알려져 있다. 이 실험은 색소침착에 기초한 제브라피쉬 RPE 재생을 정량화하는 자동화된 방법을 검증하기 위해 여기에서 반복되었다. 아래에 요약 된 결과는 수정 일 (0dpf)부터 RpEGEN을 사용한 RPE 재생의 정량화에 이르기까지 프로토콜의 모든 단계를 포함했습니다.
유충 제브라 피쉬에서 RPE 절제 프로토콜 구현 (약리학 적 조작 포함)
3개의 분리된 모군(N=3)으로부터 채취한 배아는 약 6 hpf의 1.5x PTU로 처리를 시작하였고, RPE에서의 색소침착의 부재 및 표면 멜라노사이트는 1 dpf에서 육안으로 확인되었다. 배아는 2 mg/mL의 프로나제를 사용하여 2 dpf 상에서 효소적으로 데코리온화되었다(단계 2.4). 4 dpf 상에서, 유충을 트리카인 (MS-222)을 사용하여 마취시키고, 형광 스테레오 현미경을 사용하여 eGFP를 스크리닝하였다 (단계 3.2 및 5.2). eGFP+ 유충을 6-웰 플레이트 (n=10 유충/웰)로 이동시키고, 0.06% v/v DMSO (비히클 대조군) 또는 15 μM IWR-1 (단계 5.3) 중 하나로 처리하였다. 여기에보고 된 유충 밀도는 처음에는 1 유충 /cm2 성장 면적의 근사치를 기반으로했으며 시간이 지남에 따라 신중한 건강 모니터링 (예 : 수영 방광 발달)을 통해 검증되었습니다. eGFP의 강도는 4dpf에서 희미하게 나타났고, 그래서 유충은 밝은 eGFP 발현을 확인하기 위해 5 dpf에서 재선별되었다(도 1). RPE65 (제브라피쉬의 rpe65a)는 성숙한 RPE7 의 마커이며, 텔레오스트 어류에서, 망막 및 RPE 세포는 수정체(35)에 인접한 망막의 원위 끝에서 줄기 세포 틈새인 섬모 한계 영역(CMZ)으로부터 지속적으로 생성된다. 따라서, rpe65a:nfsB-eGFP 트랜스제닉 라인에서, 미성숙 RPE가 주변에 더 많이 존재하고 eGFP-(전체 RPE 조직의 대략 3분의 1)가 나타나는 반면, 성숙한 RPE의 중심 2-3은 eGFP를 발현한다(도 1B; 백색 화살촉). 전이유전자는 또한 송과선에서 가시적이었고(도 1A; 황색 화살촉), 이는 rpe65a가 제브라피쉬36에서 송과체 발현을 나타내는 것으로 예상되었다. 비교적 희미하거나 eGFP- 유충을 6-웰 플레이트로부터 뽑아내고 5 dpf 상에서 안락사시켰다. DMSO 또는 IWR-1로 정확히 24시간 후처리에서, 5 dpf 유충을 RPE를 절제하기 위해 10 mM MTZ로 처리하였다(단계 3.1, 3.3, 및 5.4). MTZ는 RPE 재생이 일어날 수 있도록 정확히 24시간(즉, 6dpf/1dpi에서) 후에 세척되었다.
유충은 6 dpf / 1 dpi에서 9 dpf / 4 dpi의 안락사 시간까지 투과 된 광 조명을 사용하여 스테레오 현미경으로 매일 관찰되었습니다. 유전자 절제의 성공은 MTZ+ 유충에서 눈의 중앙 2분의 2에 색소의 부재에 의해 2 dpi에서 생체내에서 확인되었고(도 2B; 적색 화살촉) 7 dpf MTZ-대조군 형제자매들(도 2A)에 비해 (단계 4.2). 예상한 바와 같이, 2dpi에서 색소가 결여된 영역은 5dpf에서 관찰된 rpe65a:nfsB-eGFP 전이유전자 발현의 영역과 유사하게 나타났다(도 1B). 평가는 PTU의 제거 후 재색소침착을 겪는 RPE로서 2 dpi에서 수행되었고, 생체내에서 관찰되는 시간에 따라, 절제된 중심 RPE와 절약된(unablated) 주변 RPE 사이의 현저한 차이는 후자가 완전히 재착색되지 않은 경우 식별하기 어려울 수 있다. 거시적 모호성에 대한 가능성에도 불구하고, 1dpi에서의 RPE 절제는 이전에 절편된 조직에서 쉽게 명백해지는 것으로 나타났으며, 세포 사멸(pyknotic nuclei)의 증거와 함께 중앙 RPE 및 외부 핵층(ONL; 즉, 광수용체) 조직 완전성의 손실을 드러냈다(도 5)3. 조직 손실에 대항하여, 강력한 증식은 rpe65a:nfsB-eGFP 제브라피쉬 모델3에서 조직 재생 동안 핵심 동인인 것으로 결정되었다. RPE 절제가 인접한 조직(예를 들어, 광수용체 및 브루크막)의 퇴행을 초래하는 초기 세포자멸사 반응 둘 다; 도 6A-C) 및 손상 부위 내로 안쪽으로 이동하는 이종 재생 "구역"을 산출하는 후속되는 말초-중추 증식 반응 (도 6D-F), 광범위하게 특성화되고 이전에 논의되었다 3.
RpEGEN을 사용한 RPE 색소침착에 기반한 자동화된 정량화를 위한 조직 준비, 공초점 이미지 획득 및 이미지 전처리
9 dpf/4 dpi에서, DMSO- 및 IWR-1-처리된 유충을 트리카인 과다 투여에 의해 안락사시키고, 실온에서 3시간 동안 4% PFA에 고정시켰다(단계 5.6). 각각의 독립적인 부모 그룹으로부터의 네 마리의 유충을 후속 조직 처리를 위해 무작위로 선택하였다 (N=3; n=12마리의 유충 처리당). Cryoprotection, 냉동 절제 (12 μm 두께에서), DAPI를 사용한 핵 역염색, 및 커버슬립 장착은 단계 5.7 5,31에서 참조된 바와 같이 수행되었다. 각 유충으로부터 가시적인 시신경을 갖는 중앙 단면을 40x 오일 침지 대물(수치 조리개 = 1.30)을 사용하여 공초점 레이저 스캐닝 현미경 상에서 이미지화하여 1 μm z-단계 간격으로 512 x 512 픽셀 z-스택 이미지를 획득하였다. 각 이미지에는 DAPI에 대한 채널 1 = 405nm 여기, eGFP에 대한 채널 2 = 488nm 여기, 채널 3 = 밝은 필드의 투과 광의 세 가지 채널의 데이터가 포함되어 있습니다. 밝은 필드 이미지에서 픽셀 강도를 정량화함에 따라 전송 된 조명 램프 전압 설정이 일정하게 유지되고 통계 비교를 위해 수집 된 모든 데이터가 같은 날에 이미징되었습니다.
공초점 현미경 z-스택 이미지는 FIJI를 사용하여 단계 6에 설명된 바와 같이 자동화된 정량화를 위해 전처리되었다. 이미지가 ROI 생성을 어렵게 만드는 방식으로 손상된 경우 (예 : 찢어짐(그림 7A; 자홍색 화살촉) 또는 랜드마크 장애물(그림 7B; 자홍색 타원형) 또는 왜곡된 ROI 강도 측정(예를 들어, 폴딩(그림 7C; 자홍색 타원형)). 이러한 배제 기준을 가진 몇몇 유충을 생략했음에도 불구하고, 본 명세서의 모든 데이터세트는 다음과 같은 수의 생물학적 반복실험(larvae)을 갖는 N=3을 나타낸다: n=11, DMSO MTZ-; n = 10, IWR-1 MTZ-; n = 11, DMSO MTZ+; n = 12, IWR-1 MTZ+. DAPI 채널을 사용하여, RPE ROI는 먼저 RPE(망막-마주침)의 등쪽 정점 측이 OLM의 등쪽 팁에 직접 인접하는 지점을 식별함으로써 시작되었다(그림 3B',D'; 파란색 화살촉)(단계 6.2.2). 원위 RPE 확장은 섹션마다 다를 수 있으므로 OLM은 RPE ROI 끝점을 표준화하고 MATLAB에서 각도 거리 측정을 정규화하기 위한 해부학적 랜드마크로 사용되었습니다(여기서 0° = 등쪽 ROI 끝점 및 180° = 복부 ROI 끝점). 약리학 적 조작 또는 돌연변이 배경에서 RPE 절제를 수행 할 때 전처리 및 정량화 전에 해부학 적 랜드 마크를 확인하고 검증해야합니다. 여기서, OLM은 정량화 된 모든 유충에서 명백했으며 찢어짐에 의해 손상되지 않았습니다 (에서와 같이). 그림 7B) 또는 DMSO 또는 IWR-1로 치료. 등쪽 시작점을 확인한 후, 배쪽 OLM의 팁에 인접한 지점에 도달할 때까지 RPE(등쪽 대 복부)의 정점 쪽에 이어 ROI가 생성되었다(그림 3B",D"; 파란색 화살촉). 이어서, 단계 6.2.3에서 논의된 바와 같이 RPE의 정점과 기저(맥락막-직면) 측면 사이에 복부 ROI 종점이 생성되었다(그림 3B",D"; 자홍색 선). ROI는 RPE (복부에서 등쪽)의 기저면에 이어 등쪽 OLM의 시작점에 인접한 기저면에 도달 할 때까지 계속되었습니다. ROI는 뾰족한 등쪽 끝 (그림 3B',D'; 자홍색 선)을 심실로 행한 바와 같이. 유전적 절제는 재생이 진행됨에 따라 회복되는 중심 eGFP 발현의 손실을 초래하는 것으로 나타났다 (요약된 그림 6)3; 따라서, 재생 정도와 관심 시점에서의 eGFP의 강도에 따라, eGFP 채널은 MTZ에서의 ROI 생성에만 유용할 수 있다.- 그룹. 따라서, 공초점 획득에는 eGFP 채널 이미지도 포함되었지만, ROI 생성은 단계 6.2.3에서 언급된 바와 같이 DAPI 및 브라이트필드 채널을 사용하여 완료되었다. RPE ROI 생성은 DMSO 및 IWR-1 처리 MTZ에서 간단했습니다.- 애벌레 그룹 및 눈에 띄게 착색 된 정점 미세 융모가있는 영역을 포괄합니다 (그림 3B; 빨간 화살촉)과 함께 눈에 띄게 색소가 침착 된 세포체. MTZ에도 동일한 파라미터가 적용되었습니다.+ 애벌레 그룹 (그림 3D; 빨간 화살촉); 그러나, 손상 부위 내의 잔류 손상된 조직으로 인해, 정점 미세융모 및 색소침착 경계는 일부 경우에 브라이트필드 채널에서만 설명하기가 어려웠다. 이 영역에서, DAPI 채널은 또한 ROI (그림 3C,D; 손상 부위-국소화된 세포 파편들의 예는 시안 화살촉으로 표시된다). 미성숙/성숙 RPE의 마커를 사용한 면역염색 (예를 들어, ZPR2; 그림 6D,E)37 및/또는 광수용체(예를 들어, ZPR1)37,38 또한 절제 된 유충에서 RPE ROI를 윤곽을 그리는 것을 용이하게하기 위해 사용될 수 있습니다.
이전에, 4 dpf에서 4 dpi로 IWR-1로 처리된 절제된 유충은 DMSO 처리된 형제 대조군에 비해 RPE 재생의 유의한 장애를 보였다(도 8C)3. 이것은 중앙 안료 회수율의 퍼센트로 보고되었으며, 이는 재생 경계를 지정하기 위해 각도 거리의 모델 및 수동 측정에 대한 상당한 사전 경험이 필요했습니다 (그림 8B; 검은 화살촉). RpEGEN은 RPE 재생의 정량화를 자동화하고 내재적 편향을 줄이기 위해 만들어졌습니다. 뿐만 아니라 RpEGEN은 매우 강력한 데이터 세트를 생성할 수 있었습니다. 예를 들어, n=10개의 DMSO 처리된 MTZ+ 유충의 수동 정량화로부터 10개의 데이터 포인트가 이전에 생성되었고(그림 8C; 섹션 측정당 색소 회수율 %)3, RpEGEN을 사용하여 n=11개의 DMSO 처리된 MTZ+ 유충/ROI로부터 174,801개의 데이터 포인트가 생성되었다(도 9C; 픽셀 강도 측정).
RpEGEN은 FIJI를 사용하여 생성된 원래 ROI에서 골격화된 중심선(1픽셀 폭)을 도출하여 RPE 전체에 걸쳐 색소침착의 지역적 변화를 점진적으로 평가하기 위해 개발되었습니다(그림 4A,B). 분석을 위해 ROI 내의 모든 픽셀을 통합하기 위해(즉, 중심선 픽셀뿐만 아니라), ROI 마스크의 각 픽셀에 대해 가장 가까운 중심선 인덱스의 맵을 생성하기 위해 중심선으로부터 각 픽셀에 대해 유클리드 거리 변환을 수행하였다. 이 인덱스 맵을 통해 중심선 외부의 각 픽셀을 단일 중심선 픽셀로 간주하여 각 유충에 대한 전체 RPE에 대한 포괄적인 데이터 세트를 만들 수 있었습니다(그림 4E). RPE의 등쪽 대 복부 길이는 정규화 된 픽셀 거리 (그림 4F; 0-1 임의 단위)와는 달리 각도 거리 (그림 4G; 0-180 °)로 표시되었는데, 이는 RPE 재생 3,4,5의 이전 측정과 각도 거리가 형태 학적 차이에 따라 변하지 않는다는 사실에 기초하여보다 직관적이었습니다. 5도 빈에서 파생된 중간 강도는 대규모 추세를 강조하고 1도 비닝된 데이터에서 관찰된 고주파 변동성을 최소화하기 위해 선택된 메트릭이었습니다(표 1, 그림 10A). 순열 시뮬레이션은 두 처리 그룹(여기서, DMSO MTZ+ 및 IWR-1 MTZ+(둘 다 4 dpi), 도 10B)의 중앙값이 유사한지 여부를 확인하기 위해 귀무 가설을 시험하기 위해 선택되었다(39). 이러한 리샘플링 기법은 데이터의 분포에 대한 엄격한 가정이 결여되어 있으며, 강력한 p-값 추정치를 생성하기 위해 다양한 테스트 통계(예를 들어, 평균, 중앙값 등)에 사용될 수 있다. 다수의 이러한 파라미터들(예를 들어, 원시 및 중앙값 데이터의 빈 크기, 순열 시뮬레이션 반복 등)은 사용자의 요구에 맞게 적응되고 수정될 수 있다. 후자의 경우 통계적으로 강력한 비교를 생성하기 위해 20,000 번의 반복이 선택되었지만 너무 적은 반복으로 잘못된 p- 값 추정치가 생성 될 수 있으므로 계산 효율성과 통계적 견고성의 균형을 맞추기 위해주의를 기울여야합니다. 해석을 시작하기 전에 p-값 분포와 값이 상대적으로 안정적인지 확인하기 위해 여러 반복 값(10,000, 20,000 등)을 실행하는 것이 좋습니다. 순열 반복을 늘리면 통계적 검정력이 증가하지만(실행하는 데 시간이 더 오래 걸리기도 함) 일부 데이터 세트에 도움이 될 수 있습니다.
공초점 이미지 데이터 세트는 단계 7에 설명된 대로 RpEGEN을 사용하여 정량화되었습니다. 주석이 달린 RpEGEN 및 지원 스크립트는 GitHub(https://github.com/burchfisher/RpEGEN)에서 8비트 TIF 및 관심 있는 사용자가 테스트할 수 있는 해당 ROI 파일과 함께 사용할 수 있습니다. MTZ-애벌레 ROI의 원시 데이터를 표시하는 히트맵은 0.06% v/v DMSO 또는 15μM IWR-1로 처리했는지에 관계없이 RPE의 등쪽(0°)에서 복부(180°) 길이까지 걸쳐 더 어두운 픽셀 강도(0 = 검정 및 255 = 흰색, 8비트 색상 스케일)의 전반적인 분포를 보여주었습니다(그림 9A, B). 중앙값 픽셀 강도를 플로팅하면 모든 그룹들 사이에서 시각화가 용이해졌고, RPE에 걸쳐 MTZ-그룹들 사이의 유사성을 보여주었다(그림 10A; 흑백 및 회색 선). 이들 데이터는 무손상 착색된 RPE 단일층(도 9E, F)의 존재를 지지하고, 절제되지 않은 RPE에 대한 기준선 중앙값 픽셀 강도 값(즉, 150 미만)을 제공하였다(도 10A; 흑백 및 회색 선). 비교적으로, MTZ+ 애벌레 ROI의 원시 (그림 9C, D) 및 중앙값 (그림 10A; 파란색 및 빨간색 선) 데이터는 치료 조건에 관계없이 중앙 RPE에서 더 가벼운 픽셀 강도의 전반적인 분포를 보여주었습니다. Ablated DMSO 처리 유충은 약 100°(± 15°)에서 광 픽셀의 중앙 집중화된 분포를 보였다(도 9C; 주황색-적색 빈). 이것은 시신경 안팎의 중앙 RPE 손상 부위에서 색소 침착이 보이지 않는 것과 일치했습니다 (그림 9G; 파란색 화살촉). Ablated IWR-1 처리 유충은 또한 MTZ+ DMSO 처리 형제 대조군과 비교했을 때 등쪽(약 50°까지) 및 심실로(약 5°까지) 확장된 광 픽셀의 중앙 집중화된 분포를 보였다(그림 9D; 주황색-적색 빈). 확장된 손상 부위의 존재는 단면화된 조직에서 명확하게 볼 수 있었다(도 9H; 파란색 화살촉). 두 개의 1도 빈을 제외하고, MTZ+ 그룹 간의 관찰된 차이는 중앙 RPE에서 통계적으로 유의하였다(도 10B; ~40-140°의 연한 청색 음영 영역; p-값≤ 0.05)은 MTZ+ DMSO 처리된 형제 대조군과 비교했을 때 MTZ+ IWR-1 처리된 유충에서 유의하게 더 적은 중앙 RPE 색소침착을 나타낸다. RpEGEN을 사용한 통계적 비교(그림 10B)를 통한 이러한 원시 데이터(그림 9C,D) 및 중앙값(그림 10A) 데이터의 해석은 단면화된 조직(그림 9G,H)을 관찰함으로써 검증되었을 뿐만 아니라 수동 정량화(그림 8)3의 이전 결과도 뒷받침했습니다.
도 1: rpe65a:nfsB-eGFP 시비 후 5일째에 전이유전자 발현. (A-C) 유전자 절제에 대한 스크리닝 시에 송과선(A; 황색 화살촉)에서의 희미한 전이유전자 발현과 RPE(B,C)에서의 밝은 전이유전자 발현을 보여주는 PTU 처리된 5 dpf 유충의 전체마운트 이미지. (B) 전이유전자 발현은 RPE의 중심 삼분의 일에 눈에 띄게 국소화되고, 백색 화살촉은 말초(미성숙)와 중심(성숙한) RPE 사이의 경계를 강조한다. 녹색 = eGFP. 앞쪽이 위로 올라왔다. 배율 막대 = 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 생체내에서 RPE의 성공적인 유전자 절제의 검증. (A) 눈 전체에 걸쳐 RPE 색소침착을 보여주는 세 개의 절제되지 않은(MTZ-) 7dpf 유충과 (B) RPE(적색 화살촉)의 중앙 2분의 2에 색소가 없는 절제 구역을 보여주는 세 개의 절제된(MTZ+) 2dpi 유충의 전체마운트 이미지. 앞쪽이 위로 올라왔다. 배율 막대 = 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: RpEGEN을 사용한 자동화된 정량화를 위한 관심 영역(ROI) (A,B) 절제되지 않은 (MTZ-) 9dpf 유충과 (C,D) 자홍색에서 RPE ROI가 강조 표시된 절제 된 (MTZ +) 4 dpi 유충의 횡단 냉동 절제술. (B,D) 빨간색 화살촉은 눈에 띄게 착색 된 정점 미세 융모가 ROI에 포함 된 영역을 강조합니다. (C,D) 시안 화살촉은 부상 부위의 예를 들어 국소화된 DAPI+ 파편을 가리키며, 이는 ROI에 RPE 세포 파편을 포함하는데 사용되었다. (B', B", D', D") 등쪽 및 복부 ROI 영역(B와 D의 검은색 점선)의 디지털 줌은 MATLAB에서 엔드포인트 감지에 중요한 제안된 ROI 시작점(파란색 화살표 헤드)과 뾰족한 ROI 끝을 보여줍니다. 밝은 필드 이미지는 그림 9E, G에도 나와 있습니다. 흰색 / 회색 = 핵. Dorsal이 위로 올라가고 원위가 남아 있습니다. (A-D) 배율 막대 = 40μm. (B',B",D',D") 배율 막대 = 10μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: RpEGEN 처리 워크플로. (A) MATLAB으로 가져온 적절한 지향 8비트 브라이트필드 이미지 및 FIJI 생성 ROI(빨간색)의 예. Dorsal이 위로 올라가고 원위가 남아 있습니다. 색상 막대는 8비트 회색조 강도 값을 나타내며, 여기서 0 = 검정, 255 = 흰색입니다. (B) (C)에 도시된 바와 같이 측지선 픽셀 거리 묘사에 대한 시작점과 종점의 묘사와 잘못된 스퍼스의 존재를 보여주는 ROI 마스크(적색)의 초기 이진 골격화(흰색). (C)의 컬러 바는 유클리드 픽셀 거리를 나타냅니다. (D) 스퍼스는 최종 픽셀에서 시작 픽셀로 돌아가는 단순화된 최소 비용 경로를 사용하여 제거되어 스퍼스가 없는 연속적인 중심선(빨간색)이 생성됩니다. (E) ROI 마스크의 모든 픽셀과 중심선 픽셀(흰색) 사이의 거리 변환을 기반으로 가장 가까운 선형 중심선 인덱스. 이러한 인덱스 값을 사용하면 ROI 마스크 내의 각 이미지 픽셀을 분석을 위해 가장 가까운 중심선 픽셀에 할당할 수 있습니다. 색상 막대는 선형 중심선 픽셀 인덱스 값을 나타냅니다. (F) 중심선을 따라 정규화된 픽셀 거리의 예로, 여기서 0(파란색, 원위 등쪽 픽셀)은 시작 픽셀이고 1(빨간색, 원위 최대 복부 픽셀)은 끝 픽셀입니다. (G)는 (F)와 비슷하지만 각도 거리를 사용하는데, 여기서 0도(파란색)는 시작 픽셀이고 180도(빨간색)는 끝 픽셀입니다. (h) 각 중심선 픽셀에 대해 계산된 중앙값 픽셀 강도 값의 예. 색상 막대는 지정된 각 중심선 픽셀에 기여하는 모든 ROI 픽셀의 중간 회색 음영 강도 값을 나타냅니다. 이 그림은 0.06% v/v DMSO 또는 15μM IWR-1 처리 그룹의 유충이 아닌 테스트 데이터 세트의 이미지를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: RPE 절제 및 광수용체 변성의 증거. (A) 절제되지 않은 6 dpf 유충의 횡단 냉동 절편. (A,A') PTU에 노출 된 후, 전이유전자 발현은 성숙한 RPE 세포로 제한되며, 가장 밝은 발현은 RPE의 중심 삼분의 일에 국한됩니다. 화살촉은 정점 미세 융모를 나타냅니다. (A") 차등 간섭 콘트라스트(DIC) 이미지는 정상적인 외부 핵층(ONL; 즉, 광수용체) 아키텍처를 나타낸다. (B,B') 1 dpi 유충의 횡단 냉동 절편은 ONL 라미네이션에서 eGFP + 세포 형태학 및 해체의 상당한 파괴를 나타냅니다. 화살표는 박리된 핵과 피크노틱 핵을 나타냅니다. (B") DIC 이미지는 ONL 아키텍처의 현저한 혼란을 더욱 잘 보여줍니다. 녹색 = eGFP, 파란색 = 핵, 노란색 = ONL. Dorsal이 위로 올라가고 원위가 남아 있습니다. (A)에서의 스케일 바는 40 μm를 나타내고 (B)에 적용될 수 있다. 스케일 바(A')는 40 μm를 나타내고 (A", B', B")에 적용될 수 있다. 이 그림과 그림 범례 텍스트는 Hanovice et al. 2019 (그림 1)3에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 애벌레 제브라피쉬에서의 RPE 재생의 모델. (A) nfsB-eGFP는 눈의 중앙 이삼분의 일에서 성숙한 RPE로 발현된다. (b) MTZ의 적용은 RPE 및 광수용체의 아폽토시스(TUNEL, 적색)를 유도한다. (C) RPE 절제는 광수용체 및 브루크의 막(점선)의 퇴행을 유도한다. (D) 주변부에서 절제되지 않은 RPE는 증식하기 시작하고 부상 부위(파란색)로 확장된다. (e) 재생된 eGFP+ RPE가 주변부에 나타나듯이, RPE는 주변 RPE(pRPE), 차별화된 RPE(dRPE), 전이 영역(TZ) 및 부상 부위(IS)의 네 개의 영역으로 나눌 수 있다. (E, 삽입) 재생된 분화된 RPE(녹색)는 절제되지 않은 말초 RPE에 근접한 주변부에서 나타나고, 전이 영역에 인접한 증식성 세포를 함유한다. 전이 영역은 여전히 분화 RPE 세포 (ZPR2, 적색) 및 증식성 세포 (파란색)로 구성됩니다. 손상 부위는 어떠한 RPE 분화 마커도 발현하지 않는 무색소 증식성 세포를 포함한다. (F) 기능적 RPE 층과 브루크의 멤브레인의 재생은 14dpi에 의해 완료된다. 이 그림과 그림 범례 텍스트는 Hanovice et al. 2019 (그림 14)3에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 이미지 분석에서 제외된 손상된 조직 절편. (A-C) 제외 기준을 충족하는 0.06% v/v DMSO 및 15μM IWR-1 데이터 세트에서 유충의 횡단 냉동 절편. 한 유충은 등쪽 RPE 조직 찢어짐 (A; 자홍색 화살촉)을 나타내고 다른 두 마리의 유충은 DAPI 채널 (B; 마젠타 점선 타원형)에서 해부학 적 랜드 마크 (등쪽 OLM)를 막거나 밝은 필드 채널 (C; 자홍색 점선 타원형)에서 RPE 강도 측정을 왜곡 할 수있는 조직 폴딩을 보여줍니다. 흰색 / 회색 = 핵. Dorsal이 위로 올라가고 원위가 남아 있습니다. 배율 막대 = 40μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 8: IWR-1을 이용한 약리학적 억제는 RPE 재생을 손상시킨다. (A) 0.06% v/v DMSO 및 (B) 15 μM IWR-1 처리군으로부터의 절제(MTZ+) 4 dpi 유충의 횡단 냉동 절편. 브라이트필드 이미지(A,B) 및 퍼센트 RPE 회수/섹션(C)의 정량화는 IWR-1 처리된 유충에서 색소 단층의 회복에 상당한 지연을 보여준다(스튜던트의 짝을 이루지 않은 t-test, *** p < 0.0001). (B) 검은 화살촉은 재생성 RPE의 가장 중앙에 있는 가장자리를 나타낸다. Dorsal이 위로 올라가고 원위가 남아 있습니다. 스케일 바(B)는 40 μm를 나타내고 (A)에 적용될 수 있다. 이 그림과 그림 범례 텍스트는 Hanovice et al.에서 수정되었습니다. 2019년(그림 13)3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: RpEGEN에서 RPE 재생의 자동 정량화에서 출력된 원시 데이터. (A-D) 각 데이터 세트의 모든 유충에 대해 등쪽(x축; 각도 거리 = 0°)에서 복부(x축; 각도 거리 = 180°)까지 전체 RPE ROI 영역에서 컴파일된 밝은 필드 픽셀 강도 분포를 보여주는 히트맵: (A) n = 11, DMSO MTZ-; (b) n=10, IWR-1MTZ-; (c) n=11, DMSO MTZ+; (d) n = 12, IWR-1 MTZ+ (3개의 독립적인 부모 그룹에서, N = 3). 예를 들어 (A)는 11개의 ROI에서 177,460픽셀의 데이터를 표시합니다. y축에서 픽셀 강도는 0 = 검정, 255 = 흰색인 8비트 색상 배율을 기준으로 표시됩니다. 원시 데이터는 5-8비트 강도 값(y축) 빈으로 5도(x축)로 표시되며, 여기서 빨간색 = 최대 빈 수, 진한 파란색 = 최소 빈 카운트입니다. (E-H) 대표적인 (E,F) 비절제 (MTZ-) 9 dpf 유충 및 (G,H) 0.06 % v / v DMSO 및 15 μM IWR-1 처리 그룹에서 4 dpi 유충의 횡단 냉동 절편. RPE ROI는 자홍색으로 강조 표시되고 각도 거리 극단이 표시됩니다(0° = 등쪽, 180° = 복부). 대체로 이러한 데이터는 처리에 관계없이 (C, D, G, H) 완화 된 ROI와 비교할 때 (A, B, E, F) 완화되지 않은 ROI에서 어두운 픽셀 (0-150 사이의 강도 값)의 분포를 보여줍니다. 절제된 ROI의 데이터는 (D,H)가 IWR-1 처리 유충에서 기숙사 (~ 50 °까지)와 약간 심실 (~ 5 °까지) 확장되는 DMSO 처리 그룹에서 더 가벼운 픽셀 (150-250 사이의 강도 값)의 중앙 집중화 된 (100 ° ± 15 °) 분포를 보여줍니다. (G, H) 안료가 없는 이러한 중앙 절제 구역은 파란색 화살촉으로 강조 표시됩니다. 검은 화살표는 시신경의 위치를 나타냅니다. DMSO 처리된 유충으로부터의 이미지는 도 3에 도시되어 있다. 배율 막대 = 40μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10: RpEGEN에서 RPE 재생성의 자동화된 정량화에서 파생된 그룹 결과 및 통계적 비교. (A) 각 그룹에 대한 원시 데이터로부터 파생된 5도 비닝된 중앙값 및 95% 신뢰 엔벨로프. 플롯은 RPE의 등쪽 (0 °)과 복부 (180 °) 길이의 MTZ- 그룹 (검은 색과 회색 선) 사이의 유사성을 보여 주며 중앙 RPE (~ 40-140 ° 사이의 연한 파란색 음영 영역)의 MTZ + 그룹 (파란색 및 빨간색 선) 간의 현저한 차이점을 보여줍니다. 구체적으로, 중앙값 픽셀 강도는 임의의 다른 처리군과 비교했을 때 IWR-1 MTZ+4dpi에서 더 가벼워지고(0 = 검정 및 255=흰색) 나타나며, 이는 중심 RPE 색소침착 감소에 해당한다. (B) DMSO MTZ+4 dpi 및 IWR-1 MTZ+ 4dpi에 대한 RPE의 등쪽(0°)에서 복부(180°) 길이에 걸쳐 1도 빈으로부터 도출된 중앙값의 통계적 비교는 (A)에서의 관찰을 강화한다. p-값은 20,000회 반복을 통한 순열 시뮬레이션과 각 1도 빈에 대한 양면 검정을 사용하여 계산되었습니다. 두 그룹이 대응하는 1도 빈에 대해 유사한 중앙값을 갖는다는 귀무 가설 하에서, 0.05≤ p-값은 그룹 중위수 간의 통계적으로 유의한 차이를 나타냅니다(파선 검정선 = 95% 신뢰 구간(CI)). 중앙 RPE (~ 40-140 ° 사이≤ 연한 파란색 음영 영역)에 걸쳐 0.05의 p-값의 존재는 절제 (MTZ +) DMSO 처리 형제 대조군과 비교할 때 절제 (MTZ +) IWR-1 처리 유충에서 색소 침착이 현저히 적음을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 변수 이름 | 변수 유형 | 가변 크기 | 변수 설명 | ||
| ROIname | 세포 | {N x 1} | 처리된 ROI 파일의 이름 | ||
| 로시 | 세포 | {N x 1} | 처리된 각 ROI 파일에 대한 ROI 꼭짓점 | ||
| IMG이름 | 세포 | {N x 1} | 처리된 TIF 이미지 파일의 이름 | ||
| 증권 시세 표시기 | 세포 | {N x 1} | 처리된 각 TIF에 대한 8비트 브라이트필드 이미지 데이터 | ||
| ROIBW | 세포 | {N x 1} | IMG 이미지와 동일한 차원의 논리적(0 또는 1) ROI 마스크 | ||
| 클라인 | 테이블이 있는 셀 | {N x 1} (n x 16) | x, y, 거리, 각도, 인덱스, 점 수 및 통계를 포함한 개별 이미지의 중심선 데이터 | ||
| 증권 시세 표시기 | 세포 | {N x 1} | 중심선은 ROI 마스크 포인트와 CLine 계산을 위한 가장 가까운 중심선 점과 관련된 데이터를 인게이지합니다. | ||
| 클린 BW | 세포 | {N x 1} | 중심선의 위치(=1)를 나타내는 IMG 이미지와 동일한 치수를 갖는 논리적(0 또는 1) 행렬 | ||
| RAW_data | 테이블 | N x 3 | 모든 다른 IMG 이미지에서 ROI의 각 픽셀에 대한 모든 원시 데이터를 결합한 표 | ||
| BIN_1_deg_all | 테이블 | N x 9 | 1도 비닝된 데이터 및 RAW_data의 데이터를 사용한 통계를 포함하는 테이블 | ||
| BIN_5_deg_all | 테이블 | N x 9 | 5도 비닝된 데이터와 이 데이터의 데이터를 사용한 통계를 포함하는 표RAW_data | ||
| BIN_10_deg_all | 테이블 | N x 9 | 10도 비닝된 데이터 및 RAW_data의 데이터를 사용한 통계를 포함하는 테이블 | ||
표 1: RpEGEN.m 스크립트에서 MAT 파일로 내보낸 변수에 대한 설명입니다. 정의는 다음과 같습니다 : ROI (들) = 관심 지역 (들); TIF = 태그가 지정된 이미지 파일 형식입니다.
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Discussion
이 프로토콜은 RPE를 유전적으로 완화시키는 방법론을 설명하고 유충 노화 제브라 피쉬에서 퇴행 및 재생 메커니즘을 연구합니다. 이 프로토콜은 또한 성인 제브라 피쉬3에서 성공적으로 수행되었지만 덜 광범위한 특성화로 인해 애벌레가 여기에 초점을 맞추고 있습니다. 프로토콜의이 부분의 중요한 측면 (단계 1-4)은 1) 멜라닌 생성의 발병 전에 배아에 1.5x PTU를 추가, 2) 2-3 dpf 상에서 PTU 처리 배아를 데코리온화, 3) eGFP에 대한 신중한 스크리닝, 4) MTZ를 사용한 유전자 절제 동안 물 변화의 타이밍을 포함한다. PTU는 멜라닌 합성21,22를 억제하고 rpe65a:nfsB-eGFP 전이유전자 발현에 대한 스크리닝을 용이하게 하고색소 조직3의 부재 및 후속 복귀에 기초한 RPE 퇴행성 및 재생 과정의 특성화를 가능하게 하기 위해 이 RPE 절제 패러다임에 활용되고 있다. PTU는 멜라닌 생성이 21 시작되면 추가 색소 침착을 억제하지만 탈색 조직은 억제하지 않으므로 제브라 피쉬25에서 약24 마력 (hpf)에서 시작되는 색소 침착이 시작되기 전에 PTU를 첨가해야합니다. 여기서, 그리고 선행 연구4,5에서, PTU는 멜라닌 합성이 시작되기 전에 억제를 보장하기 위해 대략 6 hpf26에서 첨가되었다. PTU는 주요 프로토콜 단계의 시각화를 가능하게하지만, PTU 치료는 발달의 일부 측면 (2.3 단계에서 논의 된대로)에 영향을 미치고 배아 부화를 손상시킬 수 있습니다. 후자의 과정은, 너무 오래 지연된다면, 형태학 및 운동성 결핍으로 이어질 수 있고, 생존력(40)에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 배아를 효소적으로 pronase로 데코리오닝(hatching) 하거나 2-3dpf에서 포셉을 수동으로 사용하는 것은 유전자 절제 전에 애벌레 건강을 유지하고 표준화하는 데 중요합니다. 오래된 유충의 건강과 생존 가능성 (PTU 치료와 관련이 없음)에 대한 문제를 피하기위한 또 다른 중요한 고려 사항은 실험41을 위해 9 dpf / 4dpi를 초과하는 수생 시설 시스템에서 남아있는 경우 유충이 표준화 된 먹이 요법을 시작해야한다는 것입니다.
설명된 바와 같이, rpe65a는 후안구의 중심 삼분의 일에서 성숙한 RPE에서 전이유전자 발현을 유도한다. PTU로 처리된 5 dpf 유충에서 eGFP의 발현은 도 1에 도시된 바와 같이 정상적으로 쉽게 검출되고 눈에 띄게 강렬한(bright) 것이다. 밝은 발현을 가진 형제자매에 비해 5dpf에서 eGFP를 희미하게 발현하는 유충도 관찰될 수 있다. 세대 간의 발현 강도 비율 (즉, 밝은 대 희미한)의 변화도 존재할 수 있으며, 일부 세대는 다른 세대보다 더 희미하게 유충을 표현합니다. 어쨌든, 희미한 eGFP 발현을 갖는 유충은 보통 각 클러치에서 소수의 동물을 나타낸다. 희미하게 발현하는 유충이 덜 심각한 RPE 손상 표현형을 보이는지는 알 수 없지만, 각 클러치의 밝은 eGFP+ 코호트에서 절제가 수행되었으며 비교적 희미한 형제는 스크리닝에서 안락사되고 분석에서 제외되었습니다. 유사하게, 제브라피쉬 RPE 절제 및 재생 표현형의 광범위한 특성화는 rpe65a:nfsB-eGFP 전이유전자에 대해 이형접합체인 유충에서 rpe65a:nfsB-eGFP 이형접합성 성인을 야생형 성인3으로 아웃크로스시킴으로써 수행되었다. 그러나 rpe65a : nfsB-eGFP에 대한 유충이 더 심한 절제 표현형을 나타내는지 여부는 알려지지 않았습니다. 절제 프로토콜을 표준화하기 위한 다른 노력으로는 24시간 유전자 절제 기간 동안 MTZ- 및 MTZ+ 접시에 동일하고 측정된 부피(예를 들어, 10cm 페트리 접시 당 30mL)를 첨가하는 것이 포함된다. 마찬가지로, 약리학 적 치료 접시에있는 유충은 동등하고 측정 된 부피 (예 : 6 웰 당 5 mL)와 신선한 화합물의시기 적절한 보충 (예 : 매 24 시간마다)을 받았습니다. 다른 MTZ 및 / 또는 약리학 적 화합물 처리로 요리를 취급 할 때, 운송 및 물 교환 중에 엎지르거나 의도하지 않은 교차 오염을 방지하기 위해주의 깊은 조치를 취해야합니다.
제브라피쉬 RPE 절제 프로토콜은 약리학적 조작을 포함하도록 변형될 수 있다(단계 5). 이것은 RPE 재생의 중요한 조절자로서 면역 반응5, mTOR4 및 Wnt3 신호전달 경로를 확인하기 위해 이전에 수행되었다; 후자는 여기에서 반복 가능한 것으로 밝혀졌으며 RpEGEN의 유효성을 검사하는 데 사용되었습니다. 중요한 RPE 재생 경로를 조명하는 것 외에도, 약리학 적 조작은 제브라 피쉬 망막 재생 연구 10,42,43,44,45,46,47에 널리 사용되었습니다. RPE 절제 프로토콜에 통합되기 전에, 약리학적 제제는 독성, 효능 및 치료 기간에 대해 엄격하게 평가되어야 한다. 이것은 다음과 같이 행해질 수 있다: 독성을 평가하기 위한 용량 반응 실험을 수행함(48); 알려진 표적 유전자/단백질의 발현 평가 4,5; 약리학적 조작의 공지된 기능적 결과, 예를 들어 PLX3397 처리로 백혈구의 고갈 48,49,50,51을 평가한다. 여기서, DMSO (비히클 대조군) 및 IWR-1을 유전자 절제 24 시간 전에 첨가하고, 유충은 4 dpf에서 약리학적 전처리 직전에 스크리닝하였다. eGFP+ 유충은 4 dpf 상의 eGFP-유충과 구별될 수 있지만, eGFP의 강도는 상당히 희미하게 나타날 수 있으며, 이것이 유충이 5 dpf에서 eGFP 발현을 위해 재선별된 이유이다(대표적인 결과). 4 dpf 이전의 eGFP에 대한 스크리닝은 발현이 너무 낮아서 눈에 검출되지 않을 수 있기 때문에 어려울 수 있다. 따라서, 4 dpf 이전에 (즉, 2 dpf 상에서) 약리학적 제제를 사용한 전처리는 eGFP가 명확하게 보일 때 5 dpf 상에서 분리될 스크리닝되지 않은 유충에 첨가될 수 있다. 유충을 조작해야하는 모든 시나리오 (예 : 스크리닝 중, 이미징 용 임베딩 등)에서 약리학 적 치료 조건을 유지해야하며 스크리닝 연령에 관계없이 RPE는 5dpf에서 MTZ로 절제되어야합니다.
유전자 절제 프로토콜 외에도, 공초점 현미경 이미지 전처리 및 RpEGEN을 이용한 RPE 재생의 자동화된 정량화를 위한 단계별 지침이 요약되어 있다(단계 6-7). RpEGEN은 사용자 간 RPE 재생 정량화를 표준화하고 출력 데이터 세트의 견고성을 높이는 동시에 이전에 수행된 지루한 수동 정량화와 함께 발생할 수 있는 본질적인 편향을 최소화하기 위해 만들어졌습니다. 프로토콜의이 부분의 중요한 측면은 ROI 생성 중에 수행됩니다 (단계 6). 첫째, 이미지/눈은 RpEGEN이 이러한 방향성에 최적화되었기 때문에 등쪽 위쪽, 원위 왼쪽 방향(예: 그림 3A-D, 그림 4)에 있어야 합니다. 또한 RPE ROI의 등쪽 및 복부 말단 끝이 그림 3B', B", D',D"(마젠타 선)와 같이 뾰족한 팁으로 테이퍼되는 것이 중요합니다. 이러한 끝이 대신 제곱되거나 반올림된 경우 RpEGEN 스크립트는 중심선 골격 시작 및 끝 픽셀을 결정하는 데 어려움을 겪을 수 있으며 중앙 회선이 아닌 터미널 ROI 끝에서 스퍼를 생성할 수 있습니다(그림 4B). 말단 ROI 끝에서 스퍼링하면 디스퍼링 중에 중심선이 짧아지거나(그림 4D) 주변 RPE의 각도 거리 측정 문제가 발생할 수 있습니다(그림 4G). 각 개별 유충에 해당하는 TIF 및 ROI 파일에 대한 동일한 명명 시스템도 중요한 단계이며 8 비트 TIF 파일을 RpEGEN의 올바른 ROI와 페어링하는 데 필수적입니다. TIF 및 ROI 파일 이름이 일치하지 않으면 대표 결과 섹션(그림 4)에 설명된 RpEGEN 처리 워크플로를 생성하지 못하고 궁극적으로 이 스크립트를 사용하여 RPE 재생 정량화를 방지할 수 있습니다.
총체적으로, 이 프로토콜은 유충 제브라피쉬에서 RPE를 성공적으로 절제하고, RPE 손상 전, 도중, 또는 사후에 관심 있을 수 있는 신호전달 경로를 조작하고, 제한된 고유 편향을 가진 표준화된 방식으로 RPE 재생을 정량화하는 지침을 제공한다. RPE의 재생 잠재력을 연구하기 위해 이용가능한 생체내 및 시험관내 모델의 맥락에서, 제브라피쉬는 내재적 RPE 재생(14)을 위한 그의 능력에서 독특하다. 그러나, 이것은 RPE 손상의 급성 모델이며, 치료 개발을 목표로 하는 RPE 퇴행성 질환(예를 들어, AMD)과 같이 만성적이지 않다. 이것은 모델의 한계이지만, 크게 알려지지 않은 RPE 재생의 메커니즘을 연구 할 수있는 훌륭한 플랫폼으로 남아 있으며 장래에 만성 부상 및 질병을 연구하기 위해 적응할 수 있습니다. 본원에 기술된 도구 및 방법론은 다재다능하며, 또한 퇴행성 반응에 관여하는 세포 과정의 연구 및 절제 후 RPE 인접 조직의 운명을 연구하는데 적용될 수 있다. 마찬가지로 RpEGEN 스크립트는 사용자 데이터 출력 요구에 맞게 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 안료 이외의 마커의 공간 분석을 수행한다 (예를 들어, 계내 혼성화 프로브, 단백질 발현 등).
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Disclosures
L.L.L.은 인간 다능성 줄기 세포로부터 망막 색소 상피를 유도하는 신속한 방법을 기술하는 미국 특허 #9,458,428에 대한 공동 발명가이다; 이는 본 명세서의 내용과 무관하다. J.M.G.와 G.B.F.는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
본원에 기재된 작업은 국립 보건원 (RO1-EY29410 내지 J.M.G, 및 NIH CORE 그랜트 P30-EY08098 내지 안과)에 의해 지원되었다; UPMC 면역 이식 및 치료 센터 (L.L.L. 및 J.M.G.); 안과 연구의 E. Ronald Salvitti Chair (J.M.G.). 안과 Wiegand Fellowship in Ophthalmology (L.L.L), 피츠버그의 Eye & Ear Foundation, 그리고 실명 방지를위한 연구, 뉴욕, 뉴욕의 무제한 보조금으로부터 추가 지원이 접수되었습니다. 저자는 또한 기술 지원에 대한 아만다 플랫과 휴 해머 박사와 우수한 동물 관리 지원에 대한 수생 스태프에게 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab Material/Equipment | |||
| 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) | Millipore Sigma | D9542 | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | Catalog number is for 50 mL tubes |
| Diamond tip scribing pen | Fisher Scientific | 50-254-51 | Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % | Fisher Scientific | BP231 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
| Embryo incubator (large) | Fisher Scientific | 3720A | |
| Embryo incubator (mini/tabletop) | Labnet | I5110A | |
| Fluorescence stereo microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | Or similar, with 488 nm excitation laser/filter |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-4 | Manufactured by Corning, non-sterile |
| InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo | Millipore Sigma | 5.04462 | Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements |
| Methylene blue (powder) | Fisher Scientific | BP117-100 | Also available as a premade aqeuous solution |
| Metronidazole (MTZ) | Millipore Sigma | M3761 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
| N-phenylthiourea (PTU) | Millipore Sigma | P7629 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
| Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free | Fisher Scientific | AA433689M | Chemical waste, proper disposal required |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 10 cm diameter |
| Phosphate buffered saline (powder packets) | Millipore Sigma | P3813 | Used to make 10 X PBS stock |
| Pronase | Millipore Sigma | PRON-RO | |
| Shaking incubator | Benchmark | H2010 | Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius |
| Stereo microscope | Leica | S9i | Or similar, with transmitted light illumination |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Fine-tipped forceps for manual dechorionation |
| Tabletop rotator/shaker | Scilogex | SK-D1807-E | |
| Transfer pipette | Millipore Sigma | Z135003 | 3.2 mL bulb draw, non-sterile |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Pentair | TRS1, TRS2, TRS5 | Also available from Fisher Scientific (NC0342409) |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Software Material | |||
| FIJI (Fiji is Just ImageJ) | FIJI (Fiji is Just ImageJ) | https://imagej.net/software/fiji/ | Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats |
| GRAMM examples and how-tos | MathWorks | https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like. | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox |
| MATLAB support | MathWorks | https://www.mathworks.com/support.html |
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