Summary
本文重点介绍使用电子吸收光谱和等温滴定量热法来探测和量化Cu（II）与肽和蛋白质结合的热力学。
Abstract
铜（II）是生物系统中的必需金属，赋予与其相互作用的生物分子独特的化学性质。据报道，它直接与多种肽结合，并发挥从介导结构到电子转移性质再到赋予催化功能的必要和病理作用。在 体外 量化这些Cu（II）肽复合物的结合亲和力和热力学，可以深入了解结合的热力学驱动力，不同金属离子之间对肽或不同肽之间对Cu（II）的潜在竞争，以及Cu（II）肽复合物 在体内的普遍性。然而，由于无数因素，量化结合热力学可能具有挑战性，包括考虑滴定实验中的所有竞争平衡，特别是在缺乏代表肽，d块金属离子及其相互作用的离散光谱手柄的情况下。
这里提供了一组可靠的实验，用于准确定量Cu（II）肽热力学。本文重点介绍在存在和不存在发色配体的情况下使用电子吸收光谱来提供Cu（II）所需的光谱处理，以及使用无标记等温滴定量热法。在这两种实验技术中，都描述了一个过程来解释所有竞争均衡。虽然本文的重点是Cu（II），但所描述的一组实验可以应用于Cu（II）-肽相互作用之外，并为在生理相关条件下准确定量其他金属肽系统提供框架。
Introduction
生物学已经发展到利用生命适应和生存周围环境所需的金属离子的多样化化学性质。估计有25%-50%的蛋白质使用金属离子来构建结构和功能1.金属离子的特殊作用和氧化还原状态与协调它的生物配体的组成和几何形状直接相关。此外，氧化还原活性金属离子（如Cu（II））必须受到严格调节，以免它们 通过 芬顿样化学与氧化剂相互作用形成活性氧（ROS）2，3，4。了解驱动其生物化学的结合模式和亲和力应有助于阐明金属离子的生物学作用。
许多技术用于研究金属和肽的结合相互作用。这些主要是光谱技术，但也包括使用分子动力学的计算机模拟，如Cu（II）与β（Aβ）β（Aβ）片段的相互作用所看到的。许多大学都可以使用的一种广泛使用的光谱技术是核磁共振（NMR）。通过使用Cu（II）的顺磁性，Gaggelli等人能够通过附近原子核6的松弛来显示金属离子在浮出物上结合的位置。电子顺磁共振（EPR）也可用于探测顺磁性金属离子结合7的位置和模式。其他光谱技术如圆二向色性（CD）可以描述三肽系统8等系统中关于Cu（II）的配位，质谱可以显示化学计量以及金属离子通过片段化模式9，10协调到哪些残基。
其中一些技术，如核磁共振，是无标记的，但需要大浓度的肽，这对研究提出了挑战。另一种称为荧光光谱的常用技术已被用于将酪氨酸或色氨酸的位置与Cu（II）11，12的淬火联系起来。类似地，这种技术可以显示Cu（II）结合13引起的结构变化。然而，这些金属肽结合研究的挑战在于，它们探测并非所有系统都具有的染色氨基酸，例如酪氨酸，金属离子在经典模式下结合，并且该技术在生理条件下可能不利于。事实上，一些肽正在出现，它们不含这种发色氨基酸或在经典模型下结合，排除了使用这些技术14，15。本文详细介绍了在生理相关条件下评估这些场景中的结合特性的方法。
生物配体可以采用不同的质子化状态，可以影响金属离子的结合，例如组氨酸上的咪唑环。如果 pH 值不能始终如一地维持，则结果可能会复杂或相互冲突。因此，缓冲液是金属 - 蛋白质/肽相互作用研究中的重要组成部分。然而，许多缓冲液已被证明与金属离子16，17有利地相互作用。除了与感兴趣的生物分子竞争外，缓冲液可能具有相似的配位原子，这些配位原子可能难以与肽或蛋白质的配位原子区分开来。在这项研究中，重点是电子吸收光谱和等温滴定量热法（ITC）作为研究Cu（II）肽相互作用的两种互补技术，并特别考虑了缓冲液的选择。
电子吸收光谱是一种快速，广泛可用的技术，用于研究金属结合相互作用。用紫外（UV）或可见光波长的光照射可导致金属中心的d-d波段的吸收，这提供了有关配体分类，金属几何形状和明显结合亲和力的宝贵信息18，19。对于这些复合物，将金属离子直接滴定到蛋白质或肽溶液中可以量化结合化学计量和明显的结合亲和力。在某些情况下，如d5 或d10 电子构型，该络合物不吸收光（即，在光谱上是沉默的）。在这些光谱上沉默的过渡金属配合物中，可以通过使用竞争配体来规避这些限制，该配体在与金属离子协调时产生可检测的电荷转移带。在任何一种情况下，这种方法仅限于量化化学计量和明显的结合亲和力，并且在没有近似的情况下没有提供关于结合焓的见解。
作为对从电子吸收光谱获得的信息的补充，ITC是一种有吸引力的技术，用于直接和严格定量结合焓20。ITC直接测量结合事件期间释放或消耗的热量，并且由于滴定是在恒定压力下进行的，因此测量的热量是所有平衡的焓（ΔHITC）。此外，还量化了结合事件（n）的化学计量和表观结合亲和力（KITC）。根据这些参数，确定自由能（ΔGITC）和熵（ΔSITC），提供结合事件的热力学快照。由于它不依赖于光吸收，因此ITC是光谱沉默物质的理想技术，例如d5 或d10 金属离子配合物。然而，由于量热法测量热量，任何不匹配的缓冲系统和未解释的平衡都可能对准确确定金属离子结合热力学的分析产生不利影响，并且必须非常小心地解决这些因素20。如果以适当的严格程度进行，ITC是一种用于确定金属 - 蛋白质/肽复合物热力学的强大技术。
在这里，使用染色体沉默的铜结合肽C肽来证明这两种技术的互补使用。C肽是在胰岛素成熟过程中形成的31个残基裂解产物;它缺乏发色残基，但已被证明与生理相关的亲和力14，15结合Cu（II）。Cu（II）结合位点由谷氨酸盐和天冬氨酸盐的侧链以及肽14，15的N末端组成。这些配位原子与许多常用缓冲系统的原子非常相似。这里，显示了电子吸收光谱学中d-d和电荷转移带的串联使用，以及ITC在量化Cu（II）与C肽结合热力学中的串联使用。研究Cu（II）与C肽结合的方法可应用于其他金属离子和蛋白质/肽系统。
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Protocol
1. 电子吸收光谱：直接滴定与缓冲液竞争
- 样品制备
- 使用超纯水（>18 MΩ电阻）在pH 7.4下制备50mM 2-[双（2-羟乙基）氨基]-2-（羟甲基）丙烷-1，3-二醇（双Tris）的缓冲溶液。通过用高亲和力树脂孵育至少2小时并进行随后过滤来除去痕量金属离子。
- 将已知量的肽溶解或稀释到无金属缓冲液中。
注意：当监测消光系数为21的d-d条带时，必须使用更高浓度的肽。在这里，缓冲溶液中C肽的最终浓度为300μM（体积取决于比色皿的大小）。C肽是通过固相肽合成合成的，在文献14的其他地方有详细说明。 - 将已知质量的CuCl2 溶解在超纯水中，制成10-15mM的溶液。
注意：重要的是首先将金属盐溶解在无缓冲水中以防止沉淀。可以使用其他Cu（II）盐，但必须注意确保阴离子的弱配位。
- 运行实验
- 打开电子吸收分光光度计，让它在使用前预热约15-20分钟。启动分光光度计软件并配置扫描范围（200-900 nm）、扫描速率（200 nm/s）和双光束基线校正等参数（更多参数列在 补充文件中）。
- 收集光束路径中没有比色皿或样品的基线。
- 在双光束分光光度计中使用两个匹配的比色皿，将一个比色皿与115μL超纯水一起加载，另一个比色皿与115μL肽样品一起加载。确保比色皿中没有气泡，因为这些气泡会干扰信号。
- 将带有超纯水的比色皿放在参比光束中，将带有肽的比色皿放在样品束中。
- 收集无金属（apo）肽的吸收光谱。
- 将亚化学计量量（0.5当量，150μM）的Cu（II）溶液加入带有肽样品的比色皿中。确保添加的Cu（II）体积小于3μL，并记录体积以供以后分析。
- 轻轻地上下移液以混合溶液，同时避免产生气泡。让溶液反应并平衡5分钟并记录吸收光谱。
- 重复将步骤1.2.6中的Cu（II）等分试样加入到肽溶液中，以获得以下当量：1.0，1.5，2.0，3.0和5.0（或总共300，450，600，900和1，500μM）。确保记录添加的Cu（II）的总体积和比色皿的总体积。
注意：如果需要更高的分辨率，请减小等效项之间的间距。 - 取出样品比色皿，按照制造商的说明彻底清洁。
- 加入不含肽的缓冲溶液并记录吸收光谱。按照步骤1.2.5-1.2.8重复添加Cu（II）等分试样，记录每个Cu（II）当量的吸收光谱。
- 将所有光谱导出为csv文件进行处理。根据制造商的说明彻底清洁比色皿，并关闭分光光度计的电源。
- 处理数据
- 在电子表格程序上加载所有光谱。
- 从所有其他光谱中减去仅缓冲液（0μM Cu（II））光谱，以从缓冲液本身除去任何吸光度特征。
- 归一化每个光谱以考虑添加Cu（II）溶液（步骤1.2.6）所产生的稀释。有关归一化的示例，请参阅 补充文件，Eq （1）14 ，其中v初始 是添加到比色皿中的肽的体积（115μL），v Cu（II） 是在步骤1.2.6中添加的Cu（II）溶液的体积，Abs缓冲液减去的光谱 是在步骤1.2.7中获得的数据。
- 将所有光谱绘制在一起，以确定变化区域。
注意：来自Cu（II）配合物的典型d-d带范围为500至750 nm。这种分光光度法滴定可能具有挑战性，因为d-d波段的消光系数很小，这是八面体几何体21中的拉波特禁止跃迁。如果吸光度太弱，另一种方法是利用发色配体，在与Cu（II）结合时产生电荷转移带（见第2节）。
2. 电子吸收光谱：肽与发色配体的竞争
- 样品制备
- 将1，10-菲咯啉（phen）溶解在超纯水中，得到终浓度为〜1mM。
- 除了第1.1节中描述的肽（步骤1.1.2）和Cu（II）（步骤1.1.3）的样品制备外，在缓冲液（[Cu（phen）3]2+）中制备10μM Cu（II）和40μM酚溶液。确保体积填满比色皿。
- 运行实验
- 按照步骤1.2.1和1.2.2启动电子吸收分光光度计，但将扫描范围设置为200-400nm。
- 在两个匹配的比色皿中，将一个比色皿与115μL超纯水一起加载，另一个比色皿中加入115μL[Cu（phen）3]2 + 溶液。将带有水的比色皿放在参比光束中，将比色皿与[Cu（phen）3]2 + 溶液放在样品束中。
- 收集金属配体配合物的吸收光谱。
- 向[Cu（phen）3]2+ 溶液中加入化学计量量（≈1当量，≈10μM）肽。轻轻地上下移液以彻底混合，但要注意不要引入气泡。记录添加的肽的体积以备将来分析。
注意：使用装有115 μL的比色皿，加入3.83 μL的300 μM肽，最终肽浓度为9.7 μM。 - 将溶液孵育5分钟以达到平衡。记录吸收光谱。
注意：如果金属肽和金属配体的结合亲和力相似，则添加的肽的浓度将需要大过量。确保考虑为归一化而添加的肽的总体积。 - 重复将肽等分试样加入到[Cu（phen）3]2 + 溶液中，以获得以下近似当量：2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，14，16，18，22和26。记录添加的肽的体积，以便可以确定稀释的浓度。
- 取出样品，并按照制造商的说明彻底清洁比色皿。收集缓冲区的频谱。在缓冲液中收集50μM肽的光谱。
- 将所有数据导出为csv文件进行处理，并根据制造商的说明清洁比色皿。
- 处理数据
- 在电子表格程序上加载光谱，并从其他光谱中减去缓冲光谱。
- 按照 补充文件等式 （2）14 对光谱进行归一化。
- 使用[Cu（phen）3]2+ 在265nm（ε最大值 = 90，000 M-1 cm-1）22处的消光系数，确定每次添加肽时[Cu（phen）3]2 + 的浓度。
- 对于肽的每次添加，通过减去步骤2.3.2中确定的[Cu（phen）3]2 +的剩余浓度，从[Cu（phen）3]2 +的初始浓度（在0μM肽处）中减去Cu（II）肽复合物的浓度来确定Cu（II）-肽复合物的浓度。
- 通过 补充文件等式（3）14中的方程计算游离苯配体的浓度。
- 使用补充文件Eq（4）14计算游离肽的浓度，其中[肽]储备液表示滴定到比色皿中的未稀释肽，V1表示加入的储备肽的体积，V2是比色皿的总体积，[Cu2 +肽]在步骤2.3.4中测定。
- 使用补充文件23中的等式（5）计算实验结合亲和力（Kex）。
- 在补充文件中通过等式（6）23将Cu（II）肽的解离常数与Kex相关联，其中Kd，Cu（II）-phen = 1.0×10-9（见22）。确定所有确定的解离常数的平均值和标准偏差。
注意：在4：1的比例下，溶液中存在[铜：铜）3]2+，[铜（苯）2]2+和[铜（苯）]2+ ，肽将螯合Cu（II）远离物质（[铜（苯）]2+）与最弱的结合22。
3. 等温滴定量热法
- 样品制备
- 使用超纯水（>18 MΩ电阻）在pH 7.4下制备15mM 3-吗啉丙烷-1-磺酸（MOPS）的缓冲溶液。通过用高亲和力树脂孵育至少2小时，随后通过瓶顶0.45μm膜进行真空过滤，除去痕量金属离子。
- 将已知质量的CuCl2 溶解在超纯水中，以制备≈50-100 mM的溶液。将该Cu（II）溶液稀释到缓冲液中，以获得终浓度为1.4 mM Cu（II）的1.0 mL溶液。记录所用CuCl2 溶液的确切体积。
- 将肽溶液溶解或稀释在缓冲液中，制成450μL的154μM肽溶液。确保将步骤3.1.2中相同比例的额外超纯水添加到肽溶液中，这将减少稀释热并增加信噪比。
- 制备样品后，确保溶液处于相同的pH值，并在需要时进行相应的调整。
- 可选步骤：对溶液进行脱气，以最大限度地减少加载到 ITC 中的微气泡。
- 运行实验
- 打开 ITC。启动 ITC 软件以运行仪器。等待第一次初始化，这将要求重新定位布氏体;然后，按照屏幕上的说明进行操作。
- 从参考单元格中取出封面。从参比池中取出任何水，并用450μL脱气超纯水冲洗三次。
- 慢慢地将超纯水吸取到上样注射器的450μL标记，注意不要将气泡引入注射器。将上样注射器插入参比细胞中，直到它距离底部≈1mm，然后缓慢注入部分溶液，直到150μL残留在上样注射器中。多次上下移动上下加载注射器柱塞≈25μL，以清除细胞表面上的任何气泡。缓慢注射，直到柱塞达到上样注射器上的100μL标记，从而将总共350μL超纯水分配到参比细胞中，并更换参比细胞盖。
- 从样品池中取出任何残留溶液，并使用上样注射器用450μL10mM乙二胺四乙酸（EDTA）上样。浸泡10分钟以确保去除痕量金属离子，因为EDTA会结合痕量金属。
- 取出EDTA溶液（含有结合的痕量金属离子），并用大量超纯水彻底冲洗加载注射器。
- 按照制造商的说明清洁ITC，用超纯水冲洗样品池。
- 通过用450μL缓冲液冲洗至少三次来调节样品池。
- 取出调节样品池的缓冲液。使用上样注射器将肽溶液加载到样品池中（按照步骤3.2.3）。
- 用200μL缓冲溶液冲洗滴定注射器。为此，取出柱塞并使用微量移液器将缓冲液通过玻璃滴定注射器顶部的孔移液，穿过注射器，然后从下面的针头中取出。
- 将柱塞完全插入滴定注射器。
- 将滴定注射器针头的尖端浸入金属溶液中，然后慢慢拉动柱塞，使金属溶液充满注射器，并在滴定注射器的玻璃部分顶部产生空隙体积。通过平行于地板旋转滴定注射器来去除大部分空隙体积，取下柱塞，然后将玻璃部分稍微向地板倾斜。轻轻摇动滴定注射器，使溶液移动到滴定注射器玻璃部分的末端并填充大部分空隙体积，但要确保保留2-3μL空隙体积。在保持注射器与地板平行的同时，重新插入柱塞。
- 将滴定注射器竖直，将针头的尖端浸入金属溶液中，然后将柱塞向下推，直到空气停止从针头中流出。将柱塞缓慢拉升至刚好高于50μL标记，同时将针头尖端保持在溶液中，从而加载滴定注射器。
- 小心地将滴定注射器的玻璃部分插入滴定管并拧紧直至手指拧紧。当由于柱塞的压缩而从滴定注射器中流出少量溶液时，请使用轻型精密刮水器小心地吸收溶液，而不会接触针尖。
- 将带有滴定注射器的滴定管插入样品池并牢固地固定。
- 在 ITC 软件上设置参数。从仪器控制开始，设置搅拌速率（典型搅拌速率范围为 150 至 350 RPM）和进行实验的温度（通常为 25 °C）。在“实验详细信息”下输入注射器和细胞浓度（以毫摩尔为单位）。
- 在 “实验方法 ”部分中，选择“ 增量滴定”。单击 “设置” 并指定 20 次 2.5 μL 的进样。如果需要更高的分辨率来观察结合事件，请增加注射次数并减少每次注射的体积。输入每次进样之间的 时间间隔 ，使其足够长，使信号平衡并返回到基线，通常 为300秒。
- 单击“ 运行 ”按钮以启动试验并指定保存数据的位置。
- 实验完成后，清洁样品池和滴定注射器。
- 运行所有实验至少一式三份，以确保精确的数据收集。
- 运行对照实验，其中将金属溶液滴定到缓冲溶液中（在没有肽的情况下），以确保来自金属离子的稀释热很小，并且没有不明原因的平衡。如果稀释热很大，如果可能的话，考虑使用不同的缓冲系统。
- 处理数据
- 启动 ITC 分析软件并加载数据文件进行分析。
- 导航到“ 基线 ”选项卡并检查热图。注意从热图中的气泡或其他伪影中逸出或吸收的任何外源热量。寻找不是由于注入金属溶液引起的尖峰。
- 确保分析软件生成的基线遵循注入和平衡后的数据部分。如果它偏离，请使用 基线枢轴点 来调整基线。确保 整合区域 包括金属注入产生的峰值，但遮挡步骤2中发现的温度图中的任何气泡或伪影。从温度图中减去基线。
注意：只有在收集了多个热图后，才建议进行这种类型的操作，以便实验人员知道什么是真实数据，什么是伪影，因为调整基线和 集成区域 可能会极大地影响数据。 - 导航到“ 建模 ”窗口以开始拟合数据，分析软件将显示每次进样的综合和浓度归一化数据。
- 左键单击第一次注入的基准面，将其从拟合算法中移除。
注意：这很常见，因为滴定剂和样品池溶液之间会有轻微的混合，导致第一次进样时摩尔分配不精确。 - 在“模型”部分中，在“样式”下拉菜单中选择“空白（常量）”，该菜单基于最终的进样焓，将从每个数据点中减去，并考虑稀释热。此外，在第二个“样式”下拉菜单中选择“独立”（或系统的最佳模型）以适合数据。
注意：对于标准的 1：1 绑定交互，最常见的模型是独立模型。 - 使用两个模型拟合数据，方法是按下带有 Σ 的绿色 播放 按钮。
注：另一个用于处理 ITC 数据的软件是 SEDPHAT24。 - 在格罗索赫梅等人先前报告的事后分析中解释所有竞争均衡。20.
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Representative Results
目标是使用电子吸收光谱和ITC的互补技术量化和证实Cu（II）与C肽结合的热力学。由于电子吸收光谱的稳健性，直接滴定Cu（II）成300μM C肽（图1）。由于Cu（II）的d-d带，150 μM的Cu（II）的添加导致600 nm处的带立即增加，并持续增加至300 μM Cu（II）的加入。进一步添加300μM以上的Cu（II）没有增加d-d带的吸收，表明饱和并且Cu（II）在1：1复合物中与C肽结合。此外，由于双-Tris与Cu（II）结合的亲和力相对较高（对数K = 5.27）16，Cu（II）/C肽亲和力应在微摩尔范围内具有下限（对数K>6），以螯合金属离子远离缓冲液。在该系统中，由于消光系数小，吸收带的精确定量具有挑战性。
为了规避d-d条带的小消光系数，如上所述使用了发色配体phen。将C肽滴定成≈10μM [Cu（phen）3]2+（图2A），并且从265nm处的电荷转移带的吸收减少（图2B），表明C肽能够从苯配体中螯合Cu（II）。在仔细检查时，需要大浓度的C肽（高达140μM）以适度地超过phen配体（表1）。考虑到 [Cu（phen）3]2+ （对数 K 1、β 2 和 β3 分别为 9.0、15.7 和 20.8）22 的较大顺序形成常数，这并不奇怪。光谱分析表明，Cu（II）/C肽结合亲和力在对数K = 7.4-7.8的范围内（表1）。
测量结合相互作用的完整热力学的黄金标准是ITC。 图3 提供了在15 mM MOPS（pH 7.4）中滴定成C肽的Cu（II）的代表性热图，这为Cu（II）提供了竞争。在这里，使用MOPS缓冲液代替双三缓冲液，因为KCu（II）-MOPS
图 1：在 50 mM 双三、pH 7.4 中向 300 μM C 肽中添加 150、300、450、600、900 和 1，500 μM Cu（II） C-d 环时监测 Cu（II） d-d 条带。Cu（II）的d-d带在600 nm处增加，直到形成1：1 Cu（II）：C肽复合物。此前，马扎尔和戈德温报告说，Cu（II）-bis-Tris亲和力是对数K = 5.2716。该滴定表明，C肽可以超过缓冲液以结合Cu（II），并表明Cu（II）/ C肽在微摩尔范围内的亲和力。该图经史蒂文森等人许可转载。请点击此处查看此图的大图。
图2：[Cu（phen）3]2+的形成和代表性的电子吸收光谱监测添加C肽后电荷转移带的减少（A）显示[Cu（phen）3]2+的形成及其电荷转移带的中心在265nm（ε°≈90，000 M-1 cm-1）22。对数 K 1、β 2 和 β3 的形成常数分别为 9.0、15.7 和20.8，分别为22。（B）具有代表性的电子吸收光谱监测[Cu（phen）3]2+作为C肽螯合Cu（II）的电荷转移带的降低。滴定在50 mM双三，pH 7.4下进行。数据分析如表1所示。该图经史蒂文森等人许可转载。缩写：MLCT =金属到配体的电荷转移。请点击此处查看此图的大图。
图3：将Cu（II）的代表性热图滴定成C肽和缓冲液 （A）该代表性热图显示了将1.4mM Cu（II）滴定成154μM C肽在15mM MOPS，pH 7.4。数据拟合到具有以下参数的单站点模型：n = 1.2 ± 0.1;Kd，ITC = 6 （± 3） x 10-7;ΔHITC = −3.4 ± 0.2 千焦摩尔-1。（B）在没有C肽显示无结合热图的情况下，将1.4 mM Cu（II）的代表性对照滴定成15 mM MOPS，pH值为7.4，如图 A所示。 请点击此处查看此图的大图。
| [C肽] | A265 | [铜3]2+ | [芬]自由 | [C肽]自由 | [铜（II）/C肽] | Kex （x108） | Kd铜（II）/C 肽 | 对数K d铜（II）/C 肽 | |
| 0.0 | 1.0649 | 11.83 | 4.5 | 0 | 0.00 | 北斗区划 | 北斗区划 | 北斗区划 | |
| 9.7 | 0.9948 | 11.05 | 6.84 | 7.45 | 0.78 | 0.0543 | 1.84E-08 | 7.75 | |
| 18.7 | 0.9785 | 10.87 | 7.38 | 16.00 | 0.96 | 0.0367 | 2.73E-08 | 7.56 | |
| 27.3 | 0.9651 | 10.72 | 7.83 | 24.09 | 1.11 | 0.0310 | 3.23E-08 | 7.49 | |
| 35.3 | 0.9475 | 10.53 | 8.42 | 31.55 | 1.30 | 0.0307 | 3.26E-08 | 7.49 | |
| 42.8 | 0.9374 | 10.42 | 8.75 | 38.79 | 1.42 | 0.0288 | 3.48E-08 | 7.46 | |
| 50.0 | 0.9283 | 10.31 | 9.06 | 45.64 | 1.52 | 0.0275 | 3.63E-08 | 7.44 | |
| 56.7 | 0.9134 | 10.15 | 9.55 | 51.92 | 1.68 | 0.0288 | 3.47E-08 | 7.46 | |
| 63.1 | 0.9025 | 10.03 | 9.92 | 57.97 | 1.81 | 0.0291 | 3.43E-08 | 7.46 | |
| 69.2 | 0.8927 | 9.92 | 10.24 | 63.73 | 1.91 | 0.0294 | 3.40E-08 | 7.47 | |
| 75.0 | 0.878 | 9.76 | 10.73 | 69.04 | 2.08 | 0.0314 | 3.19E-08 | 7.50 | |
| 85.7 | 0.8542 | 9.49 | 11.53 | 78.99 | 2.34 | 0.0341 | 2.93E-08 | 7.53 | |
| 95.4 | 0.8316 | 9.24 | 12.28 | 88.01 | 2.59 | 0.0371 | 2.69E-08 | 7.57 | |
| 104.3 | 0.8151 | 9.06 | 12.83 | 96.38 | 2.78 | 0.0387 | 2.58E-08 | 7.59 | |
| 112.4 | 0.7976 | 8.86 | 13.41 | 103.98 | 2.97 | 0.0411 | 2.44E-08 | 7.61 | |
| 126.9 | 0.7809 | 8.68 | 13.97 | 117.87 | 3.16 | 0.0411 | 2.44E-08 | 7.61 | |
| 139.2 | 0.7586 | 8.43 | 14.71 | 129.53 | 3.40 | 0.0437 | 2.29E-08 | 7.64 | |
| 范围 | 7.4-7.8 | ||||||||
表1：图2B中溶液中物质浓度的代表性计算。所有浓度均为微摩尔。本表经史蒂文森等人许可转载。
| 平等 | n | ΔH （千焦摩尔-1） | n × ΔH （千焦摩尔-1） |
| 铜（II）-澳门币 → 铜（II） + 澳门币 | 1 | 5.4 | 5.44 |
| 澳门币 + H+ →澳门币-H+ | 0.097 | −21.0 | −2.04 |
| 铜（II） + C 肽-H+ →铜（II）/C 肽 + H+ | 1 | X | X |
| ΔH国际贸易中心 = Χ + 3.40 | |||
| Χ = ΔH国际贸易中心 − 3.40 | |||
| Χ = ΔH铜（II）/C 肽 = −6.8 千焦摩尔-1 |
表2：确定ΔH铜（II）/C肽的事后分析。如图3所示，将1.4 mM Cu（II）滴定成154μM C肽，在15mM MOPS，pH值为7.4，一式三份。在考虑了表中所示的所有竞争平衡后，发现ΔHCu（II）/C肽为-8.66 kJ mol-1。Cu（II）从C肽中置换的质子数量是根据（ΔHITC + ΔHCu（II）缓冲液）与ΔH缓冲液-H的斜率确定的，其中数据收集在多个缓冲液中。所有焓值都可以在NIST25中找到，也可以在文献15的其他地方确定。所有竞争均衡均按Grossoehme等人所述进行核算，20 该图经史蒂文森等人许可转载。
补充文件：协议部分中使用的相关方程以及电子吸收分光光度计和ITC设置的其他参数。请按此下载此档案。
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Discussion
本文为量化Cu（II）与肽结合的亲和力和热力学提供了一种可靠的方法。含有Cu（II）的配合物由于其d 9电子构型而非常适合监测金属位点的d-d 吸收带。虽然消光系数很小，因此需要较大浓度的复合物才能产生可靠的信号，但将Cu（II）滴定成肽可以快速提供对结合化学计量和近似结合亲和力的见解。然而，如果金属由缓冲液和肽的相似原子和几何形状协调，则辨别光谱的差异可能具有挑战性。为了定量确定结合亲和力，通常使用发色配体，例如phen，因为它们与金属离子21的对称性允许电荷转移。通过在发色配体和非发色肽之间建立竞争，并通过了解金属与配体的亲和力，可以直接确定金属肽亲和力。使用电子吸收光谱进行进一步的热力学分析具有挑战性。为了使用紫外-可见光谱等技术量化结合焓，必须在多个温度下测定结合亲和力并进行范特霍夫分析。该分析假设结合的比热为零，这很少为真，因此仅提供结合焓20的估计。
等温滴定量热更适合于阐明金属肽相互作用的热力学的更完整概述。在这种技术中，将金属离子滴定到肽溶液中，并直接测量各种平衡的热量。由于实验是在恒定压力下进行的，因此ITC测量的热量等于焓。ITC可以克服电子吸收光谱的一些局限性，例如研究光谱上沉默的金属离子，并且不需要像范特霍夫分析那样做出假设。然而，有时，在ITC中发生的反应几乎不产生热量，因此不会被观察到。这可以通过增加金属和肽的浓度或使用不同的缓冲液和具有不同质子化焓来绕过。如果金属离子在与肽结合时取代多个质子，则后者特别有用。然而，这两种技术 - ITC和电子吸收光谱 - 都提供了正交方法来研究相同的系统并很好地相互补充。
在研究金属离子与肽的结合时，这两种技术都存在许多具有挑战性的方面。许多金属离子不溶于水或微溶于水。当加入到缓冲液中时，金属离子的沉淀会进一步加剧这种情况。在ITC中，这可以表现为基线缓慢，逐渐的变化以及注入金属时产生的大量热量。这表明即使在肽被金属离子饱和之后，稀释热值也很大。在电子吸收光谱中，金属离子沉淀通过较低波长处的吸收增加而表现出来，并且类似于以紫外区域为中心的宽峰。在这两种技术中，实验者必须确保金属离子在选择的条件下是可溶的（例如，缓冲液、pH、温度、浓度）。这两种方法的另一个限制可以通过加法顺序的概念来显示。在某些情况下，形成的一种金属配合物可能是不稳定的，而以不同的顺序添加相同的试剂会使另一种中间物质惰性。这种动力学与热力学控制的图示阻碍了对所有竞争均衡的准确分析。
ITC和电子吸收光谱都依赖于肽与缓冲液或配体之间的竞争来结合金属离子。这里介绍c值，这有助于识别KITC是否可以通过拟合算法准确确定。c值在补充文件等式（7）20中定义，其中n是化学计量，KITC是明显的结合亲和力，[样品细胞]是样品细胞中物质的浓度。当 c 值介于 1 和 1，000 之间时，确定的 KITC 是准确的。但是，低于 1 的 c 值可能仅提供 KITC 的上限，而高于 1，000 的 c 值可能仅提供20 的下限。这就是从互补技术中收集数据的价值：如果由于一种技术的局限性而遗漏了某些内容，则可能会在其互补技术中捕获某些内容。在这些实验中，如果竞争对象大大有利于一个物种（即肽的金属离子亲和力远大于缓冲液的亲和力），则平衡将发生偏移，使其难以解释。Kocyla等人23也详细表明了这一点。为了解决这一挑战，引入或替换不同的竞争配体，或选择不同的缓冲液通常用于增加配体和肽之间的竞争，以实现准确的定量。这是因为金属缓冲液（或金属配体）和金属肽亲和力的差异将使c值落在1至1，000的窗口内。然而，应该指出的是，使用竞争配体或其他缓冲液进行定量分析需要金属配体或金属缓冲配合物的热力学参数是已知的或可以通过其他方法确定的。
最后，准确量化肽浓度可能具有挑战性。量化肽浓度的一些常见方法是测量特定的氨基酸并将这些氨基酸的数量与肽的序列相关联。例如，电子吸收光谱可以测量芳族残基，如酪氨酸，埃尔曼试剂可以量化游离硫醇26的数量，布拉德福德测定法提供了存在多少残基27的指示。不幸的是，本研究中使用的肽没有芳香族残基或游离硫醇，而Bradford测定在将来自大块蛋白质的标准品与感兴趣的小肽进行比较时提出了挑战。相反，肽浓度由干质量决定。虽然不理想并且容易出现轻微高估肽浓度的浓度（由于盐的存在，表观质量测量值可能高于实际肽质量），但所有用于测量的等分试样都经过相同的处理，这允许更准确的比较。在光谱研究中，如果游离肽的浓度低于预期，则计算出的结合亲和力表示下限（补充文件，等式（5）和等式（6））。这两种技术都存在与这些技术相关的挑战，但以文献为指导，许多挑战是可以克服的。
这里详细介绍的实验方法允许准确定量金属肽结合热力学。ITC和电子吸收光谱都是正交的，可以深入了解结合亲和力，但ITC允许直接焓定量。一旦这些热力学被量化，就可以推断出这些金属肽复合物是否可以在生理条件下形成。随着对生理金属离子通量的理解不断加深，可以预测结合亲和力是否足以 在体内 形成复杂物质。此外，研究人员可以预测同一肽的多个金属离子或同一金属离子的多个肽之间的竞争。通过研究金属离子和肽之间的这些竞争，研究人员可以通过将自由能解析为焓和熵贡献来开始了解金属肽复合物的结合亲和力。热力学是理解金属离子和肽之间动态相互作用的一个组成部分，ITC和电子吸收光谱学正在提供查询这些系统的手柄。这里描述的方法可以扩展并用于研究其他金属离子与大分子的结合相互作用，并且可能对生理过程，药物设计等产生影响。
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Disclosures
作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
SC感谢怀特黑德暑期研究奖学金。MJS感谢旧金山大学的创业基金和教师发展基金。MCH承认来自美国国立卫生研究院（NIH MIRA 5R35GM133684-02）和美国国家科学基金会（NSF CAREER 2048265）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,10-phenanthroline | Sigma Aldrich | 131377-25G | |
| bis-Tris buffer | Fisher | BP301-100 | |
| Bottle-top 0.45 micron membrane | Nalgene | 296-4545 | Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable |
| Copper(II) chloride | Alfa Aesar | 12458 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-500G | |
| Electronic absorption spectrophotometer | Varian | Cary 5000 | Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable |
| high affinity resin | Sigma Aldrich | C7901-25G | |
| Isothermal titration calorimeter (ITC) | TA Instruments | Nano ITC Low Volume | |
| ITC analysis software | TA Instruments | NanoAnalyze | SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used |
| ITC software | TA Instruments | ITCRun | |
| light-duty delicate wiper | Kimwipe | 34155 | |
| loading syringe | Hamilton | Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL | |
| matched cuvettes | Starna Cells, Inc | 16.100-Q-10/Z20 | Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer |
| MOPS buffer | Alfa Aesar | A12914 | |
| spectrophotometer software | Cary | WinUV Scan | |
| spreadsheet program | Microsoft | Excel | Any suitable spreadsheet program will work |
| titration syringe | TA Instruments | 5346 | |
| ultrapure water | Millipore Sigma | Milli-Q | Any water is okay as long as >18 MΩ resistance |
References
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