Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Quantifizierung der Bindungswechselwirkungen zwischen Cu(II)- und Peptidresten in Gegenwart und Abwesenheit von Chromophoren

Published: April 5, 2022 doi: 10.3791/63668

Summary

Dieser Artikel konzentriert sich auf die Verwendung der elektronischen Absorptionsspektroskopie und der isothermen Titrationskalorimetrie, um die Thermodynamik der Cu(II)-Bindung an Peptide und Proteine zu untersuchen und zu quantifizieren.

Abstract

Kupfer(II) ist ein essentielles Metall in biologischen Systemen, das den Biomolekülen, mit denen es interagiert, einzigartige chemische Eigenschaften verleiht. Es wurde berichtet, dass es direkt an eine Vielzahl von Peptiden bindet und sowohl notwendige als auch pathologische Rollen spielt, von der Vermittlung der Struktur über Elektronentransfereigenschaften bis hin zur Vermittlung katalytischer Funktionen. Die Quantifizierung der Bindungsaffinität und Thermodynamik dieser Cu(II)-Peptidkomplexe in vitro liefert Einblicke in die thermodynamische Antriebskraft der Bindung, mögliche Wettbewerbe zwischen verschiedenen Metallionen für das Peptid oder zwischen verschiedenen Peptiden für Cu(II) und die Prävalenz des Cu(II)-Peptidkomplexes in vivo. Die Quantifizierung der Bindungsthermodynamik kann jedoch aufgrund einer Vielzahl von Faktoren eine Herausforderung darstellen, einschließlich der Berücksichtigung aller konkurrierenden Gleichgewichte innerhalb eines Titrationsexperiments, insbesondere in Fällen, in denen es an diskreten spektroskopischen Griffen mangelt, die das Peptid, das d-Block-Metallion und ihre Wechselwirkungen darstellen.

Hier wird ein robuster Satz von Experimenten zur genauen Quantifizierung der Cu(II)-Peptid-Thermodynamik bereitgestellt. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Verwendung der elektronischen Absorptionsspektroskopie in Gegenwart und Abwesenheit von chromophoren Liganden, um den erforderlichen spektroskopischen Griff auf Cu (II) und die Verwendung der markierungsfreien isothermen Titrationskalorimetrie bereitzustellen. In beiden experimentellen Techniken wird ein Prozess beschrieben, der alle konkurrierenden Gleichgewichte berücksichtigt. Während der Schwerpunkt dieses Artikels auf Cu(II) liegt, kann der beschriebene Satz von Experimenten über Cu(II)-Peptid-Wechselwirkungen hinausgehen und einen Rahmen für die genaue Quantifizierung anderer Metall-Peptid-Systeme unter physiologisch relevanten Bedingungen bieten.

Introduction

Die Biologie hat sich weiterentwickelt, um die vielfältige Chemie von Metallionen zu nutzen, die das Leben benötigt, um sich anzupassen und in seiner Umgebung zu überleben. Schätzungsweise 25%-50% der Proteine verwenden Metallionen für Struktur und Funktion1. Die besondere Rolle und der Redoxzustand des Metallions stehen in direktem Zusammenhang mit der Zusammensetzung und Geometrie der biologischen Liganden, die es koordinieren. Darüber hinaus müssen redoxaktive Metallionen wie Cu(II) streng reguliert werden, damit sie nicht über Fenton-ähnliche Chemie mit Oxidationsmitteln wechselwirken, um reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zu bilden2,3,4. Das Verständnis der Bindungsmodi und der Affinität, die seine Biochemie antreiben, sollte dazu beitragen, die biologische Rolle des Metallions aufzuklären.

Viele Techniken werden verwendet, um die Bindungswechselwirkungen von Metallen und Peptiden zu untersuchen. Dies sind meist spektroskopische Techniken, umfassen aber auch Computersimulationen unter Verwendung der Molekulardynamik, wie sie durch Cu (II) -Wechselwirkungen mit einem Fragment von Amyloid-Beta (Aβ) 5 gesehen werden. Eine weit verbreitete spektroskopische Technik, die vielen Universitäten zugänglich ist, ist die Kernspinresonanz (NMR). Durch die Verwendung der paramagnetischen Natur von Cu(II) konnten Gaggelli et al. zeigen, wo das Metallion durch Relaxation der nahen Kerne6 an ein Petide bindet. Die paramagnetische Elektronenresonanz (EPR) kann auch verwendet werden, um den Ort und den Modus der paramagnetischen Metallionenbindung7 zu untersuchen. Andere spektroskopische Techniken wie der zirkuläre Dichroismus (CD) können die Koordination über Cu(II) in Systemen wie Tripeptidsystemen8 beschreiben, und die Massenspektrometrie kann die Stöchiometrie zeigen und auf welche Reste das Metallion durch Fragmentierungsmuster koordiniertwird 9,10.

Einige dieser Techniken, wie NMR, sind markierungsfrei, erfordern jedoch große Peptidkonzentrationen, was die Untersuchung vor Herausforderungen stellt. Eine andere gängige Technik, die als Fluoreszenzspektroskopie bezeichnet wird, wurde verwendet, um die Position eines Tyrosins oder Tryptophans mit dem Abschrecken aus einem Cu(II)11,12 in Beziehung zu setzen. In ähnlicher Weise kann diese Technik strukturelle Veränderungen als Folge der Cu(II)-Bindung13 zeigen. Die Herausforderungen bei diesen Metall-Peptid-Bindungsstudien bestehen jedoch darin, dass sie chromophore Aminosäuren wie Tyrosin untersuchen, die nicht alle Systeme haben, dass das Metallion unter einem klassischen Modell bindet und dass die Technik unter physiologischen Bedingungen möglicherweise nicht förderlich ist. In der Tat entstehen mehrere Peptide, die solche chromophoren Aminosäuren nicht enthalten oder nach klassischen Modellen binden, was die Verwendung dieser Techniken ausschließt14,15. Dieser Artikel beschreibt Ansätze zur Beurteilung von Bindungseigenschaften in diesen Szenarien unter physiologisch relevanten Bedingungen.

Biologische Liganden können verschiedene Protonierungszustände annehmen, die die Metallionenbindung beeinflussen können, wie z.B. den Imidazolring auf Histidin. Wenn der pH-Wert nicht konsequent aufrechterhalten wird, können die Ergebnisse verworren oder widersprüchlich sein. Aus diesem Grund sind Puffer ein wesentlicher Bestandteil bei der Untersuchung von Metall-Protein/Peptid-Wechselwirkungen. Es wurde jedoch gezeigt, dass viele Puffer günstig mit Metallioneninteragieren 16,17. Zusätzlich zum Wettbewerb mit dem interessierenden biologischen Molekül kann der Puffer ähnliche koordinierende Atome aufweisen, die von den koordinierenden Atomen des Peptids oder Proteins schwer zu unterscheiden sind. In dieser Studie liegt der Fokus auf der elektronischen Absorptionsspektroskopie und der isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) als zwei komplementäre Techniken zur Untersuchung von Cu(II)-Peptid-Wechselwirkungen, mit besonderen Überlegungen zur Pufferwahl.

Die elektronische Absorptionsspektroskopie ist eine schnelle, allgemein zugängliche Technik zur Untersuchung von Metallbindungswechselwirkungen. Die Bestrahlung mit Licht in den ultravioletten (UV) oder sichtbaren Wellenlängen kann zur Absorption von metallzentrierten d-d-Bändern führen, die wertvolle Informationen über Ligandenklassifizierung, Metallgeometrien und scheinbare Bindungsaffinitätenliefern 18,19. Für diese Komplexe können direkte Titrationen von Metallionen in Protein- oder Peptidlösungen Bindungsstöchiometrien und scheinbare Bindungsaffinitäten quantifizieren. In einigen Fällen, wie z.B. d5 oder d10 Elektronenkonfigurationen, absorbiert der Komplex kein Licht (d.h. ist spektroskopisch stumm). In diesen spektroskopisch stillen Übergangsmetallkomplexen können diese Einschränkungen durch die Verwendung eines konkurrierenden Liganden umgangen werden, der bei Koordinierung auf das Metallion nachweisbare Ladungsübertragungsbänder ergibt. In beiden Fällen beschränkt sich dieser Ansatz darauf, nur die Stöchiometrie und die scheinbare Bindungsaffinität zu quantifizieren, und ohne Näherungen wird kein Einblick in die Bindungsenthalpie gegeben.

Ergänzend zu den Informationen aus der elektronischen Absorptionsspektroskopie ist ITC eine attraktive Technik zur direkten und rigorosen Quantifizierung der Bindungsenthalpie20. ITC misst direkt die während eines Bindungsereignisses freigesetzte oder verbrauchte Wärme, und da die Titration bei konstantem Druck stattfindet, ist die gemessene Wärme die Enthalpie aller Gleichgewichte (ΔHITC). Zusätzlich werden die Stöchiometrie des Bindungsereignisses (n) und der scheinbaren Bindungsaffinität (KITC) quantifiziert. Aus diesen Parametern werden die freie Energie (ΔG ITC) und die Entropie (ΔSITC) bestimmt, wodurch eine thermodynamische Momentaufnahme des Bindungsereignisses bereitgestellt wird. Da es nicht auf Lichtabsorption angewiesen ist, ist ITC eine ideale Technik für spektroskopisch stumme Spezies, zum Beispiel d5 oder d10 Metallionenkomplexe. Da die Kalorimetrie jedoch die Wärme misst, können unübertroffene Puffersysteme und nicht berücksichtigte Gleichgewichte die Analyse beeinträchtigen, um die Metallionenbindungsthermodynamik genau zu bestimmen, und es muss große Sorgfalt darauf verwendet werden, diese Faktoren anzugehen20. Wenn es mit der entsprechenden Strenge durchgeführt wird, ist ITC eine robuste Technik zur Bestimmung der Thermodynamik von Metall-Protein/Peptid-Komplexen.

Hier wird ein chromophorisch leises kupferbindendes Peptid, C-Peptid, verwendet, um die komplementäre Verwendung der beiden Techniken zu demonstrieren. C-Peptid ist ein 31-Restspaltprodukt (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ), das während der Insulinreifung gebildet wird; Es fehlen chromophore Rückstände, aber es wurde gezeigt, dass es Cu(II) mit physiologisch relevanter Affinität14,15 bindet. Die Cu(II)-Bindungsstelle besteht aus den Seitenketten eines Glutamats und eines Aspartats sowie dem N-Terminus des Peptids14,15. Diese koordinierenden Atome ähneln stark denen vieler häufig verwendeter gepufferter Systeme. Hier wird die Tandemverwendung der d-d- und Ladungstransferbänder in der elektronischen Absorptionsspektroskopie und ITC zur Quantifizierung der Cu(II)-Bindung der Thermodynamik an das C-Peptid gezeigt. Der Ansatz aus der Untersuchung der Cu(II)-Bindung an C-Peptid kann auf andere Metallionen und Protein/Peptid-Systeme angewendet werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Elektronische Absorptionsspektroskopie: direkte Titration mit Pufferwettbewerb

  1. Probenvorbereitung
    1. Es wird eine gepufferte Lösung von 50 mM2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-(hydroxymethyl)propan-1,3-diol (bisTris) bei pH 7,4 unter Verwendung von Reinstwasser (>18 MΩ Beständigkeit) hergestellt. Entfernen Sie Spurenmetallionen, indem Sie mit einem hochaffinen Harz für mindestens 2 h mit anschließender Filtration inkubieren.
    2. Lösen oder verdünnen Sie eine bekannte Menge des Peptids in den metallfreien Puffer.
      HINWEIS: Bei der Überwachung von d-d-Banden mit kleinen Extinktionskoeffizienten21 müssen höhere Peptidkonzentrationen verwendet werden. Hier betrug die Endkonzentration des C-Peptids in gepufferter Lösung 300 μM (das Volumen hängt von der Größe der Küvette ab). C-Peptid wurde durch Festphasenpeptidsynthese synthetisiert und wird an anderer Stelle in der Literatur14 ausführlich beschrieben.
    3. Eine bekannte Masse vonCuCl2 wird in Reinstwasser gelöst, um eine Lösung bei 10-15 mM herzustellen.
      HINWEIS: Es ist wichtig, das Metallsalz zunächst in ungepuffertem Wasser aufzulösen, um Niederschläge zu vermeiden. Andere Cu(II)-Salze können verwendet werden, es ist jedoch darauf zu achten, dass das Anion schwach koordiniert ist.
  2. Ausführen des Experiments
    1. Schalten Sie das elektronische Absorptionsspektralphotometer ein und lassen Sie es vor Gebrauch für ~ 15-20 Minuten aufwärmen. Starten Sie die Spektralphotometer-Software und konfigurieren Sie die Parameter wie Scanbereich (200-900 nm), Abtastrate (200 nm/s) und Doppelstrahl-Baseline-korrigiert (weitere Parameter sind in der Ergänzungsdatei aufgeführt).
    2. Sammeln Sie eine Baseline ohne Küvetten oder Proben in den Balkenpfaden.
    3. Laden Sie mit zwei aufeinander abgestimmten Küvetten im Doppelstrahl-Spektralphotometer eine Küvette mit 115 μL Reinstwasser und die andere Küvette mit 115 μL der Peptidprobe. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in den Küvetten befinden, da diese das Signal stören.
    4. Legen Sie die Küvette mit Reinstwasser in den Referenzstrahl und die Küvette mit Peptid in den Probenstrahl.
    5. Sammeln Sie das Absorptionsspektrum des metallfreien (Apo-) Peptids.
    6. Mit der Peptidprobe wird eine substöchiometrische Menge (0,5 Äquivalente, 150 μM) der Cu(II)-Lösung in die Küvette gegeben. Stellen Sie sicher, dass das zugesetzte Cu(II)-Volumen weniger als 3 μL beträgt, und zeichnen Sie das Volumen zur späteren Analyse auf.
    7. Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Lösung zu mischen und gleichzeitig die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Lassen Sie die Lösung 5 min lang reagieren und ausgleichen und zeichnen Sie das Absorptionsspektrum auf.
    8. Wiederholen Sie die Zugabe von Cu(II)-Aliquots wie in Schritt 1.2.6 in die Peptidlösung für die folgenden Äquivalente: 1,0, 1,5, 2,0, 3,0 und 5,0 (oder insgesamt 300, 450, 600, 900 und 1.500 μM). Stellen Sie sicher, dass Sie das Gesamtvolumen des hinzugefügten Cu(II) und das Gesamtvolumen der Küvette aufzeichnen.
      HINWEIS: Wenn mehr Auflösung gewünscht wird, verringern Sie den Abstand zwischen den Entsprechungen.
    9. Entfernen Sie die Probenküvette und reinigen Sie sie gründlich gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    10. Fügen Sie die gepufferte Lösung ohne Peptid hinzu und zeichnen Sie das Absorptionsspektrum auf. Wiederholen Sie die Addition von Cu(II)-Aliquots wie in den Schritten 1.2.5-1.2.8 und zeichnen Sie das Absorptionsspektrum für jedes Cu(II)-Äquivalent auf.
    11. Exportieren Sie alle Spektren als CSV-Dateien zur Verarbeitung. Reinigen Sie die Küvetten gründlich gemäß den Anweisungen des Herstellers und schalten Sie das Spektralphotometer aus.
  3. Verarbeitung der Daten
    1. Laden Sie alle Spektren in ein Tabellenkalkulationsprogramm.
    2. Subtrahieren Sie das reine Pufferspektrum (0 μM Cu(II)) von jedem anderen Spektrum, um alle Absorptionsmerkmale aus dem Puffer selbst zu entfernen.
    3. Normalisieren Sie jedes Spektrum, um die Verdünnung zu berücksichtigen, die sich aus der Zugabe der Cu(II)-Lösung ergibt (Schritt 1.2.6). In der Ergänzungsdatei Eq (1)14 finden Sie ein Beispiel für die Normalisierung, wobei vinitial das Volumen (115 μL) des der Küvette hinzugefügten Peptids, v Cu(II) das Volumen der in Schritt 1.2.6 hinzugefügten Cu(II)-Lösung und dassubtrahierte Spektrum des Abs-Puffers die in Schritt 1.2.7 erhaltenen Daten sind.
    4. Ordnen Sie alle Spektren zusammen auf, um Bereiche der Veränderung zu identifizieren.
      HINWEIS: Typische D-D-Bänder aus Cu(II)-Komplexen reichen von 500 bis 750 nm. Diese spektralphotometrische Titration kann aufgrund des kleinen Extinktionskoeffizienten aus d-d-Bändern, die Laporte-verbotene Übergänge in der oktaedrischen Geometrie21 sind, eine Herausforderung darstellen. Wenn die Absorption zu schwach ist, besteht ein alternativer Ansatz darin, chromophore Liganden zu verwenden, die bei Bindung an Cu(II) zu Ladungsübertragungsbändern führen (siehe Abschnitt 2).

2. Elektronische Absorptionsspektroskopie: Peptidkonkurrenz mit chromophorem Liganden

  1. Probenvorbereitung
    1. 1,10-Phenanthrolin (Phen) in Reinstwasser auflösen, um eine Endkonzentration von ~1 mM zu erhalten.
    2. Zusätzlich zu der in Abschnitt 1.1 beschriebenen Probenvorbereitung für das Peptid (Schritt 1.1.2) und Cu(II) (Schritt 1.1.3) wird eine 10 μM Cu(II)- und 40 μM Phenlösung im Puffer ([Cu(phen)3]2+) hergestellt. Stellen Sie sicher, dass das Volumen die Küvette füllt.
  2. Ausführen des Experiments
    1. Starten Sie das elektronische Absorptionsspektralphotometer wie in den Schritten 1.2.1 und 1.2.2, stellen Sie den Scanbereich jedoch auf 200-400 nm ein.
    2. Laden Sie in zwei aufeinander abgestimmten Küvetten eine Küvette mit 115 μL Reinstwasser und die andere Küvette mit 115 μL der [Cu(phen)3]2+ Lösung. Legen Sie die Küvette mit Wasser in den Referenzstrahl und die Küvette mit [Cu(phen)3]2+ Lösung in den Probenstrahl.
    3. Sammeln Sie das Absorptionsspektrum des Metall-Liganden-Komplexes.
    4. Zugabe einer stöchiometrischen Menge (≈1 Äquivalente, ≈10 μM) Peptid zu der [Cu(phen)3]2+ Lösung. Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um gründlich zu mischen, aber achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen. Notieren Sie das Volumen des hinzugefügten Peptids für zukünftige Analysen.
      HINWEIS: Bei Verwendung von Küvetten, die 115 μL fassen, ergibt die Zugabe von 3,83 μL 300 μM Peptid eine endgültige Peptidkonzentration von 9,7 μM.
    5. Inkubieren Sie die Lösung für 5 Minuten, um das Gleichgewicht zu erreichen. Zeichnen Sie das Absorptionsspektrum auf.
      HINWEIS: Wenn die Bindungsaffinität des Metall-Peptids und des Metall-Liganden ähnlich sind, muss die Konzentration des hinzugefügten Peptids im großen Übermaß sein. Achten Sie darauf, das Gesamtvolumen des zur Normalisierung hinzugefügten Peptids zu berücksichtigen.
    6. Wiederholen Sie die Zugabe von Peptidaliquoten in die [Cu(phen)3]2+-Lösung für die folgenden ungefähren Äquivalente: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 22 und 26. Notieren Sie das Volumen des hinzugefügten Peptids, damit die verdünnte Konzentration bestimmt werden kann.
    7. Entfernen Sie die Probe und reinigen Sie die Küvette gründlich gemäß den Anweisungen des Herstellers. Sammeln Sie ein Spektrum des Puffers. Sammeln Sie ein Spektrum von 50 μM Peptid im Puffer.
    8. Exportieren Sie alle Daten als CSV-Dateien zur Verarbeitung und reinigen Sie die Küvetten gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  3. Verarbeitung der Daten
    1. Laden Sie die Spektren in ein Tabellenkalkulationsprogramm und subtrahieren Sie das Pufferspektrum von den anderen Spektren.
    2. Normalisieren Sie die Spektren nach Supplemental File, Eq (2)14.
    3. Bestimmen Sie unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten für [Cu(phen)3]2+ bei 265 nm (εmax = 90.000 M-1 cm-1)22 die Konzentration von [Cu(phen)3]2+ bei jeder Zugabe des Peptids.
    4. Für jede Addition des Peptids ist die Konzentration des Cu(II)-Peptidkomplexes zu bestimmen, indem die verbleibende Konzentration von [Cu(phen)3]2+, wie in Schritt 2.3.2 bestimmt, von der Anfangskonzentration von [Cu(phen)3]2+ (bei 0 μM Peptid) subtrahiert wird.
    5. Berechnen Sie die Konzentration des freien Phen-Liganden anhand der Gleichung in Supplemental File, Eq (3)14.
    6. Berechnen Sie die Konzentration des freien Peptids mit Supplemental File, Eq (4)14, wobei [Peptid]stock das unverdünnte Peptid darstellt, das in die Küvette titriert ist, V1 das Volumen des zugegebenen Stammpeptids, V 2 das Gesamtvolumen der Küvette und [Cu2+-Peptid] in Schritt2.3.4 bestimmt wird.
    7. Berechnen Sie die experimentelle Bindungsaffinität (Kex) mit Eq (5) in der Ergänzungsdatei23.
    8. Beziehen Sie die Dissoziationskonstante von Cu(II)-peptid auf Kex durch Eq (6)23 in Supplemental File, wobei Kd,Cu(II)-phen = 1,0 × 10-9 ist (siehe 22). Bestimmen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung von allen ermittelten Dissoziationskonstanten.
      HINWEIS: Unter einem Verhältnis von 4:1 von phen:Cu(II), [Cu(phen)3]2+, [Cu(phen)2]2+ und [Cu(phen)]2+ existieren in der Lösung, und das Peptid chelatiert Cu(II) weg von der Spezies ([Cu(phen)]2+) mit der schwächsten Bindung 22.

3. Isotherme Titrationskalorimetrie

  1. Probenvorbereitung
    1. Es wird eine gepufferte Lösung von 15 mM 3-morpholinopropan-1-sulfonsäure (MOPS) bei pH 7,4 unter Verwendung von Reinstwasser (>18 MΩ Beständigkeit) hergestellt. Entfernen Sie Spurenmetallionen, indem Sie mit einem hochaffinen Harz für mindestens 2 h inkubieren, mit anschließender Vakuumfiltration durch eine 0,45 μm große Membran mit Flaschenverschluss.
    2. Eine bekannte Masse vonCuCl2 wird in Reinstwasser gelöst, um eine Lösung von ≈50-100 mM herzustellen. Diese Cu(II)-Lösung wird in Puffer verdünnt, um eine 1,0-ml-Lösung mit einer Endkonzentration von 1,4 mM Cu(II) zu erhalten. Notieren Sie das genaue Volumen der verwendetenCuCl2-Lösung .
    3. Lösen oder verdünnen Sie die Peptidlösung im Puffer, um 450 μL einer 154 μM Peptidlösung herzustellen. Stellen Sie sicher, dass der Peptidlösung der gleiche Anteil an zusätzlichem Reinstwasser aus Schritt 3.1.2 zugesetzt wird, wodurch die Verdünnungswärme reduziert und das Signal-Rauschen erhöht wird.
    4. Stellen Sie nach der Vorbereitung der Proben sicher, dass die Lösungen den gleichen pH-Wert haben, und stellen Sie sie bei Bedarf entsprechend ein.
    5. Optionaler Schritt: Entgasen Sie die Lösungen, um Mikroblasen zu minimieren, die in die ITC geladen werden.
  2. Ausführen des Experiments
    1. Schalten Sie die ITC ein. Starten Sie die ITC-Software, um das Instrument auszuführen. Warten Sie auf die erste Initialisierung, bei der Sie aufgefordert werden, den Buret nach Hause zu bringen. Folgen Sie dann den Anweisungen auf dem Bildschirm.
    2. Entfernen Sie die Abdeckung aus der Referenzzelle. Entfernen Sie das Wasser aus der Referenzzelle und spülen Sie es dreimal mit 450 μL entgastem Reinstwasser ab.
    3. Ziehen Sie langsam Reinstwasser bis zur 450-μL-Marke einer Ladespritze auf und achten Sie darauf, keine Luftblasen in die Spritze einzuführen. Setzen Sie die Ladespritze in die Referenzzelle ein, bis sie ≈ 1 mm vom Boden entfernt ist, und injizieren Sie langsam einen Teil der Lösung, bis 150 μL in der Ladespritze verbleiben. Bewegen Sie den Ladespritzenkolben mehrmals schnell um ≈25 μL auf und ab, um Blasen auf der Zelloberfläche zu entfernen. Langsam injizieren, bis der Kolben die 100-μL-Marke auf der Ladespritze erreicht, wodurch insgesamt 350 μL Reinstwasser in die Referenzzelle abgegeben werden, und die Referenzzellabdeckung ersetzen.
    4. Entfernen Sie die Restlösung aus der Probenzelle und beladen Sie sie mit 450 μL 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) mit einer Ladespritze. 10 Minuten einweichen, um sicherzustellen, dass Spurenmetallionen entfernt werden, da die EDTA Spurenmetalle bindet.
    5. Entfernen Sie die EDTA-Lösung (mit gebundenen Spurenmetallionen) und spülen Sie die Ladespritze gründlich mit reichlich Reinstwasser ab.
    6. Reinigen Sie die ITC gemäß den Anweisungen des Herstellers und spülen Sie die Probenzelle mit Reinstwasser ab.
    7. Konditionieren Sie die Probenzelle, indem Sie mindestens dreimal mit 450 μL Puffer spülen.
    8. Entfernen Sie den Puffer, der die Probenzelle konditioniert. Die Peptidlösung wird mit der Ladespritze in die Probenzelle geladen (folgen Sie Schritt 3.2.3).
    9. Spülen Sie die Titrationsspritze mit 200 μL gepufferter Lösung ab. Entfernen Sie dazu den Kolben und verwenden Sie eine Mikropipette, um den Puffer durch das Loch an der Oberseite der Glastitrationsspritze, durch die Spritze und die Nadel darunter zu pipettieren.
    10. Setzen Sie den Kolben vollständig in die Titrationsspritze ein.
    11. Tauchen Sie die Spitze der Titrationsspritzennadel in die Metalllösung und ziehen Sie den Kolben langsam nach oben, wodurch die Metalllösung die Spritze füllt und zu einem Hohlraumvolumen an der Oberseite des Glasteils der Titrationsspritze führt. Entfernen Sie den größten Teil des Hohlraumvolumens, indem Sie die Titrationsspritze parallel zum Boden drehen, den Kolben entfernen und den Glasteil leicht zum Boden neigen. Geben Sie der Titrationsspritze einen sanften Shake, so dass sich die Lösung zum Ende des Glasteils der Titrationsspritze bewegt und den größten Teil des Hohlraumvolumens ausfüllt, aber stellen Sie sicher, dass 2-3 μL Hohlraumvolumen erhalten bleiben. Während Sie die Spritze parallel zum Boden halten, setzen Sie den Kolben wieder ein.
    12. Halten Sie die Titrationsspritze aufrecht, tauchen Sie die Nadelspitze wieder in die Metalllösung und drücken Sie den Kolben nach unten, bis die Luft nicht mehr aus der Nadel kommt. Laden Sie die Titrationsspritze, indem Sie den Kolben langsam bis knapp über die 50-μL-Marke hochziehen, während Sie die Nadelspitze in der Lösung halten.
    13. Führen Sie den Glasteil der Titrationsspritze vorsichtig in die Bürte ein und schrauben Sie ihn fest. Wenn eine kleine Menge Lösung aufgrund der Kompression des Kolbens aus der Titrationsspritze kommt, verwenden Sie einen leichten empfindlichen Scheibenwischer, um die Lösung vorsichtig zu absorbieren, ohne die Nadelspitze zu berühren.
    14. Setzen Sie die Bürte mit Titrationsspritze in die Probenzelle ein und befestigen Sie sie sicher.
    15. Richten Sie die Parameter in der ITC-Software ein. Beginnen Sie mit der Instrumentensteuerung, stellen Sie die Rührrate (typische Rührraten reichen von 150 bis 350 U / min) und die Temperatur , bei der das Experiment durchgeführt wird (typischerweise 25 ° C), ein. Geben Sie die Spritzen- und Zellkonzentrationen in millimolaren Einheiten unter Experimentdetails ein.
    16. Wählen Sie im Abschnitt Experimentmethode die Option Inkrementelle Titration aus. Klicken Sie auf Setup und geben Sie 20 Injektionen von 2,5 μL an. Wenn mehr Auflösung erforderlich ist, um das Bindungsereignis zu beobachten, erhöhen Sie die Anzahl der Injektionen und verringern Sie das Volumen pro Injektion. Geben Sie den Zeitabstand zwischen den einzelnen Injektionen so ein, dass er lang genug ist, damit sich das Signal ausgleichen und zur Ausgangslinie zurückkehren kann, typischerweise 300 s.
    17. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen , um das Experiment zu starten und anzugeben, wo die Daten gespeichert werden.
    18. Nach Abschluss des Experiments reinigen Sie die Probenzelle und die Titrationsspritze.
    19. Führen Sie alle Experimente mindestens dreifach durch, um eine präzise Datenerfassung zu gewährleisten.
    20. Führen Sie ein Kontrollexperiment durch, bei dem die Metalllösung in die gepufferte Lösung (in Abwesenheit von Peptid) titriert wird, um sicherzustellen, dass die Verdünnungswärme des Metallions gering ist und dass es keine unberücksichtigten Gleichgewichte gibt. Wenn die Verdünnungswärme groß ist, sollten Sie nach Möglichkeit ein anderes Puffersystem in Betracht ziehen.
  3. Verarbeitung der Daten
    1. Starten Sie die ITC-Analysesoftware und laden Sie die Datendatei zur Analyse.
    2. Navigieren Sie zur Registerkarte Baseline , und überprüfen Sie das Thermogramm. Beachten Sie jede exogene Wärme, die sich aus Luftblasen oder anderen Artefakten im Thermogramm entwickelt oder absorbiert hat. Suchen Sie nach Spikes, die nicht auf die Injektion der Metalllösung zurückzuführen sind.
    3. Stellen Sie sicher, dass die von der Analysesoftware generierte Baseline dem Teil der Daten nach Injektion und Gleichsetzung folgt. Wenn es davon abweicht, verwenden Sie Baseline-Pivot-Punkte , um die Baseline anzupassen. Stellen Sie sicher, dass die Integrationsbereiche den durch die Injektion des Metalls erzeugten Peak enthalten, aber alle Luftblasen oder Artefakte im Thermogramm in Schritt 2 einschließen. Subtrahieren Sie die Baseline vom Thermogramm.
      HINWEIS: Diese Art der Manipulation wird erst empfohlen, nachdem mehrere Thermogramme gesammelt wurden, damit der Experimentator weiß, was echte Daten und was ein Artefakt ist, da die Anpassung der Baseline und der Integrationsregionen die Daten drastisch beeinflussen kann.
    4. Navigieren Sie zum Fenster Modellierung , um mit der Anpassung der Daten zu beginnen, in die die Analysesoftware die integrierten und konzentrationsnormalisierten Daten für jede Injektion anzeigt.
    5. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf den Bezug der ersten Injektion, um ihn aus dem Anpassungsalgorithmus zu entfernen.
      HINWEIS: Dies ist üblich, da es zu einer geringfügigen Vermischung zwischen dem Titriermittel und der Probenzelllösung kommt, was zu einer ungenauen molaren Abgabe der ersten Injektion führt.
    6. Wählen Sie im Abschnitt Modelle im Dropdown-Menü Stil die Option Leer (konstant), das auf der endgültigen Injektionsenthalpie basiert und von jedem Datenpunkt subtrahiert wird, wobei die Verdünnungswärme berücksichtigt wird. Wählen Sie außerdem im zweiten Dropdown-Menü Formatvorlage die Option Unabhängig (oder das beste Modell für das System) aus, um die Daten anzupassen.
      HINWEIS: Für standardmäßige 1:1-Bindungsinteraktionen ist das gängigste Modell Unabhängig.
    7. Passen Sie die Daten mit den beiden Modellen an, indem Sie die grüne Play-Taste mit einem Σ drücken.
      HINWEIS: Eine weitere Software zur Verarbeitung von ITC-Daten ist SEDPHAT24.
    8. Berücksichtigen Sie alle konkurrierenden Gleichgewichte in der Post-hoc-Analyse, die zuvor von Grossoehme et al. berichtet wurde. 20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ziel war es, die Thermodynamik der Cu(II)-Bindung an C-Peptid mit den komplementären Techniken der elektronischen Absorptionsspektroskopie und der ITC zu quantifizieren und zu bestätigen. Aufgrund der robusten Natur der elektronischen Absorptionsspektroskopie wurde eine direkte Titration von Cu(II) in 300 μM C-Peptid durchgeführt (Abbildung 1). Die Zugabe von 150 μM Cu(II) verursachte einen sofortigen Anstieg der Bande bei 600 nm, der der d-d-Bande von Cu(II) zugeschrieben wurde, und stieg weiter an, bis 300 μM Cu(II) hinzugefügt wurden. Eine weitere Addition über 300 μM Cu(II) erhöhte nicht die Absorption der d-d-Bande, was auf eine Sättigung hinweist und darauf hindeutet, dass Cu(II) in einem 1:1-Komplex an C-Peptid bindet. Darüber hinaus sollte aufgrund der relativ hohen Affinität von Bis-Tris zur Bindung an Cu(II) (log K = 5,27)16 die Cu(II)/C-Peptid-Affinität eine untere Grenze im mikromolaren Bereich (log K > 6) aufweisen, um das Metallion weg vom Puffer zu chelatisieren. In diesem System ist die genaue Quantifizierung der Absorptionsbänder aufgrund des kleinen Extinktionskoeffizienten eine Herausforderung.

Um den kleinen Extinktionskoeffizienten des d-d-Bandes zu umgehen, wurde ein chromophorer Ligand, Phen, wie oben beschrieben, verwendet. C-Peptid wurde in ≈10 μM [Cu(phen)3]2+ titriert (Abbildung 2A), und die Absorption aus dem Ladungstransferband bei 265 nm nahm ab (Abbildung 2B), was darauf hindeutet, dass C-Peptid Cu(II) aus dem Phenliganden chelatisieren konnte. Bei näherer Betrachtung war eine große Konzentration von C-Peptid (bis zu 140 μM) erforderlich, um den Phen-Liganden leicht zu übertreffen (Tabelle 1). Dies ist angesichts der großen sequentiellen Bildungskonstanten für [Cu(phen)3]2+ (9,0, 15,7 und 20,8 für log K1, β2 bzw. β 3)22 nicht verwunderlich. Die Analyse der Spektren zeigt, dass die Cu(II)/C-Peptid-Bindungsaffinität im Bereich von log K = 7,4-7,8 liegt (Tabelle 1).

Der Goldstandard für die Messung der vollständigen Thermodynamik einer Bindungswechselwirkung ist ITC. Abbildung 3 zeigt ein repräsentatives Thermogramm von Cu(II), das in 15 mM MOPS, pH 7,4, in C-Peptid titriert ist, was die Konkurrenz für das Cu(II) darstellt. Hier wurde MOPS-Puffer anstelle von Bis-Tris-Puffer verwendet, da K Cu(II)-MOPS K Cu(II)-bis-Tris16,25 < und weniger Konkurrenz bieten würde, so dass die ITC die Affinität genau messen kann (siehe Diskussion). Durch die Messung der Wärme, die zwischen allen Gleichgewichten verbraucht oder entwickelt wird, liefert das Thermogramm eine sigmoidale Form. Anfängliche Injektionen von Cu (II), bevor das Peptid gesättigt ist, führen zu großen Wärmemengen im Vergleich zur Verdünnungswärme. Die Differenz in diesen Wärmewerten istΔH ITC. Der Wendepunkt beschreibt zwei nützliche Informationen. Die erste ist die Bindungsstöchiometrie der Spezies in der Spritze im Vergleich zu den Spezies in der Zelle (d.h. Cu(II):C-Peptid ist 1:1). Zweitens ist die Steigung der Passform am Wendepunkt direkt proportional zur KITC. Nach dem Sammeln von Daten in dreifacher und in mehreren Puffern wurde eine Post-hoc-Analyse20 durchgeführt, bei der alle konkurrierenden Gleichgewichte berücksichtigt werden (Tabelle 2) und die pufferunabhängige Thermodynamik bestimmt wird. Für Cu(II)-Bindung an C-Peptid ist K Cu(II)/C-peptid = 1 (± 1) x 10 8 und ΔHCu(II)/C-peptid = -8 (± 4) kJmol-1. Daraus werden weitere verbindliche thermodynamische Parameter bestimmt, wobei ΔG°Cu(II)/C-peptid = -46 (± 4) kJ mol-1 und ΔSCu(II)/C-peptide = 120 (± 10) J mol-1 K-1 (siehe 15).

Figure 1
Abbildung 1: Überwachung der Cu(II)-d-d-Bande bei Zugabe von 150, 300, 450, 600, 900 und 1.500 μM Cu(II) bis 300 μM C-Peptid in 50 mM bis-Tris, pH 7,4. Die d-d-Bande von Cu(II) steigt bei 600 nm an, bis ein 1:1 Cu(II):C-Peptidkomplex gebildet wird. Zuvor berichteten Magyar und Godwin, dass die Cu(II)-bis-Tris-Affinität log K = 5,2716 ist. Diese Titration zeigt, dass C-Peptid den Puffer zur Bindung von Cu(II) übertreffen kann und weist auf eine Cu(II)/C-Peptid-Affinität im mikromolaren Bereich hin. Diese Abbildung wird mit Genehmigung von Stevenson et al.14 nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Bildung von [Cu(phen)3]2+ und repräsentativen elektronischen Absorptionsspektren, die die Abnahme des Ladungstransferbandes bei Zugabe von C-Peptid überwachen. (A) Das Reaktionsschema, das die Bildung von [Cu(phen)3]2+ und sein Ladungstransferband zentriert bei 265 nm (ε° ≈ 90.000 M-1 cm-1)22 zeigt. Die Formationskonstanten sind 9,0, 15,7 und 20,8 für log K1, β2 und β3 bzw.22. (B) Repräsentative elektronische Absorptionsspektren, die die Abnahme des Ladungstransferbandes von [Cu(phen)3]2+ als C-Peptidchelate Cu(II) überwachen. Die Titration wurde in 50 mM bis-Tris, pH 7,4 durchgeführt. Die Datenanalyse ist in Tabelle 1 dargestellt. Diese Abbildung wird mit Genehmigung von Stevenson et al.14 nachgedruckt. Abkürzung: MLCT = Metall-Libanden-Ladungstransfer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative Thermogramme von Cu(II), titriert in C-Peptid und Puffer . (A) Dieses repräsentative Thermogramm zeigt die Titration von 1,4 mM Cu(II) in 154 μM C-Peptid in 15 mM MOPS, pH 7,4. Die Daten werden an ein One-Site-Modell mit den folgenden Parametern angepasst: n = 1,2 ± 0,1; Kd,ITC = 6 (± 3) x 10-7; ΔHITC = −3,4 ± 0,2 kJ mol-1. (B) Eine repräsentative Kontrolltitration von 1,4 mM Cu(II) in 15 mM MOPS, pH 7,4, in Abwesenheit eines C-Peptids, das kein bindendes Thermogramm zeigt, das in Panel A zu sehen ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

[C-Peptid] A265 [Cu(phen)3] 2+ [phen] kostenlos [C-Peptid] kostenlos [Cu(II)/C-Peptid] Kex (x108) KdCu(II)/C-Peptid log KdCu(II)/C-Peptid
0.0 1.0649 11.83 4.5 0 0.00 Nd Nd Nd
9.7 0.9948 11.05 6.84 7.45 0.78 0.0543 1.84E-08 7.75
18.7 0.9785 10.87 7.38 16.00 0.96 0.0367 2.73E-08 7.56
27.3 0.9651 10.72 7.83 24.09 1.11 0.0310 3.23E-08 7.49
35.3 0.9475 10.53 8.42 31.55 1.30 0.0307 3.26E-08 7.49
42.8 0.9374 10.42 8.75 38.79 1.42 0.0288 3.48E-08 7.46
50.0 0.9283 10.31 9.06 45.64 1.52 0.0275 3.63E-08 7.44
56.7 0.9134 10.15 9.55 51.92 1.68 0.0288 3.47E-08 7.46
63.1 0.9025 10.03 9.92 57.97 1.81 0.0291 3.43E-08 7.46
69.2 0.8927 9.92 10.24 63.73 1.91 0.0294 3.40E-08 7.47
75.0 0.878 9.76 10.73 69.04 2.08 0.0314 3.19E-08 7.50
85.7 0.8542 9.49 11.53 78.99 2.34 0.0341 2.93E-08 7.53
95.4 0.8316 9.24 12.28 88.01 2.59 0.0371 2.69E-08 7.57
104.3 0.8151 9.06 12.83 96.38 2.78 0.0387 2.58E-08 7.59
112.4 0.7976 8.86 13.41 103.98 2.97 0.0411 2.44E-08 7.61
126.9 0.7809 8.68 13.97 117.87 3.16 0.0411 2.44E-08 7.61
139.2 0.7586 8.43 14.71 129.53 3.40 0.0437 2.29E-08 7.64
Bereich 7.4-7.8

Tabelle 1: Repräsentative Berechnungen für die Konzentrationen von Spezies in Lösung aus Abbildung 2B. Alle Konzentrationen sind in Mikromolaren. Dieser Nachdruck erfolgt mit Genehmigung von Stevenson et al.14.

Equlibria n ΔH (kJ mol-1) n × ΔH (kJ mol-1)
Cu(II)-MOPS → Cu(II) + MOPS 1 5.4 5.44
MOPS + H+ → MOPS-H+ 0.097 −21,0 −2,04
Cu(II) + C-Peptid-H+ → Cu(II)/C-Peptid + H+ 1 X X
ΔHITC = Χ + 3,40
χ = ΔHITC − 3,40
Χ = ΔHCu(II)/C-Peptid = −6,8 kJ mol-1

Tabelle 2: Post-hoc-Analyse zur Bestimmung desΔH-Cu(II)/C-Peptids. Wie in Abbildung 3,1,4 mM Cu(II) gezeigt, wurde es in 154 μM C-Peptid in 15 mM MOPS, pH 7,4, dreifach titriert. Nach Berücksichtigung aller in der Tabelle dargestellten konkurrierenden Gleichgewichte ergibt sich ein ΔHCu(II)/C-Peptid von −8,66 kJ mol-1. Die Anzahl der Protonen, die durch Cu(II) aus dem C-Peptid verdrängt werden, wird aus der Steigung von (ΔHITC + ΔHCu(II)-Buffer) gegenüber ΔHBuffer-H bestimmt, wo Daten in mehreren Puffern gesammelt werden. Alle Enthalpiewerte finden sich in NIST25 oder werden an anderer Stelle in der Literatur15 bestimmt. Alle konkurrierenden Gleichgewichte werden wie von Grossoehme et al.20 beschrieben berücksichtigt.Diese Abbildung wird mit Genehmigung von Stevenson et al.15 nachgedruckt.

Ergänzende Datei: Relevante Gleichungen, die im Protokollabschnitt verwendet werden, und zusätzliche Parameter für elektronische Absorptionsspektralphotometer und ITC-Setup. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dieser Artikel bietet eine robuste Methode zur Quantifizierung der Affinität und Thermodynamik der Cu(II)-Bindung an Peptide. Komplexe mit Cu(II) eignen sich aufgrund seiner d 9-Elektronenkonfiguration ideal zur Überwachung des d-d-Absorptionsbandes am Metallstandort. Obwohl der Extinktionskoeffizient klein ist und daher größere Konzentrationen des Komplexes erforderlich sind, um ein zuverlässiges Signal zu erhalten, können Titrationen von Cu(II) in Peptid schnell einen Einblick in die Bindungsstöchiometrie und die ungefähre Bindungsaffinität geben. Es kann jedoch schwierig sein, einen Unterschied in den Spektren zu erkennen, wenn das Metall durch ähnliche Atome und Geometrien aus Puffer und Peptid koordiniert wird. Um die Bindungsaffinität quantitativ zu bestimmen, werden aufgrund ihrer symmetrieerlaubten Ladungsübertragungen mit Metallionen21 häufig chromophore Liganden wie Phen verwendet. Durch den Aufbau einer Konkurrenz zwischen einem chromophoren Liganden und einem nichtchromophoren Peptid und durch die Kenntnis der Affinität des Metalls zum Liganden kann die Metall-Peptid-Affinität direkt bestimmt werden. Die weitere thermodynamische Analyse mittels elektronischer Absorptionsspektroskopie ist eine Herausforderung. Um die Bindungsenthalpie mit einer Technik wie der UV-Vis-Spektroskopie zu quantifizieren, muss die Bindungsaffinität bei mehreren Temperaturen bestimmt und eine Van't Hoff-Analyse durchgeführt werden. Diese Analyse geht davon aus, dass die spezifische Bindungswärme Null ist, was selten zutrifft und somit nur eine Schätzung der Bindungsenthalpie20 liefert.

Die isotherme Titrationskalorimetrie ist besser geeignet, um einen vollständigeren Überblick über die Thermodynamik von Metall-Peptid-Wechselwirkungen zu erhalten. Bei dieser Technik wird ein Metallion in die Peptidlösung titriert und die Wärme verschiedener Gleichgewichte direkt gemessen. Da das Experiment bei konstantem Druck durchgeführt wird, ist die von der ITC gemessene Wärme gleich der Enthalpie. ITC kann einige der Einschränkungen der elektronischen Absorptionsspektroskopie überwinden, wie z.B. die Untersuchung spektroskopisch stiller Metallionen und die Notwendigkeit, die Annahmen wie in der Van't Hoff-Analyse zu treffen. Manchmal erzeugen die in der ITC stattfindenden Reaktionen jedoch wenig bis gar keine Wärme und werden daher nicht beobachtet. Dies kann entweder durch steigende Konzentrationen von Metall und Peptid oder durch die Verwendung eines anderen Puffers mit einer anderen Protonationsenthalpie umgangen werden. Letzteres ist besonders nützlich, wenn das Metallion bei der Bindung an das Peptid mehrere Protonen verdrängt. Beide Techniken - ITC und elektronische Absorptionsspektroskopie - bieten jedoch orthogonale Methoden, um dasselbe System zu untersuchen und sich gut zu ergänzen.

Es gibt viele herausfordernde Aspekte in beiden Techniken bei der Untersuchung von Metallionen, die an Peptide binden. Viele Metallionen sind in Wasser unlöslich oder schwer löslich. Dies wird durch die Ausfällung des Metallions bei Zugabe zum Puffer noch verstärkt. In der ITC kann sich dies durch eine langsame, allmähliche Verschiebung der Baseline und große Mengen an Wärme manifestieren, die beim Einspritzen des Metalls erzeugt werden. Dies deutet auf große Werte der Verdünnungswärme hin, selbst nachdem das Peptid durch Metallionen gesättigt wäre. In der elektronischen Absorptionsspektroskopie manifestiert sich die Metallionenfällung durch erhöhte Absorption bei niedrigeren Wellenlängen und ähnelt einem breiten Peak, der im UV-Bereich zentriert ist. Bei beiden Techniken muss der Experimentator sicherstellen, dass das Metallion unter den Bedingungen der Wahl (z. B. Puffer, pH-Wert, Temperatur, Konzentration) löslich ist. Eine weitere Einschränkung beider Methoden kann sich durch das Konzept der Additionsreihenfolge zeigen. In einigen Fällen kann ein gebildeter Metallkomplex labil sein, während die Zugabe der gleichen Reagenzien in einer anderen Reihenfolge eine andere Zwischenspezies inert machen würde. Diese Darstellung der kinetischen versus thermodynamischen Steuerung behindert eine genaue Analyse aller konkurrierenden Gleichgewichte.

Sowohl die ITC- als auch die elektronische Absorptionsspektroskopie beruhen auf Wettbewerben zwischen dem Peptid und entweder Puffer oder Liganden zur Bindung des Metallions. Hier wird der c-Wert eingeführt, der hilft zu erkennen, ob KITC durch den Anpassungsalgorithmus genau bestimmt werden kann. Der c-Wert ist in Supplemental File, Eq (7)20 definiert, wobei n die Stöchiometrie, KITC die scheinbare Bindungsaffinität und [Probenzelle] die Konzentration der Spezies in der Probenzelle ist. Wenn der c-Wert zwischen 1 und 1.000 liegt, ist der ermittelte KITC genau. c-Werte unter 1 können jedoch nur eine Obergrenze für KITC darstellen, während c-Werte über 1.000 nur eine untere Grenzevon 20 darstellen können. Dies ist der Wert des Sammelns von Daten aus komplementären Techniken: Wenn etwas in einer Technik aufgrund ihrer Einschränkungen übersehen wird, kann es in seiner komplementären Technik gefangen sein. Wenn in diesen Experimenten die Konkurrenz für eine Spezies stark begünstigt wird (dh die Metallionenaffinität des Peptids ist viel größer als die Affinität des Puffers), werden die Gleichgewichte verschoben, was die Interpretation erschwert. Dies wird auch von Kocyla et al.23 ausführlich gezeigt. Um diese Herausforderung zu umgehen, wird häufig die Einführung oder der Ersatz durch einen anderen konkurrierenden Liganden oder die Wahl eines anderen Puffers verwendet, um den Wettbewerb zwischen Ligand und Peptid für eine genaue Quantifizierung zu erhöhen. Dies liegt daran, dass der Unterschied zwischen Metallpuffer- (oder Metallliganden) und Metall-Peptid-Affinitäten es ermöglichen würde, dass der c-Wert innerhalb des Fensters von 1 bis 1.000 liegt. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die Verwendung eines konkurrierenden Liganden oder eines anderen Puffers für die quantitative Analyse voraussetzt, dass die thermodynamischen Parameter des Metall-Liganden oder Metall-Puffer-Komplexes bekannt sind oder mit anderen Mitteln bestimmt werden können.

Schließlich kann die genaue Quantifizierung der Peptidkonzentration eine Herausforderung darstellen. Einige gängige Methoden zur Quantifizierung von Peptidkonzentrationen bestehen darin, bestimmte Aminosäuren zu messen und die Menge dieser Aminosäuren mit der Sequenz des Peptids in Beziehung zu setzen. Zum Beispiel kann die elektronische Absorptionsspektroskopie aromatische Rückstände wie Tyrosin messen, Ellmans Reagenz kann die Anzahl der freien Thiole26 quantifizieren und Bradford-Assays geben einen Hinweis darauf, wie viele Rückständevorhanden sind 27. Leider haben Peptide wie das in dieser Studie verwendete keine aromatischen Reste oder freien Thiole, und Bradford-Assays stellen Herausforderungen dar, wenn Standards von massiven Proteinen mit dem kleinen Peptid von Interesse verglichen werden. Stattdessen wurde die Peptidkonzentration durch Trockenmasse bestimmt. Obwohl nicht ideal und anfällig für Konzentrationen, die leichte Überschätzungen der Peptidkonzentration darstellen (da die scheinbaren Massenmessungen aufgrund der Anwesenheit von Salzen wahrscheinlich höher sind als die tatsächlichen Peptidmassen), wurden alle Aliquots für die Messung gleich behandelt, was genauere Vergleiche ermöglicht. Wenn in den spektroskopischen Studien die Konzentration des freien Peptids niedriger ist als erwartet, stellt die berechnete Bindungsaffinität eine untere Grenze dar (Supplemental File, Eq (5) und Eq (6)). Es gibt Herausforderungen, die mit beiden gezeigten Techniken verbunden sind, aber mit Literatur als Leitfaden können viele überwunden werden.

Der hier beschriebene experimentelle Ansatz ermöglicht eine genaue Quantifizierung der Metall-Peptid-bindenden Thermodynamik. Sowohl die ITC- als auch die elektronische Absorptionsspektroskopie sind orthogonal und geben Einblick in die Bindungsaffinität, aber die ITC ermöglicht eine direkte Enthalpiequantifizierung. Sobald diese Thermodynamik quantifiziert ist, kann daraus geschlossen werden, ob sich diese Metall-Peptid-Komplexe unter physiologischen Bedingungen bilden können. Wenn das Verständnis des physiologischen Metallionenflusses wächst, kann vorhergesagt werden, ob die Bindungsaffinität stark genug für eine komplexe Bildung in vivo ist. Darüber hinaus kann der Forscher Vorhersagen über Wettbewerbe zwischen mehreren Metallionen für dasselbe Peptid oder mehreren Peptiden für dasselbe Metallion treffen. Betrachtet man diese Wettbewerbe zwischen Metallionen und Peptiden, kann der Forscher beginnen zu verstehen, was zur Bindungsaffinität des Metall-Peptid-Komplexes beiträgt, indem er die freie Energie in Enthalpie- und Entropiebeiträge analysiert. Die Thermodynamik ist ein integraler Bestandteil der Wertschätzung des dynamischen Zusammenspiels zwischen Metallionen und Peptiden, und ITC und elektronische Absorptionsspektroskopie bieten Griffe, um diese Systeme zu befragen. Die hier beschriebenen Methoden können erweitert und verwendet werden, um andere Metallionenbindungswechselwirkungen mit Makromolekülen zu untersuchen, und können Auswirkungen auf physiologische Prozesse, das Arzneimitteldesign und mehr haben.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Acknowledgments

SC dankt dem Whitehead Summer Research Fellowship. MJS dankt den Startup Funds und dem Faculty Development Fund an der University of San Francisco. MCH würdigt die Finanzierung durch die National Institutes of Health (NIH MIRA 5R35GM133684-02) und die National Science Foundation (NSF CAREER 2048265).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,10-phenanthroline Sigma Aldrich 131377-25G
bis-Tris buffer Fisher BP301-100
Bottle-top 0.45 micron membrane Nalgene 296-4545 Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable
Copper(II) chloride Alfa Aesar 12458
EDTA Sigma Aldrich EDS-500G
Electronic absorption spectrophotometer Varian Cary 5000 Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable
high affinity resin Sigma Aldrich C7901-25G
Isothermal titration calorimeter (ITC) TA Instruments Nano ITC Low Volume
ITC analysis software TA Instruments NanoAnalyze SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used
ITC software TA Instruments ITCRun
light-duty delicate wiper Kimwipe 34155
loading syringe Hamilton Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL
matched cuvettes Starna Cells, Inc 16.100-Q-10/Z20 Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer
MOPS buffer Alfa Aesar A12914
spectrophotometer software Cary WinUV Scan
spreadsheet program Microsoft Excel Any suitable spreadsheet program will work
titration syringe TA Instruments 5346
ultrapure water Millipore Sigma Milli-Q Any water is okay as long as >18 MΩ resistance

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waldron, K. J., Robinson, N. J. How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal. Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).
  2. Puig, S., Thiele, D. J. Molecular mechanisms of copper uptake and distribution. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).
  3. Huffman, D. L., O'Halloran, T. V. Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins. Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).
  4. Kaplan, J. H., Lutsenko, S. Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs. Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).
  5. Makowska, J., et al. Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the Aβ (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations. Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).
  6. Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. 1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides. Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).
  7. García, J. E., et al. Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106−115: evaluating the role of protons and methionine residues. Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).
  8. Jakab, N. I., et al. Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy. Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).
  9. Keltner, Z., et al. Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants. Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).
  10. Whittal, R. M., et al. a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry. Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).
  11. Żamojć, K., et al. A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).
  12. Beuning, C. N., et al. Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-β complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching. Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).
  13. Makowska, J., Żamojć, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzyński, L. Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus. Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).
  14. Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization. ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).
  15. Stevenson, M. J., et al. Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity. Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).
  16. Magyar, J. S., Godwin, H. A. Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects. Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).
  17. Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. (Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions - a review. RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).
  18. Sigel, H., Martin, R. B. Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands. Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).
  19. Liu, J., et al. Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers. Chemical Reviews. 114 (8), 4366 (2014).
  20. Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).
  21. Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. Inorganic Chemistry. , Pearson. (2014).
  22. Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system. Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).
  23. Kocyła, A., Pomorski, A., Krężel, A. Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications. Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).
  24. Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions. Methods. 76, 137-148 (2015).
  25. NIST. Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).
  26. Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4′-dithiodipyridine. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).
  27. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
Quantifizierung der Bindungswechselwirkungen zwischen Cu(II)- und Peptidresten in Gegenwart und Abwesenheit von Chromophoren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Choi, S., San Juan, J. A., Heffern, M. C., Stevenson, M. J. Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores. J. Vis. Exp. (182), e63668, doi:10.3791/63668 (2022).More

Choi, S., San Juan, J. A., Heffern, M. C., Stevenson, M. J. Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores. J. Vis. Exp. (182), e63668, doi:10.3791/63668 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter