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Ablación mediada por nitrorreductasa/metronidazol y una plataforma MATLAB (RpEGEN) para estudiar la regeneración del epitelio pigmentario de la retina del pez cebra

Published: March 2, 2022 doi: 10.3791/63658
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Ophthalmology, Louis J. Fox Center for Vision Restoration, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Earth Research Institute, University of California, Santa Barbara, 3Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Este protocolo describe la metodología para extirpar genéticamente el epitelio pigmentario de la retina (EPR) utilizando un modelo de pez cebra transgénico. La adaptación del protocolo para incorporar la modulación de la vía de señalización utilizando compuestos farmacológicos es ampliamente detallada. Se desarrolló una plataforma de MATLAB para cuantificar la regeneración de RPE basada en la pigmentación, que se presenta y discute.

Abstract

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) reside en la parte posterior del ojo y realiza funciones esenciales para mantener la salud y la integridad de los tejidos retinianos y vasculares adyacentes. En la actualidad, la limitada capacidad reparadora de la EPR de mamíferos, que se limita a pequeñas lesiones, ha obstaculizado el progreso hacia la comprensión de los procesos regenerativos de EPR in vivo . Aquí, se proporciona una metodología detallada para facilitar el estudio de la reparación in vivo de RPE utilizando el pez cebra, un modelo de vertebrados capaz de regeneración de tejidos robustos. Este protocolo describe un paradigma de lesión mediada por nitrorreductasa/metronidazol transgénico (NTR/MTZ) (rpe65a:nfsB-eGFP), que da como resultado la ablación de los dos tercios centrales del EPR después de 24 h de tratamiento con MTZ, con posterior recuperación tisular. Se hace hincapié en las ablaciones de EPR en larvas de pez cebra y también se describen los métodos para probar los efectos de los compuestos farmacológicos en la regeneración de EPR. También se discute la generación y validación de RpEGEN, un script de MATLAB creado para automatizar la cuantificación de la regeneración de RPE basada en la pigmentación. Más allá de los mecanismos activos de reparación del EPR, este protocolo se puede ampliar a estudios de la degeneración del EPR y las respuestas a las lesiones, así como a los efectos del daño del EPR en los tejidos retinianos y vasculares adyacentes, entre otros procesos celulares y moleculares. Este sistema de pez cebra es muy prometedor en la identificación de genes, redes y procesos que impulsan la regeneración de RPE y los mecanismos relacionados con la enfermedad de RPE, con el objetivo a largo plazo de aplicar este conocimiento a los sistemas de mamíferos y, en última instancia, hacia el desarrollo terapéutico.

Introduction

La metodología descrita aquí detalla un protocolo para extirpar genéticamente el epitelio pigmentario de la retina (EPR) utilizando larvas de pez cebra. El EPR se extiende sobre la parte posterior del ojo y reside entre las capas estratificadas de la retina neural y la capa de vasculatura que constituye la coroides. El soporte trófico, la absorción de luz fototóxica y el mantenimiento de las proteínas del ciclo visual son solo algunas de las funciones críticas que realiza el EPR que son esenciales para mantener la salud y la integridad de estos tejidos adyacentes1. El daño al EPR de mamíferos es reparable cuando las lesiones son pequeñas2; sin embargo, el daño sufrido por lesiones más grandes o enfermedad degenerativa progresiva es irreversible. En los seres humanos, las enfermedades degenerativas de EPR (por ejemplo, la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) y la enfermedad de Stargardt) conducen a la pérdida permanente de la visión y, con pocas opciones de tratamiento disponibles, disminuyen la calidad de vida del paciente. La capacidad limitada del EPR de mamíferos para autorrepararse ha creado una brecha de conocimiento en el campo de los procesos regenerativos del EPR. Dada la robusta capacidad regenerativa del pez cebra en muchos tipos de tejidos diferentes, este protocolo se desarrolló para establecer un sistema de vertebrados in vivo para facilitar los estudios sobre el EPR intrínsecamente regenerador y descubrir mecanismos que impulsan esa respuesta. Utilizando el paradigma de ablación descrito aquí, la vía de señalización canónica Wnt3, la vía mTOR4 y las respuestas relacionadas con el sistema inmunológico5 se han identificado como mediadores críticos de la regeneración de RPE, probablemente con funciones superpuestas.

En este paradigma de ablación genética, el pez cebra Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 expresa el gen6 de la nitrorreductasa derivada de bacterias (NTR/nfsB) fusionado con eGFP bajo control del elemento potenciador de RPE, rpe65a7. La ablación se logra agregando el profármaco, metronidazol (MTZ), al sistema de agua que alberga el pez cebra. La activación intracelular de MTZ por nitrorreductasa da como resultado la reticulación del ADN y la apoptosis en células que expresan NTR/nfsB 8,9. Esta tecnología ha sido ampliamente utilizada en el pez cebra para extirpar células de la retina 10,11,12,13 y otros tejidos 8. Juntos, estos elementos permiten la expresión dirigida (rpe65a) de una metodología de ablación celular inducible (NTR/MTZ)8,9 y un marcador fluorescente (eGFP) para la visualización.

También existen otros modelos in vivo interesantes que se pueden utilizar para estudiar el potencial regenerativo del RPE14. Estos son amplios e incluyen la transdiferenciación de EPR a retina después de la retinectomía en anfibios, en la que las células de EPR perdidas por el recrecimiento retiniano se reemplazan15,16; Restauración de RPE post-lesión en el ratón MRL/MpJ "súper curativo"17; y estimulación exógena de la proliferación de EPR en un modelo de rata de EPR espontáneo y degeneración retiniana18, entre otros. También se han desarrollado modelos in vitro, como las células madre de EPR humanas adultas (RPESCs)19. Todos estos modelos son herramientas valiosas que trabajan para descubrir los procesos celulares relacionados con la regeneración de RPE (por ejemplo, proliferación, diferenciación, etc.); sin embargo, el pez cebra es único en su capacidad para la reparación intrínseca de RPE después de la ablación.

Si bien la metodología aquí está escrita para centrarse en la comprensión de los mecanismos que impulsan la regeneración de RPE, la línea Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) y este protocolo de ablación genética podrían utilizarse para estudiar otros procesos celulares como la apoptosis de RPE, la degeneración de RPE y el efecto de la lesión de RPE en los tejidos retinianos y vasculares adyacentes. El protocolo de ablación también se puede modificar para incluir la manipulación farmacológica, que es una estrategia preliminar conveniente para detectar vías de señalización de interés. Por ejemplo, se ha demostrado que el bloqueo de la vía Wnt canónica mediante el Inhibidor de la Respuesta Wnt-1 (IWR-1)20 perjudica la regeneracióndel EPR 3. Esto se repitió aquí para guiar a los usuarios a través de un experimento de manipulación farmacológica y servir como prueba de concepto para validar un script de MATLAB (RpEGEN) creado para cuantificar la regeneración de RPE basada en la recuperación de la pigmentación. Al igual que la línea transgénica y el protocolo de ablación, los scripts RpEGEN son adaptables y podrían usarse para cuantificar otros marcadores / procesos celulares dentro del RPE.

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Protocol

Todas las metodologías descritas en este documento cumplen con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Pittsburgh.

1. Preparación previa a la recogida de embriones de pez cebra

  1. Ajuste la incubadora de embriones a 28,5 °C.
  2. Preparar una solución madre 25x del inhibidor de la melanogénesis, N-feniltiorea (PTU)21,22. Esta solución madre se escala a partir de una receta común22 y 1x es igual a 0.003% de peso por volumen (% p/v) (por ejemplo, 0.003 g de polvo de PTU en 100 mL de disolvente líquido).
    1. Para hacer una solución madre de PTU grande de 25x, agregue 0.75 g de polvo de PTU a 1 L de agua desionizada purificada (en adelante, dH2O) y mezcle bien a temperatura ambiente (~ 25 ° C) usando una barra de agitación y una placa de agitación. Conservar a 4°C durante un máximo de 3 meses protegido de la luz.
      NOTA: Es difícil conseguir que la PTU entre en solución acuosa y puede ser necesaria una agitación prolongada durante la noche.
      PRECAUCIÓN: La PTU es peligrosa y se debe tener cuidado para evitar la ingestión, inhalación y / o contacto con la piel o los ojos. El polvo de PTU y todos los derivados líquidos de PTU descritos en este documento pueden necesitar ser eliminados como desechos químicos dependiendo de las regulaciones estatales e institucionales. Se recomienda la confirmación de los métodos adecuados de eliminación de residuos de PTU, si los hubiera, antes de su uso.
    2. Para hacer una solución de trabajo de PTU de 1,5x (en lo sucesivo denominada PTU de 1,5x), agregue 60 ml de solución madre de PTU de 25 x a 940 ml de agua de la instalación de alojamiento de pez cebra (en lo sucesivo, "agua del sistema"). Se han descrito parámetros óptimos de calidad del agua para el pez cebra23 y las instalaciones acuáticas deben contar con procedimientos estándar de monitoreo del agua. Guarde 1.5x PTU a 28.5°C durante 1-2 semanas protegido de la luz.
      NOTA: Este protocolo se realiza de forma rutinaria utilizando las concentraciones de PTU, disolventes y parámetros de almacenamiento descritos en el paso 1.2. Como medida de precaución, los embriones / larvas deben observarse cada 1-2 días mientras están en PTU para validar la eficacia y confirmar la despigmentación sostenida. Las condiciones de disolución y/o almacenamiento deben optimizarse si se sospecha una disminución de la solubilidad/eficacia de la PTU.
  3. Prepare una solución madre de 0.05% p/v de azul de metileno, un inhibidor del crecimiento de hongos, agregando 0.05 g de polvo de azul de metileno a 100 ml de dH2O. Mezcle bien con una barra de agitación y una placa de agitación. Conservar a 4°C.
  4. Prepare pipetas para la manipulación de embriones / larvas (por ejemplo, mover embriones / larvas entre placas de Petri, separar larvas durante la detección de fluorescencia, recolectar larvas sacrificadas en tubos de microcentrífuga para su fijación, etc.) cortando el extremo cónico de una pipeta Pasteur de vidrio con una pluma de garabato de punta de diamante. Graba alrededor de la circunferencia de la pipeta con la pluma de diamante y tira suavemente o rompe el extremo para hacer un descanso limpio.
    NOTA: La boca de la pipeta debe ser lo suficientemente lisa y ancha como para absorber fácilmente un embrión aún dentro del corion sin esquilar. Use una pipeta de transferencia de extracción de bombilla como alternativa. Las pipetas preparadas también se pueden usar para eliminar el líquido durante los cambios de agua (en lugar de verter) para minimizar la pérdida de embriones / larvas.
  5. Prepare una solución de paraformaldehído al 4% (PFA) en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) (por ejemplo, agregue 10 ml de PFA al 16% a 4 ml de 10 x PBS y 26 ml de dH2O). Conservar a 4°C durante un máximo de 4 semanas protegido de la luz.
    PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es un producto químico peligroso y debe manipularse en una campana extractora de humos químicos y eliminarse adecuadamente. Se debe tener cuidado y usar equipo de protección personal (EPP) para evitar la ingestión, inhalación y / o contacto con la piel o los ojos.

2. Recolección y mantenimiento de embriones de pez cebra antes de la ablación genética (0-5 días después de la fertilización)

  1. Mantener el pez cebra adulto como se describió anteriormente 3,4,5. La tarde / noche antes de la recolección de embriones, separe el pez cebra adulto en tanques de reproducción para el desove.
  2. A la mañana siguiente (0 días después de la fertilización (dpf)), recoger embriones en placas de Petri de 10 cm de diámetro en agua del sistema y eliminar todos los óvulos no viables o no fertilizados, que aparecerán opacos y / o mostrarán citoplasma irregular y escisión fallida24.
    NOTA: Los eventos normales de escisión y estadificación del desarrollo serán evidentes en embriones sanos como se describe25. Las placas de Petri deben mantenerse tres cuartas partes llenas (~ 30 ml para un plato de 10 cm de diámetro) durante todo el protocolo.
    1. Agregue dos gotas de azul de metileno al 0,05% p/v a cada placa de Petri, mezcle suavemente y almacene los embriones a 28,5 °C durante el resto del protocolo.
  3. Alrededor de las 6 h posteriores a la fertilización (hpf)4,5,26, reemplace el agua del sistema en placas de Petri embrionarias con 1.5x PTU (solución de trabajo hecha en el paso 1.2.2) y reponga el azul de metileno.
    NOTA: La PTU debe agregarse a los embriones antes del inicio de la pigmentación (es decir, antes de 24 hpf)25 ya que los tejidos ya pigmentados no se despigmentarán al agregar PTU21. Cabe señalar, sin embargo, que la reducción del tamaño de los ojos, los déficits oculares y craneofaciales, y la interrupción de algunas vías de señalización (por ejemplo, la señalización tiroidea) se han reportado en el pez cebra tratado con PTU 27,28,29. La toxicidad para el desarrollo de la PTU parece depender de la concentración y el momento de la adición de PTU27,29. Como se mencionó anteriormente para validar la eficacia de la PTU (paso 1.2), los signos de toxicidad de la PTU también deben controlarse cuidadosamente y, si se sospecha, se debe optimizar la concentración de trabajo y / o el tiempo de adición de PTU.
  4. En 2-3 dpf, dechorionar embriones usando solución de pronasa recién hecha.
    1. Disolver la pronasa en 1,5x PTU a una concentración de 2 mg/ml por vórtice.
      PRECAUCIÓN: La pronasa se envasa como un polvo muy fino y es irritante. Tomar medidas para evitar la inhalación y/o el contacto con la piel, los ojos, etc.
    2. Separe los embriones eclosionados de los embriones no eclosionados y trate solo los embriones no eclosionados.
    3. Reemplace 1.5x PTU con 2 mg/ml de solución de pronasa hecha en el paso 2.4.1 y deje en embriones no eclosionados durante 4-5 min con agitación suave (por ejemplo, en un rotador/agitador de mesa o mediante remolino manual).
    4. Vierta la solución de pronasa e inmediatamente enjuague con 1.5x PTU fresca. Triture suavemente 1.5x PTU enjuague sobre los embriones con una pipeta de transferencia de extracción de bulbo.
    5. Repita un segundo enjuague de PTU de 1.5x para desechar todos los restos de corion y luego reponga 1.5x PTU para mantenimiento.
      NOTA: Los embriones también se pueden descoronar manualmente usando fórceps de punta fina. En este caso, los restos de corion deben eliminarse y 1.5x PTU se debe reponer después de la deselección manual.
  5. Monitoree la salud del embrión / larva y reponga 1.5x PTU cada 1-2 días. Los embriones/larvas se mantienen en 1,5x PTU hasta la ablación a 5 dpf.
    NOTA: La importancia de los pasos 2.3 y 2.4 se aborda más a fondo en la sección Discusión.

3. Detección de larvas de pez cebra para rpe65a: nfsB-eGFP y ablación genética del epitelio pigmentario de la retina (5-6 días después de la fertilización)

  1. Haga una solución fresca de metronidazol (MTZ) de 10 mM a 5 dpf (día de la ablación). Este proceso tarda 2 h en completarse.
    1. Agregue polvo de MTZ al agua del sistema sin PTU y mezcle bien mediante agitación vigorosa (por ejemplo, 250 rotaciones por minuto) durante 1 h a 37 ° C.
    2. Enfríe la solución MTZ de 10 mM durante 1 h adicional a temperatura ambiente en un rotador/agitador de mesa y asegure la disolución completa antes de agregarla a las placas de Petri con larvas.
      NOTA: El cribado de fluorescencia y la separación de larvas de eGFP+ (paso 3.2) se pueden realizar durante las incubaciones a 37 °C y a temperatura ambiente.
      PRECAUCIÓN: MTZ es peligroso, y se debe tener cuidado para prevenir la ingestión, inhalación y / o contacto con la piel o los ojos. El polvo MTZ y todos los derivados líquidos descritos en este documento pueden necesitar ser eliminados como desechos químicos dependiendo de las regulaciones estatales e institucionales. Se recomienda la confirmación de los métodos adecuados de eliminación de residuos MTZ, si los hubiera, antes de su uso.
  2. Cribar larvas de pez cebra para el transgén rpe65a:nfsB-eGFP.
    1. Anestesiar larvas con 0,168 g/L de tricaína (MS-222) y separar larvas transgénicas (eGFP+) (Figura 1) de larvas no transgénicas (eGFP-) utilizando un microscopio estereoscópico de fluorescencia con un láser/filtro de excitación de 488 nm.
      NOTA: Se debe agregar tricaína a 1.5x PTU y / o soluciones compuestas farmacológicas, ya que las larvas deben permanecer inmersas en el tratamiento mientras se examinan para detectar eGFP. Incubar larvas en tricaína solo durante la duración del cribado (por ejemplo, ≤10 min para una sola placa de Petri de 10 cm que contenga 50 larvas).
    2. Wake criabilizó las larvas inmediatamente pipeteando directamente en una placa de Petri con PTU fresca de 1.5x sin tricaína.
    3. Al finalizar el cribado, separe aún más las larvas de eGFP+ en dos grupos de placas de Petri: un grupo para recibir tratamiento MTZ (ablated/MTZ+) y un grupo para ser el control noblated (MTZ-).
  3. Extirpar el epitelio pigmentario de la retina.
    1. Retire 1.5x PTU de los platos de control sin abrir (MTZ-) y agregue agua fresca del sistema sin PTU.
    2. Retire 1,5 veces la PTU de los platos de tratamiento ablacionados (MTZ+) y agregue la solución MTZ de 10 mM recién hecha (paso 3.1.).
    3. Retire la solución MTZ de 10 mM después de exactamente 24 h (designada 1 día después de la lesión (dpi)) y agregue agua fresca del sistema sin PTU. Cambie el agua dulce del sistema sin PTU en el plato ( es) MTZ. Las larvas no volverán a estar expuestas a la PTU durante el resto del protocolo.
      NOTA: Puede ser difícil pipetear o verter todos los 1.5x PTU (pasos 3.3.1 y 3.3.2) o 10 mM MTZ (paso 3.3.3) entre los intercambios de solución sin pérdida larvaria ya que los animales están nadando activamente. En este caso, se pueden agregar lavados de agua del sistema sin PTU para garantizar un intercambio exitoso de soluciones.

4. Mantenimiento larvario post-ablación genética (más de 6 días post-fertilización)

  1. Revise las larvas y reponga el agua del sistema sin PTU diariamente hasta la eutanasia (paso 5.6) o regrese a la instalación de alojamiento de peces cebra.
  2. Monitoree el éxito y el alcance de la ablación in vivo a 2 dpi (7 dpf) utilizando la iluminación de luz transmitida en un microscopio estereoscópico (Figura 2).

5. Incorporación del tratamiento farmacológico en el protocolo de ablación del epitelio pigmentario de la retina del pez cebra

NOTA: Como se realizó anteriormente3, el tratamiento con 15 μM IWR-1 o control de vehículos con sulfóxido de dimetilo (DMSO) a partir de 4 dpf se describe aquí como un experimento de ejemplo para probar RpEGEN. Las concentraciones y los plazos pueden variar con diferentes compuestos farmacológicos y las recomendaciones para la validación dosis-respuesta, la duración del tratamiento, el cribado y otros aspectos del diseño experimental para estudios de manipulación farmacológica se abordan en la sección Discusión. Siga los pasos 6 y 7 si se requiere análisis de imágenes.

  1. Recolectar y mantener embriones como se describe en el paso 2. Dechorionato embriones en 2 dpf.
  2. Cribar larvas de eGFP+ en 4 dpf como se describe en el paso 3.2. En lugar de placas de Petri, coloque las larvas de eGFP + en placas de 6 pocillos a una densidad de n ≤ 10 larvas por 6 pocillos para el tratamiento farmacológico. Designe placas separadas de 6 pocillos para larvas que no se ablacionarán (MTZ-) y larvas que serán ablacionadas (MTZ +).
    NOTA: La señal eGFP es visible en 4 dpf, pero parece más tenue que la intensidad de la señal en 5 dpf.
  3. Pretratar larvas de eGFP+ de 4 dpf con 15 μM IWR-1 o control de vehículo DMSO de volumen emparejado durante exactamente 24 h antes de la ablación genética con solución MTZ de 10 mM.
    NOTA: A menudo, se necesita muy poco compuesto para los experimentos de tratamiento farmacológico. Para evitar pesar pequeñas cantidades de polvo de IWR-1, este compuesto farmacológico se compra ya en solución DMSO, a una concentración de 25 mM, y se alicita en volúmenes más pequeños a su llegada para evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación.
    1. Determinar el volumen de tratamientos farmacológicos y de control de vehículos necesarios y alícuota 1.5x PTU en tubos cónicos en consecuencia. Se recomienda un volumen de 5 ml/pocillo de una placa de 6 pocillos.
    2. Añadir el stock de IWR-1 a 1,5x PTU para una concentración final de 15 μM de IWR-1 (por ejemplo, 3 μL de 25 mM de IWR-1 por 5 mL de 1,5x PTU). Agregue un volumen coincidente de existencias de DMSO a 1,5x PTU (por ejemplo, 3 μL ≥ 99,7% DMSO por 5 mL de 1,5x PTU). Aquí, esto terminará produciendo una concentración final de 0.06% volumen / volumen (% v / v) DMSO. Mezclar bien por vórtice y confirmar visualmente la disolución de los compuestos.
      PRECAUCIÓN: DMSO, IWR-1 y otros compuestos farmacológicos y solventes pueden necesitar ser eliminados como desechos químicos dependiendo de las regulaciones estatales e institucionales. Se recomienda la confirmación del nivel de peligro y los métodos adecuados de eliminación de desechos para estos compuestos, si los hubiera, antes de su uso.
    3. Retire 1.5x PTU de las larvas de eGFP+ en placas de 6 pocillos y agregue 5 mL/pocillo de DMSO recién hecho al 0.06% v/v o tratamientos IWR-1 de 15 μM del paso 5.3.2.
  4. En 5 dpf, ablate el RPE. Además del pretratamiento de 24 h (paso 5.3), las larvas permanecerán inmersas en tratamientos farmacológicos y de control de vehículos durante 24 h de ablación genética con 10 mM MTZ y durante la recuperación post-ablación, hasta la fijación (por ejemplo, de 4-9 dpf).
    1. Hacer 10 mM MTZ solución 2 h antes de realizar la ablación genética (paso 3.1).
    2. Determinar el volumen de tratamientos farmacológicos y de control de vehículos necesarios para placas de 6 pocillos no ablacionadas (MTZ-) y ablacionadas (MTZ+) y alícuotas volúmenes apropiados de agua fresca del sistema sin PTU (MTZ-) o solución MTZ de 10 mM (MTZ+) en tubos cónicos. Esto producirá cuatro condiciones de tratamiento: 1) 0.06% v / v DMSO, MTZ-; 2) 15 μM IWR-1, MTZ-; 3) 0.06% v/v DMSO, MTZ+; y 4) 15 μM IWR-1, MTZ+.
    3. Agregue soluciones de stock IWR-1 y DMSO a los tubos cónicos respectivos como se realiza en el paso 5.3.2. Mezclar bien por vórtice y confirmar visualmente la disolución de los compuestos.
    4. Retire los tratamientos con DMSO al 0,06% v/v y 15 μM IWR-1 en 1,5x PTU (paso 5.3.2) de las placas de 6 pocillos designadas no ablacionadas (MTZ-) y ablacionadas (MTZ+) y reponga con los tratamientos apropiados realizados en el paso 5.4.3.
    5. Retire los tratamientos DMSO al 0,06% v/v y 15 μM IWR-1 en solución MTZ de 10 mM después de exactamente 24 h y reponga con tratamientos en agua dulce del sistema sin PTU. Reponga los tratamientos dmSO v/v 0,06% y IWR-1 de 15 μM en agua dulce del sistema sin PTU en la placa o placas de 6 pocillos no abraminadas (MTZ-).
  5. Siga el mantenimiento larvario después de la ablación como se describe en el paso 4 y reponga 0.06% v / v DMSO o 15 μM IWR-1 tratamientos diariamente en agua del sistema sin PTU.
  6. Sacrificar las larvas a 9 dpf (4 dpi para hermanos tratados con MTZ de la misma edad) sumergiendo a los animales en una solución de tricaína de 0,3 g / L (sobredosis letal) junto con un enfriamiento rápido (por ejemplo, colocar placas de Petri en hielo) durante al menos 20 min30. Verifique que las larvas no respondan al tacto y se fijen en PFA al 4% (paso 1.5) durante 3 h a temperatura ambiente o a 4 ° C durante la noche.
  7. Procese el tejido larvario posterior a la fijación para la adquisición de imágenes de la pila z en un microscopio confocal como se describió anteriormente 5,31 y aquí en la sección Resultados representativos. El análisis en los pasos 6 y 7 requerirá, como mínimo, la adquisición de marcadores nucleares (por ejemplo, DAPI) e imágenes de pila z de campo brillante.

6. Preprocesamiento de imágenes z-stack de microscopio confocal en FIJI (ImageJ)

  1. Importe y formatee imágenes de la pila z del microscopio confocal utilizando FIJI32.
    1. Abra imágenes de microscopio utilizando las Opciones de importación de bioformatos establecidas en Ver pila con: Hyperstack y Modo de color: Escala de grises.
    2. Genere una proyección de máxima intensidad de la imagen del microscopio importada eligiendo Imagen | Pilas | Proyecto Z. En la ventana ZProjection , establezca Iniciar sector y Detener sector para incluir todos los sectores de esa imagen. Por ejemplo, establezca Start Slice: 1 y Stop Slice: 18 para una pila z que tenga un total de 18 slices. Elija Tipo de proyección: Intensidad máxima y haga clic en Aceptar.
    3. Convierta el archivo de proyección de máxima intensidad en una imagen de 8 bits (si aún no lo ha hecho) eligiendo Imagen | Tipo | 8 bits.
    4. Reoriente la imagen para que el lado dorsal esté hacia arriba y el distal (es decir, la lente) se deje eligiendo Imagen | Transformar | Voltear horizontalmente (para el último comando, elija la opción que mejor se adapte a la direccionalidad necesaria para esa imagen). Para obtener una imagen multicanal, haga clic en Sí en la pila de procesos. para reorientar todos los canales.
      NOTA: Este paso es crítico, pero no es necesario si la imagen ya está en la orientación dorsal hacia arriba, distal izquierda. Consulte la Figura 3A-D y la Figura 4 para imágenes con ojos en la direccionalidad correcta para el procesamiento.
    5. Guarde la proyección de intensidad máxima de 8 bits como un archivo de formato de archivo de imagen etiquetada (TIF) seleccionando Archivo | Guardar como | Tiff....
  2. Generar RPE región de interés (ROI) utilizando FIJI.
    1. Abra una imagen TIF de 8 bits generada como se describe en el paso 6.1. Inicie el Administrador de ROI eligiendo Analizar | Herramientas | Gestor de ROI.
    2. Usar | de imagen Zoom y alternar entre el DAPI y los canales de campo brillante para identificar los puntos en los que el lado apical del RPE está adyacente a la punta de la membrana limitante externa (OLM) (Figura 3B', B", D', D"; puntas de flecha azules). Utilice este hito anatómico como punto de partida del ROI.
    3. Cree el ROI de RPE con la herramienta Selecciones de polígonos (en la barra de herramientas FIJI) utilizando los canales de imagen DAPI y de campo brillante y la función de zoom (Imagen | Zoom) para identificar los límites apicales y basales del EPR. Lleve los extremos dorsal y ventral del ROI (es decir, donde el ROI pasa del lado apical al basal del RPE) a un punto agudo en lugar de embotar o redondear (Figura 3B', B", D', D"; líneas magenta).
      NOTA: La creación de un extremo de ROI puntiagudo es un paso crítico para optimizar la detección de puntos finales mediante RpEGEN y se aborda en la sección Discusión.
    4. Agregue el ROI haciendo clic en Agregar en el Administrador de ROI. Ajuste el ROI según sea necesario y haga clic en Actualizar en el Administrador de ROI.
    5. Guarde el archivo ROI eligiendo Más>> | Salvar... dentro del ROI Manager. Utilice nombres idénticos para los archivos de imagen ROI y TIF coincidentes (por ejemplo, [nombre de archivo].tif y [nombre de archivo].roi).
  3. Combine archivos TIF y ROI de 8 bits para cada condición en una sola carpeta. Por ejemplo, la carpeta, DMSO_9dpf, contendrá todos los archivos TIF y ROI coincidentes para el grupo larvario tratado con DMSO de 9 dpf sin abrir (MTZ-) 0.06% v/ v.

7. Cuantificación y visualización de la regeneración RPE mediante scripts RpEGEN

  1. Instale y prepare scripts RpEGEN.
    1. Descargue los últimos scripts rpEGEN del repositorio de GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) haciendo clic en Code | Descargar ZIP.
    2. Descomprima la carpeta y colóquela en la ubicación del espacio de trabajo deseada (por ejemplo, Escritorio).
    3. Abra MATLAB.
    4. Desplácese hasta la carpeta RpEGEN en el panel Carpeta actual (normalmente en el lado izquierdo).
    5. Haga clic derecho en la carpeta RpEGEN y elija Agregar a la ruta | Carpetas y subcarpetas seleccionadas. Esto agrega la carpeta a la ruta de MATLAB para que pueda buscar y ejecutar automáticamente cualquier script de la carpeta.
    6. Haga doble clic en la carpeta RpEGEN en el panel Carpeta actual para mostrar todas las subcarpetas y los archivos M.
    7. Haga doble clic en el archivo RpEGEN.m para abrirlo en el panel Editor .
    8. En la sección VARIABLES DEFINIDAS POR EL USUARIO del archivo RpEGEN.m, escriba las ubicaciones de directorio de las carpetas que contienen los archivos ROI (.roi), los archivos de imagen (.tif) y dónde se deben guardar los archivos de salida. Introduzca el nombre del grupo para el archivo .mat que se va a exportar (por ejemplo, DMSO_9dpf, DMSO_4dpi, etc.) y la ubicación del canal de campo brillante en la pila de imágenes TIF (por ejemplo, 3, si brightfield es el tercer canal de una pila de imágenes). Si el archivo de imagen solo contiene la imagen de campo brillante, entonces esto debe ser igual a 1.
  2. Ejecute el script RpEGEN.m y valide los resultados.
    NOTA: RpEGEN requiere que image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox y Statistics and Machine Learning Toolbox estén activados en la licencia de MATLAB de usuario para poder ejecutarse. Además, se requiere la caja de herramientas ReadImageJROI33 disponible gratuitamente para importar FIYI ROIs a MATLAB; sin embargo, se proporciona en la carpeta RpEGEN junto con otros archivos de función M que no requieren ninguna activación.
    1. Ejecute el script haciendo clic en el botón Ejecutar del menú Editor en la parte superior de MATLAB.
      NOTA: Una vez iniciado, la ventana Comando proporcionará un resultado detallado que indica la progresión del script. Después de guardar el archivo MAT que contiene los datos extraídos, aparecerá una figura de tres paneles y se guardará como PDF en el directorio de salida para cada ejecución de imagen. Estas son cifras de control de calidad (QC) para asegurarse de que todo se haya ejecutado correctamente e incluyen: 1) la imagen de campo brillante superpuesta por el ROI (Figura 4A); 2) el ROI con la línea central y la distancia angular asociada (grados) (Figura 4G); y 3) el ROI con los valores de intensidad de la mediana de la línea central (0-255, escala de color de 8 bits) (Figura 4H). Espere hasta que los PDF de control de calidad se hayan guardado en la carpeta de salida y la última figura haya desaparecido antes de continuar con el siguiente paso.
    2. Abra los pdf individuales exportados a la carpeta de salida en cualquier visor de PDF y verifique que todos los ROI coincidan con las imágenes de campo brillante, que los valores de la línea central sean aproximaciones razonables del centro de los ROI y que los valores de intensidad media estén debidamente rellenados con datos (es decir, no todos el mismo valor en toda la línea central).
      NOTA: Una descripción detallada y la estructura de cada variable guardada en el archivo MAT por RpEGEN.m se puede encontrar en la Tabla 1.
  3. Ejecute el script RpEGEN_PermPlot.m.
    NOTA: El script RpEGEN_PermPlot.m utiliza la salida de RpEGEN.m para ejecutar comparaciones estadísticas utilizando una simulación de permutación de las medianas de dos grupos y también proporciona el código para reproducir las gráficas de este documento utilizando la caja de herramientas GRAMM34 disponible gratuitamente, que también se ha incluido en la carpeta RpEGEN.
    1. Haga doble clic en el archivo RpEGEN_PermPlot.m para abrirlo en una nueva pestaña del Editor .
    2. En la SECCIÓN 1 - VARIABLES DEFINIDAS POR EL USUARIO en el archivo RpEGEN_PermPlot.m, ingrese la ubicación del directorio para la carpeta de salida que contiene los archivos MAT de la ejecución de RpEGEN.m e ingrese cada nombre de archivo MAT que se cargará (por ejemplo, DMSO_4dpi.mat, IWR1_4dpi.mat).
    3. Ejecute esta sección del script haciendo clic en el botón Ejecutar sección en el menú Editor en la parte superior de MATLAB.
    4. En la Sección 2, ingrese los nombres de los dos grupos para la comparación estadística en el data_A y data_B variables (estos son los grupos de los cuales se derivarán las medianas utilizando la simulación de permutación). En la variable bin_sz , especifique el número de grados sobre los que se integrarán los valores de intensidad media de los conjuntos de datos (el valor predeterminado es bins de 1 grado).
      NOTA: La variable reps indica el número de permutaciones que se deben usar para construir una distribución de probabilidad y se puede establecer en cualquier número (el valor predeterminado es 20,000). En general, un mayor número de repeticiones será estadísticamente más robusto, pero aumentará el tiempo de procesamiento.
    5. Ejecute esta sección del script haciendo clic en el botón Ejecutar sección en el menú Editor en la parte superior de MATLAB. Esta sección puede tardar algún tiempo en completarse en función del número de repeticiones especificadas, pero proporciona una actualización continua del estado en la ventana de comandos.
    6. Ejecute las secciones FIGURA DE MAPA DE CALOR y RESULTADOS DE GRUPO Y VALORES P de forma independiente mediante el botón Ejecutar sección . Edite variables de datos en cualquier sección comentada con "ENTER DATA HERE". Los PDF de estas figuras se guardan automáticamente para cada uno y se pueden modificar fácilmente en cualquier software vectorial de posprocesamiento.
      NOTA: Las gráficas generadas en el archivo RpEGEN_PermPlot.m son ad hoc y es probable que requieran modificaciones basadas en los datos específicos de cada usuario y las necesidades de visualización. Sin embargo, las cifras proporcionan una base sólida que se puede individualizar fácilmente utilizando los sitios web de MATLAB y GRAMM.

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Representative Results

Se sabe que la inhibición de la vía canónica de señalización Wnt perjudica significativamente la regeneración del RPE del pez cebra utilizando el paradigma de ablación genética (rpe65a: nfsB-eGFP) y la metodología de manipulación farmacológica (IWR-1) descrita en el protocolo3. Este experimento se repitió aquí para validar un método automatizado para cuantificar la regeneración de RPE del pez cebra basada en la pigmentación. Los resultados resumidos a continuación abarcaron todos los pasos del protocolo, desde el día de la fertilización (0 dpf) hasta la cuantificación de la regeneración de RPE utilizando RpEGEN.

Implementación del protocolo de ablación RPE (con manipulación farmacológica) en larvas de pez cebra
Los embriones recolectados de tres grupos parentales separados (N = 3) comenzaron el tratamiento con 1,5x PTU alrededor de 6 hpf y la ausencia de pigmentación en el EPR y los melanocitos de superficie se confirmó visualmente en 1 dpf. Los embriones fueron descoronados enzimáticamente a 2 dpf usando 2 mg/ml de pronasa (paso 2.4). En 4 dpf, las larvas fueron anestesiadas usando tricaína (MS-222) y examinadas para eGFP usando un microscopio estereoscópico de fluorescencia (pasos 3.2 y 5.2). Las larvas de eGFP+ se trasladaron a placas de 6 pocillos (n = 10 larvas/pozo) y se trataron con DMSO (control del vehículo) de 0,06% v/v o IWR-1 de 15 μM (paso 5.3). La densidad larvaria reportada aquí se basó inicialmente en la aproximación de 1 larva / cm2 área de crecimiento y se validó a través de un cuidadoso monitoreo de la salud (por ejemplo, desarrollo de la vejiga natatoria) a lo largo del tiempo. La intensidad de eGFP parecía tenue en 4 dpf, por lo que las larvas se volvieron a examinar en 5 dpf para confirmar la expresión brillante de eGFP (Figura 1). RPE65 (rpe65a en pez cebra) es un marcador de RPE7 maduro y, en peces teleósteos, las células retinianas y RPE se generan continuamente a partir de la zona marginal ciliar (CMZ), un nicho de células madre en la punta distal de la retina, adyacente a la lente35. Así, en la línea transgénica rpe65a:nfsB-eGFP, los RPE más inmaduros existen en la periferia y aparecen eGFP- (aproximadamente un tercio del tejido RPE total) mientras que los dos tercios centrales maduros del RPE expresan eGFP (Figura 1B; puntas de flecha blancas). El transgén también fue visible en la glándula pineal (Figura 1A; punta de flecha amarilla), que se esperaba ya que rpe65a muestra expresión pineal en el pez cebra36. Las larvas comparativamente tenues o eGFP- fueron extraídas de placas de 6 pocillos y sacrificadas en 5 dpf. Exactamente a las 24 h posteriores al tratamiento con DMSO o IWR-1, se trataron 5 larvas dpf con 10 mM MTZ para extirpar el EPR (pasos 3.1, 3.3 y 5.4). MTZ se lavó después de exactamente 24 h (es decir, en 6 dpf / 1 dpi) para permitir que se produjera la regeneración de RPE.

Las larvas se observaron diariamente en un microscopio estereoscópico utilizando iluminación de luz transmitida de 6 dpf / 1 dpi al momento de la eutanasia en 9 dpf / 4 dpi. El éxito de la ablación genética se confirmó in vivo a 2 dpi por la ausencia de pigmento en los dos tercios centrales del ojo en larvas MTZ+ (Figura 2B; puntas de flecha rojas) en comparación con 7 dpf MTZ- hermanos control (Figura 2A) (paso 4.2). Como se anticipó, el área desprovista de pigmento en 2 dpi parecía análoga a la región de expresión transgénica rpe65a:nfsB-eGFP observada en 5 dpf (Figura 1B). La evaluación se realizó a 2 dpi y no antes, ya que el EPR sometido a repigmentación después de la extracción de la PTU y, dependiendo del tiempo de observación in vivo, una marcada diferencia entre el EPR central ablacionado y el EPR periférico no ablacionado (no ablacionado) puede ser difícil de discernir si este último no se ha reimpmentado completamente. A pesar de la posibilidad de ambigüedad macroscópica, previamente se demostró que la ablación de RPE a 1 dpi era fácilmente evidente en el tejido seccionado, revelando una pérdida de RPE central y de la integridad tisular de la capa nuclear externa (ONL; es decir, fotorreceptor) junto con evidencia de muerte celular (núcleos picnóticos) (Figura 5)3. Contrariamente a la pérdida de tejido, se determinó que la proliferación robusta era un factor clave durante la regeneración tisular en el modelo3 de pez cebra rpe65a:nfsB-eGFP. Tanto la respuesta apoptótica temprana, donde la ablación de RPE conduce a la degeneración de los tejidos adyacentes (por ejemplo, fotorreceptores y la membrana de Bruch; Figura 6A-C), y la respuesta proliferativa periférica a central que sigue, que produce "zonas" de regeneración heterogéneas que se mueven hacia adentro en el sitio de la lesión (Figura 6D-F), han sido ampliamente caracterizadas y discutidas anteriormente3.

Preparación de tejidos, adquisición de imágenes confocales y preprocesamiento de imágenes para cuantificación automatizada basada en pigmentación RPE utilizando RpEGEN
Con 9 dpf/4 dpi, las larvas tratadas con DMSO e IWR-1 fueron sacrificadas por sobredosis de tricaína y fijadas en PFA al 4% durante 3 h a temperatura ambiente (paso 5.6). Cuatro larvas de cada grupo parental independiente fueron elegidas al azar para el procesamiento tisular posterior (N = 3; n = 12 larvas por tratamiento). La crioprotección, la crioseccionación (a 12 μm de espesor), la contratinción nuclear con DAPI y el montaje de la cubierta se realizaron como se indica en el paso 5.7 5,31. Se tomó una imagen de una sección central, con nervio óptico visible, de cada larva en un microscopio de barrido láser confocal utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 40x (apertura numérica = 1.30) para adquirir imágenes de pila z de 512 x 512 píxeles con un intervalo de paso z de 1 μm. Cada imagen contenía datos de tres canales: canal 1 = excitación de 405 nm para DAPI, canal 2 = excitación de 488 nm para eGFP, canal 3 = luz transmitida para campo brillante. A medida que la intensidad de los píxeles se cuantificó en imágenes de campo brillante, los ajustes de voltaje de la lámpara de luz transmitida se mantuvieron constantes y todos los datos recopilados para las comparaciones estadísticas se tomaron imágenes el mismo día.

Las imágenes de la pila z del microscopio confocal se preprocesaron para la cuantificación automatizada como se describe en el paso 6, utilizando FIJI. Las imágenes se excluyeron del preprocesamiento y la cuantificación si el tejido se vio comprometido de una manera que dificultaría la generación de ROI (por ejemplo, del desgarro (Figura 7A; puntas de flecha magenta) u obstrucción de punto de referencia (Figura 7B; óvalos magenta)) o sesgar las mediciones de intensidad del ROI (por ejemplo, desde el plegado (Figura 7C; óvalos magenta)). A pesar de omitir algunas larvas con estos criterios de exclusión, todos los conjuntos de datos aquí representados representan N = 3 con el siguiente número de réplicas biológicas (larvas): n = 11, DMSO MTZ-; n = 10, IWR-1 MTZ-; n = 11, DMSO MTZ+; n = 12, IWR-1 MTZ+. Utilizando el canal DAPI, los ROI de EPR se iniciaron identificando primero el punto en el que el lado apical dorsal del EPR (orientado a la retina) estaba directamente adyacente a la punta dorsal del OLM (Figura 3B',D'; puntas de flecha azules) (paso 6.2.2). Como la extensión distal del RPE puede variar entre secciones, el OLM se utilizó como un punto de referencia anatómico para estandarizar los puntos finales del RPE ROI y normalizar las mediciones de distancia angular en MATLAB (donde 0° = punto final del ROI dorsal y 180° = punto final del ROI ventral). Al realizar ablaciones de EPR con manipulación farmacológica o en un fondo mutante, se debe identificar y validar un hito anatómico antes del preprocesamiento y la cuantificación. Aquí, el OLM fue evidente en todas las larvas cuantificadas y no se vio comprometido por el desgarro (como en Figura 7B) o tratamiento con DMSO o IWR-1. Después de identificar el punto de partida dorsal, se generaron ROI siguiendo el lado apical del EPR (dorsal a ventral) hasta que se alcanzó el punto adyacente a la punta del OLM ventral (Figura 3B",D"; puntas de flecha azules). Luego, se realizó un punto final de ROI ventral entre los lados apical y basal (orientado hacia la coroides) del EPR como se discutió en el paso 6.2.3 (Figura 3B",D"; línea magenta). El ROI se continuó, siguiendo el lado basal del EPR (ventral-a-dorsal) hasta llegar al lado basal adyacente al punto de partida en el OLM dorsal. El ROI se encerró entonces creando un extremo dorsal puntiagudo (Figura 3B',D'; línea magenta) como se hace ventralmente. Se ha demostrado que la ablación genética da lugar a una pérdida de la expresión central de eGFP que se recupera a medida que avanza la regeneración (resumido en Figura 6)3; por lo tanto, dependiendo del grado de regeneración y la intensidad de eGFP en el punto de interés temporal, el canal eGFP solo puede ser útil para la generación de ROI en el MTZ- grupo. Por lo tanto, mientras que las adquisiciones confocales también contenían imágenes de canal eGFP, la generación de ROI se completó utilizando los canales DAPI y brightfield como se menciona en el paso 6.2.3. La generación de RPE ROI fue sencilla en MTZ tratada con DMSO e IWR-1- grupos larvales y regiones abarcadas con microvellosidades apicales visiblemente pigmentadas (Figura 3B; punta de flecha roja) junto con los cuerpos celulares prominentemente pigmentados. Se aplicaron los mismos parámetros a MTZ+ grupos larvales (Figura 3D; punta de flecha roja); sin embargo, debido al tejido dañado residual dentro del sitio de la lesión, las microvellosidades apicales y los límites de pigmentación fueron difíciles de delinear solo en el canal de campo brillante en algunos casos. En estas áreas, el canal DAPI también se utilizó para identificar desechos celulares dentro del sitio de lesión de RPE, que se incluyó en el ROI (Figura 3C,D; ejemplos de lesión de desechos celulares localizados en el sitio se indican con puntas de flecha cian). Inmunotinción con marcadores de EPR inmaduro/maduro (por ejemplo, ZPR2; Figura 6D,E)37 y/o fotorreceptores (por ejemplo, ZPR1)37,38 también podría emplearse para facilitar el esbozo de los ROI de EPR en larvas ablacionadas.

Anteriormente, las larvas ablacionadas tratadas con IWR-1 de 4 dpf a 4 dpi mostraron un deterioro significativo de la regeneración de RPE en comparación con los controles hermanos tratados con DMSO (Figura 8C)3. Esto se informó como el porcentaje de recuperación de pigmento central, que requirió una experiencia previa sustancial con el modelo y las mediciones manuales de distancia angular para designar los límites de regeneración (Figura 8B; puntas de flecha negras). RpEGEN fue creado para automatizar la cuantificación de la regeneración de RPE y reducir los sesgos intrínsecos. No solo eso, RpEGEN también permitió la generación de conjuntos de datos altamente robustos; por ejemplo, previamente se generaron 10 puntos de datos a partir de la cuantificación manual de n = 10 larvas MTZ+ tratadas con DMSO (Figura 8C; % de recuperación de pigmento por mediciones de sección)3, mientras que 174.801 puntos de datos se generaron a partir de n = 11 larvas/ROI MTZ+ tratadas con DMSO aquí utilizando RpEGEN (Figura 9C; mediciones de intensidad de píxeles).

RpEGEN se desarrolló para evaluar incrementalmente los cambios regionales en la pigmentación en la totalidad del RPE al derivar una línea central esqueletizada (ancho de 1 píxel) del ROI original generado utilizando FIJI (Figura 4A, B). Para incorporar todos los píxeles dentro del ROI para el análisis (es decir, no solo los píxeles de la línea central), se realizó una transformación de distancia euclidiana en cada píxel de la línea central para crear un mapa del índice de línea central más cercano para cada píxel en la máscara de ROI. Este mapa de índices permitió que cada píxel fuera de la línea central se atribuyera a un solo píxel de línea central, creando un conjunto de datos completo en todo el RPE para cada larva (Figura 4E). La longitud dorsal a ventral del EPR se representó mediante distancia angular (Figura 4G; 0-180°) en oposición a la distancia de píxeles normalizada (Figura 4F; 0-1 unidades arbitrarias), ya que esto fue más intuitivo basado en mediciones previas de regeneración de RPE 3,4,5 y el hecho de que la distancia angular no varía con diferencias morfológicas. Las intensidades medianas derivadas de los contenedores de 5 grados fueron la métrica elegida para resaltar las tendencias a gran escala y minimizar la variabilidad de alta frecuencia observada en los datos agrupados de 1 grado (Tabla 1, Figura 10A). Se eligió la simulación de permutación para probar la hipótesis nula para ver si las medianas de los dos grupos de tratamiento (aquí, DMSO MTZ+ e IWR-1 MTZ+ (ambos de 4 dpi), Figura 10B) son similares39. Esta técnica de remuestreo carece de suposiciones estrictas sobre la distribución de los datos y se puede utilizar en una variedad de estadísticas de prueba (por ejemplo, media, mediana, etc.) para generar estimaciones sólidas del valor p. Varios de estos parámetros (por ejemplo, el tamaño del contenedor de datos sin procesar y medianos, las repeticiones de simulación de permutación, etc.) se pueden adaptar y modificar para adaptarse a las necesidades del usuario. Para este último, se eligieron 20,000 repeticiones para generar una comparación estadísticamente robusta, sin embargo, se debe tener cuidado de equilibrar la eficiencia computacional con la robustez estadística, ya que muy pocas repeticiones pueden producir estimaciones erróneas del valor p. Se recomienda ejecutar múltiples valores de repetición (10.000, 20.000, etc.) para asegurar que la distribución y los valores del valor p sean relativamente estables antes de comenzar las interpretaciones. El aumento de las repeticiones de permutación aumentará la potencia estadística (pero también tardará más en ejecutarse), lo que puede ser beneficioso para algunos conjuntos de datos.

Los conjuntos de datos de imágenes confocales se cuantificaron utilizando RpEGEN como se describe en el paso 7. El RpEGEN anotado y los scripts de soporte están disponibles en GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) junto con el TIF de 8 bits y los archivos ROI correspondientes para que los usuarios interesados los prueben. Los mapas de calor que muestran datos brutos de roIs larvales de MTZ mostraron una distribución general de intensidades de píxeles más oscuras (donde 0 = negro y 255 = blanco, escala de color de 8 bits) que abarca la longitud dorsal (0 °) a ventral (180 °) del EPR, independientemente del tratamiento con 0.06% v / v DMSO o 15 μM IWR-1 (Figura 9A, B). El trazado de las intensidades medias de píxeles facilitó la visualización entre todos los grupos y mostró similitudes entre los grupos MTZ- a través del RPE (Figura 10A; líneas negras y grises). Estos datos respaldaron la presencia de una monocapa de RPE pigmentada intacta (Figura 9E, F) y proporcionaron valores de intensidad de píxeles medios de referencia (es decir, por debajo de 150) para RPE no ablacionado (Figura 10A; líneas negras y grises). Comparativamente, los datos brutos (Figura 9C, D) y mediana (Figura 10A; líneas azules y rojas) de los ROI larvales MTZ + mostraron una distribución general de intensidades de píxeles más claras en el EPR central, nuevamente, independientemente de la condición del tratamiento. Las larvas tratadas con DMSO ablacionadas mostraron una distribución centralizada de píxeles de luz a aproximadamente 100 ° (± 15 °) (Figura 9C; contenedores de color rojo anaranjado). Esto correspondió a una ausencia visible de pigmentación en el sitio central de la lesión por EPR en/alrededor del nervio óptico (Figura 9G; puntas de flecha azules). Las larvas tratadas con IWR-1 ablacionadas también mostraron una distribución centralizada de píxeles de luz que se expandieron tanto dorsalmente (a alrededor de 50 °) como ventralmente (aproximadamente 5 °) en comparación con los controles hermanos tratados con MTZ + DMSO (Figura 9D; contenedores de color rojo anaranjado). La presencia de un sitio de lesión expandido fue claramente visible en el tejido seccionado (Figura 9H; puntas de flecha azules). A excepción de dos contenedores de 1 grado, la diferencia observada entre los grupos MTZ+ fue estadísticamente significativa en el EPR central (Figura 10B; área sombreada de color azul claro entre ~40-140°; El valor p ≤ 0,05), lo que indica una pigmentación significativamente menor de RPE central en larvas tratadas con MTZ+ IWR-1 en comparación con los controles hermanos tratados con MTZ+ DMSO. La interpretación de estos datos brutos (Figura 9C,D) y medianos (Figura 10A) con comparación estadística (Figura 10B) utilizando RpEGEN se validó no solo mediante la observación de tejido seccionado (Figura 9G, H), sino que también apoyó los hallazgos previos de la cuantificación manual (Figura 8)3.

Figure 1
Figura 1: expresión transgénica de rpe65a:nfsB-eGFP a los 5 días posteriores a la fecundación. (A-C) Imágenes de montaje completo de una larva de 5 dpf tratada con PTU que muestran una expresión transgénica tenue en la glándula pineal (A; punta de flecha amarilla) y una expresión de transgen brillante en el EPR (B, C) en el momento de la detección de la ablación genética. (B) La expresión transgénica está visiblemente localizada en los dos tercios centrales del EPR, y las puntas de flecha blancas resaltan el límite entre el EPR periférico (inmaduro) y central (maduro). Verde = eGFP. Anterior está arriba. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Verificación de la ablación genética exitosa del EPR in vivo. Imágenes de montaje completo de (A) tres larvas no ablacionadas (MTZ-) de 7 dpf que muestran pigmentación RPE en todo el ojo y (B) tres larvas ablacionadas (MTZ +) de 2 dpi que muestran una zona de ablación donde hay una ausencia de pigmento en los dos tercios centrales del RPE (puntas de flecha rojas).. Anterior está arriba. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Regiones de interés (ROI) de RPE para la cuantificación automatizada utilizando RpEGEN. Criosecciones transversales de (A,B) una larva no ablacionada (MTZ-) de 9 dpf y (C,D) una larva ablada (MTZ+) de 4 dpi con los ROI de EPR resaltados en magenta. (B,D) Las puntas de flecha rojas resaltan las regiones donde las microvellosidades apicales visiblemente pigmentadas se incluyeron en el ROI. (C,D) Las puntas de flecha cian apuntan a regiones de ejemplo de escombros DAPI + localizados en el sitio de la lesión, que se utilizaron para incluir los desechos de células RPE en el ROI. (B',B",D',D") Los zooms digitales de las regiones de ROI dorsal y ventral (cuadros punteados negros en B y D) muestran los puntos de partida de ROI sugeridos (puntas de flecha azules) y los extremos de ROI puntiagudos que son críticos para la detección de endpoints en MATLAB. Las imágenes de campo brillante también se muestran en la Figura 9E,G. Blanco/gris = núcleos. La dorsal está arriba y la distal está a la izquierda. (A-D) Barras de escala = 40 μm. (B',B",D',D") Barras de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Flujo de trabajo de procesamiento RpEGEN. (A) Ejemplo de una imagen de campo brillante de 8 bits correctamente orientada y un ROI (rojo) generado por FIJI importado a MATLAB. La dorsal está arriba y la distal está a la izquierda. La barra de color representa valores de intensidad de escala de grises de 8 bits donde 0 = negro y 255 = blanco. (B) Esqueletización binaria inicial (blanco) de la máscara ROI (rojo) que muestra la presencia de espolones erróneos y la delineación de los puntos inicial y final para la delineación de distancia de píxeles geodésicos como se muestra en (C). La barra de color en (C) representa la distancia de píxeles euclidianos. (D) Los espuelas se eliminan utilizando una ruta simplificada de menor costo desde el píxel final hasta el píxel inicial, lo que resulta en una línea central continua desprovista de espolones (rojo). (E) Índices de línea central lineal más cercanos basados en una transformación de distancia entre todos los píxeles de la máscara roi y los píxeles de la línea central (blanco). Estos valores de índice permiten que cada píxel de imagen dentro de la máscara roi se asigne al píxel de línea central más cercano para su análisis. La barra de color representa los valores del índice de píxeles de la línea central lineal. (F) Un ejemplo de la distancia de píxeles normalizada a lo largo de la línea central, donde 0 (azul, píxel dorsal más distal) es el píxel de inicio y 1 (rojo, píxel ventral más distal) es el píxel final. (G) Similar a (F) pero usando la distancia angular, donde 0 grados (azul) es el píxel de inicio y 180 grados (rojo) es el píxel final. (H) Ejemplo de los valores medios de intensidad de píxeles calculados para cada píxel de la línea central. La barra de color representa el valor medio de intensidad de escala de grises de todos los píxeles roi que contribuyen a cada píxel de línea central dado. Esta figura muestra imágenes de un conjunto de datos de prueba y no larvas de los grupos de tratamiento 0.06% v/v DMSO o 15 μM IWR-1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Evidencia de ablación de RPE y degeneración de fotorreceptores. (A) Criosecciones transversales de una larva de 6 dpf no ablacionada. (A,A') Después de la exposición a la PTU, la expresión transgénica se restringe a las células RPE maduras, con la expresión más brillante confinada a los dos tercios centrales del RPE. Las puntas de flecha indican microvellosidades apicales. (A") Las imágenes de contraste de interferencia diferencial (DIC) revelan una arquitectura normal de la capa nuclear externa (ONL; es decir, fotorreceptor). (B,B') Las criosecciones transversales de una larva de 1 dpi revelan una interrupción significativa de la morfología celular eGFP + y desorganización en la laminación ONL. Las flechas indican núcleos delaminados y picnóticos. (B") Las imágenes dic revelan aún más la marcada interrupción de la arquitectura ONL. Verde = eGFP, azul = núcleos, amarillo = ONL. La dorsal está arriba y la distal está a la izquierda. La barra de escala en (A) representa 40 μm y se puede aplicar a (B). La barra de escala en (A') representa 40 μm y se puede aplicar a (A",B',B"). Esta figura y el texto de la leyenda de la figura han sido modificados de Hanovice et al. 2019 (Figura 1)3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Modelo de regeneración de EPR en larvas de pez cebra. (A) nfsB-eGFP se expresa en EPR maduro en los dos tercios centrales del ojo. (B) La aplicación de MTZ conduce a la apoptosis (TUNEL, rojo) de RPE y fotorreceptores. (C) La ablación de RPE conduce a la degeneración de los fotorreceptores y la membrana de Bruch (línea punteada). (D) El EPR no ablacionado en la periferia comienza a proliferar y extenderse hacia el sitio de la lesión (azul). (E) A medida que el EPR eGFP+ regenerado aparece en la periferia, el EPR se puede dividir en cuatro zonas: EPR periférico (pRPE), EPR diferenciado (dRPE), zona de transición (TZ) y sitio de lesión (IS). (E, recuadro) El EPR diferenciado regenerado (verde) aparece en la periferia proximal al EPR periférico no ablacionado, y contiene células proliferativas adyacentes a la zona de transición. La zona de transición consiste en células RPE aún diferenciadoras (ZPR2, rojo) y células proliferativas (azul). El sitio de la lesión comprende células proliferativas no pigmentadas que no expresan ningún marcador de diferenciación de EPR. (F) La regeneración de una capa funcional de RPE y la membrana de Bruch se completa en 14 dpi. Esta figura y el texto de la leyenda de la figura han sido modificados de Hanovice et al. 2019 (Figura 14)3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Secciones de tejido comprometidas excluidas del análisis de imágenes. (A-C) Criosecciones transversales de larvas de los conjuntos de datos DMSO de 0,06% v/v y 15 μM IWR-1 que cumplieron con los criterios de exclusión. Una larva muestra desgarro dorsal del tejido RPE (A; puntas de flecha magenta) y otras dos larvas muestran plegamiento del tejido que obstruye un hito anatómico (OLM dorsal) en el canal DAPI (B; óvalos punteados magenta) o puede sesgar las mediciones de intensidad de RPE desde el canal de campo brillante (C; óvalos punteados magenta). Blanco/gris = núcleos. La dorsal está arriba y la distal está a la izquierda. Barras de escala = 40 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: La inhibición farmacológica mediante IWR-1 perjudica la regeneración del EPR. Criosecciones transversales de larvas ablacionadas (MTZ+) de 4 dpi de (A) 0,06% v/v DMSO y (B) 15 μM IWR-1 grupos de tratamiento. Las imágenes de campo brillante (A, B) y la cuantificación del porcentaje de recuperación / sección (C) de RPE muestran un retraso significativo en la recuperación de una monocapa pigmentada en larvas tratadas con IWR-1 (prueba t no apareada de Student, *** p < 0.0001). (B) Las puntas de flecha negras indican el borde más central del RPE regenerador. La dorsal está arriba y la distal está a la izquierda. La barra de escala en (B) representa 40 μm y se puede aplicar a (A). Esta figura y el texto de la leyenda de la figura han sido modificados de Hanovice et al. 2019 (Figura 13)3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Resultado de datos brutos de la cuantificación automatizada de la regeneración de RPE en RpEGEN. (A-D) Mapas de calor que muestran distribuciones de intensidad de píxeles de campo brillante compiladas de toda la región de ROI de RPE, desde dorsal (x-ejes; distancia angular = 0°) hasta ventral (x-ejes; distancia angular = 180°), para todas las larvas en cada conjunto de datos: (A) n = 11, DMSO MTZ-; (B) n = 10, IWR-1 MTZ-; (C) n = 11, DMSO MTZ+; (D) n = 12, IWR-1 MTZ+ (de tres grupos padres independientes, N = 3). Por ejemplo, (A) muestra datos de 177.460 píxeles en 11 ROI. En los ejes y, la intensidad de los píxeles se muestra en función de una escala de color de 8 bits donde 0 = negro y 255 = blanco. Los datos sin procesar se muestran en contenedores de 5 grados (eje x) por valor de intensidad de 5-8 bits (eje y) donde rojo = recuento máximo de contenedores y azul oscuro = recuento mínimo de contenedores. (E-H) Criosecciones transversales de larvas representativas (E,F) no ablacionadas (MTZ-) de 9 dpf y larvas (G,H) ablacionadas (MTZ+) de 4 dpi de 0,06% v/v DMSO y 15 μM IWR-1 grupos de tratamiento. Los ROI de EPR se resaltan en magenta y se indican extremos de distancia angular (0° = dorsal, 180° = ventral). En términos generales, estos datos muestran la distribución de píxeles más oscuros (valores de intensidad entre 0-150) en los ROI no ablacionados (A, B, E, F) en comparación con los ROI ablacionados (C, D, G, H), independientemente del tratamiento. Los datos de los ROI ablacionados muestran (C,G) una distribución centralizada (100° ± 15°) de píxeles más ligeros (valores de intensidad entre 150-250) en el grupo de tratamiento DMSO que (D,H) se expande dorsalmente (a ~50°) y ligeramente ventralmente (por ~5°) en larvas tratadas con IWR-1. (G,H) Estas zonas de ablación central ausentes de pigmento están resaltadas por puntas de flecha azules. Las flechas negras indican la ubicación del nervio óptico. Las imágenes de larvas tratadas con DMSO también se muestran en la Figura 3. Barras de escala = 40 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10: Resultados del grupo y comparación estadística derivada de la cuantificación automatizada de la regeneración de EPR en RpEGEN. (A) Valores medios agrupados de 5 grados y envolventes de confianza del 95% derivados de los datos brutos para cada grupo. La gráfica muestra similitud entre los grupos MTZ- (líneas negras y grises) a través de la longitud dorsal (0°) a ventral (180°) del EPR con diferencias notables entre los grupos MTZ+ (líneas azules y rojas) en el RPE central (área sombreada azul claro entre ~40-140°). Específicamente, la intensidad media de píxeles parece más ligera (0 = negro y 255 = blanco) en el IWR-1 MTZ + 4 dpi en comparación con cualquier otro grupo de tratamiento, lo que corresponde a una disminución de la pigmentación central de RPE. (B) Una comparación estadística de los valores medios derivados de los contenedores de 1 grado a través de la longitud dorsal (0°) a ventral (180°) del EPR para DMSO MTZ+ 4 dpi e IWR-1 MTZ+ 4 dpi refuerza la observación en (A). Los valores de p se calcularon mediante una simulación de permutación con 20.000 repeticiones y una prueba de dos caras para cada contenedor de 1 grado. Bajo la hipótesis nula de que los dos grupos tienen valores medios similares para cualquier bin de 1 grado correspondiente, un valor p ≤ 0,05 indica una diferencia estadísticamente significativa entre las medianas del grupo (línea negra discontinua = intervalo de confianza [IC] del 95%). La presencia de valores de p ≤ 0,05 en el RPE central (área sombreada de color azul claro entre ~ 40-140 °) indica significativamente menos pigmentación en larvas tratadas con IWR-1 ablacionada (MTZ +) en comparación con los controles hermanos tratados con DMSO ablatado (MTZ +). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nombre de la variable Tipo de variable Tamaño variable Descripción de la variable
ROIname Celda {N x 1} Nombres de los archivos ROI procesados
ROIxy Celda {N x 1} Vértices de ROI para cada archivo ROI procesado
IMGname Celda {N x 1} Nombres de los archivos de imagen TIF procesados
IMG Celda {N x 1} Datos de imagen de campo brillante de 8 bits para cada TIF procesado
ROIBW Celda {N x 1} Máscara de ROI lógica (0 o 1) con las mismas dimensiones que las imágenes IMG
Cline Celda con tablas {N x 1} (n x 16) Datos de línea central para imágenes individuales, incluyendo x, y, distancia, ángulo, índice, número de puntos y estadísticas
CIdx Celda {N x 1} Datos de índice de línea central relacionados con los puntos de máscara de ROI al punto de línea central más cercano para calcular CLine
CLineBW Celda {N x 1} Matriz lógica (0 o 1) con las mismas dimensiones que las imágenes IMG que indican la ubicación de la línea central (=1)
RAW_data Mesa N x 3 Tabla que combina todos los datos sin procesar para cada píxel en los ROI en todas las diferentes imágenes IMG
BIN_1_deg_all Mesa N x 9 Tabla que contiene datos y estadísticas agrupados de 1 grado utilizando los datos de RAW_data
BIN_5_deg_all Mesa N x 9 Tabla que contiene datos y estadísticas agrupados de 5 grados utilizando los datos de RAW_data
BIN_10_deg_all Mesa N x 9 Tabla que contiene datos y estadísticas agrupados de 10 grados utilizando los datos de RAW_data

Tabla 1: Descripción de las variables exportadas desde el script RpEGEN.m al archivo MAT. Las definiciones son las siguientes: ROI(s) = región(es) de interés; TIF = formato de archivo de imagen etiquetada.

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Discussion

Este protocolo describe la metodología para extirpar genéticamente el EPR y estudiar los mecanismos de degeneración y regeneración en peces cebra de edad larvaria. Este protocolo también se ha realizado con éxito en peces cebraadultos 3 pero con una caracterización menos extensa, por lo que las larvas son el foco aquí. Los aspectos críticos de esta parte del protocolo (pasos 1-4) incluyen: 1) agregar 1.5x PTU a los embriones antes del inicio de la melanogénesis, 2) descoorizar embriones tratados con PTU en 2-3 dpf, 3) detección cuidadosa de eGFP y 4) sincronización de los cambios de agua durante la ablación genética con MTZ. La PTU inhibe la síntesis de melanina21,22 y se ha utilizado en este paradigma de ablación de EPR para facilitar el cribado de la expresión transgénica de rpe65a:nfsB-eGFP y para permitir la caracterización de los procesos degenerativos y regenerativos de EPR basados en la ausencia y posterior retorno, respectivamente, del tejido pigmentado3. Como la PTU inhibirá una mayor pigmentación, pero no los tejidos de despigmentados una vez que la melanogénesis haya comenzado21, la PTU debe agregarse antes del inicio de la pigmentación, que comienza alrededor de 24 hpf en el pez cebra25. Aquí, y en estudios previos 4,5, se ha agregado PTU a aproximadamente 6 hpf26 para asegurar la inhibición antes de que comience la síntesis de melanina. Si bien la PTU permite la visualización de los pasos clave del protocolo, el tratamiento con PTU puede afectar algunos aspectos del desarrollo (como se discutió en el paso 2.3) y afectar la eclosión del embrión. Este último proceso, si se retrasa demasiado, puede dar lugar a déficits de morfología y motilidad y afectar a la viabilidad40; por lo tanto, la deselección (eclosión) de embriones, ya sea enzimáticamente con pronasa o manualmente usando fórceps en 2-3 dpf es importante para mantener y estandarizar la salud larvaria antes de la ablación genética. Otra consideración importante para evitar problemas con la salud y viabilidad de las larvas más viejas (no relacionadas con el tratamiento con PTU), es que las larvas deben comenzar regímenes de alimentación estandarizados si permanecen fuera de un sistema de instalaciones acuáticas más allá de 9 dpf / 4 dpi para los experimentos41.

Como se explicó, rpe65a impulsa la expresión transgénica en RPE maduro en los dos tercios centrales del ojo posterior. La expresión de eGFP en larvas de 5 dpf tratadas con PTU es normalmente fácilmente detectable y visiblemente intensa (brillante), como se muestra en la Figura 1. También se pueden observar larvas que expresan débilmente eGFP a 5 dpf en comparación con hermanos con expresión brillante. También puede existir una variación en las relaciones de intensidad de expresión (es decir, brillante vs. tenue) entre generaciones, y algunas generaciones tienen larvas que expresan más tenuemente que otras. En cualquier caso, las larvas con expresión tenue de eGFP suelen representar una minoría de los animales en cada embrague. Si bien se desconoce si las larvas que se expresan débilmente muestran fenotipos de lesión por EPR menos graves, se han realizado ablaciones en la cohorte brillante eGFP + de cada embrague y los hermanos comparativamente tenues han sido sacrificados en la detección y excluidos del análisis. Del mismo modo, se ha realizado una amplia caracterización de los fenotipos de ablación y regeneración del RPE del pez cebra en larvas heterocigotas para el transgén rpe65a:nfsB-eGFP, mediante el cruce de adultos heterocigotos rpe65a:nfsB-eGFP a adultos heterocigotos de tipo salvaje3. Es poco probable, sin embargo, no se sabe, si las larvas homocigotas para rpe65a:nfsB-eGFP muestran fenotipos de ablación más graves. Otros esfuerzos para estandarizar el protocolo de ablación incluyen la adición de volúmenes iguales y medidos (por ejemplo, 30 ml por placa de Petri de 10 cm) a platos MTZ y MTZ + durante el período de ablación genética de 24 h. Del mismo modo, las larvas en los platos de tratamiento farmacológico han recibido volúmenes iguales y medidos (por ejemplo, 5 ml por 6 pocillos) y la reposición oportuna de compuestos frescos (por ejemplo, cada 24 h). Al manipular platos con diferentes tratamientos MTZ y/o compuestos farmacológicos, se deben tomar medidas cuidadosas para evitar derrames y contaminación cruzada inadvertida durante el transporte y los cambios de agua.

El protocolo de ablación de RPE del pez cebra se puede modificar para incluir la manipulación farmacológica (paso 5). Esto se ha hecho previamente para identificar las vías de señalización de la respuesta inmune5, mTOR4 y Wnt3 como reguladores críticos de la regeneración de RPE; este último ha demostrado ser repetible aquí y se utilizó para validar RpEGEN. Además de iluminar las vías críticas de regeneración del EPR, la manipulación farmacológica se ha empleado ampliamente para los estudios de regeneración de la retina del pez cebra 10,42,43,44,45,46,47. Antes de la incorporación en el protocolo de ablación de EPR, los agentes farmacológicos deben evaluarse rigurosamente para determinar su toxicidad, eficacia y duración del tratamiento. Esto se puede hacer mediante: la realización de experimentos de dosis-respuesta para evaluar la toxicidad48; evaluar la expresión de genes/proteínas diana conocidos 4,5; y la evaluación de las consecuencias funcionales conocidas de la manipulación farmacológica, por ejemplo, el agotamiento de los leucocitos con el tratamiento con PLX3397 48,49,50,51. Aquí, DMSO (control de vehículos) e IWR-1 se agregaron 24 h antes de la ablación genética y las larvas se examinaron inmediatamente antes del pretratamiento farmacológico en 4 dpf. Mientras que las larvas de eGFP+ son distinguibles de las larvas de eGFP- en 4 dpf, la intensidad de eGFP puede parecer bastante tenue, por lo que las larvas fueron reexaminadas para la expresión de eGFP en 5 dpf (Resultados representativos). La detección de eGFP antes de 4 dpf puede ser difícil ya que la expresión puede ser tan baja que es indetectable para el ojo. Por lo tanto, el pretratamiento con agentes farmacológicos antes de 4 dpf (es decir, en 2 dpf)4 se puede agregar a larvas no examinadas que se separarán en 5 dpf cuando eGFP sea claramente visible. En cualquier escenario en el que las larvas necesiten ser manipuladas (por ejemplo, durante el cribado, la incrustación para la obtención de imágenes, etc.), se deben mantener las condiciones de tratamiento farmacológico y, independientemente de la edad de detección, el EPR debe ablacionarse con MTZ a 5 dpf.

Además del protocolo de ablación genética, se describen instrucciones paso a paso para el preprocesamiento de imágenes de microscopio confocal y la cuantificación automatizada de la regeneración de RPE utilizando RpEGEN (pasos 6-7). RpEGEN se creó para estandarizar la cuantificación de la regeneración de RPE entre los usuarios y aumentar la robustez del conjunto de datos de salida, al tiempo que minimiza los sesgos intrínsecos que pueden venir con la tediosa cuantificación manual realizada anteriormente. Los aspectos críticos de esta parte del protocolo se realizan durante la generación de ROI (paso 6). Primero, la imagen / ojo debe estar en la orientación dorsal hacia arriba, distal izquierda (por ejemplo, Figura 3A-D, Figura 4) ya que RpEGEN se ha optimizado para esta direccionalidad. También es fundamental que los extremos terminales dorsal y ventral del ROI de EPR se reduzcan a una punta puntiaguda como se muestra en la Figura 3B', B",D',D" (líneas magenta). Si estos extremos están al cuadrado o redondeados, el script RpEGEN puede tener dificultades para determinar los píxeles de inicio y fin del esqueleto de la línea central y puede generar espolones en los extremos del ROI terminal en lugar de una línea centralizada (Figura 4B). Los espolones en los extremos del ROI terminal podrían provocar un acortamiento de la línea central durante el desespurio (Figura 4D) y / o problemas con las mediciones de distancia angular en el RPE periférico (Figura 4G). Los sistemas de nomenclatura idénticos para los archivos TIF y ROI correspondientes a cada larva individual también son un paso significativo e imperativo para emparejar el archivo TIF de 8 bits con el ROI correcto en RpEGEN. Los nombres de archivo TIF y ROI no coincidentes darán lugar a que no se genere el flujo de trabajo de procesamiento rpEGEN descrito en la sección Resultados representativos (Figura 4) y, en última instancia, evitará la cuantificación de la regeneración de RPE utilizando este script.

Colectivamente, este protocolo proporciona instrucciones para extirpar con éxito el EPR en larvas de pez cebra, para manipular las vías de señalización que pueden ser de interés antes, durante o después de la lesión del EPR, y para cuantificar la regeneración del EPR de una manera estandarizada con sesgos inherentes limitados. En el contexto de los modelos in vivo e in vitro disponibles para estudiar el potencial regenerativo del EPR, el pez cebra es único en su capacidad de regeneración intrínseca del EPR14. Sin embargo, este es un modelo agudo de lesión por EPR, no crónico como lo son las enfermedades degenerativas de EPR dirigidas al desarrollo terapéutico (por ejemplo, DMAE). Si bien esta es una limitación del modelo, sigue siendo una excelente plataforma para estudiar los mecanismos de regeneración del EPR, que son en gran parte desconocidos, y pueden ser adaptables en el futuro para estudiar lesiones y enfermedades crónicas. Las herramientas y la metodología descritas aquí son versátiles y también podrían aplicarse a estudios de procesos celulares involucrados en la respuesta degenerativa y para estudiar el destino de los tejidos adyacentes a la EPR después de la ablación. Del mismo modo, el script RpEGEN podría modificarse para adaptarse a las necesidades de salida de datos del usuario; por ejemplo, para realizar análisis espaciales de marcadores distintos del pigmento (por ejemplo, sondas de hibridación in situ , expresión de proteínas, etc.).

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Disclosures

L.L.L. es el coinventor de la patente estadounidense # 9,458,428, que describe un método acelerado para derivar el epitelio pigmentario de la retina a partir de células madre pluripotentes humanas; esto no está relacionado con el contenido de este documento. J.M.G. y G.B.F. no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El trabajo descrito en este documento fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (RO1-EY29410 a J.M.G, y NIH CORE Grant P30-EY08098 al Departamento de Oftalmología); el UpMC Immune Transplant & Therapy Center (a L.L.L. y J.M.G.); y la Cátedra E. Ronald Salvitti en Investigación en Oftalmología (a J.M.G.). Se recibió apoyo adicional de la Beca Wiegand en Oftalmología (a L.L.L), la Fundación Eye & Ear de Pittsburgh, y una subvención sin restricciones de Research to Prevent Blindness, Nueva York, NY. Los autores también desean agradecer a Amanda Platt por la asistencia técnica y al Dr. Hugh Hammer y al personal acuático por su excelente apoyo para el cuidado de los animales.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) Millipore Sigma D9542
6-well plates Fisher Scientific 07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 05-539-13 Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing pen Fisher Scientific 50-254-51 Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % Fisher Scientific BP231 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large) Fisher Scientific 3720A
Embryo incubator (mini/tabletop) Labnet I5110A
Fluorescence stereo microscope Zeiss Axio Zoom.V16 Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-4 Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo Millipore Sigma 5.04462 Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder) Fisher Scientific BP117-100 Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ) Millipore Sigma M3761 Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU) Millipore Sigma P7629 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free Fisher Scientific AA433689M Chemical waste, proper disposal required
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712 10 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets) Millipore Sigma P3813 Used to make 10 X PBS stock
Pronase Millipore Sigma PRON-RO
Shaking incubator Benchmark H2010 Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscope Leica S9i Or similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forceps Fine Science Tools 91150-20 Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shaker Scilogex SK-D1807-E
Transfer pipette Millipore Sigma Z135003 3.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Pentair TRS1, TRS2, TRS5 Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ) FIJI (Fiji is Just ImageJ) https://imagej.net/software/fiji/ Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tos MathWorks https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB support MathWorks https://www.mathworks.com/support.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Grierson, I., et al. repair and regeneration of the retinal pigment epithelium. Eye. 8 (2), 255-262 (1994).
  3. Hanovice, N. J., et al. Regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium after widespread genetic ablation. PLoS Genetics. 15 (1), 1007939 (2019).
  4. Lu, F., Leach, L. L., Gross, J. M. mTOR activity is essential for retinal pigment epithelium regeneration in zebrafish. bioRxiv. , (2021).
  5. Leach, L. L., Hanovice, N. J., George, S. M., Gabriel, A. E., Gross, J. M. The immune response is a critical regulator of zebrafish retinal pigment epithelium regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (21), (2021).
  6. Zenno, S., Koike, H., Tanokura, M., Saigo, K. Gene cloning, purification, and characterization of nfsb, a minor oxygen-insensitive nitroreductase from escherichia coli, similar in biochemical properties to frase I, the major flavin reductase in vibrio fischeri. The Journal of Biochemistry. 120 (4), 736-744 (1996).
  7. Hamel, C. P., et al. Molecular cloning and expression of rpe65, a novel retinal pigment epithelium-specific microsomal protein that is post-transcriptionally regulated in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15751-15757 (1993).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
  10. White, D. T., et al. Immunomodulation-accelerated neuronal regeneration following selective rod photoreceptor cell ablation in the zebrafish retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 3719-3728 (2017).
  11. Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590 (2016).
  12. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. The Journal of Comparative Neurology. 518 (6), 800-814 (2010).
  13. Hagerman, G. F., et al. Rapid recovery of visual function associated with blue cone ablation in zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0166932 (2016).
  14. George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).
  15. Chiba, C., et al. Visual cycle protein rpe65 persists in new retinal cells during retinal regeneration of adult newt. The Journal of Comparative Neurology. 495 (4), 391-407 (2006).
  16. Yoshii, C., Ueda, Y., Okamoto, M., Araki, M. Neural retinal regeneration in the anuran amphibian xenopus laevis post-metamorphosis: Transdifferentiation of retinal pigmented epithelium regenerates the neural retina. Developmental Biology. 303 (1), 45-56 (2007).
  17. Xia, H., Krebs, M. P., Kaushal, S., Scott, E. W. Enhanced retinal pigment epithelium regeneration after injury in mrl/mpj mice. Experimental Eye Research. 93 (6), 862-872 (2011).
  18. McGill, T. J., et al. Subretinal transplantation of human central nervous system stem cells stimulates controlled proliferation of endogenous retinal pigment epithelium. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 43 (2019).
  19. Salero, E., et al. Adult human rpe can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
  20. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nature Chemical Biology. 5 (2), 100-107 (2009).
  21. Whittaker, J. R. An analysis of melanogenesis in differentiating pigment cells of ascidian embryos. Developmental Biology. 14 (1), 1-39 (1966).
  22. Westerfield, M. Zebrafish Book, 5th Edition; A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregon, USA. (2007).
  23. Hammer, H. S. Water quality for zebrafish culture in The Zebrafish in Biomedical Research. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. 321-335 (2020).
  24. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  25. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  26. Camp, E., Lardelli, M. Tyrosinase gene expression in zebrafish embryos. Development Genes and Evolution. 211 (3), 150-153 (2001).
  27. Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
  28. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PloS One. 7 (6), 40132 (2012).
  29. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and igf signaling. PLoS One. 6 (8), 22991 (2011).
  30. Leary, S., et al. Avma Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , American veterinary medical association. Schaumburg, Illinois, USA. (2020).
  31. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on cryosections from embryonic and adult zebrafish eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, 4779 (2007).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Muir, D. GitHub - ReadImageJROI. , Available from: https://github.com/DylanMuir/ReadImageJROI (2021).
  34. Morel, P. Gramm: Grammar of graphics plotting in matlab. Journal of Open Source Software. 3 (23), 568 (2018).
  35. Reinhardt, R., et al. Sox2, tlx, gli3, and her9 converge on rx2 to define retinal stem cells in vivo. The EMBO Journal. 34 (11), 1572-1588 (2015).
  36. Schonthaler, H. B., et al. Evidence for rpe65-independent vision in the cone-dominated zebrafish retina. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1940-1949 (2007).
  37. Yazulla, S., Studholme, K. M. Neurochemical anatomy of the zebrafish retina as determined by immunocytochemistry. Journal of Neurocytology. 30 (7), 551-592 (2001).
  38. Larison, K. D., Bremiller, R. Early onset of phenotype and cell patterning in the embryonic zebrafish retina. Development. 109 (3), 567-576 (1990).
  39. Dwass, M. Modified randomization tests for nonparametric hypotheses. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (1), 181-187 (1957).
  40. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: A refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  41. Hernandez, R. E., Galitan, L., Cameron, J., Goodwin, N., Ramakrishnan, L. Delay of initial feeding of zebrafish larvae until 8 days postfertilization has no impact on survival or growth through the juvenile stage. Zebrafish. 15 (5), 515-518 (2018).
  42. Meyers, J. R., et al. Β-catenin/wnt signaling controls progenitor fate in the developing and regenerating zebrafish retina. Neural Development. 7, 30 (2012).
  43. Tappeiner, C., et al. Inhibition of the tgfβ pathway enhances retinal regeneration in adult zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0167073 (2016).
  44. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, o-phospho-l-serine, suppresses müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Experimental Eye Research. 91 (5), 601-612 (2010).
  45. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (38), 15858-15863 (2011).
  46. Lemmens, K., et al. Matrix metalloproteinases as promising regulators of axonal regrowth in the injured adult zebrafish retinotectal system. The Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1472-1493 (2016).
  47. Elsaeidi, F., Bemben, M. A., Zhao, X. F., Goldman, D. Jak/stat signaling stimulates zebrafish optic nerve regeneration and overcomes the inhibitory actions of socs3 and sfpq. The Journal of Neuroscience. 34 (7), 2632-2644 (2014).
  48. Van Dyck, A., et al. Müller glia-myeloid cell crosstalk accelerates optic nerve regeneration in the adult zebrafish. Glia. 69 (6), 1444-1463 (2021).
  49. Conedera, F. M., Pousa, A. M. Q., Mercader, N., Tschopp, M., Enzmann, V. Retinal microglia signaling affects müller cell behavior in the zebrafish following laser injury induction. Glia. 67 (6), 1150-1166 (2019).
  50. Chen, S., Lathrop, K. L., Kuwajima, T., Gross, J. M. Retinal ganglion cell survival after severe optic nerve injury is modulated by crosstalk between jak/stat signaling and innate immune responses in the zebrafish retina. Development. 149 (8), (2022).
  51. de Preux Charles, A. S., Bise, T., Baier, F., Marro, J., Jaźwińska, A. Distinct effects of inflammation on preconditioning and regeneration of the adult zebrafish heart. Open Biology. 6 (7), 160102 (2016).

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Biología Número 181 pez cebra epitelio pigmentario de la retina nitrorreductasa metronidazol ablación genética regeneración pigmentación compuestos farmacológicos RpEGEN
Ablación mediada por nitrorreductasa/metronidazol y una plataforma MATLAB (RpEGEN) para estudiar la regeneración del epitelio pigmentario de la retina del pez cebra
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Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross,… More

Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross, J. M. Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (181), e63658, doi:10.3791/63658 (2022).

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