Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Zebra Balığı Retinal Pigment Epitelinin Rejenerasyonunu İncelemek için Nitroredüktaz / Metronidazol Aracılı Ablasyon ve Bir MATLAB Platformu (RpEGEN)

Published: March 2, 2022 doi: 10.3791/63658
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Ophthalmology, Louis J. Fox Center for Vision Restoration, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Earth Research Institute, University of California, Santa Barbara, 3Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Bu protokol, transgenik zebra balığı modeli kullanarak retinal pigment epitelini (RPE) genetik olarak ablate etme metodolojisini açıklamaktadır. Farmakolojik bileşikler kullanarak sinyal yolu modülasyonunu içerecek şekilde protokolün uyarlanması kapsamlı bir şekilde detaylandırılmıştır. Pigmentasyona dayalı RPE rejenerasyonunu ölçmek için bir MATLAB platformu geliştirildi ve sunuldu ve tartışıldı.

Abstract

Retinal pigment epiteli (RPE) gözün arkasında bulunur ve komşu retinal ve vasküler dokuların sağlığını ve bütünlüğünü korumak için gerekli işlevleri yerine getirir. Günümüzde, küçük yaralanmalarla sınırlı olan memeli RPE'nin sınırlı onarıcı kapasitesi, in vivo RPE rejeneratif süreçlerini anlamadaki ilerlemeyi engellemiştir. Burada, sağlam doku rejenerasyonu yapabilen omurgalı bir model olan zebra balığı kullanılarak in vivo RPE onarımının incelenmesini kolaylaştırmak için ayrıntılı bir metodoloji sağlanmaktadır. Bu protokol, transgenik bir nitroredüktaz / metronidazol (NTR / MTZ) aracılı yaralanma paradigmasını (rpe65a: nfsB-eGFP) tanımlar, bu da MTZ ile 24 saatlik tedaviden sonra RPE'nin merkezi üçte ikisinin ablasyonuna ve ardından doku iyileşmesine neden olur. Larva zebra balığında RPE ablasyonlarına odaklanılmış ve farmakolojik bileşiklerin RPE rejenerasyonu üzerindeki etkilerini test etmek için yöntemler de özetlenmiştir. Pigmentasyona dayalı RPE rejenerasyonunun nicelleştirilmesini otomatikleştirmek için oluşturulan bir MATLAB betiği olan RpEGEN'in oluşturulması ve doğrulanması da tartışılmaktadır. Aktif RPE onarım mekanizmalarının ötesinde, bu protokol, RPE dejenerasyonu ve yaralanma yanıtlarının yanı sıra RPE hasarının diğer hücresel ve moleküler süreçlerin yanı sıra bitişik retinal ve vasküler dokular üzerindeki etkileri üzerine yapılan çalışmalara genişletilebilir. Bu zebra balığı sistemi, RPE rejenerasyonunu ve RPE hastalığıyla ilgili mekanizmaları yönlendiren genleri, ağları ve süreçleri tanımlamada, bu bilgiyi memeli sistemlerine ve nihayetinde terapötik gelişime doğru uygulamak için uzun vadeli bir amaç doğrultusunda önemli bir umut vaat etmektedir.

Introduction

Burada açıklanan metodoloji, larva zebra balığı kullanarak retinal pigment epitelini (RPE) genetik olarak ablate etmek için bir protokolü detaylandırmaktadır. RPE gözün arkasına uzanır ve nöral retinanın tabakalaşmış tabakaları ile koroidi oluşturan vaskülatür tabakası arasında bulunur. Trofik destek, fototoksik ışığın emilimi ve görsel döngü proteinlerinin bakımı, RPE'nin bu bitişik dokuların sağlığını ve bütünlüğünü sürdürmek için gerekli olan kritik işlevlerden sadecebirkaçıdır 1. Memeli RPE'sine verilen hasar, lezyonlar küçük olduğunda onarılabilir2; Bununla birlikte, daha büyük yaralanmaların veya ilerleyici dejeneratif hastalıkların maruz kaldığı hasar geri dönüşümsüzdür. İnsanlarda, RPE dejeneratif hastalıkları (örneğin, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ve Stargardt hastalığı) kalıcı görme kaybına ve az sayıda tedavi seçeneği ile hastanın yaşam kalitesinin düşmesine neden olur. Memeli RPE'nin kendi kendini onarma yeteneğinin sınırlı olması, RPE rejeneratif süreçleri alanında bir bilgi boşluğu yaratmıştır. Zebra balıklarının birçok farklı doku tipinde sağlam rejeneratif kapasitesi göz önüne alındığında, bu protokol, içsel olarak yenilenen RPE ile ilgili çalışmaları kolaylaştırmak ve bu yanıtı yönlendiren mekanizmaları ortaya çıkarmak için in vivo omurgalı bir sistem kurmak için geliştirilmiştir. Burada özetlenen ablasyon paradigması kullanılarak, kanonik Wnt sinyal yolu3, mTOR yolu4 ve bağışıklık ile ilgili yanıtlar5 , muhtemelen örtüşen işlevlerle RPE rejenerasyonunun kritik mediatörleri olarak tanımlanmıştır.

Bu genetik ablasyon paradigmasında, Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 zebra balığı, RPE arttırıcı elementin kontrolü altında eGFP'ye kaynaşmış bakteri kaynaklı nitroredüktaz (NTR / nfsB) gen 6'yı eksprese eder, rpe65a7. Ablasyon, zebra balığı barındıran sisteme ön ilaç metronidazol (MTZ) eklenerek elde edilir. MTZ'nin nitroredüktaz ile hücre içi aktivasyonu, NTR / nfsB eksprese eden hücrelerde DNA çapraz bağlanması ve apoptoz ile sonuçlanır 8,9. Bu teknoloji, zebra balıklarında retina10,11,12,13 hücrelerini ve diğer dokuları ablate etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır8. Bu elemanlar birlikte, indüklenebilir hücre ablasyon metodolojisinin (NTR / MTZ) 8,9 ve görselleştirme için bir floresan işaretleyicinin (eGFP) hedeflenen ekspresyonunu (rpe65a) sağlar.

RPE14'ün rejeneratif potansiyelini incelemek için kullanılabilecek diğer ilginç in vivo modeller de mevcuttur. Bunlar geniştir ve amfibilerde retinektomi sonrası RPE-retina transdiferansiyasyonunu içerir, burada retinal yeniden büyümeye kaybedilen RPE hücreleri değiştirilir15,16; "Süper şifa" MRL / MpJ fare17'de yaralanma sonrası RPE restorasyonu; ve diğerlerinin yanı sıra spontan RPE ve retinal dejenerasyon18'in bir sıçan modelinde RPE proliferasyonunun eksojen uyarılması. Yetişkin insan RPE kök hücreleri (RPESC'ler)19 gibi in vitro modeller de geliştirilmiştir. Bu modellerin tümü, RPE rejenerasyonu ile ilgili hücresel süreçleri ortaya çıkarmak için çalışan değerli araçlardır (örneğin, proliferasyon, farklılaşma, vb.); Bununla birlikte, zebra balığı, ablasyon sonrası içsel RPE onarımı için kapasitesinde benzersizdir.

Buradaki metodoloji, RPE rejenerasyonunu yönlendiren mekanizmaları anlamaya odaklanmak için yazılmış olsa da, Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) hattı ve bu genetik ablasyon protokolü, RPE apoptozisi, RPE dejenerasyonu ve RPE hasarının bitişik retinal ve vasküler dokular üzerindeki etkisi gibi diğer hücresel süreçleri incelemek için kullanılabilir. Ablasyon protokolü, ilgilenilen sinyal yollarını taramak için uygun bir ön strateji olan farmakolojik manipülasyonu içerecek şekilde de değiştirilebilir. Örneğin, Wnt Yanıt-1 İnhibitörü (IWR-1)20 kullanılarak kanonik Wnt yolunun bloke edilmesinin, RPE rejenerasyonunu bozduğugösterilmiştir 3. Bu, kullanıcılara farmakolojik bir manipülasyon deneyi boyunca rehberlik etmek ve pigmentasyonun geri kazanımına dayalı RPE rejenerasyonunu ölçmek için oluşturulan bir MATLAB komut dosyasını (RpEGEN) doğrulamak için kavram kanıtı olarak hizmet etmek için burada tekrarlandı. Transgenik çizgi ve ablasyon protokolü gibi, RpEGEN komut dosyaları uyarlanabilir ve RPE içindeki diğer belirteçleri / hücresel süreçleri ölçmek için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Burada özetlenen tüm metodolojiler, Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) ile uyumludur.

1. Zebra balığı embriyo toplama işleminden önce hazırlık

  1. Embriyo inkübatörünü 28.5 ° C'ye ayarlayın.
  2. Melanogenez inhibitörü, N-feniltiourea (PTU) 21,22'nin 25x stok çözeltisini hazırlayın. Bu stok çözeltisi ortak bir reçete22'den ölçeklendirilir ve 1x, hacim başına% 0,003 ağırlığa eşittir (% w / v) (örneğin, 0,003 g PTU tozu 100 mL sıvı çözücüye).
    1. Büyük bir 25x PTU stok çözeltisi yapmak için, 1 L arıtılmış deiyonize suya (bundan böyle dH2O olarak anılacaktır) 0,75 g PTU tozu ekleyin ve bir karıştırma çubuğu ve karıştırma plakası kullanarak oda sıcaklığında (~ 25 ° C) iyice karıştırın. Işıktan korunan 3 aya kadar 4°C'de saklayın.
      NOT: PTU'nun sulu çözeltiye girmesini sağlamak zordur ve gece boyunca uzun süreli karıştırma gerekebilir.
      DİKKAT: PTU tehlikelidir ve yutulmasını, solunmasını ve / veya cilt veya gözlerle temasını önlemek için özen gösterilmelidir. PTU tozu ve burada açıklanan tüm PTU sıvı türevlerinin, devlet ve kurumsal düzenlemelere bağlı olarak kimyasal atık olarak bertaraf edilmesi gerekebilir. Kullanımdan önce varsa uygun PTU atık bertaraf yöntemlerinin onaylanması önerilir.
    2. 1,5x PTU çalışma çözümü (bundan böyle 1,5x PTU olarak anılacaktır) yapmak için, 940 mL zebra balığı muhafaza tesisi suyuna (bundan böyle sistem suyu olarak anılacaktır) 60 mL 25x PTU stok çözeltisi ekleyin. Zebra balığı için optimum su kalitesi parametreleri tanımlanmıştır23 ve su sporları tesislerinde standart su izleme prosedürleri uygulanmalıdır. 1,5x PTU'yu ışıktan korunan 1-2 hafta boyunca 28,5 ° C'de saklayın.
      NOT: Bu protokol, adım 1.2'de açıklanan PTU konsantrasyonları, çözücüler ve depolama parametreleri kullanılarak rutin olarak gerçekleştirilir. Bir önlem olarak, etkinliği doğrulamak ve sürekli depigmentasyonu doğrulamak için PTU'dayken embriyolar / larvalar her 1-2 günde bir gözlenmelidir. PTU çözünürlüğünde/etkinliğinde azalma olduğundan şüpheleniliyorsa, çözünme ve/veya depolama koşulları optimize edilmelidir.
  3. 100 mL dH2O'ya 0.05 g metilen mavisi tozu ekleyerek bir mantar büyüme inhibitörü olan metilen mavisi% 0.05'lik bir stok çözeltisi hazırlayın. 4°C'de saklayın.
  4. Elmas uçlu karalama kalemi kullanarak bir cam Pasteur pipetinin konik ucunu keserek embriyo/larva manipülasyonu için pipetler hazırlayın (örneğin, Petri bulaşıkları arasında embriyoları/larvaları hareket ettirmek, floresan taraması sırasında larvaları ayırmak, ötenazi larvalarını fiksasyon için mikrosantrifüj tüplerine toplamak, vb.). Elmas kalemle pipetin çevresini aşındırın ve temiz bir mola vermek için ucunu yavaşça çekin veya çıkarın.
    NOT: Pipetin ağzı, akoryonun içinde kalan bir embriyoyu kesmeden kolayca alabilecek kadar pürüzsüz ve geniş olmalıdır. Alternatif olarak bir ampul çekme transfer pipeti kullanın. Hazırlanan pipetler, embriyo / larva kaybını en aza indirmek için su değişimleri sırasında (dökmek yerine) sıvıyı uzaklaştırmak için de kullanılabilir.
  5. 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde %4'lük bir paraformaldehit (PFA) çözeltisi hazırlayın (örneğin; 4 mL'lik 10x PBS'ye 10 mL'lik PFA'lık 10 mL ve 26 mL dH2O'ya 10 mL PFA ekleyin). Işıktan korunan 4 haftaya kadar 4°C'de saklayın.
    DİKKAT: Paraformaldehit tehlikeli bir kimyasaldır ve kimyasal bir duman başlığında kullanılmalı ve uygun şekilde atılmalıdır. Yutulmasını, solunmasını ve / veya cilt veya gözlerle temasını önlemek için özen gösterilmeli ve kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyilmelidir.

2. Zebra balığı genetik ablasyon öncesi embriyo toplama ve bakımı (döllenmeden 0-5 gün sonra)

  1. Yetişkin zebra balıklarını daha önce tarif edildiği gibi koruyun 3,4,5. Embriyo toplamadan önceki öğleden sonra / akşam, yetişkin zebra balıklarını yumurtlama için üreme tanklarına ayırın.
  2. Ertesi sabah (döllenmeden 0 gün sonra (dpf)), embriyoları sistem suyunda 10 cm çapında Petri kaplarına toplayın ve opak görünecek ve / veya düzensiz sitoplazma ve başarısız bölünme24 gösterecek olan tüm cansız veya döllenmemiş yumurtaları çıkarın.
    NOT: Normal bölünme ve gelişimsel evreleme olayları, sağlıklı embriyolarda tarif edildiği gibi belirgin olacaktır25. Petri kapları, protokol boyunca dörtte üçü dolu (10 cm çapında bir çanak için ~ 30 mL) tutulmalıdır.
    1. Her Petri kabına iki damla% 0.05 w / v metilen mavisi ekleyin, nazikçe karıştırın ve protokolün geri kalanı için embriyoları 28.5 ° C'de saklayın.
  3. Yaklaşık 6 saat döllenme sonrası (hpf)4,5,26, embriyo Petri kaplarındaki sistem suyunu 1.5x PTU (adım 1.2.2'de yapılan çalışma çözeltisi) ile değiştirin ve metilen mavisini yenileyin.
    NOT: PTU, pigmentasyonun başlamasından önce embriyolara eklenmelidir (yani, 24 hpf'den önce)25, çünkü zaten pigmentli dokular PTU21'in eklenmesiyle pigment çözmez. Bununla birlikte, PTU ile tedavi edilen zebra balığı27,28,29'da göz boyutunun azalması, oküler ve kraniyofasiyal eksikliklerin ve bazı sinyal yollarının bozulmasının (örneğin, tiroid sinyalizasyonu) bildirildiği belirtilmelidir. PTU'nun gelişimsel toksisitesi, PTU ilavesi27,29'un konsantrasyonuna ve zamanlamasına bağlı görünmektedir. PTU etkinliğini doğrulamak için yukarıda belirtildiği gibi (adım 1.2), PTU toksisitesi belirtileri de dikkatle izlenmeli ve şüpheleniliyorsa, PTU ilavesinin çalışma konsantrasyonu ve / veya zamanı optimize edilmelidir.
  4. 2-3 dpf'de, taze yapılmış pronaz çözeltisi kullanarak embriyoları dekoryonatlayın.
    1. Pronazları vorteks yoluyla 2 mg / mL'lik bir konsantrasyonda 1.5x PTU'da çözün.
      DİKKAT: Pronaz çok ince bir toz halinde paketlenmiştir ve tahriş edicidir. Solunmasını ve / veya cilt, göz vb. İle temasını önlemek için önlemler alın.
    2. Yumurtadan çıkmış embriyoları yumurtadan çıkmamış embriyolardan ayırın ve sadece yumurtadan çıkmamış embriyoları pronaz ile tedavi edin.
    3. 1.5x PTU'yu adım 2.4.1'de yapılan 2 mg / mL pronaz çözeltisi ile değiştirin ve yumurtadan çıkmamış embriyolarda nazik ajitasyonla 4-5 dakika bekletin (örneğin, bir masa üstü döndürücü / çalkalayıcı veya manuel döner ile).
    4. Pronaz çözeltisini dökün ve hemen taze 1.5x PTU ile durulayın. 1.5x PTU'yu ampul çekme transfer pipeti ile embriyoların üzerinde nazikçe tritüre edin.
    5. Tüm akoryon kalıntılarını atmak için ikinci bir 1,5x PTU durulamasını tekrarlayın ve ardından bakım için 1,5x PTU'yu doldurun.
      NOT: Embriyolar ayrıca ince uçlu forseps kullanılarak manuel olarak dekoriyonize edilebilir. Bu durumda, koryon kalıntıları çıkarılmalı ve manuel dekoryonasyondan sonra 1.5x PTU yenilenmelidir.
  5. Embriyo / larva sağlığını izleyin ve her 1-2 günde bir 1.5x PTU'yu yenileyin. Embriyolar / larvalar 5 dpf'de ablasyona kadar 1.5x PTU'da tutulur.
    NOT: Adım 2.3 ve 2.4'ün önemi Tartışma bölümünde daha ayrıntılı olarak ele alınmıştır.

3. Zebra balığı larvalarının rpe65a:nfsB-eGFP taraması ve retinal pigment epitelinin genetik ablasyonu (döllenmeden 5-6 gün sonra)

  1. 5 dpf'de (ablasyon günü) taze bir 10 mM metronidazol (MTZ) çözeltisi yapın. Bu işlemin tamamlanması 2 saat sürer.
    1. PTU olmadan sistem suyuna MTZ tozu ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat boyunca kuvvetli çalkalama (örneğin, dakikada 250 dönüş) ile iyice karıştırın.
    2. 10 mM MTZ solüsyonunu oda sıcaklığında 1 saat daha soğutun ve larvalarla Petri kaplarına eklemeden önce tamamen çözünmesini sağlayın.
      NOT: Floresan taraması ve eGFP + larvalarının ayrılması (adım 3.2), 37 °C ve oda sıcaklığındaki inkübasyonlar sırasında gerçekleştirilebilir.
      DİKKAT: MTZ tehlikelidir ve yutulmasını, solunmasını ve / veya cilt veya gözlerle temasını önlemek için özen gösterilmelidir. MTZ tozu ve burada açıklanan tüm sıvı türevlerinin, devlet ve kurumsal düzenlemelere bağlı olarak kimyasal atık olarak bertaraf edilmesi gerekebilir. Kullanımdan önce varsa, uygun MTZ atık bertaraf yöntemlerinin onaylanması önerilir.
  2. zebra balığı larvalarını rpe65a:nfsB-eGFP transgeni için tarayın.
    1. Larvaları 0.168 g / L trikain (MS-222) ile anestezi yapın ve transgenik (eGFP +) larvaları (Şekil 1) transgenik olmayan (eGFP-) larvalardan 488 nm uyarma lazeri / filtresi ile floresan stereo mikroskop kullanarak ayırın.
      NOT: Trikain, 1.5x PTU ve / veya farmakolojik bileşik çözeltilere eklenmelidir, çünkü larvalar eGFP için taranırken tedaviye daldırılmalıdır. Larvaları trikaine sadece tarama süresince inkübe edin (örneğin; 50 larva içeren tek bir 10 cm'lik Petri kabı için ≤10 dakika).
    2. Trikainsiz taze 1.5x PTU ile doğrudan bir Petri kabına pipet yaparak larvaları hemen uyandırın.
    3. Taramanın tamamlanmasının ardından, eGFP + larvalarını iki Petri kabı grubuna ayırın: MTZ tedavisi almak için bir grup (ablated / MTZ +) ve bir grup unblated (MTZ-) kontrolü olmak.
  3. Retinal pigment epitelini ablate edin.
    1. Kabartılmamış (MTZ-) kontrol kaplarından 1,5x PTU'yu çıkarın ve PTU olmadan tatlı sistem suyu ekleyin.
    2. Ablatlanmış (MTZ +) işlem kaplarından 1,5x PTU'yu çıkarın ve taze yapılmış 10 mM MTZ çözeltisini ekleyin (adım 3.1.).
    3. 10 mM MTZ solüsyonunu tam olarak 24 saat sonra çıkarın (yaralanma sonrası 1 gün (dpi) olarak belirlenmiştir) ve PTU olmadan tatlı sistem suyu ekleyin. MTZ çanaklarında PTU olmadan tatlı sistem suyunu değiştirin. Larvalar, protokolün geri kalanında tekrar PTU'ya maruz kalmayacaktır.
      NOT: Hayvanlar aktif olarak yüzerken larva kaybı olmadan çözelti değişimleri arasında 1,5x PTU'nun (adım 3.3.1 ve 3.3.2) veya 10 mM MTZ'nin (adım 3.3.3) tamamını pipetlemek veya dökmek zor olabilir. Bu durumda, başarılı bir çözüm değişimi sağlamak için PTU'suz sistem suyunun yıkanması (yıkanması) eklenebilir.

4. Genetik ablasyon sonrası larva bakımı (döllenme sonrası 6+ gün)

  1. Larvaları kontrol edin ve ötanaziye kadar (adım 5.6) veya zebra balığı barınma tesisine geri dönene kadar PTU olmadan sistem suyunu günlük olarak doldurun.
  2. Bir stereo mikroskop üzerinde iletilen ışık aydınlatmasını kullanarak 2 dpi (7 dpf) üzerinde in vivo ablasyonun başarısını ve kapsamını izleyin (Şekil 2).

5. Zebra balığı retinal pigment epitel ablasyon protokolüne farmakolojik tedavinin dahil edilmesi

NOT: Daha önce3 kez gerçekleştirildiği gibi, 4 dpf'den başlayan 15 μM IWR-1 veya hacim uyumlu dimetil sülfoksit (DMSO) araç kontrolü ile tedavi, RpEGEN'i test etmek için örnek bir deney olarak burada özetlenmiştir. Konsantrasyonlar ve zaman çizelgeleri farklı farmakolojik bileşiklere göre değişebilir ve doz-yanıt doğrulaması, tedavi süresi, tarama ve farmakolojik manipülasyon çalışmaları için deneysel tasarımın diğer yönleri için öneriler Tartışma bölümünde ele alınmıştır. Görüntü analizi gerekiyorsa 6. ve 7. adımları izleyin.

  1. Embriyoları adım 2'de açıklandığı gibi toplayın ve koruyun. 2 dpf'de embriyoları dekoryonat.
  2. Adım 3.2'de açıklandığı gibi eGFP + larvalarını 4 dpf üzerinde tarayın. Petri kapları yerine, farmakolojik tedavi için eGFP + larvalarını 6 kuyucuk başına n ≤ 10 larva yoğunluğunda 6 kuyucuklu plakalara yerleştirin. Unblated (MTZ-) ve ablatize edilecek larvalar (MTZ +) için ayrı 6 kuyucuklu plakalar belirleyin.
    NOT: eGFP sinyali 4 dpf'de görünür, ancak 5 dpf'deki sinyal yoğunluğundan daha sönük görünür.
  3. 10 mM MTZ çözeltisi ile genetik ablasyondan önce tam 24 saat boyunca 15 μM IWR-1 veya hacim uyumlu DMSO araç kontrolü ile 4 dpf eGFP+ larvasına ön işlem yapın.
    NOT: Genellikle, farmakolojik tedavi deneyleri için çok az bileşik gereklidir. Az miktarda IWR-1 tozunun tartılmasını önlemek için, bu farmakolojik bileşik zaten DMSO çözeltisinde, 25 mM'lik bir konsantrasyonda satın alınır ve tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için varışta daha küçük hacimlere ayrılır.
    1. Gerekli farmakolojik ve araç kontrol tedavilerinin hacmini belirleyin ve buna göre konik tüplere 1.5x PTU aliquot yapın. 6 delikli bir plakanın 5 mL/kuyucuk hacmi önerilir.
    2. 15 μM IWR-1 nihai konsantrasyonu için 1,5x PTU'ya IWR-1 stoğu ekleyin (örneğin, 1,5x PTU'nun 5 mL'si başına 3 μL 25 mM IWR-1). 1,5x PTU'ya eşleşen bir DMSO stok hacmi ekleyin (ör. 1,5x PTU'nun 5 mL'si başına 3 μL ≥ %99,7 DMSO). Burada, bu,% 0.06 hacim / hacim (% v / v) DMSO'luk bir nihai konsantrasyon elde edecektir. Vorteks ile iyice karıştırın ve bileşiklerin çözünmesini görsel olarak onaylayın.
      DİKKAT: DMSO, IBR-1 ve diğer farmakolojik bileşiklerin ve çözücülerin, devlet ve kurumsal düzenlemelere bağlı olarak kimyasal atık olarak atılması gerekebilir. Kullanımdan önce tehlike seviyesinin ve varsa bu bileşikler için uygun atık bertaraf yöntemlerinin doğrulanması önerilir.
    3. 6 delikli plakalarda eGFP + larvalarından 1.5x PTU'yu çıkarın ve 5.3.2. adımdan itibaren taze yapılmış% 0.06 v / v DMSO veya 15 μM IWR-1 tedavilerinden 5 mL / kuyucuk ekleyin.
  4. 5 dpf'de, RPE'yi ablayın. 24 saatlik ön tedaviye (adım 5.3) ek olarak, larvalar 10 mM MTZ ile 24 saatlik genetik ablasyon sırasında ve ablasyon sonrası iyileşme sırasında, fiksasyona kadar (örneğin, 4-9 dpf'den) farmakolojik ve araç kontrol tedavilerine dalmış kalacaktır.
    1. Genetik ablasyon yapmadan 2 saat önce 10 mM MTZ solüsyonu yapın (adım 3.1).
    2. Hem unblated (MTZ-) hem de ablated (MTZ+) 6 delikli plakalar ve PTU (MTZ-) veya 10 mM MTZ çözeltisi (MTZ+) içermeyen tatlı sistem suyunun konik tüplere uygun hacimleri için gerekli farmakolojik ve araç kontrol işlemlerinin hacmini belirleyin. Bu, dört tedavi koşulu sağlayacaktır: 1)% 0.06 v / v DMSO, MTZ-; 2) 15 μM IWR-1, MTZ-; 3) % 0.06 v / v DMSO, MTZ +; ve 4) 15 μM IWR-1, MTZ +.
    3. IWR-1 ve DMSO stok çözümlerini adım 5.3.2'de gerçekleştirildiği şekilde ilgili konik tüplere ekleyin. Vorteks ile iyice karıştırın ve bileşiklerin çözünmesini görsel olarak onaylayın.
    4. 1.5x PTU'da (adım 5.3.2) %0.06 v/v DMSO ve 15 μM IWR-1 tedavilerini, belirlenmiş unblated (MTZ-) ve ablated (MTZ+) 6 delikli plakalardan çıkarın ve adım 5.4.3'te yapılan uygun tedavilerle doldurun.
    5. Tam 24 saat sonra 10 mM MTZ çözeltisinde %0,06 v/v DMSO ve 15 μM IWR-1 işlemlerini kesin ve PTU'suz tatlı sistem suyunda arıtmalarla yenileyin. %0,06 v/v DMSO ve 15 μM IWR-1 arıtmalarını, unblated (MTZ-) 6 delikli plaka(lar)da PTU içermeyen tatlı sistem suyunda doldurun.
  5. Adım 4'te belirtildiği gibi ablasyon sonrası larva bakımını takip edin ve PTU'suz sistem suyunda günlük% 0.06 v / v DMSO veya 15 μM IWR-1 işlemlerini yenileyin.
  6. Larvaları 9 dpf (yaş uyumlu MTZ ile muamele edilmiş kardeşler için 4 dpi) üzerinde, hayvanları 0.3 g / L trikain çözeltisine (ölümcül doz aşımı) batırarak en az 20 dakika30 boyunca hızlı soğutma (örneğin, Petri kaplarını buzun üzerine yerleştirin) ile birleştirerek ötenazileştirin. Larvaların, oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 ° C'de% 4 PFA'da (adım 1.5) 3 saat boyunca dokunmaya ve sabitlemeye yanıt vermediğinden emin olun.
  7. Fiksasyon sonrası larva dokusunu konfokal mikroskopta daha önce 5,31'de ve burada Temsili Sonuçlar bölümünde açıklandığı gibi işleyin. Adım 6 ve 7'deki analiz, en azından, nükleer işaretleyicinin (örneğin, DAPI) ve parlak alan z-yığını görüntülerinin elde edilmesini gerektirecektir.

6. FIJI'de konfokal mikroskop z-stack görüntü ön işleme (ImageJ)

  1. FIJI 32 kullanarak konfokal mikroskop z-stack görüntülerini içe aktarın vebiçimlendirin.
    1. Biyo-Biçimler İçe Aktarma Seçenekleri'ni kullanarak mikroskop görüntülerini açın, Yığını şu şekilde görüntüle: Köprü ve Renk modu: Gri tonlamalı.
    2. Görüntü | seçerek içe aktarılan mikroskop görüntüsünün maksimum yoğunluk projeksiyonunu oluşturun Yığınlar | Z Projesi. ZProjection penceresinde, Dilimi Başlat ve Dilimi Durdur'u bu görüntünün tüm dilimlerini içerecek şekilde ayarlayın. Örneğin, toplam 18 dilimi olan bir z-yığını için Başlangıç Dilimi: 1 ve Dilimi Durdur: 18 olarak ayarlayın. Projeksiyon Türü: Maksimum Yoğunluk'u seçin ve Tamam'a tıklayın.
    3. Görüntü | seçeneğini belirleyerek maksimum yoğunluk projeksiyon dosyasını 8 bitlik bir görüntüye (zaten değilse) dönüştürün Tip | 8 bit.
    4. Görüntü seçilerek görüntüyü dorsal taraf yukarı ve distal (yani lens) bırakılacak şekilde yeniden | Dönüştürme | Yatay Çevir (son komut için, o görüntü için gereken yönselliğe en uygun seçeneği belirleyin). Çok kanallı bir görüntü için, İşlem Yığını'nda Evet? penceresi, tüm kanalları yeniden yönlendirmek için kullanılır.
      NOT: Bu adım kritiktir, ancak görüntü zaten sırt yukarı, distal sol yöndeyse gerekli değildir. İşleme için doğru yöndelikte gözleri olan görüntüler için Şekil 3A-D ve Şekil 4'e bakın.
    5. Dosya |'i seçerek 8 bit maksimum yoğunluk projeksiyonunu etiketli görüntü dosyası biçimi (TIF) dosyası olarak kaydedin Farklı Kaydet | Tiff....
  2. FIJI kullanarak RPE ilgi alanı (ROI) oluşturun.
    1. Adım 6.1'de açıklandığı gibi oluşturulan 8 bitlik bir TIF görüntüsünü açın. Yatırım getirisi Yöneticisi'ni Analiz Et'i seçerek | Araçlar | Yatırım Getirisi Yöneticisi.
    2. Resim | Kullan RPE'nin apikal tarafının dış sınırlayıcı membranın (OLM) ucuna bitişik olduğu noktaları tanımlamak için DAPI ve parlak alan kanallarını yakınlaştırın ve bunlar arasında geçiş yapın (Şekil 3B', B", D', D"; mavi ok uçları). Bu anatomik dönüm noktasını yatırım getirisi başlangıç noktası olarak kullanın.
    3. Hem DAPI hem de parlak alan görüntü kanallarını ve yakınlaştırma işlevini (Görüntü | kullanarak Poligon Seçimleri aracıyla (FIJI araç çubuğunda) RPE yatırım getirisini oluşturun Zoom) apikal ve bazal RPE sınırlarını tanımlamak için. ROI'nin dorsal ve ventral uçlarını (yani, ROI'nin RPE'nin apikalden bazal tarafına geçtiği yer) köreltmek veya yuvarlamak yerine keskin bir noktaya getirin (Şekil 3B', B", D', D"; macenta çizgileri).
      NOT: Sivri uçlu bir yatırım getirisi ucu oluşturmak, RpEGEN kullanarak uç nokta algılamasını optimize etmek için kritik bir adımdır ve Tartışma bölümünde ele alınmıştır.
    4. YG Yöneticisi'nde Ekle'ye tıklayarak YG'yi ekleyin. YG'yi gerektiği gibi ayarlayın ve YG Yöneticisi'nde Güncelle'ye tıklayın.
    5. Diğer'i seçerek yatırım getirisi dosyasını kaydedin >> | Kurtarmak... ROI Yöneticisi içinde. Eşleşen YG ve TIF görüntü dosyaları için aynı adları kullanın (ör. [dosya adı].tif ve [dosya adı].roi).
  3. Her koşul için 8 bit TIF ve ROI dosyalarını tek bir klasörde birleştirin. Örneğin, DMSO_9dpf klasör, 9 dpf unblated (MTZ-) %0,06 v/v DMSO ile muamele görmüş larva grubu için eşleşen tüm TIF ve ROI dosyalarını içerir.

7. RpEGEN betikleri kullanılarak RPE rejenerasyonunun nicelleştirilmesi ve görselleştirilmesi

  1. RpEGEN komut dosyalarını kurun ve hazırlayın.
    1. GitHub deposundan (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) Kod | tıklayarak en son RpEGEN betiklerini indirin ZIP'i indirin.
    2. Klasörün sıkıştırmasını açın ve istediğiniz çalışma alanı konumuna (ör. Masaüstü) yerleştirin.
    3. MATLAB'ı açın.
    4. Geçerli Klasör bölmesinde (genellikle sol tarafta) RpEGEN klasörüne gidin.
    5. RpEGEN klasörüne sağ tıklayın ve Yola Ekle'yi seçin | Seçili Klasörler ve Alt Klasörler. Bu, klasörü MATLAB yoluna ekler, böylece klasördeki tüm komut dosyalarını otomatik olarak bulabilir ve çalıştırabilir.
    6. Tüm alt klasörleri ve M dosyalarını göstermek için Geçerli Klasör bölmesindeki RpEGEN klasörüne çift tıklayın.
    7. Düzenleyici bölmesinde açmak için RpEGEN.m dosyasına çift tıklayın.
    8. RpEGEN.m dosyasının KULLANICI TANIMLI DEĞİŞKİLER bölümünün altında, yatırım getirisi dosyalarını (.roi), görüntü dosyalarını (.tif) içeren klasörlerin dizin konumlarını ve çıktı dosyalarının kaydedilmesi gereken yerleri girin. Dışa aktarılacak .mat dosyasının grup adını (ör. DMSO_9dpf, DMSO_4dpi vb.) ve TIF görüntü yığınındaki parlak alan kanalının konumunu (ör. parlakalan görüntü yığınındaki üçüncü kanalsa 3) girin. Görüntü dosyası yalnızca parlak alan görüntüsünü içeriyorsa, bu 1'e eşit olmalıdır.
  2. RpEGEN.m komut dosyasını çalıştırın ve sonuçları doğrulayın.
    NOT: RpEGEN, çalışması için Görüntü İşleme Araç Kutusu, Eğri Sığdırma Araç Kutusu ve İstatistik ve Makine Öğrenimi Araç Kutusu'nun kullanıcı MATLAB lisansında etkinleştirilmesini gerektirir. Ek olarak, FIJI YG'lerini MATLAB'a aktarmak için ücretsiz olarak kullanılabilen ReadImageJROI araç kutusu33 gereklidir; ancak, herhangi bir etkinleştirme gerektirmeyen diğer işlev M dosyalarıyla birlikte RpEGEN klasöründe sağlanır.
    1. MATLAB'ın üst kısmındaki Düzenleyici menüsündeki Çalıştır düğmesine tıklayarak komut dosyasını çalıştırın.
      NOT: Başlatıldığında, Komut penceresi komut dosyasının ilerlemesini gösteren ayrıntılı çıktı sağlar. Ayıklanan verileri içeren MAT dosyasını kaydettikten sonra, üç panelli bir şekil görünecek ve her görüntü çalıştırması için çıktı dizinine PDF olarak kaydedilecektir. Bunlar, her şeyin düzgün çalıştığından emin olmak için kalite kontrol (QC) rakamlarıdır ve şunları içerir: 1) YG tarafından üst üste bindirilmiş parlak alan görüntüsü (Şekil 4A); 2) merkez çizgisi ve ilişkili açısal mesafe (derece) ile yatırım getirisi (Şekil 4G); ve 3) merkez çizgisi medyan yoğunluk değerlerine sahip yatırım getirisi (0-255, 8 bit renk ölçeği) (Şekil 4H). Bir sonraki adıma geçmeden önce QC PDF'leri çıktı klasörüne kaydedilene ve son rakam kaybolana kadar bekleyin.
    2. Çıktı klasörüne dışa aktarılan PDF'leri tek tek herhangi bir PDF görüntüleyicide açın ve tüm YG'lerin parlak alan görüntüleriyle eşleştiğini, merkez çizgisi değerlerinin YG'lerin merkezinin makul yaklaşımları olduğunu ve medyan yoğunluk değerlerinin verilerle uygun şekilde doldurulduğunu doğrulayın (yani, tüm merkez çizgisinde aynı değerin tümü değil).
      NOT: RpEGEN.m tarafından MAT dosyasına kaydedilen her değişkenin ayrıntılı bir açıklaması ve yapısı Tablo 1'de bulunabilir.
  3. RpEGEN_PermPlot.m komut dosyasını çalıştırın.
    NOT: RpEGEN_PermPlot.m betiği, iki grubun medyanlarının permütasyon simülasyonunu kullanarak istatistiksel karşılaştırmalar yapmak için RpEGEN.m çıktısını kullanır ve ayrıca RpEGEN klasörüne de dahil edilmiş olan serbestçe kullanılabilen GRAMM araç kutusu34'ü kullanarak bu makaledeki grafikleri yeniden üretmek için kod sağlar.
    1. Yeni bir Düzenleyici sekmesinde açmak için RpEGEN_PermPlot.m dosyasına çift tıklayın.
    2. RpEGEN_PermPlot.m dosyasındaki BÖLÜM 1 - KULLANICI TANIMLI DEĞİŞKİLER altında, RpEGEN.m çalıştıran MAT dosyalarını içeren çıktı klasörünün dizin konumunu girin ve yüklenecek her MAT dosya adını girin (örneğin, DMSO_4dpi.mat, IWR1_4dpi.mat).
    3. MATLAB'ın üst kısmındaki Düzenleyici menüsündeki Çalıştır Bölümü'nü tıklatarak komut dosyasının bu bölümünü çalıştırın.
    4. Bölüm 2'de, data_A ve data_B değişkenlerde istatistiksel karşılaştırma için iki grubun adlarını girin (bunlar, permütasyon simülasyonu kullanılarak medyanların türetileceği gruplardır). bin_sz değişkeninde, veri kümeleri için medyan yoğunluk değerlerinin tümleştirileceği derece sayısını girin (varsayılan değer 1 derecelik bölmelerdir).
      NOT: reps değişkeni, bir olasılık dağılımı oluşturmak için kullanılacak permütasyon sayısını gösterir ve herhangi bir sayıya ayarlanabilir (varsayılan değer 20.000'dir). Genel olarak, daha fazla sayıda tekrar istatistiksel olarak daha sağlam olacaktır, ancak işlem süresini artıracaktır.
    5. MATLAB'ın üst kısmındaki Düzenleyici menüsündeki Çalıştır Bölümü'nü tıklatarak komut dosyasının bu bölümünü çalıştırın. Bu bölümün tamamlanması, belirtilen yineleme sayısına bağlı olarak biraz zaman alabilir, ancak komut penceresinde sürekli bir durum güncelleştirmesi sağlar.
    6. HEATMAP FIGURE ve GROUP RESULTS AND P-VALUES bölümlerini Çalıştır Bölümünü kullanarak bağımsız olarak çalıştırın. "VERİLERİ BURAYA GİRİN" ile yorumlanan bölümlerdeki veri değişkenlerini düzenleyin. Bu şekillerin PDF'leri her biri için otomatik olarak kaydedilir ve herhangi bir vektör yazılımı son işleminde kolayca değiştirilebilir.
      NOT: RpEGEN_PermPlot.m dosyasında oluşturulan grafikler geçicidir ve büyük olasılıkla her kullanıcının özel verilerine ve görselleştirme gereksinimlerine göre değişiklikler gerektirecektir. Bununla birlikte, rakamlar hem MATLAB hem de GRAMM web siteleri kullanılarak kolayca kişiselleştirilebilecek sağlam bir temel sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kanonik Wnt sinyal yolunu inhibe etmenin, protokol3'te açıklanan genetik ablasyon paradigması (rpe65a: nfsB-eGFP) ve farmakolojik manipülasyon metodolojisi (IWR-1) kullanılarak zebra balığı RPE rejenerasyonunu önemli ölçüde bozduğu bilinmektedir. Bu deney, pigmentasyona dayalı zebra balığı RPE rejenerasyonunu ölçmek için otomatik bir yöntemi doğrulamak için burada tekrarlandı. Aşağıda özetlenen sonuçlar, döllenme gününden (0 dpf) RpEGEN kullanarak RPE rejenerasyonunun nicelleştirilmesine kadar protokolün tüm adımlarını kapsıyordu.

Larva zebra balıklarında RPE ablasyon protokolünün (farmakolojik manipülasyon ile) uygulanması
Üç ayrı ebeveyn grubundan (N = 3) toplanan embriyolar, 6 hpf civarında 1.5x PTU ile tedaviye başladı ve RPE ve yüzey melanositlerinde pigmentasyon yokluğu 1 dpf'de görsel olarak doğrulandı. Embriyolar 2 dpf'de 2 mg/mL pronaz kullanılarak enzimatik olarak dekoriyonize edildi (adım 2.4). 4 dpf'de larvalar trikain (MS-222) kullanılarak anestezi altına alındı ve floresan stereo mikroskop kullanılarak eGFP için tarandı (adım 3.2 ve 5.2). eGFP + larvaları 6 kuyucuklu plakalara (n = 10 larva / kuyu) taşındı ve% 0.06 v / v DMSO (araç kontrolü) veya 15 μM IWR-1 (adım 5.3) ile tedavi edildi. Burada bildirilen larva yoğunluğu başlangıçta 1 larva /cm2 büyüme alanının yakınlaştırılmasına dayanıyordu ve zaman içinde dikkatli sağlık izlemesi (örneğin, yüzme kesesi gelişimi) ile doğrulandı. eGFP'nin yoğunluğu 4 dpf'de loş görünüyordu, bu nedenle larvalar parlak eGFP ekspresyonunu doğrulamak için 5 dpf'de yeniden tarandı (Şekil 1). RPE65 (zebra balığında rpe65a) olgun RPE7'nin bir belirtecidir ve teleost balıklarında, retinal ve RPE hücreleri, retinanın distal ucunda, lens35'e bitişik bir kök hücre nişi olan siliyer marjinal bölgeden (CMZ) sürekli olarak üretilir. Bu nedenle, rpe65a:nfsB-eGFP transgenik çizgisinde, daha olgunlaşmamış RPE çevrede bulunur ve eGFP- (toplam RPE dokusunun yaklaşık üçte biri) görünürken, RPE'nin olgun, merkezi üçte ikisi eGFP'yi ifade eder (Şekil 1B; beyaz ok uçları). Transgen, epifiz bezinde de görülebiliyordu (Şekil 1A; sarı ok ucu), rpe65a'nın zebra balığı 36'da epifiz ekspresyonunu göstermesi bekleniyordu. Nispeten loş veya eGFP- larvaları 6 kuyucuklu plakalardan çekildi ve 5 dpf'de ötenazi yapıldı. DMSO veya IWR-1 ile tedaviden tam olarak 24 saat sonra, 5 dpf larvası RPE'yi ablate etmek için 10 mM MTZ ile tedavi edildi (adım 3.1, 3.3 ve 5.4). MTZ, RPE rejenerasyonunun gerçekleşmesine izin vermek için tam olarak 24 saat sonra (yani 6 dpf / 1 dpi'de) yıkandı.

Larvalar günlük olarak stereo mikroskopta 6 dpf / 1 dpi'den 9 dpf / 4 dpi'de ötenazi zamanına iletilen ışık aydınlatması kullanılarak gözlendi. Genetik ablasyonun başarısı, MTZ + larvalarında gözün merkezi üçte ikisinde pigment bulunmaması (Şekil 2B; kırmızı ok uçları) ile 7 dpf MTZ kontrol kardeşlerine (Şekil 2A) kıyasla 2 dpi'de in vivo olarak doğrulanmıştır (adım 4.2). Beklendiği gibi, 2 dpi üzerinde pigmentten yoksun alan, 5 dpf'de gözlenen rpe65a:nfsB-eGFP transgen ekspresyonu bölgesine benzer görünmektedir (Şekil 1B). Değerlendirme, PTU'nun çıkarılmasından sonra RPE'nin repigmentasyona uğraması nedeniyle 2 dpi üzerinde ve daha erken değil de daha erken yapılmamıştır ve gözlem zamanına bağlı olarak, ablatlanmış merkezi RPE ile korunmuş (unblated) periferik RPE arasındaki belirgin bir farkın, ikincisi tam olarak repigmente edilmemişse ayırt edilmesi zor olabilir. Makroskopik belirsizlik olasılığına rağmen, 1 dpi'de RPE ablasyonunun daha önce kesitli dokuda kolayca görülebildiği ve merkezi RPE ve dış nükleer tabaka (ONL; yani fotoreseptör) doku bütünlüğünün kaybının yanı sıra hücre ölümü (piknotik çekirdekler) kanıtı ortaya çıktığı gösterilmiştir (Şekil 5)3. Doku kaybına karşı, rpe65a:nfsB-eGFP zebra balığı model3'te doku rejenerasyonu sırasında sağlam proliferasyonun önemli bir itici güç olduğu belirlenmiştir. RPE ablasyonunun bitişik dokuların dejenerasyonuna yol açtığı erken apoptotik yanıt (örneğin, fotoreseptörler ve Bruch zarı; Şekil 6A-C) ve bunu takiben, yaralanma bölgesine doğru içe doğru hareket eden heterojen rejenerasyon "bölgeleri" veren periferik-merkezi proliferatif yanıt (Şekil 6D-F), daha önce kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiş ve tartışılmıştır 3.

RpEGEN kullanarak RPE pigmentasyonuna dayalı otomatik niceleme için doku hazırlama, konfokal görüntü elde etme ve görüntü ön işleme
9 dpf / 4 dpi'de, DMSO ve IWR-1 ile tedavi edilen larvalar trikain doz aşımı ile ötenazi yapıldı ve oda sıcaklığında 3 saat boyunca% 4 PFA'da sabitlendi (adım 5.6). Her bağımsız ebeveyn grubundan dört larva, sonraki doku işleme için rastgele seçildi (N = 3; tedavi başına n = 12 larva). Kriyoproteksiyon, kriyoseksiyon (12 μm kalınlıkta), DAPI ile nükleer karşı boyama ve kapak kayması montajı, adım 5.7 5,31'de belirtildiği gibi gerçekleştirilmiştir. Her larvadan görünür optik sinire sahip merkezi bir bölüm, 1 μm z-adım aralığıyla 512 x 512 piksel z-yığını görüntüleri elde etmek için 40x yağ daldırma hedefi (sayısal açıklık = 1.30) kullanılarak konfokal lazer tarama mikroskobunda görüntülendi. Her görüntü üç kanaldan veri içeriyordu: kanal 1 = DAPI için 405 nm uyarma, eGFP için kanal 2 = 488 nm uyarma, kanal 3 = parlak alan için iletilen ışık. Parlak alan görüntülerinde piksel yoğunluğu ölçüldükçe, iletilen ışık lambası voltajı ayarları sabit tutuldu ve istatistiksel karşılaştırmalar için toplanan tüm veriler aynı gün içinde görüntülendi.

Konfokal mikroskop z-stack görüntüleri, FIJI kullanılarak adım 6'da açıklandığı gibi otomatik niceleme için önceden işlendi. Görüntüler, dokunun ROI üretimini zorlaştıracak şekilde tehlikeye atılması durumunda (örneğin, yırtılma (Şekil 7A; macenta ok uçları) veya dönüm noktası tıkanıklığı (Şekil 7B; macenta ovaller)) veya çarpık ROI yoğunluk ölçümleri (örneğin, katlanmadan (Şekil 7C; macenta ovaller)). Bu dışlama kriterlerine sahip birkaç larvayı atlamasına rağmen, buradaki tüm veri kümeleri aşağıdaki sayıda biyolojik replikasyon (larva) ile N = 3'ü temsil eder: n = 11, DMSO MTZ-; n = 10, IWR-1 MTZ-; n = 11, DMSO MTZ+; n = 12, IWR-1 MTZ+. DAPI kanalı kullanılarak, RPE'nin dorsal apikal tarafının (retinaya bakan) OLM'nin dorsal ucuna doğrudan bitişik olduğu noktanın belirlenmesiyle RPE ROI'leri başlatıldı (Şekil 3B',D'; mavi ok uçları) (adım 6.2.2). Distal RPE uzantısı bölümler arasında değişebildiğinden, OLM, RPE ROI uç noktalarını standartlaştırmak ve MATLAB'da açısal mesafe ölçümlerini normalleştirmek için anatomik bir dönüm noktası olarak kullanılmıştır (burada 0 ° = dorsal ROI son noktası ve 180 ° = ventral ROI bitiş noktası). Farmakolojik manipülasyonla veya mutant bir arka planda RPE ablasyonları yapılırken, ön işleme ve nicelemeden önce anatomik bir dönüm noktası tanımlanmalı ve doğrulanmalıdır. Burada, OLM nicelleştirilmiş tüm larvalarda belirgindi ve yırtılma ile tehlikeye atılmadı (örneğin, Şekil 7B) veya DMSO veya IWR-1 ile tedavi. Dorsal başlangıç noktası belirlendikten sonra, RPE'nin apikal tarafını (dorsal-ventral) takiben, ventral OLM'nin ucuna bitişik noktaya ulaşılana kadar ROI'ler üretildi (Şekil 3B",D"; mavi ok uçları). Daha sonra, RPE'nin apikal ve bazal (koroid-yüz) tarafları arasında adım 6.2.3'te tartışıldığı gibi bir ventral ROI sonlanım noktası yapıldı (Şekil 3B",D"; eflatun çizgi). ROI, RPE'nin bazal tarafını (ventral-to-dorsal) takip ederek, dorsal OLM'deki başlangıç noktasına bitişik bazal tarafa ulaşana kadar devam etti. ROI daha sonra sivri bir sırt ucu (Şekil 3B',D'; macenta hattı) ventralal olarak yapıldığı gibi. Genetik ablasyonun, rejenerasyon ilerledikçe geri kazanılan merkezi eGFP ekspresyonunun kaybına neden olduğu gösterilmiştir (özetlenmiştir Şekil 6)3; Bu nedenle, rejenerasyonun derecesine ve eGFP'nin ilgi çekici zaman noktasındaki yoğunluğuna bağlı olarak, eGFP kanalı yalnızca MTZ'de ROI üretimi için yararlı olabilir.- grup. Bu nedenle, konfokal alımlar eGFP kanal görüntülerini de içerirken, ROI üretimi, adım 6.2.3'te belirtildiği gibi DAPI ve parlak alan kanalları kullanılarak tamamlanmıştır. DMSO ve IWR-1 ile muamele edilmiş MTZ'de RPE ROI üretimi basitti- larva grupları ve gözle görülür pigmentli apikal mikrovilluslu bölgeleri kapsar (Şekil 3B; kırmızı ok ucu) belirgin pigmentli hücre gövdeleri ile birlikte. MTZ'ye de aynı parametreler uygulandı+ larva grupları (Şekil 3D; kırmızı ok ucu); Bununla birlikte, yaralanma bölgesindeki artık hasarlı doku nedeniyle, apikal mikrovillus ve pigmentasyon sınırlarının bazı durumlarda tek başına parlak alan kanalında tanımlanması zordu. Bu alanlarda, DAPI kanalı, ROI'ye dahil edilen RPE yaralanma bölgesi içindeki hücresel kalıntıları tanımlamak için de kullanılmıştır (Şekil 3C,D; yaralanma yeri lokalize hücresel enkaz örnekleri camgöbeği ok uçları ile gösterilir). Olgunlaşmamış/olgun RPE belirteçleri ile immün boyama (örneğin, ZPR2; Şekil 6D,E)37 ve/veya fotoreseptörler (örneğin, ZPR1)37,38 ablatlanmış larvalarda RPE ROI'lerinin ana hatlarını çizmeyi kolaylaştırmak için de kullanılabilir.

Daha önce, 4 dpf'den 4 dpi'ye kadar IWR-1 ile tedavi edilen ablated larvalar, DMSO ile tedavi edilen kardeş kontrollere kıyasla RPE rejenerasyonunda anlamlı bozulma gösterdi (Şekil 8C)3. Bu, rejenerasyon sınırlarını belirlemek için model ve açısal mesafenin manuel ölçümleri ile ilgili önemli bir deneyim gerektiren merkezi pigment geri kazanımının yüzdesi olarak rapor edildi (Şekil 8B; siyah ok uçları). RpEGEN, RPE rejenerasyonunun nicelleştirilmesini otomatikleştirmek ve içsel önyargıları azaltmak için oluşturulmuştur. Sadece bu değil, RpEGEN aynı zamanda son derece sağlam veri kümelerinin oluşturulmasını da sağladı; Örneğin, daha önce n = 10 DMSO ile muamele edilmiş MTZ + larvalarının manuel nicelleştirilmesinden 10 veri noktası üretilmişti (Şekil 8C; kesit ölçümleri başına % pigment geri kazanımı)3, oysa 174.801 veri noktası n = 11 DMSO ile muamele edilmiş MTZ + larva / ROI'den RpEGEN kullanılarak üretildi (Şekil 9C; piksel yoğunluğu ölçümleri).

RpEGEN, FIJI kullanılarak üretilen orijinal ROI'den iskeletleştirilmiş bir merkez çizgisi (1 piksel genişliği) elde ederek RPE'nin tamamı boyunca pigmentasyondaki bölgesel değişiklikleri kademeli olarak değerlendirmek için geliştirilmiştir (Şekil 4A, B). Tüm pikselleri analiz için YG'ye dahil etmek üzere (yani, yalnızca merkez çizgisi pikselleri değil), YG maskesindeki her piksel için en yakın merkez çizgisi dizininin bir haritasını oluşturmak üzere merkez çizgisinden her pikselde bir Öklid mesafe dönüşümü gerçekleştirildi. Bu endeks haritası, merkez çizgisinin dışındaki her pikselin tek bir merkez çizgisi pikseline atfedilmesine izin verdi ve her larva için tüm RPE boyunca kapsamlı bir veri kümesi oluşturdu (Şekil 4E). RPE'nin dorsal-ventral uzunluğu, normalleştirilmiş piksel mesafesinin (Şekil 4F; 0-1 keyfi birimler) aksine açısal mesafe (Şekil 4G; 0-180 °) ile temsil edildi, çünkü bu, RPE rejenerasyonu 3,4,5'in önceki ölçümlerine ve açısal mesafenin morfolojik farklılıklarla değişmediği gerçeğine dayanarak daha sezgiseldi. 5 derecelik bölmelerden türetilen medyan yoğunluklar, büyük ölçekli eğilimleri vurgulamak ve 1 derecelik kümelenmiş verilerde gözlenen yüksek frekanslı değişkenliği en aza indirmek için seçilen metriktir (Tablo 1, Şekil 10A). Permütasyon simülasyonu, iki tedavi grubunun medyanlarının (burada, DMSO MTZ + ve IWR-1 MTZ + (her ikisi de 4 dpi), Şekil 10B) benzer olup olmadığını görmek için sıfır hipotezini test etmek için seçildi39. Bu yeniden örnekleme tekniği, verilerin dağılımı hakkında katı varsayımlardan yoksundur ve sağlam p-değeri tahminleri oluşturmak için bir dizi test istatistiğinde (örneğin, ortalama, medyan, vb.) kullanılabilir. Bu parametrelerin bir kısmı (örneğin, ham ve medyan verilerin kutu boyutu, permütasyon simülasyon tekrarları, vb.) kullanıcı ihtiyaçlarına uyacak şekilde uyarlanabilir ve değiştirilebilir. İkincisi için, istatistiksel olarak sağlam bir karşılaştırma oluşturmak için 20.000 tekrar seçildi, ancak çok az sayıda tekrar hatalı p değeri tahminleri üretebileceğinden, hesaplama verimliliğini istatistiksel sağlamlıkla dengelemeye özen gösterilmelidir. Yorumlara başlamadan önce p değeri dağılımının ve değerlerinin nispeten kararlı olmasını sağlamak için çoklu tekrarlama değerlerinin (10.000, 20.000, vb.) çalıştırılması önerilir. Permütasyon tekrarlarının arttırılması, istatistiksel gücü artıracaktır (ancak çalışması daha uzun sürecektir), bu da bazı veri kümeleri için faydalı olabilir.

Konfokal görüntü veri kümeleri, adım 7'de açıklandığı gibi RpEGEN kullanılarak ölçülmüştür. Açıklamalı RpEGEN ve destek betikleri, ilgilenen kullanıcıların test etmesi için 8 bit TIF ve ilgili ROI dosyalarıyla birlikte GitHub'da (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) mevcuttur. MTZ-larva ROI'lerinden ham verileri görüntüleyen ısı haritaları,% 0.06 v / v DMSO veya 15 μM IWR-1 ile tedaviden bağımsız olarak, RPE'nin dorsal (0 °) ila ventral (180 °) uzunluğunu kapsayan daha koyu piksel yoğunluklarının (burada 0 = siyah ve 255 = beyaz, 8 bit renk skalası) genel bir dağılımını göstermiştir (Şekil 9A, B). Medyan piksel yoğunluklarının çizilmesi, tüm gruplar arasında görselleştirmeyi kolaylaştırdı ve RPE genelinde MTZ grupları arasında benzerlikler gösterdi (Şekil 10A; siyah ve gri çizgiler). Bu veriler, bozulmamış pigmentli RPE tek katmanının varlığını destekledi (Şekil 9E, F) ve unblated RPE için temel medyan piksel yoğunluğu değerlerini (yani 150'nin altında) sağladı (Şekil 10A; siyah ve gri çizgiler). Karşılaştırmalı olarak, MTZ + larva ROI'lerinden elde edilen ham (Şekil 9C, D) ve medyan (Şekil 10A; mavi ve kırmızı çizgiler) verileri, tedavi durumundan bağımsız olarak, yine merkezi RPE'de daha hafif piksel yoğunluklarının genel bir dağılımını göstermiştir. Ablated DMSO ile muamele edilmiş larvalar, ışık piksellerinin merkezi dağılımını yaklaşık 100 ° 'de (± 15 °) göstermiştir (Şekil 9C; turuncu-kırmızı kutular). Bu, optik sinir içinde / çevresinde merkezi RPE yaralanma bölgesinde pigmentasyonun gözle görülür bir yokluğuna karşılık geliyordu (Şekil 9G; mavi ok uçları). Ablated IWR-1 ile muamele edilmiş larvalar ayrıca, MTZ + DMSO ile tedavi edilen kardeş kontrolleri ile karşılaştırıldığında hem dorsal olarak (yaklaşık 50 ° 'ye) hem de ventralal (yaklaşık 5 ° 'ye) genişleyen ışık piksellerinin merkezi dağılımını göstermiştir (Şekil 9D; turuncu-kırmızı kutular). Genişlemiş bir yaralanma bölgesinin varlığı kesitli dokuda açıkça görülebiliyordu (Şekil 9H; mavi ok uçları). İki adet 1 derecelik kutu dışında, MTZ+ grupları arasında gözlenen fark merkezi RPE'de istatistiksel olarak anlamlıydı (Şekil 10B; ~40-140° arasında açık mavi gölgeli alan; p-değeri ≤ 0.05), MTZ + DMSO ile tedavi edilen kardeş kontrollerine kıyasla MTZ + IWR-1 ile tedavi edilen larvalarda anlamlı derecede daha az merkezi RPE pigmentasyonunu gösterir. Bu ham (Şekil 9C,D) ve medyan (Şekil 10A) verilerinin RpEGEN kullanılarak istatistiksel karşılaştırma (Şekil 10B) ile yorumlanması sadece kesitli doku (Şekil 9G,H) gözlemlenerek değil, aynı zamanda manuel nicelemeden elde edilen önceki bulguları da desteklemiştir (Şekil 8)3.

Figure 1
Şekil 1: rpe65a:nfsB-eGFP transgen ekspresyonu, döllenmeden 5 gün sonra. (A-C) Genetik ablasyon taraması sırasında epifiz bezinde (A; sarı ok ucu) loş transgen ekspresyonu ve RPE'de (B, C) parlak transgen ekspresyonu gösteren PTU ile tedavi edilmiş 5 dpf larvanın bütünsel görüntüleri. (B) Transgen ekspresyonu, RPE'nin merkezi üçte ikisine gözle görülür şekilde lokalize edilir ve beyaz ok uçları, periferik (olgunlaşmamış) ve merkezi (olgun) RPE arasındaki sınırı vurgular. Yeşil = eGFP. Anterior yukarı. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: RPE'nin in vivo başarılı genetik ablasyonunun doğrulanması. (A) üç unblated (MTZ-) 7 dpf larvasının göz boyunca RPE pigmentasyonu gösteren ve (B) RPE'nin merkezi üçte ikisinde pigment bulunmadığı bir ablasyon bölgesini gösteren üç ablated (MTZ +) 2 dpi larvasının (kırmızı ok uçları) bütünsel görüntüleri. Anterior yukarı. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: RpEGEN kullanarak otomatik niceleme için RPE ilgi alanları (ROI'ler). (A,B) unblated (MTZ-) 9 dpf larva ve (C,D) ablated (MTZ+) 4 dpi larva ile RPE ROI'leri macenta ile vurgulanmış transvers kriyoseksiyonlar. (B,D) Kırmızı ok uçları, gözle görülür pigmentli apikal mikrovillusların ROI'ye dahil edildiği bölgeleri vurgulamaktadır. (C,D) Camgöbeği ok uçları, ROI'ye RPE hücre kalıntılarını dahil etmek için kullanılan yaralanma bölgesi lokalize DAPI + kalıntılarının örnek bölgelerine işaret etmektedir. (B',B",D',D") Hem dorsal hem de ventral ROI bölgelerinin dijital yakınlaştırmaları (B ve D'de siyah noktalı kutular), önerilen ROI başlangıç noktalarını (mavi ok uçları) ve MATLAB'da uç nokta tespiti için kritik olan sivri ROI uçlarını gösterir. Parlak alan görüntüleri Şekil 9E,G'de de gösterilmiştir. Beyaz/gri = çekirdekler. Dorsal yukarı ve distal kaldı. (A-D) Ölçek çubukları = 40 μm. (B',B",D',D") Ölçek çubukları = 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: RpEGEN işleme iş akışı. (A) MATLAB'a aktarılan, düzgün yönlendirilmiş 8 bit parlak alan görüntüsü ve FIJI tarafından oluşturulan yatırım getirisi (kırmızı) örneği. Dorsal yukarı ve distal kaldı. Renk çubuğu, 0 = siyah ve 255 = beyaz olmak üzere 8 bit gri tonlamalı yoğunluk değerlerini temsil eder. (B) ROI maskesinin (kırmızı) hatalı mahmuzların varlığını gösteren ilk ikili iskeletizasyonu (beyaz) ve (C)'de gösterildiği gibi jeodezik piksel mesafesi tanımlaması için başlangıç ve bitiş noktalarının tanımlanması. (C) içindeki renk çubuğu Öklid piksel mesafesini temsil eder. (D) Mahmuzlar, bitiş pikselinden başlangıç pikseline kadar basitleştirilmiş, en düşük maliyetli bir yol kullanılarak kaldırılır ve mahmuzlardan (kırmızı) yoksun sürekli bir merkez çizgisi elde edilir. (E) YG maskesindeki tüm pikseller ile merkez çizgisi pikselleri (beyaz) arasındaki mesafe dönüşümüne dayanan en yakın doğrusal merkez çizgisi endeksleri. Bu dizin değerleri, YG maskesindeki her görüntü pikselinin analiz için en yakın merkez çizgisi pikseline atanmasına izin verir. Renk çubuğu, doğrusal merkez çizgisi piksel dizini değerlerini temsil eder. (F) Merkez çizgisi boyunca normalleştirilmiş piksel mesafesine bir örnek, burada 0 (mavi, distal-en dorsal piksel) başlangıç pikseli ve 1 (kırmızı, distal-en ventral piksel) bitiş pikselidir. (G) (F)'ye benzer, ancak açısal mesafeyi kullanarak, 0 derece (mavi) başlangıç pikseli ve 180 derece (kırmızı) bitiş pikselidir. (H) Her merkez çizgisi pikseli için hesaplanan medyan piksel yoğunluğu değerlerine örnek. Renk çubuğu, verilen her bir merkez çizgisi pikseline katkıda bulunan tüm YG piksellerinin medyan gri tonlama yoğunluk değerini temsil eder. Bu şekil,% 0.06 v / v DMSO veya 15 μM IWR-1 tedavi gruplarından larvaları değil, bir test veri kümesinden görüntüleri göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: RPE ablasyonu ve fotoreseptör dejenerasyonu kanıtı. (A) Kesilmemiş 6 dpf larvasının enine kriyoseksiyonları. (A,A') PTU'ya maruz kaldıktan sonra, transgen ekspresyonu olgun RPE hücreleri ile sınırlıdır ve en parlak ekspresyon RPE'nin merkezi üçte ikisi ile sınırlıdır. Ok uçları apikal mikrovillusları gösterir. (A") Diferansiyel girişim kontrastı (DIC) görüntüleri normal dış nükleer tabaka (ONL; yani fotoreseptör) mimarisini ortaya koymaktadır. (B,B') 1 dpi larvaların transvers kriyolitasyonları, ONL laminasyonunda eGFP+ hücre morfolojisinde önemli bozulmalar ve düzensizlik olduğunu ortaya koymaktadır. Oklar delamine ve piknotik çekirdekleri gösterir. (B") DIC görüntüleri, ONL mimarisinin belirgin bozulmasını daha da ortaya koymaktadır. Yeşil = eGFP, mavi = çekirdek, sarı = ONL. Dorsal yukarı ve distal kaldı. (A) içindeki ölçek çubuğu 40 μm'yi temsil eder ve (B)'ye uygulanabilir. (A') içindeki ölçek çubuğu 40 μm'yi temsil eder ve (A",B',B") öğesine uygulanabilir. Bu şekil ve şekil açıklaması metni Hanovice et al. 2019 (Şekil 1)3'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Larva zebra balıklarında RPE rejenerasyonu modeli . (A) nfsB-eGFP, gözün merkezi üçte ikisinde olgun RPE ile ifade edilir. (B) MTZ uygulaması, RPE ve fotoreseptörlerin apoptozuna (TUNEL, kırmızı) yol açar. (C) RPE ablasyonu, fotoreseptörlerin ve Bruch zarının (noktalı çizgi) dejenerasyonuna yol açar. (D) Periferdeki unblated RPE çoğalmaya başlar ve yaralanma bölgesine (mavi) uzanır. (E) Rejenere eGFP+ RPE çevrede göründüğünde, RPE dört bölgeye ayrılabilir: periferik RPE (pRPE), farklılaştırılmış RPE (dRPE), geçiş bölgesi (TZ) ve yaralanma bölgesi (IS). (E, giriş) Rejenere diferansiye RPE (yeşil), unblated periferik RPE'ye periferik proksimal olarak görünür ve geçiş bölgesine bitişik proliferatif hücreler içerir. Geçiş bölgesi, hala farklılaşan RPE hücrelerinden (ZPR2, kırmızı) ve proliferatif hücrelerden (mavi) oluşur. Yaralanma bölgesi, herhangi bir RPE farklılaşma belirteci ifade etmeyen pigmentsiz proliferatif hücrelerden oluşur. (F) İşlevsel bir RPE tabakasının ve Bruch membranının yenilenmesi 14 dpi ile tamamlanır. Bu şekil ve şekil efsanesi metni Hanovice et al. 2019 (Şekil 14)3'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Görüntü analizinden dışlanan uzlaşmış doku kesitleri. (A-C) Larvaların enine kriyolitleri, dışlama kriterlerini karşılayan %0.06 v/v DMSO ve 15 μM IWR-1 veri setlerinden. Bir larva dorsal RPE doku yırtılmasını (A; macenta ok uçları) gösterir ve diğer iki larva, DAPI kanalında (B; macenta noktalı ovaller) anatomik bir dönüm noktasını (dorsal OLM) engelleyen veya parlak alan kanalından (C; macenta noktalı ovaller) RPE yoğunluğu ölçümlerini çarpıtabilen doku katlanmasını gösterir. Beyaz/gri = çekirdekler. Dorsal yukarı ve distal kaldı. Ölçek çubukları = 40 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: IWR-1 kullanılarak farmakolojik inhibisyon RPE rejenerasyonunu bozar. Ablatlanmış (MTZ+) 4 dpi larvaların transvers kriyolitasyonları (A) %0.06 v/v DMSO ve (B) 15 μM IWR-1 tedavi gruplarından. Parlak alan görüntüleri (A,B) ve yüzde RPE geri kazanımı/kesitinin (C) nicelleştirilmesi, IWR-1 ile tedavi edilen larvalarda pigmentli tek tabakanın geri kazanılmasında önemli bir gecikme olduğunu göstermektedir (Student'ın eşlenmemiş t-testi, *** p < 0.0001). (B) Siyah ok uçları, yenilenen RPE'nin en merkezi kenarını gösterir. Dorsal yukarı ve distal kaldı. (B) içindeki ölçek çubuğu 40 μm'yi temsil eder ve (A)'ya uygulanabilir. Bu şekil ve şekil efsanesi metni Hanovice ve ark.'dan değiştirilmiştir. 2019 (Şekil 13)3. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 9
Şekil 9: RpEGEN'de RPE rejenerasyonunun otomatik olarak nicelleştirilmesinden elde edilen ham veri çıktısı. (A-D) Her veri kümesindeki tüm larvalar için dorsal (x eksenleri; açısal mesafe = 0°) ventralden (x-eksenleri; açısal mesafe = 180°) tüm RPE ROI bölgesinden derlenen parlak alan piksel yoğunluğu dağılımlarını gösteren ısı haritaları: (A) n = 11, DMSO MTZ-; (B) n = 10, IWR-1 MTZ-; (C) n = 11, DMSO MTZ+; (D) n = 12, IWR-1 MTZ+ (üç bağımsız ana gruptan, N = 3). Örneğin, (A) 11 YG'de 177.460 pikselden oluşan verileri görüntüler. Y eksenlerinde, piksel yoğunluğu, 0 = siyah ve 255 = beyaz olmak üzere 8 bitlik bir renk skalasına göre gösterilir. Ham veriler, kırmızı = maksimum bin sayısı ve koyu mavi = minimum bin sayısı olan 5-8 bit yoğunluk değeri (y ekseni) kutularına göre 5 derecelik (x ekseni) olarak görüntülenir. (E-H) %0.06 v/v DMSO ve 15 μM IWR-1 tedavi gruplarından temsili (E,F) unblated (MTZ-) 9 dpf larva ve (G,H) ablatlanmış (MTZ+) 4 dpi larvanın transvers kriyoseksiyonları. RPE ROI'leri macenta cinsinden vurgulanır ve açısal mesafe aşırı uçları belirtilir (0 ° = dorsal, 180 ° = ventral). Genel olarak, bu veriler, tedaviden bağımsız olarak, (C, D, G, H) ablatlanmış ROI'lere kıyasla, (A, B, E, F) unblated ROI'lerde daha koyu piksellerin (0-150 arasındaki yoğunluk değerleri) dağılımını göstermektedir. Ablatlanmış ROI'lerden elde edilen veriler, DMSO tedavi grubunda (D, H) IWR-1 ile tedavi edilen larvalarda dorsal olarak (~ 50 °) ve hafif ventralal olarak (~ 50 °) genişleyen DMSO tedavi grubunda daha hafif piksellerin (100 ° ± 150 ° ) merkezi (100 ° 150 ° ) dağılımını göstermektedir. (G,H) Pigment içermeyen bu merkezi ablasyon bölgeleri mavi ok uçlarıyla vurgulanır. Siyah oklar optik sinirin yerini gösterir. DMSO ile tedavi edilen larvalardan gelen görüntüler de Şekil 3'te gösterilmiştir. Ölçek çubukları = 40 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 10
Şekil 10: Grup sonuçları ve RpEGEN'de RPE rejenerasyonunun otomatik olarak ölçülmesinden elde edilen istatistiksel karşılaştırma. (A) 5 derecelik bağlanmış medyan değerler ve% 95 güven zarfları her grup için ham verilerden türetilmiştir. Grafik, RPE'nin dorsal (0 °) ila ventral (180 °) uzunluğu boyunca MTZ grupları (siyah ve gri çizgiler) arasında benzerlik gösterir ve merkezi RPE'deki MTZ + grupları (mavi ve kırmızı çizgiler) arasında (~ 40-140 ° arasında açık mavi gölgeli alan) dikkate değer farklılıklar gösterir. Spesifik olarak, medyan piksel yoğunluğu, IWR-1 MTZ + 4 dpi'de, merkezi RPE pigmentasyonunun azalmasına karşılık gelen diğer herhangi bir tedavi grubuna kıyasla daha hafif görünür (0 = siyah ve 255 = beyaz). (B) DMSO MTZ+ 4 dpi ve IWR-1 MTZ+ 4 dpi için RPE'nin dorsal (0°) ila ventral (180°) uzunluğu boyunca 1 derecelik bölmelerden türetilen medyan değerlerin istatistiksel olarak karşılaştırılması, (A)'daki gözlemi güçlendirir. p-Değerleri, 20.000 tekrarlı bir permütasyon simülasyonu ve her 1 derecelik bin için iki taraflı bir test kullanılarak hesaplandı. İki grubun karşılık gelen herhangi bir 1 derecelik bin için benzer medyan değerlere sahip olduğu sıfır hipotezi altında, 0.05 ≤ bir p-değeri, grup medyanları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farkı gösterir (kesikli siyah çizgi =% 95 güven aralığı (CI)). Merkezi RPE boyunca 0.05'≤ p-değerlerinin varlığı (~ 40-140 ° arasındaki açık mavi gölgeli alan), ablatlanmış (MTZ +) IWR-1 ile tedavi edilen larvalarda, ablatlanmış (MTZ +) DMSO ile tedavi edilen kardeş kontrollerine kıyasla önemli ölçüde daha az pigmentasyon olduğunu gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Değişken Adı Değişken Türü Değişken Boyut Değişken Açıklaması
ROIname Hücre {N x 1} İşlenen yatırım getirisi dosyalarının adları
Yatırım getirisi Hücre {N x 1} İşlenen her YG dosyası için YG köşeleri
IMGname Hücre {N x 1} İşlenen TIF görüntü dosyalarının adları
cesaret Hücre {N x 1} İşlenen her TIF için 8 bit parlak alan görüntü verileri
ROIBW Hücre {N x 1} IMG görüntüleriyle aynı boyutlara sahip mantıksal (0 veya 1) yatırım getirisi maskesi
Cüce Hücre w / Tablolar {N x 1} (n x 16) x, y, mesafe, açı, dizin, nokta sayısı ve istatistikler dahil olmak üzere tek tek görüntüler için merkez çizgisi verileri
CIdx Hücre {N x 1} YG maskesiyle ilgili merkez çizgisi endeksi verileri, CLine'i hesaplamak için en yakın merkez çizgisi noktasına işaret eder
CLineBW Hücre {N x 1} Merkez çizgisinin konumunu gösteren IMG görüntüleriyle aynı boyutlara sahip mantıksal (0 veya 1) matris (=1)
RAW_data Masa N x 3 Tüm farklı IMG görüntülerinde YG'lerdeki her piksel için tüm ham verileri birleştiren tablo
BIN_1_deg_all Masa N x 9 1 derecelik bağlanmış verileri ve RAW_data verileri kullanan istatistikleri içeren tablo
BIN_5_deg_all Masa N x 9 RAW_data verileri kullanan 5 derecelik bağlanmış verileri ve istatistikleri içeren tablo
BIN_10_deg_all Masa N x 9 10 derecelik ciltlenmiş verileri ve RAW_data verileri kullanan istatistikleri içeren tablo

Tablo 1: RpEGEN.m komut dosyasından MAT dosyasına dışa aktarılan değişkenlerin açıklaması. Tanımlar aşağıdaki gibidir: ROI(ler) = ilgilenilen bölge(ler); TIF = etiketli görüntü dosyası biçimi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol, RPE'yi genetik olarak ablate etmek ve larval yaşlı zebra balıklarında dejenerasyon ve rejenerasyon mekanizmalarını incelemek için metodolojiyi açıklamaktadır. Bu protokol yetişkin zebra balığı3'te de başarıyla gerçekleştirilmiştir, ancak daha az kapsamlı karakterizasyona sahiptir, bu nedenle larvalar burada odak noktasıdır. Protokolün bu bölümünün kritik yönleri (adım 1-4) şunları içerir: 1) melanogenezin başlamasından önce embriyolara 1.5x PTU eklenmesi, 2) 2-3 dpf'de PTU ile tedavi edilen embriyoların dekoryonlanması, 3) eGFP için dikkatli tarama ve 4) MTZ ile genetik ablasyon sırasında su değişikliklerinin zamanlaması. PTU, melanin sentezi21,22'yi inhibe eder ve bu RPE ablasyon paradigmasında, rpe65a: nfsB-eGFP transgen ekspresyonunun taranmasını kolaylaştırmak ve sırasıyla pigmentli doku3'ün yokluğuna ve daha sonra geri dönüşüne dayanan RPE dejeneratif ve rejeneratif süreçlerin karakterizasyonunu sağlamak için kullanılmıştır. PTU daha fazla pigmentasyonu inhibe edeceğinden, ancak melanogenez21'e başladıktan sonra depigment dokularını inhibe etmeyeceğinden, zebra balığı25'te yaklaşık 24 hpf başlayan pigmentasyonun başlangıcından önce PTU eklenmelidir. Burada ve önceki çalışmalarda4,5, melanin sentezi başlamadan önce inhibisyon sağlamak için yaklaşık 6 hpf26'da PTU eklenmiştir. PTU, anahtar protokol adımlarının görselleştirilmesini sağlarken, PTU tedavisi gelişimin bazı yönlerini etkileyebilir (adım 2.3'te tartışıldığı gibi) ve embriyo kuluçkasını bozabilir. İkinci süreç, çok uzun süre gecikirse, morfoloji ve hareketlilik açıklarına yol açabilir ve canlılığı etkileyebilir40; Bu nedenle, embriyoların pronaz ile enzimatik olarak veya 2-3 dpf üzerinde forseps kullanılarak manuel olarak dekoryonlanması (kuluçkalanması), genetik ablasyondan önce larva sağlığının korunması ve standartlaştırılması için önemlidir. Eski larva sağlığı ve canlılığı (PTU tedavisi ile ilgisi olmayan) ile ilgili sorunlardan kaçınmak için bir diğer önemli husus, larvaların deneyler için 9 dpf / 4 dpi'yi geçen bir su tesisi sisteminin dışında kalması durumunda standartlaştırılmış beslenme rejimlerine başlaması gerektiğidir41.

Açıklandığı gibi, rpe65a, posterior gözün merkezi üçte ikisinde olgun RPE'de transgen ekspresyonunu yönlendirir. PTU ile tedavi edilen 5 dpf larvalarında eGFP ekspresyonu normalde kolayca tespit edilir ve Şekil 1'de gösterildiği gibi gözle görülür şekilde yoğundur (parlak). Parlak ekspresyonlu kardeşlere kıyasla 5 dpf'de eGFP'yi loş bir şekilde ifade eden larvalar da gözlenebilir. Nesiller arasındaki ekspresyon yoğunluğu oranlarındaki farklılıklar (yani, parlak ve loş) da mevcut olabilir, bazı nesiller larvaları diğerlerinden daha loş bir şekilde ifade eder. Her durumda, loş eGFP ekspresyonuna sahip larvalar genellikle her debriyajdaki hayvanların azınlığını temsil eder. Loş eksprese eden larvaların daha az şiddetli RPE yaralanması fenotipleri gösterip göstermediği bilinmemekle birlikte, her debriyajdan parlak eGFP + kohortunda ablasyonlar yapılmış ve nispeten loş kardeşler taramada ötenazi yapılmış ve analizden çıkarılmıştır. Benzer şekilde, zebra balığı RPE ablasyonu ve rejenerasyon fenotiplerinin kapsamlı karakterizasyonu, rpe65a:nfsB-eGFP transgeni için larva heterozigotlarında, rpe65a:nfsB-eGFP heterozigot yetişkinleri vahşi tip yetişkinlere geçerek gerçekleştirilmiştir3. Bununla birlikte, rpe65a: nfsB-eGFP için larvaların homozigot olarak daha şiddetli ablasyon fenotipleri gösterip göstermediği bilinmemektedir. Ablasyon protokolünü standartlaştırmaya yönelik diğer çabalar, 24 saatlik genetik ablasyon periyodu boyunca MTZ ve MTZ + bulaşıklarına eşit, ölçülen hacimlerin (örneğin, 10 cm Petri kabı başına 30 mL) eklenmesini içerir. Benzer şekilde, farmakolojik tedavi kaplarındaki larvalar eşit, ölçülen hacimler (örneğin, 6 kuyucuk başına 5 mL) ve taze bileşiklerin zamanında yenilenmesini (örneğin, her 24 saatte bir) almıştır. Farklı MTZ ve/veya farmakolojik bileşik işlemleriyle bulaşıkları işlerken, taşıma ve su değişimleri sırasında dökülmeyi ve yanlışlıkla çapraz kontaminasyonu önlemek için dikkatli önlemler alınmalıdır.

Zebra balığı RPE ablasyon protokolü, farmakolojik manipülasyonu içerecek şekilde değiştirilebilir (adım 5). Bu daha önce RPE rejenerasyonunun kritik düzenleyicileri olarak immün yanıt5, mTOR4 ve Wnt3 sinyal yollarını tanımlamak için yapılmıştır; ikincisinin burada tekrarlanabilir olduğu gösterilmiştir ve RpEGEN'i doğrulamak için kullanılmıştır. Kritik RPE rejenerasyon yollarını aydınlatmanın yanı sıra, zebra balığı retinal rejenerasyon çalışmaları için farmakolojik manipülasyon yaygın olarak kullanılmaktadır 10,42,43,44,45,46,47. RPE ablasyon protokolüne dahil edilmeden önce, farmakolojik ajanlar toksisite, etkinlik ve tedavi süresi açısından titizlikle değerlendirilmelidir. Bu şu şekilde yapılabilir: toksisiteyi değerlendirmek için doz yanıtı deneyleriyapmak 48; bilinen hedef genlerin/proteinlerin ekspresyonunun değerlendirilmesi 4,5; ve farmakolojik manipülasyonun bilinen fonksiyonel sonuçlarının değerlendirilmesi, örneğin, PLX3397 tedavisi48,49,50,51 ile lökositlerin tükenmesi. Burada, DMSO (araç kontrolü) ve IWR-1, genetik ablasyondan 24 saat önce eklendi ve larvalar, 4 dpf'de farmakolojik ön tedaviden hemen önce tarandı. eGFP + larvaları 4 dpf'deki eGFP- larvalarından ayırt edilebilirken, eGFP'nin yoğunluğu oldukça sönük görünebilir, bu nedenle larvalar 5 dpf'de eGFP ekspresyonu için yeniden taranmıştır (Temsili Sonuçlar). 4 dpf'den önce eGFP taraması zor olabilir, çünkü ekspresyon gözle tespit edilemeyecek kadar düşük olabilir. Böylece, 4 dpf'den önce farmakolojik ajanlarla ön işlem (yani, 2 dpf'de)4, eGFP açıkça görülebildiğinde 5 dpf'de ayrılacak olan taranmamış larvalara eklenebilir. Larvaların manipüle edilmesi gereken herhangi bir senaryoda (örneğin, tarama sırasında, görüntüleme için gömme vb.), Farmakolojik tedavi koşulları korunmalı ve tarama yaşından bağımsız olarak, RPE 5 dpf'de MTZ ile ablatlanmalıdır.

Genetik ablasyon protokolüne ek olarak, konfokal mikroskop görüntü ön işleme ve RpEGEN kullanarak RPE rejenerasyonunun otomatik olarak ölçülmesi için adım adım talimatlar özetlenmiştir (adım 6-7). RpEGEN, kullanıcılar arasında RPE rejenerasyon nicelemesini standartlaştırmak ve çıktı veri kümesinin sağlamlığını artırmak için oluşturulurken, daha önce yapılan sıkıcı manuel niceleme ile birlikte gelebilecek içsel önyargıları en aza indirgemek için oluşturulmuştur. Protokolün bu bölümünün kritik yönleri, ROI oluşturma sırasında gerçekleştirilir (adım 6). İlk olarak, görüntü / göz dorsal yukarı, distal sol yönde olmalıdır (örneğin, Şekil 3A-D, Şekil 4), çünkü RpEGEN bu yönlülük için optimize edilmiştir. RPE ROI'lerinin dorsal ve ventral terminal uçlarının Şekil 3B', B", D', D' de (macenta çizgileri) gösterildiği gibi sivri uçlu bir uca konik olması da kritiktir. Bu uçlar bunun yerine karelenir veya yuvarlanırsa, RpEGEN komut dosyası merkez çizgisi iskelet başlangıç ve bitiş piksellerini belirlemekte zorlanabilir ve merkezi bir çizgi yerine terminal ROI uçlarında mahmuzlar oluşturabilir (Şekil 4B). Terminal ROI uçlarındaki mahmuzlar, mahmuzdan arındırma sırasında merkez hattının kısalmasına (Şekil 4D) ve / veya periferik RPE'deki açısal mesafe ölçümleriyle ilgili sorunlara (Şekil 4G) yol açabilir. Her bir larvaya karşılık gelen TIF ve ROI dosyaları için özdeş adlandırma sistemleri, 8 bit TIF dosyasını RpEGEN'deki doğru ROI ile eşleştirmek için de önemli bir adım ve zorunluluktur. Eşleşmeyen TIF ve ROI dosya adları, Temsili Sonuçlar bölümünde (Şekil 4) özetlenen RpEGEN işleme iş akışının oluşturulamamasına neden olur ve sonuçta bu komut dosyasını kullanarak RPE rejenerasyon ölçümünü önler.

Toplu olarak, bu protokol larva zebra balığında RPE'yi başarılı bir şekilde ablatmak, RPE yaralanması öncesinde, sırasında veya sonrasında ilgi çekici olabilecek sinyal yollarını manipüle etmek ve RPE rejenerasyonunu sınırlı doğal önyargılarla standartlaştırılmış bir şekilde ölçmek için talimatlar sağlar. RPE'nin rejeneratif potansiyelini incelemek için mevcut in vivo ve in vitro modeller bağlamında, zebra balığı içsel RPE rejenerasyonu kapasitesi bakımından benzersizdir14. Bununla birlikte, bu, terapötik gelişim için hedeflenen RPE dejeneratif hastalıklar (örneğin, AMD) gibi kronik olmayan, RPE hasarının akut bir modelidir. Bu, modelin bir sınırlaması olsa da, büyük ölçüde bilinmeyen ve gelecekte kronik yaralanma ve hastalığı incelemek için uyarlanabilecek RPE rejenerasyon mekanizmalarını incelemek için mükemmel bir platform olmaya devam etmektedir. Burada açıklanan araçlar ve metodoloji çok yönlüdür ve dejeneratif yanıtta yer alan hücresel süreçlerin çalışmalarına ve ablasyon sonrası RPE'ye bitişik dokuların kaderini incelemek için de uygulanabilir. Benzer şekilde, RpEGEN komut dosyası, kullanıcı veri çıkışı ihtiyaçlarına uyacak şekilde değiştirilebilir; örneğin, pigment dışındaki belirteçlerin mekansal analizlerini yapmak için (örneğin, in situ hibridizasyon probları, protein ekspresyonu, vb.).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

L.L.L., insan pluripotent kök hücrelerinden retinal pigment epiteli elde etmek için hızlandırılmış bir yöntemi tanımlayan ABD Patent #9,458,428'in ortak mucididir; bunun buradaki içerikle ilgisi yoktur. J.M.G. ve G.B.F.'nin açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgments

Burada açıklanan çalışmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri (RO1-EY29410'dan J.M.G'ye ve NIH CORE Grant P30-EY08098'den Oftalmoloji Bölümü'ne) tarafından desteklenmiştir; UPMC Bağışıklık Nakli ve Terapi Merkezi (L.L.L. ve J.M.G.'ye); ve E. Ronald Salvitti Oftalmoloji Araştırmaları Kürsüsü (J.M.G.'ye). Wiegand Oftalmoloji Bursu'ndan (L.L.L.'ye), Pittsburgh Göz ve Kulak Vakfı'ndan ve New York, NY'daki Körlüğü Önleme Araştırması'ndan sınırsız bir hibe alındı. Yazarlar ayrıca teknik yardım için Amanda Platt'a ve mükemmel hayvan bakımı desteği için Dr. Hugh Hammer ve su sporları personeline teşekkür etmek istiyor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) Millipore Sigma D9542
6-well plates Fisher Scientific 07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 05-539-13 Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing pen Fisher Scientific 50-254-51 Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % Fisher Scientific BP231 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large) Fisher Scientific 3720A
Embryo incubator (mini/tabletop) Labnet I5110A
Fluorescence stereo microscope Zeiss Axio Zoom.V16 Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-4 Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo Millipore Sigma 5.04462 Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder) Fisher Scientific BP117-100 Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ) Millipore Sigma M3761 Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU) Millipore Sigma P7629 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free Fisher Scientific AA433689M Chemical waste, proper disposal required
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712 10 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets) Millipore Sigma P3813 Used to make 10 X PBS stock
Pronase Millipore Sigma PRON-RO
Shaking incubator Benchmark H2010 Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscope Leica S9i Or similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forceps Fine Science Tools 91150-20 Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shaker Scilogex SK-D1807-E
Transfer pipette Millipore Sigma Z135003 3.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Pentair TRS1, TRS2, TRS5 Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ) FIJI (Fiji is Just ImageJ) https://imagej.net/software/fiji/ Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tos MathWorks https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB support MathWorks https://www.mathworks.com/support.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Grierson, I., et al. repair and regeneration of the retinal pigment epithelium. Eye. 8 (2), 255-262 (1994).
  3. Hanovice, N. J., et al. Regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium after widespread genetic ablation. PLoS Genetics. 15 (1), 1007939 (2019).
  4. Lu, F., Leach, L. L., Gross, J. M. mTOR activity is essential for retinal pigment epithelium regeneration in zebrafish. bioRxiv. , (2021).
  5. Leach, L. L., Hanovice, N. J., George, S. M., Gabriel, A. E., Gross, J. M. The immune response is a critical regulator of zebrafish retinal pigment epithelium regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (21), (2021).
  6. Zenno, S., Koike, H., Tanokura, M., Saigo, K. Gene cloning, purification, and characterization of nfsb, a minor oxygen-insensitive nitroreductase from escherichia coli, similar in biochemical properties to frase I, the major flavin reductase in vibrio fischeri. The Journal of Biochemistry. 120 (4), 736-744 (1996).
  7. Hamel, C. P., et al. Molecular cloning and expression of rpe65, a novel retinal pigment epithelium-specific microsomal protein that is post-transcriptionally regulated in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15751-15757 (1993).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
  10. White, D. T., et al. Immunomodulation-accelerated neuronal regeneration following selective rod photoreceptor cell ablation in the zebrafish retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 3719-3728 (2017).
  11. Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590 (2016).
  12. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. The Journal of Comparative Neurology. 518 (6), 800-814 (2010).
  13. Hagerman, G. F., et al. Rapid recovery of visual function associated with blue cone ablation in zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0166932 (2016).
  14. George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).
  15. Chiba, C., et al. Visual cycle protein rpe65 persists in new retinal cells during retinal regeneration of adult newt. The Journal of Comparative Neurology. 495 (4), 391-407 (2006).
  16. Yoshii, C., Ueda, Y., Okamoto, M., Araki, M. Neural retinal regeneration in the anuran amphibian xenopus laevis post-metamorphosis: Transdifferentiation of retinal pigmented epithelium regenerates the neural retina. Developmental Biology. 303 (1), 45-56 (2007).
  17. Xia, H., Krebs, M. P., Kaushal, S., Scott, E. W. Enhanced retinal pigment epithelium regeneration after injury in mrl/mpj mice. Experimental Eye Research. 93 (6), 862-872 (2011).
  18. McGill, T. J., et al. Subretinal transplantation of human central nervous system stem cells stimulates controlled proliferation of endogenous retinal pigment epithelium. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 43 (2019).
  19. Salero, E., et al. Adult human rpe can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
  20. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nature Chemical Biology. 5 (2), 100-107 (2009).
  21. Whittaker, J. R. An analysis of melanogenesis in differentiating pigment cells of ascidian embryos. Developmental Biology. 14 (1), 1-39 (1966).
  22. Westerfield, M. Zebrafish Book, 5th Edition; A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregon, USA. (2007).
  23. Hammer, H. S. Water quality for zebrafish culture in The Zebrafish in Biomedical Research. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. 321-335 (2020).
  24. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  25. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  26. Camp, E., Lardelli, M. Tyrosinase gene expression in zebrafish embryos. Development Genes and Evolution. 211 (3), 150-153 (2001).
  27. Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
  28. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PloS One. 7 (6), 40132 (2012).
  29. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and igf signaling. PLoS One. 6 (8), 22991 (2011).
  30. Leary, S., et al. Avma Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , American veterinary medical association. Schaumburg, Illinois, USA. (2020).
  31. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on cryosections from embryonic and adult zebrafish eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, 4779 (2007).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Muir, D. GitHub - ReadImageJROI. , Available from: https://github.com/DylanMuir/ReadImageJROI (2021).
  34. Morel, P. Gramm: Grammar of graphics plotting in matlab. Journal of Open Source Software. 3 (23), 568 (2018).
  35. Reinhardt, R., et al. Sox2, tlx, gli3, and her9 converge on rx2 to define retinal stem cells in vivo. The EMBO Journal. 34 (11), 1572-1588 (2015).
  36. Schonthaler, H. B., et al. Evidence for rpe65-independent vision in the cone-dominated zebrafish retina. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1940-1949 (2007).
  37. Yazulla, S., Studholme, K. M. Neurochemical anatomy of the zebrafish retina as determined by immunocytochemistry. Journal of Neurocytology. 30 (7), 551-592 (2001).
  38. Larison, K. D., Bremiller, R. Early onset of phenotype and cell patterning in the embryonic zebrafish retina. Development. 109 (3), 567-576 (1990).
  39. Dwass, M. Modified randomization tests for nonparametric hypotheses. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (1), 181-187 (1957).
  40. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: A refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  41. Hernandez, R. E., Galitan, L., Cameron, J., Goodwin, N., Ramakrishnan, L. Delay of initial feeding of zebrafish larvae until 8 days postfertilization has no impact on survival or growth through the juvenile stage. Zebrafish. 15 (5), 515-518 (2018).
  42. Meyers, J. R., et al. Β-catenin/wnt signaling controls progenitor fate in the developing and regenerating zebrafish retina. Neural Development. 7, 30 (2012).
  43. Tappeiner, C., et al. Inhibition of the tgfβ pathway enhances retinal regeneration in adult zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0167073 (2016).
  44. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, o-phospho-l-serine, suppresses müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Experimental Eye Research. 91 (5), 601-612 (2010).
  45. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (38), 15858-15863 (2011).
  46. Lemmens, K., et al. Matrix metalloproteinases as promising regulators of axonal regrowth in the injured adult zebrafish retinotectal system. The Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1472-1493 (2016).
  47. Elsaeidi, F., Bemben, M. A., Zhao, X. F., Goldman, D. Jak/stat signaling stimulates zebrafish optic nerve regeneration and overcomes the inhibitory actions of socs3 and sfpq. The Journal of Neuroscience. 34 (7), 2632-2644 (2014).
  48. Van Dyck, A., et al. Müller glia-myeloid cell crosstalk accelerates optic nerve regeneration in the adult zebrafish. Glia. 69 (6), 1444-1463 (2021).
  49. Conedera, F. M., Pousa, A. M. Q., Mercader, N., Tschopp, M., Enzmann, V. Retinal microglia signaling affects müller cell behavior in the zebrafish following laser injury induction. Glia. 67 (6), 1150-1166 (2019).
  50. Chen, S., Lathrop, K. L., Kuwajima, T., Gross, J. M. Retinal ganglion cell survival after severe optic nerve injury is modulated by crosstalk between jak/stat signaling and innate immune responses in the zebrafish retina. Development. 149 (8), (2022).
  51. de Preux Charles, A. S., Bise, T., Baier, F., Marro, J., Jaźwińska, A. Distinct effects of inflammation on preconditioning and regeneration of the adult zebrafish heart. Open Biology. 6 (7), 160102 (2016).

Tags

Biyoloji Sayı 181 zebra balığı retinal pigment epiteli nitroredüktaz metronidazol genetik ablasyon rejenerasyon pigmentasyon farmakolojik bileşikler RpEGEN
Zebra Balığı Retinal Pigment Epitelinin Rejenerasyonunu İncelemek için Nitroredüktaz / Metronidazol Aracılı Ablasyon ve Bir MATLAB Platformu (RpEGEN)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross,… More

Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross, J. M. Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (181), e63658, doi:10.3791/63658 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter