Summary
מאמר זה מתמקד בשימוש בספקטרוסקופיית ספיגה אלקטרונית ובקלורימטריה של טיטרציה איזותרמית כדי לחקור ולכמת את התרמודינמיקה של Cu(II) הקשורה לפפטידים וחלבונים.
Abstract
נחושת(II) היא מתכת חיונית במערכות ביולוגיות, המעניקה תכונות כימיות ייחודיות לביומולקולות שאיתן היא מתקשרת. דווח כי הוא נקשר ישירות למגוון פפטידים וממלא תפקידים הכרחיים ופתולוגיים כאחד, החל ממבנה מתווך, דרך תכונות העברת אלקטרונים וכלה בהקניית תפקוד קטליטי. כימות זיקת הקישור והתרמודינמיקה של קומפלקסים אלה של Cu(II)-פפטידים במבחנה מספק תובנה לגבי הכוח המניע התרמודינמי של הקשירה, תחרויות פוטנציאליות בין יוני מתכת שונים עבור הפפטיד או בין פפטידים שונים עבור Cu(II), והשכיחות של קומפלקס Cu(II)- פפטידי in vivo. עם זאת, כימות התרמודינמיקה הקושרת יכול להיות מאתגר בשל מספר עצום של גורמים, כולל התחשבות בכל שיווי המשקל המתחרה בניסוי טיטרציה, במיוחד במקרים שבהם יש מחסור בידיות ספקטרוסקופיות בדידות המייצגות את הפפטיד, את יון המתכת בלוק d ואת האינטראקציות שלהם.
כאן, קבוצה חזקה של ניסויים מסופקת לכימות מדויק של תרמודינמיקה Cu(II)-פפטידית. מאמר זה מתמקד בשימוש בספקטרוסקופיית קליטה אלקטרונית בנוכחות והיעדר ליגנדות כרומופוריות כדי לספק את הידית הספקטרוסקופית הדרושה ב- Cu(II) ובשימוש בקלורימטריה של טיטרציה איזותרמית ללא תווית. בשתי הטכניקות הניסוייות מתואר תהליך כדי להסביר את כל שיווי המשקל המתחרה. בעוד שהמיקוד של מאמר זה הוא ב-Cu(II), קבוצת הניסויים המתוארת יכולה לחול מעבר לאינטראקציות Cu(II)-פפטידיות, ולספק מסגרת לכימות מדויק של מערכות מתכת-פפטידים אחרות בתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית.
Introduction
הביולוגיה התפתחה כדי לנצל את הכימיה המגוונת של יוני המתכת הדרושים לחיים כדי להסתגל ולשרוד בסביבתם. על פי הערכות, 25%-50% מהחלבונים משתמשים ביוני מתכת למבנה ולתפקוד1. התפקיד המסוים ומצב החמצון מחדש של יון המתכת קשורים ישירות להרכב ולגיאומטריה של הליגנדות הביולוגיות המתאמות אותו. בנוסף, יוני מתכת פעילים בפני חמצון-חיזור כגון Cu(II) חייבים להיות מווסתים היטב, שמא הם מתקשרים עם חומרים מחמצנים באמצעות כימיה דמוית פנטון כדי ליצור מיני חמצן תגובתי (ROS)2,3,4. הבנת מצבי הקשירה והאהדה המניעים את הביוכימיה שלה אמורה לסייע בהבהרת התפקיד הביולוגי של יון המתכת.
טכניקות רבות משמשות לחקר אינטראקציות הקשירה של מתכות ופפטידים. אלה הן בעיקר טכניקות ספקטרוסקופיות, אך הן כוללות גם סימולציות מחשב באמצעות דינמיקה מולקולרית, כפי שניתן לראות באמצעות אינטראקציות Cu(II) עם קטע של עמילואיד בטא (Aβ)5. טכניקה ספקטרוסקופית נפוצה הנגישה לאוניברסיטאות רבות היא תהודה מגנטית גרעינית (NMR). על ידי שימוש באופי הפאראמגנטי של Cu(II), Gaggelli et al. הצליחו להראות היכן יון המתכת נקשר על פטיד באמצעות הרפיה של גרעינים סמוכים6. ניתן להשתמש בתהודה פאראמגנטית של אלקטרונים (EPR) גם כדי לחקור את המיקום והמצב של יון המתכת הפארמגנטיתהמחייבת 7. טכניקות ספקטרוסקופיות אחרות כגון דיכרואיזם מעגלי (CD) יכולות לתאר את הקואורדינציה לגבי Cu(II) במערכות כגון מערכות טריפפטידיות8, וספקטרומטריית מסות יכולה להראות סטויכיומטריה ולאילו שאריות יון המתכת מתואם באמצעות תבניות פיצול 9,10.
חלק מהטכניקות הללו, כגון NMR, הן נטולות תוויות אך דורשות ריכוזים גדולים של פפטידים, מה שמציב אתגרים למחקר. טכניקה נפוצה נוספת הנקראת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית שימשה כדי לקשר את מיקומו של טירוזין או טריפטופן עם מרווה מ-Cu(II)11,12. באופן דומה, טכניקה זו יכולה להראות שינויים מבניים כתוצאה מכריכת Cu(II)13. עם זאת, האתגרים עם מחקרי קשירת מתכות-פפטידים אלה הם שהם בודקים חומצות אמינו כרומופוריות כגון טירוזין אשר לא כל המערכות יש, כי יון המתכת נקשר תחת מודל קלאסי, וכי ייתכן שהטכניקה אינה תורמת בתנאים פיזיולוגיים. ואכן, נוצרים מספר פפטידים שאינם מכילים חומצות אמינו כרומופוריות כאלה או נקשרים תחת מודלים קלאסיים, מה שמונע את השימוש בטכניקות אלה14,15. מאמר זה מפרט גישות להערכת תכונות מחייבות בתרחישים אלה בתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית.
ליגנדות ביולוגיות עשויות לאמץ מצבי פרוטונציה שונים שיכולים להשפיע על קשירת יוני מתכת כגון טבעת אימידזול על היסטידין. אם ה- pH אינו נשמר באופן עקבי, התוצאות יכולות להיות מפותלות או סותרות. מסיבה זו, מאגרים הם מרכיב חיוני בחקר האינטראקציות בין מתכת לחלבון/פפטיד. עם זאת, הוכח כי מאגרים רבים מקיימים אינטראקציה חיובית עם יוני מתכת16,17. בנוסף לתחרות עם המולקולה הביולוגית המעניינת, למאגר עשויים להיות אטומי תיאום דומים שקשה להבחין ביניהם לבין האטומים המתאמים של הפפטיד או החלבון. במחקר זה, ההתמקדות היא בספקטרוסקופיית ספיגה אלקטרונית וקלורימטריה של טיטרציה איזותרמית (ITC) כשתי טכניקות משלימות לחקר אינטראקציות Cu(II)-פפטיד, עם שיקולים מיוחדים הנוגעים לבחירת חיץ.
ספקטרוסקופיית ספיגה אלקטרונית היא טכניקה מהירה ונגישה לחקר אינטראקציות קושרות מתכות. הקרנה עם אור באורכי הגל האולטרה-סגולים (UV) או באורכי הגל הנראים לעין יכולה להוביל לקליטה של רצועות d-d ממוקדות מתכת, המספקות מידע רב ערך על סיווג ליגנד, גיאומטריות מתכתיות וזיקות קשירה לכאורה18,19. עבור קומפלקסים אלה, טיטרציות ישירות של יוני מתכת לתמיסות חלבון או פפטידים יכולות לכמת סטויכיומטריות קושרות וזיקות קישור לכאורה. במקרים מסוימים, כגון תצורות d5 או d10 אלקטרונים, הקומפלקס אינו בולע אור (כלומר, הוא שקט מבחינה ספקטרוסקופית). בקומפלקסים אלה של מתכת מעבר שקטה מבחינה ספקטרוסקופית, ניתן לעקוף מגבלות אלה על ידי שימוש בליגנד מתחרה, אשר בעת תיאום יון המתכת, מניב רצועות העברת מטען הניתנות לזיהוי. בכל מקרה, גישה זו מוגבלת לכימות רק סטויכיומטריה וזיקה מקשרת לכאורה, ואין תובנה לגבי אנתלפיה מחייבת ללא קירובים.
משלים מידע המתקבל מספקטרוסקופיית קליטה אלקטרונית, ITC היא טכניקה אטרקטיבית לכימות ישיר וקפדני של האנתלפיה המחייבת20. ITC מודד ישירות את החום המשתחרר או הנצרך במהלך אירוע מחייב, ומכיוון שהטיטרציה מתרחשת בלחץ קבוע, החום הנמדד הוא האנתלפיה של כל שיווי המשקל (ΔHITC). בנוסף, הסטויכיומטריה של אירוע הכריכיומטריה של אירוע הכריכה (n) וזיקת הכריכיון לכאורה (KITC) מכמתות. מפרמטרים אלה נקבעות האנרגיה החופשית (ΔGITC) והאנטרופיה (ΔSITC), המספקות תמונת מצב תרמודינמית של אירוע הקשירה. מכיוון שהוא אינו מסתמך על בליעת אור, ITC היא טכניקה אידיאלית עבור מינים שקטים באופן ספקטרוסקופי, למשל, d5 או d10 קומפלקסים של יונים מתכתיים. עם זאת, מכיוון שקלורימטריה מודדת חום, כל מערכות חיץ ללא תחרות ושיווי משקל ללא הסברה עלולים להשפיע לרעה על הניתוח כדי לקבוע במדויק את התרמודינמיקה הקושרת את יוני המתכת, ויש לנקוט בזהירות רבה כדי לטפל בגורמים אלה20. אם היא מבוצעת בקפדנות המתאימה, ITC היא טכניקה חזקה לקביעת התרמודינמיקה של קומפלקסים של חלבוני מתכת/פפטידים.
כאן, פפטיד קושר נחושת שקט כרומופורית, C-פפטיד, משמש להדגמת השימוש המשלים בשתי הטכניקות. C-פפטיד הוא מוצר ביקוע של 31 שאריות (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQSLQPLALEGSLQ) שנוצר במהלך הבשלת האינסולין; הוא חסר שאריות כרומופוריות, אך הוכח שהוא קושר את Cu(II) עם זיקה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית14,15. אתר הקישור Cu(II) מורכב משרשראות הצד של גלוטמט ואספרטאט וכן מ-N-terminus של הפפטיד14,15. אטומי תיאום אלה דומים מאוד לאלה של מערכות מאגרים נפוצות רבות. כאן מוצג השימוש הטנדם בפסי העברת ה-d-d והמטענים בספקטרוסקופיית קליטה אלקטרונית וב-ITC בכימות התרמודינמיקה הקושרת את ה-Cu(II) ל-C-פפטיד. ניתן ליישם את הגישה ממחקר Cu(II) הקושר ל-C-פפטיד על יוני מתכת אחרים ועל מערכות חלבון/פפטידים אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ספקטרוסקופיית ספיגה אלקטרונית: טיטרציה ישירה עם תחרות חיץ
- הכנה לדוגמה
- הכינו תמיסה מואצת של 50 mM 2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-(הידרוקסימתיל)פרופאן-1,3-דיול (bisTris) ב-pH 7.4 באמצעות מים אולטרה-אפורים (עמידות >18 MΩ). הסר את יוני המתכת של עקבות על ידי דגירה עם שרף בעל זיקה גבוהה למשך 2 שעות לפחות עם סינון עוקב.
- ממיסים או מדללים כמות ידועה של הפפטיד לתוך המאגר נטול המתכת.
הערה: בעת ניטור רצועות d-d עם מקדמי הכחדה קטנים21, יש להשתמש בריכוזים גבוהים יותר של פפטידים. כאן, הריכוז הסופי של C-פפטיד בתמיסה חוצצת היה 300 μM (נפח תלוי בגודל של cuvette). C-פפטיד סונתז על ידי סינתזת פפטידים בפאזה מוצקה ומפורט במקום אחר בספרות14. - להמיס מסה ידועה של CuCl2 במים אולטרה-אפורים כדי ליצור תמיסה ב 10-15 mM.
הערה: חשוב להמיס בתחילה את מלח המתכת במים שאינם מתכלים כדי למנוע משקעים. ניתן להשתמש במלחי Cu(II) אחרים, אך יש לנקוט בזהירות כדי להבטיח שהאניון תואם בצורה חלשה.
- הרצת הניסוי
- הפעילו את ספקטרופוטומטר הקליטה האלקטרוני ותנו לו להתחמם במשך כ-15-20 דקות לפני השימוש. הפעל את תוכנת הספקטרופוטומטר והגדר את הפרמטרים כגון טווח סריקה (200-900 ננומטר), קצב סריקה (200 ננומטר לשנייה) ותיקון בסיסי של קרן כפולה (פרמטרים נוספים מפורטים בקובץ המשלים).
- אסוף קו בסיס ללא cuvettes או דגימות בנתיבי הקרן.
- באמצעות שני קובטים תואמים בספקטרופוטומטר בעל הקרן הכפולה, טענו קובט אחד עם 115 μL של מים אולטרה-פוריים ואת הקובט השני עם 115 μL של דגימת הפפטיד. ודא שאין בועות אוויר בקובטות מכיוון שהן יפריעו לאות.
- מקם את הקובט עם מים אולטרה-אפורים בקרן הייחוס ואת הקובט עם פפטיד בקרן הדגימה.
- אסוף את ספקטרום הספיגה של הפפטיד נטול המתכת (apo).
- הוסף כמות תת-סטויכיומטרית (0.5 שווה ערך, 150 μM) של תמיסת Cu(II) לתוך הקובט עם דגימת הפפטיד. ודא שנפח ה- Cu(II) שנוסף קטן מ- 3 μL ורשום את עוצמת הקול לניתוח מאוחר יותר.
- יש לטפטף בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב את התמיסה תוך הימנעות מיצירת בועות אוויר. תנו לתמיסה להגיב ולשווי משקל במשך 5 דקות ותעדו את ספקטרום הקליטה.
- חזור על הוספת Cu(II) aliquots כמו בשלב 1.2.6 לתמיסת הפפטיד עבור המקבילות הבאות: 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 ו- 5.0 (או בסך הכל 300, 450, 600, 900 ו- 1,500 μM). הקפד להקליט את הנפח הכולל של Cu(II) שנוסף ואת הנפח הכולל של ה- cuvette.
הערה: אם רצויה רזולוציה נוספת, הקטן את המרווח בין מקבילים. - הסר את cuvette לדוגמה ונקה ביסודיות בהתאם להוראות היצרן.
- מוסיפים את התמיסה החצויה ללא פפטיד ורושמים את ספקטרום הספיגה. חזור על התוספת של Cu(II) aliquots כמו בשלבים 1.2.5-1.2.8, תוך רישום ספקטרום הקליטה עבור כל Cu(II) שווה ערך.
- ייצא את כל הספקטרום כקבצי csv לעיבוד. נקו ביסודיות את הקובטות על פי הוראות היצרן והפעילו את הספקטרופוטומטר.
- עיבוד הנתונים
- טען את כל הספקטרום בתוכנית גיליון אלקטרוני.
- הפחת את ספקטרום ה-buffer-only (0 μM Cu(II)) מכל ספקטרום אחר כדי להסיר את כל תכונות הספיגה מהמאגר עצמו.
- נרמל כל ספקטרום כדי לקחת בחשבון את הדילול הנובע מהוספת פתרון Cu(II) (שלב 1.2.6). ראה את הקובץ המשלים, Eq (1)14 לקבלת דוגמה לנורמליזציה כאשרv ראשוני הוא הנפח (115 μL) של פפטיד שנוסף ל- cuvette, vCu(II) הוא נפח תמיסת Cu(II) שנוסף בשלב 1.2.6,וספקטרום מופחת של חיסור ב- Abs buffer הוא הנתונים המתקבלים בשלב 1.2.7.
- גרף את כל הספקטרום יחד כדי לזהות אזורים של שינוי.
הערה: רצועות d-d טיפוסיות ממתחמי Cu(II) נעות בין 500 ל-750 ננומטר. טיטרציה ספקטרופוטומטרית זו יכולה להיות מאתגרת בשל מקדם ההכחדה הקטן מפסים d-d, שהם מעברים אסורים של לאפורטה בגאומטריה אוקטהדרלית21. אם הספיגה חלשה מדי, גישה חלופית היא שימוש בליגנדות כרומופוריות שמביאות לפסים להעברת מטען עם קשירה ל-Cu(II) (ראו סעיף 2).
2. ספקטרוסקופיית ספיגה אלקטרונית: תחרות פפטידים עם ליגנד כרומופורית
- הכנה לדוגמה
- ממיסים 1,10-phenanthroline (phen) במים אולטרה-אפורים כדי לקבל ריכוז סופי של כ-1 mM.
- בנוסף להכנת הדגימה המתוארת בסעיף 1.1 עבור הפפטיד (שלב 1.1.2) ו- Cu(II) (שלב 1.1.3), הכן תמיסת 10 μM Cu(II) ו- 40 μM phen במאגר ([Cu(phen)3]2+). ודא שעוצמת הקול ממלאת את הקובט.
- הרצת הניסוי
- התחל את ספקטרופוטומטר הקליטה האלקטרוני כמו בשלבים 1.2.1 ו- 1.2.2 אך הגדר את טווח הסריקה ל- 200-400 ננומטר.
- בשני קובטים תואמים, טענו קובט אחד עם 115 μL של מים אולטרה-פורים ואת הקובט השני עם 115 μL של תמיסת [Cu(phen)3]2+ . מקם את הקובט עם מים בקרן הייחוס ואת הקובט עם תמיסת [Cu(phen)3]2+ בקרן הדגימה.
- לאסוף את ספקטרום הקליטה של קומפלקס מתכת-ליגנד.
- הוסף כמות סטויכיומטרית (≈1 שווה ערך, ≈10 מיקרומטר) של פפטיד לתמיסה [Cu(phen)3]2+ . פיפט בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב ביסודיות אך היזהרו לא להכניס בועות אוויר. רשום את נפח הפפטיד שנוסף לניתוח עתידי.
הערה: באמצעות cuvettes המכילים 115 μL, הוספת 3.83 μL של פפטיד 300 μM מניבה ריכוז פפטיד סופי של 9.7 μM. - לדגום את הפתרון במשך 5 דקות כדי להגיע לשיווי משקל. תעדו את ספקטרום הקליטה.
הערה: אם זיקת הקישור של המתכת-פפטיד והמתכת-ליגנד דומה, ריכוז הפפטיד שנוסף יצטרך להיות עודף גדול. הקפד לקחת בחשבון את הנפח הכולל של פפטיד נוסף לנורמליזציה. - חזור על הוספת אליקוטים פפטידיים לתמיסת [Cu(phen)3]2+ עבור המקבילות המשוערות הבאות: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 22 ו-26. רשום את נפח הפפטיד שנוסף כך שניתן יהיה לקבוע את הריכוז המדולל.
- הסר את הדגימה ונקה את הקובט ביסודיות על פי הוראות היצרן. אסוף ספקטרום של המאגר. אספו ספקטרום של פפטיד של 50 מיקרומטר במאגר.
- ייצא את כל הנתונים כקבצי csv לעיבוד וניקוי cuvettes בהתאם להוראות היצרן.
- עיבוד הנתונים
- טען את הספקטרום בתוכנית גיליון אלקטרוני והפחת את ספקטרום המאגר מהספקטרום האחר.
- נרמל את הספקטרום לאחר קובץ משלים, Eq (2)14.
- באמצעות מקדם ההכחדה עבור [Cu(phen)3]2+ ב-265 ננומטר (εמקסימום = 90,000 M-1 cm-1)22, קבע את הריכוז של [Cu(phen)3]2+ עם כל תוספת של הפפטיד.
- עבור כל תוספת של הפפטיד, קבעו את הריכוז של קומפלקס ה-Cu(II)-פפטיד על ידי הפחתת הריכוז הנותר של [Cu(phen)3]2+, כפי שנקבע בשלב 2.3.2, מהריכוז ההתחלתי של [Cu(phen)3]2+ (ב-0 μM פפטיד).
- חישוב הריכוז של ליגנד phen חופשי על ידי המשוואה בקובץ משלים, Eq (3)14.
- חשב את הריכוז של פפטיד חופשי באמצעות קובץ משלים, Eq (4)14, כאשר מלאי [פפטיד] מייצג את הפפטיד הלא מדולדל שצוטט לתוך הקובט, V1 מייצג את נפח הפפטיד המלאי שנוסף, V2 הוא הנפח הכולל של הקובט, ו-[Cu2+-peptide] נקבע בשלב 2.3.4.
- חשב את זיקת הכריכה הניסיונית (Kex) באמצעות Eq (5) בקובץ משלים23.
- לקשר את קבוע הדיסוציאציה של Cu(II)-פפטיד ל-Kex על ידי Eq (6)23 בקובץ משלים, כאשר Kd,Cu(II)-phen = 1.0 × 10-9 (ראה 22). לקבוע את הממוצע ואת סטיית התקן מכל קבועי הדיסוציאציה שנקבעו.
הערה: תחת יחס של 4:1 של phen:Cu(II), [Cu(phen)3]2+, [Cu(phen)2]2+, ו-[Cu(phen)]2+ קיימים בתמיסה, והפפטיד ירחיק את Cu(II) מהמין ([Cu(phen)]2+) עם הקשירה החלשה ביותר22.
3. קלורימטריה של טיטרציה איזותרמית
- הכנה לדוגמה
- הכינו תמיסה חוצצת של 15 mM 3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS) ב-pH 7.4 באמצעות מים אולטרה-פוריים (>18 MΩ התנגדות). הסר את יוני המתכת של עקבות על ידי דגירה עם שרף בעל זיקה גבוהה למשך 2 שעות לפחות עם סינון ואקום עוקב דרך ממברנה של 0.45 מיקרומטר עם 0.45 מיקרומטר.
- להמיס מסה ידועה של CuCl2 במים אולטרה-אפורים כדי להכין תמיסה של ≈50-100 mM. דיללו את תמיסת ה-Cu(II) הזו למאגר כדי לקבל תמיסת 1.0 מ"ל עם ריכוז סופי של 1.4 mM Cu(II). הקלט את הנפח המדויק של פתרון CuCl2 שבו נעשה שימוש.
- ממיסים או מדללים את התמיסה הפפטידית במאגר כדי ליצור 450 μL של תמיסת פפטיד של 154 μM. ודא כי אותו שיעור של מים אולטרה-פורים נוספים משלב 3.1.2 מתווסף לתמיסת הפפטיד, אשר תפחית את חום הדילול ותגביר את האות לרעש.
- לאחר הכנת הדגימות, ודא כי הפתרונות הם באותו pH, ואם יש צורך, להתאים בהתאם.
- שלב אופציונלי: Degas את הפתרונות כדי למזער microbubbles שנטען לתוך ITC.
- הרצת הניסוי
- הפעל את ה- ITC. הפעל את תוכנת ITC להפעלת המכשיר. המתן לאתחול הראשון, אשר יבקש לאכלס מחדש את הבור; לאחר מכן, בצע את ההוראות המופיעות על המסך.
- הסר את הכריכה מתא הייחוס. מוציאים מים מתא הייחוס ושוטפים שלוש פעמים ב-450 μL של מים אולטרה-פוריים שעברו גז.
- לאט לאט משכו מים אולטרה-פוריים אל סימן ה-450 μL של מזרק טעינה, תוך הקפדה שלא להכניס בועות אוויר למזרק. הכנס את מזרק הטעינה לתא הייחוס עד שהוא ≈1 מ"מ מלמטה, ולאט לאט הזריק חלק מהתמיסה עד שיישאר 150 μL במזרק הטעינה. הזז את בוכנת מזרק ההעמסה במהירות למעלה ולמטה על ידי ≈25 μL מספר פעמים כדי לעקור את כל הבועות על פני התא. מזריקים באיטיות עד שהבוכנה מגיעה לסימן 100 μL על מזרק ההעמסה, ובכך מחלקים סך של 350 μL של מים אולטרה-פוריים לתוך תא הייחוס, ומחליפים את כיסוי תא הייחוס.
- הסר כל תמיסה שיורית מתא הדגימה והעמיס עם 450 μL של 10 mM חומצה אתילנדיאמינט-אצטית (EDTA) באמצעות מזרק טעינה. השרו במשך 10 דקות כדי להבטיח שיוני מתכת עקבות יוסרו מכיוון שה-EDTA יקשר מתכות עקבות.
- הסירו את תמיסת ה-EDTA (עם יוני מתכת קשורים) ושטפו היטב את מזרק ההעמסה בכמויות אדירות של מים אולטרה-פוריים.
- נקו את ה-ITC בהתאם להוראות היצרן, ושטפו את תא הדגימה במים אולטרה-אפורים.
- התנו את תא הדגימה על ידי שטיפה ב-450 μL של מאגר לפחות שלוש פעמים.
- הסר את המאגר המתנה את תא הדגימה. טען את תמיסת הפפטיד לתא הדגימה באמצעות מזרק הטעינה (בצע את שלב 3.2.3).
- יש לשטוף את מזרק הטיטרציה ב-200 μL של תמיסה חוצצת. לשם כך, הסירו את הבוכנה והשתמשו במיקרופיפט כדי לטפטף את החיץ דרך החור שבראש מזרק הזכוכית, דרך המזרק, והחוצה את המחט שמתחת.
- הכניסו את הבוכנה במלואה למזרק הטיטרציה.
- טובלים את קצה מחט מזרק הטיטרציה בתמיסת המתכת ומושכים באיטיות את הבוכנה למעלה, מה שגורם לתמיסת המתכת למלא את המזרק ולגרום לנפח ריק בחלק העליון של חלק הזכוכית של מזרק הטיטרציה. הסר את רוב נפח הריק על ידי סיבוב מזרק הטיטרציה במקביל לרצפה, הסר את הבוכנה והטה מעט את חלק הזכוכית לכיוון הרצפה. תנו למזרק הטיטרציה ניעור עדין כך שהתמיסה תנוע לקצה חלק הזכוכית של מזרק הטיטרציה ותמלא את רוב נפח הריק, אך הבטיחו שיישארו 2-3 μL של נפח ריק. תוך שמירה על המזרק מקביל לרצפה, הכניסו מחדש את הבוכנה.
- החזיקו את מזרק הטיטרציה זקוף, טבלו את קצה המחט בחזרה לתוך תמיסת המתכת ודחפו את הבוכנה כלפי מטה עד שהאוויר מפסיק לצאת מהמחט. טען את מזרק הטיטרציה על ידי משיכת הבוכנה באיטיות עד קצת מעל סימן 50 μL תוך שמירה על קצה המחט בתמיסה.
- מכניסים בזהירות את חלק הזכוכית של מזרק הטיטרציה לתוך הבור ומבריגים עד שהם צמודים לאצבעות. כאשר כמות קטנה של תמיסה יוצאת ממזרק הטיטרציה עקב דחיסת הבוכנה, השתמש במגב עדין וקליל כדי לספוג בזהירות את התמיסה מבלי לגעת בקצה המחט.
- מכניסים את הבור עם מזרק טיטרציה לתא הדגימה ומהדקים אותו היטב.
- הגדר את הפרמטרים בתוכנת ITC. החל מ-Instrument Control, קבעו את קצב הערבוב (קצבי הערבוב האופייניים נעים בין 150 ל-350 סל"ד) ואת הטמפרטורה שבה ייערך הניסוי (בדרך כלל 25 מעלות צלזיוס). הזן את המזרק ואת ריכוזי התאים ביחידות מילימולריות תחת פרטי הניסוי.
- במקטע שיטת הניסוי , בחר טיטרציה מצטברת. לחץ על הגדרה וציין 20 זריקות של 2.5 μL. אם נדרשת רזולוציה רבה יותר כדי לצפות באירוע הקשירה, הגדל את מספר הזריקות והקטן את הנפח לזריקה. הזן את מרווח הזמן בין כל הזרקה כך שיהיה ארוך מספיק כדי שהאות ישווי המשקל ויחזור לנקודת ההתחלה, בדרך כלל 300 שניות.
- לחץ על לחצן ההפעלה כדי להתחיל את הניסוי וציין היכן נשמרים הנתונים.
- עם סיום הניסוי, נקו את תא הדגימה ואת מזרק הטיטרציה.
- הפעל את כל הניסויים לפחות במשולש כדי להבטיח איסוף נתונים מדויק.
- ערכו ניסוי בקרה שבו תמיסת המתכת נזרקת לתמיסה החצויה (בהיעדר פפטיד) כדי להבטיח שחום הדילול מיוני המתכת הוא קטן ושאין שיווי משקל בלתי מוסבר. אם חום הדילול גדול, שקול מערכת חיץ אחרת, במידת האפשר.
- עיבוד הנתונים
- הפעל את תוכנת הניתוח של ITC וטען את קובץ הנתונים לניתוח.
- נווט לכרטיסיה 'בסיס בסיס ' ובדוק את התרמוגרמה. שימו לב שכל חום אקסוגני התפתח או נספג מבועות אוויר או מממצאים אחרים בתרמוגרמה. חפשו קוצים שאינם נובעים מהזרקה של תמיסת המתכת.
- ודא שהבסיס שנוצר על-ידי תוכנת הניתוח עוקב אחר החלק של הנתונים לאחר ההזרקה ושיווי המשקל. אם הוא חורג, השתמש בנקודות ציר בסיסיות כדי להתאים את קו הבסיס. ודא שאזורי האינטגרציה כוללים את השיא שנוצר מהזרקת המתכת, אך חוסמים בועות אוויר או ממצאים בתרמוגרמה שנמצאו בשלב 2. הפחת את קו הבסיס מהתרמוגרמה.
הערה: סוג זה של מניפולציה מומלץ רק לאחר איסוף תרמוגרמות מרובות, כך שהנסיין יודע מהם נתונים אמיתיים ומהו חפץ, שכן התאמת קווי הבסיס ואזורי האינטגרציה עשויה להשפיע באופן דרסטי על הנתונים. - נווט אל חלון המידול כדי להתחיל להתאים את הנתונים שבהם תוכנת הניתוח תציג את הנתונים המשולבים והמנורמלים בריכוז עבור כל זריקה.
- לחץ לחיצה שמאלית על הנתון של הזריקה הראשונה כדי להסיר אותה מאלגוריתם ההתאמה.
הערה: זה נפוץ מכיוון שיהיה ערבוב קל בין תמיסת התא הטיטרנטית לתמיסת התא לדוגמה המובילה לחלוקה טוחנת לא מדויקת של ההזרקה הראשונה. - במקטע מודלים , בחר ריק (קבוע) בתפריט הנפתח Style , המבוסס על אנתלפיית ההזרקה הסופית ויופחת מכל נקודת נתונים, תוך התחשבות בחום הדילול. בנוסף, בחר עצמאי (או את הדגם הטוב ביותר עבור המערכת) בתפריט הנפתח השני של סגנון כדי להתאים את הנתונים.
הערה: עבור אינטראקציות איגוד סטנדרטיות של 1:1, המודל הנפוץ ביותר הוא עצמאי. - התאם את הנתונים באמצעות שני הדגמים על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה הירוק עם Σ.
הערה: תוכנה נוספת לעיבוד נתוני ITC היא SEDPHAT24. - קח בחשבון את כל שיווי המשקל המתחרה בניתוח פוסט הוק שדווח בעבר על ידי Grossoehme et al. 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המטרה הייתה לכמת ולאשש את התרמודינמיקה של Cu(II) הנקשרת ל-C-פפטיד באמצעות הטכניקות המשלימות של ספקטרוסקופיית קליטה אלקטרונית ו-ITC. בשל האופי החזק של ספקטרוסקופיית קליטה אלקטרונית, בוצע טיטרציה ישירה של Cu(II) ל-300 μM C-peptide (איור 1). תוספת של 150 μM של Cu(II) גרמה לעלייה מיידית בפס ב-600 ננומטר, המיוחסת לפס d-d של Cu(II), והמשיכה לגדול עד להוספת 300 μM Cu(II). תוספת נוספת מעל 300 μM Cu(II) לא הגבירה את הספיגה של רצועת d-d, מה שמעיד על רוויה וכי Cu(II) נקשר ל-C-פפטיד בקומפלקס של 1:1. יתר על כן, בשל הזיקה הגבוהה יחסית של ביס-טריס לקשירת Cu(II) (log K = 5.27)16, זיקת ה-Cu(II)/C-פפטיד צריכה להיות בעלת גבול תחתון בטווח המיקרומולרי (log K > 6) כדי להרחיק את יון המתכת מהמאגר. במערכת זו, כימות מדויק של רצועות הספיגה הוא מאתגר בשל מקדם ההכחדה הקטן.
כדי לעקוף את מקדם ההכחדה הקטן של רצועת ה-d-d, נעשה שימוש בליגנד כרומופורית, phen, כמתואר לעיל. C-פפטיד הוכנס ל-≈10 μM [Cu(phen)3]2+ (איור 2A), והספיגה מרצועת העברת המטען ב-265 ננומטר פחתה (איור 2B), מה שמצביע על כך ש-C-פפטיד היה מסוגל לחלץ Cu(II) מליגנדת הפן. לאחר בדיקה מדוקדקת יותר, היה צורך בריכוז גדול של C-פפטיד (עד 140 μM) כדי לגבור באופן צנוע על ליגנד הפן (טבלה 1). זה לא מפתיע בהתחשב בקבועי ההיווצרות הרציפה הגדולים עבור [Cu(phen)3]2+ (9.0, 15.7 ו- 20.8 עבור לוג K1, β2 ו- β3, בהתאמה)22. ניתוח הספקטרום מראה כי זיקת הקישור של Cu(II)/C-פפטיד נמצאת בטווח של לוג K = 7.4-7.8 (טבלה 1).
תקן הזהב של מדידת התרמודינמיקה השלמה של אינטראקציה מחייבת הוא ITC. איור 3 מספק תרמוגרמה מייצגת של Cu(II) המוצמדת ל-C-פפטיד ב-15 mM MOPS, pH 7.4, המספקת את התחרות על ה-Cu(II). כאן, נעשה שימוש במאגר MOPS במקום במאגר bis-Tris מכיוון ש- K Cu(II)-MOPS < KCu(II)-bis-Tris16,25, ויספק פחות תחרות כך שה- ITC יוכל למדוד במדויק את הזיקה (ראה דיון). באמצעות מדידת החום הנצרך או התפתח בין כל שיווי המשקל, התרמוגרמה מספקת צורה סיגמואידלית. הזרקות ראשוניות של Cu(II) לפני שהפפטיד רווי גורמות לכמויות גדולות של חום בהשוואה לחום הדילול. ההבדל בערכים אלה של חום הם ΔHITC. נקודת הניפוח מתארת שתי פיסות מידע שימושיות. הראשון הוא הסטויכיומטריה המחייבת של המין במזרק בהשוואה למינים בתא (כלומר, Cu(II):C-פפטיד הוא 1:1). שנית, שיפוע ההתאמה בנקודת הניפוח הוא ביחס ישר ל-KITC. לאחר איסוף נתונים במאגרים משולשים ובמאגרים מרובים, בוצע ניתוח פוסט-הוק20 שבו נלקחים בחשבון כל שיווי המשקל המתחרה (טבלה 2), ונקבעת התרמודינמיקה הבלתי תלויה במאגר. עבור Cu(II) קושר ל-C-פפטיד, KCu(II)/C-פפטיד = 1 (± 1) x 108 ו- ΔHCu(II)/C-פפטיד = -8 (± 4) kJ mol-1. מתוך אלה, פרמטרים תרמודינמיים מקשרים אחרים נקבעים כאשר ΔG°Cu(II)/C-פפטיד = -46 (± 4) kJ mol-1 ו- ΔSCu(II)/C-פפטיד = 120 (± 10) J mol-1 K-1 (ראה 15).
איור 1: ניטור של רצועת ה-D-d Cu(II) עם תוספת של 150, 300, 450, 600, 900, 900 ו-1,500 μM Cu(II) ל-300 μM C-פפטיד ב-50 mM bis-Tris, pH 7.4. רצועת ה-d-d של Cu(II) גדלה ב-600 ננומטר עד שנוצר קומפלקס Cu(II):C-פפטידי של 1:1. בעבר, מגיאר וגודווין דיווחו כי Cu(II)-bis-Tris זיקה היא לוג K = 5.2716. טיטרציה זו מראה כי C-פפטיד יכול לגבור על המאגר כדי לקשור את Cu(II) ומציין זיקה של Cu(II)/C-פפטיד בתחום המיקרומולרי. נתון זה נדפס מחדש באישורם של Stevenson et al.14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: היווצרות של [Cu(phen)3]2+ וספקטרום ספיגה אלקטרוני מייצג המנטר את הירידה של רצועת העברת המטען עם הוספת C-פפטיד. (A) ערכת התגובה המציגה את היווצרותו של [Cu(phen)3]2+ ואת רצועת העברת המטען שלה שמרכזה 265 ננומטר (ε° ≈ 90,000 M-1 cm-1)22. קבועי ההיווצרות הם 9.0, 15.7 ו-20.8 עבור לוג K1, β2 ו-β3, בהתאמה22. (B) ספקטרום ספיגה אלקטרונית מייצגת המנטרת את הירידה של רצועת העברת המטען מ-[Cu(phen)3]2+ כ-C-פפטיד כלאטים Cu(II). הטיטרציה נערכה ב-50 mM bis-Tris, pH 7.4. ניתוח הנתונים מוצג בטבלה 1. נתון זה נדפס מחדש באישורם של Stevenson et al.14. קיצור: MLCT = העברת מטען ממתכת לליגנד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: תרמוגרמות מייצגות של Cu(II) המוצמדות ל-C-פפטיד ומאגר. (A) תרמוגרמה מייצגת זו מראה את הטיטרציה של 1.4 mM Cu(II) לתוך 154 μM C-פפטיד ב-15 mM MOPS, pH 7.4. הנתונים מתאימים למודל של אתר אחד עם הפרמטרים הבאים: n = 1.2 ± 0.1; Kd,ITC = 6 (± 3) x 10-7; ΔHITC = −3.4 ± 0.2 kJ mol-1. (B) טיטרציה של בקרה מייצגת של 1.4 mM Cu(II) לתוך 15 mM MOPS, pH 7.4, בהיעדר C-פפטיד שאינו מראה תרמוגרמה מקשרת שנראית בלוח A. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| [C-פפטיד] | א265 | [Cu(phen)3] 2+ | [פן] חינם | [C-פפטיד] חינם | [Cu(II)/C-פפטיד] | Kex (x108) | KdCu(II)/C-פפטיד | log KdCu(II)/C-פפטיד | |
| 0.0 | 1.0649 | 11.83 | 4.5 | 0 | 0.00 | ND | ND | ND | |
| 9.7 | 0.9948 | 11.05 | 6.84 | 7.45 | 0.78 | 0.0543 | 1.84E-08 | 7.75 | |
| 18.7 | 0.9785 | 10.87 | 7.38 | 16.00 | 0.96 | 0.0367 | 2.73E-08 | 7.56 | |
| 27.3 | 0.9651 | 10.72 | 7.83 | 24.09 | 1.11 | 0.0310 | 3.23E-08 | 7.49 | |
| 35.3 | 0.9475 | 10.53 | 8.42 | 31.55 | 1.30 | 0.0307 | 3.26E-08 | 7.49 | |
| 42.8 | 0.9374 | 10.42 | 8.75 | 38.79 | 1.42 | 0.0288 | 3.48E-08 | 7.46 | |
| 50.0 | 0.9283 | 10.31 | 9.06 | 45.64 | 1.52 | 0.0275 | 3.63E-08 | 7.44 | |
| 56.7 | 0.9134 | 10.15 | 9.55 | 51.92 | 1.68 | 0.0288 | 3.47E-08 | 7.46 | |
| 63.1 | 0.9025 | 10.03 | 9.92 | 57.97 | 1.81 | 0.0291 | 3.43E-08 | 7.46 | |
| 69.2 | 0.8927 | 9.92 | 10.24 | 63.73 | 1.91 | 0.0294 | 3.40E-08 | 7.47 | |
| 75.0 | 0.878 | 9.76 | 10.73 | 69.04 | 2.08 | 0.0314 | 3.19E-08 | 7.50 | |
| 85.7 | 0.8542 | 9.49 | 11.53 | 78.99 | 2.34 | 0.0341 | 2.93E-08 | 7.53 | |
| 95.4 | 0.8316 | 9.24 | 12.28 | 88.01 | 2.59 | 0.0371 | 2.69E-08 | 7.57 | |
| 104.3 | 0.8151 | 9.06 | 12.83 | 96.38 | 2.78 | 0.0387 | 2.58E-08 | 7.59 | |
| 112.4 | 0.7976 | 8.86 | 13.41 | 103.98 | 2.97 | 0.0411 | 2.44E-08 | 7.61 | |
| 126.9 | 0.7809 | 8.68 | 13.97 | 117.87 | 3.16 | 0.0411 | 2.44E-08 | 7.61 | |
| 139.2 | 0.7586 | 8.43 | 14.71 | 129.53 | 3.40 | 0.0437 | 2.29E-08 | 7.64 | |
| טווח | 7.4-7.8 | ||||||||
טבלה 1: חישובים מייצגים לריכוזי המינים בתמיסה מתוך איור 2B. כל הריכוזים הם במיקרומולר. טבלה זו נדפסה מחדש באישור Stevenson et al.14.
| אקווליבריה | n | ΔH (kJ mol-1) | n × ΔH (kJ mol-1) |
| Cu(II)-MOPS → Cu(II) + MOPS | 1 | 5.4 | 5.44 |
| MOPS + H+ → MOPS-H+ | 0.097 | −21.0 | −2.04 |
| Cu(II) + C-פפטיד-H+ → Cu(II)/C-פפטיד + H+ | 1 | X | X |
| ΔHITC = Χ + 3.40 | |||
| Χ = ΔHITC − 3.40 | |||
| Χ = ΔHCu(II)/C-פפטיד = −6.8 kJ mol-1 |
טבלה 2: ניתוח לאחר הוק לקביעת ΔHCu(II)/C-פפטיד. כפי שניתן לראות באיור 3,1.4 mM Cu(II) צומצם ל-154 μM C-פפטיד ב-15 mM MOPS, pH 7.4, במשולש. לאחר התחשבות בכל שיווי המשקל המתחרה המוצג בטבלה, נמצא כי ΔHCu(II)/C-פפטיד הוא −8.66 kJ mol-1. מספר הפרוטונים שנעקרו מ-C-פפטיד על-ידי Cu(II) נקבע מהשיפוע של (ΔHITC + ΔHCu(II)-Buffer) לעומת ΔHBuffer-H שבו הנתונים נאספים במאגרים מרובים. כל ערכי האנתלפיה נמצאים ב-NIST25 או נקבעים במקום אחר בספרות15. כל שיווי המשקל המתחרה נלקחים בחשבון כפי שתואר על ידי Grossoehme et al.20 נתון זה נדפס מחדש באישור Stevenson et al.15.
קובץ משלים: משוואות רלוונטיות המשמשות בסעיף הפרוטוקול ופרמטרים נוספים עבור ספקטרופוטומטר קליטה אלקטרוני והגדרת ITC. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מספק שיטה חזקה לכימות הזיקה והתרמודינמיקה של Cu(II) הקשורה לפפטידים. קומפלקסים עם Cu(II) מתאימים באופן אידיאלי לניטור רצועת הקליטה d-d באתר המתכת בשל תצורת האלקטרונים d9 שלה. אף על פי שמקדם ההכחדה הוא קטן, ולכן דורש ריכוזים גדולים יותר של הקומפלקס כדי להניב אות אמין, טיטרציות של Cu(II) לפפטיד יכולות לספק במהירות תובנה לגבי הסטויכיומטריה הקושרת וזיקת הקישור המשוערת. עם זאת, זה יכול להיות מאתגר להבחין בהבדל בספקטרום אם המתכת מתואמת על ידי אטומים וגיאומטריות דומים הן ממאגר והן מפפטיד. כדי לקבוע את זיקת הקישור באופן כמותי, ליגנדות כרומופוריות כגון phen משמשות לעתים קרובות בשל העברות המטען המותרות על ידי הסימטריה שלהן עם יוני מתכת21. באמצעות יצירת תחרות בין ליגנד כרומופורי לפפטיד לא כרומופורי ועל ידי הכרת הזיקה של המתכת לליגנד, ניתן לקבוע באופן ישיר את הזיקה המתכתית-פפטידית. ניתוח תרמודינמי נוסף באמצעות ספקטרוסקופיית ספיגה אלקטרונית הוא מאתגר. כדי לכמת את האנתלפיה המחייבת באמצעות טכניקה כגון ספקטרוסקופיית UV-Vis, יש לקבוע את זיקת הקישור בטמפרטורות מרובות ולבצע ניתוח van't Hoff. ניתוח זה מניח כי החום הספציפי של הכריכה הוא אפס, דבר שהוא לעתים רחוקות נכון ולכן מספק רק הערכה של אנתלפיית הכריכה20.
קלורימטריה של טיטרציה איזותרמית מתאימה יותר להבהרת סקירה מלאה יותר של התרמודינמיקה של אינטראקציות מתכת-פפטיד. בטכניקה זו, יון מתכת נזרק לתוך תמיסת הפפטיד והחום של שיווי משקל שונים נמדד ישירות. מכיוון שהניסוי נערך בלחץ קבוע, החום שנמדד על ידי ה-ITC שווה לאנתלפיה. ITC יכול להתגבר על חלק מהמגבלות של ספקטרוסקופיית ספיגה אלקטרונית, כגון חקר יוני מתכת שקטים באופן ספקטרוסקופי ולא צריך להניח את ההנחות כפי שנעשה בניתוח van't Hoff. עם זאת, לפעמים, התגובות המתרחשות ב- ITC מייצרות מעט מאוד חום ולכן אינן נצפות. ניתן לעקוף זאת באמצעות ריכוזים הולכים וגדלים של מתכת ופפטיד או באמצעות חיץ אחר עם אנתלפיה שונה של פרוטונציה. זה האחרון שימושי במיוחד אם יון המתכת מזיז פרוטונים מרובים עם היקשרותו לפפטיד. עם זאת, שתי הטכניקות -- ITC וספקטרוסקופיית ספיגה אלקטרונית -- מספקות שיטות אורתוגונליות לחקור את אותה מערכת ולהשלים זו את זו היטב.
ישנם היבטים מאתגרים רבים בשתי הטכניקות כאשר חוקרים יוני מתכת הנקשרים לפפטידים. יוני מתכת רבים אינם מסיסים או מסיסים במשורה במים. זה מחריף עוד יותר על ידי משקעים של יון המתכת כאשר מוסיפים אותם לחיץ. ב- ITC, זה יכול לבוא לידי ביטוי על ידי שינוי איטי והדרגתי בקו הבסיס וכמויות גדולות של חום שנוצר כאשר המתכת מוזרקת. זה מעיד על ערכים גדולים של חום הדילול גם לאחר שהפפטיד יהיה רווי ביון מתכת. בספקטרוסקופיית קליטה אלקטרונית, משקעי יוני מתכת מתבטאים בקליטה מוגברת באורכי גל נמוכים יותר ודומים לשיא רחב המרוכז באזור UV. בשתי הטכניקות, על הנסיין לוודא כי יון המתכת מסיס בתנאי בחירה (למשל, חיץ, pH, טמפרטורה, ריכוז). מגבלה נוספת לשתי השיטות יכולה להראות את עצמה באמצעות הרעיון של סדר הוספה. במקרים מסוימים, קומפלקס מתכתי אחד שנוצר עשוי להיות מבויש, בעוד שהוספת אותם ריאגנטים בסדר שונה תהפוך מין ביניים אחר לאינרטי. המחשה זו של שליטה קינטית לעומת תרמודינמית מעכבת ניתוח מדויק של כל שיווי המשקל המתחרה.
הן ITC והן ספקטרוסקופיית הקליטה האלקטרונית מסתמכות על תחרות בין הפפטיד לבין חיץ או ליגנד על קשירת יון המתכת. כאן, ערך c מוצג, אשר מסייע לזהות אם KITC ניתן לקבוע במדויק על ידי האלגוריתם המתאים. ערך c מוגדר בקובץ משלים, Eq (7)20, כאשר n הוא סטויכיומטריה, KITC הוא הזיקה המחייבת לכאורה, ו[תא הדגימה] הוא ריכוז המינים בתא הדגימה. כאשר ערך c הוא בין 1 ל- 1,000, ה- KITC שנקבע מדויק. עם זאת, ערכי c מתחת ל- 1 עשויים לספק רק גבול עליון ל- KITC, בעוד שערכי c מעל 1,000 עשויים לספק רק גבול תחתון20. זהו הערך של איסוף נתונים מטכניקות משלימות: אם משהו מתפספס בטכניקה אחת בשל מגבלותיו, הוא עלול להיתפס בטכניקה המשלימה שלו. בניסויים אלה, אם התחרות עדיפה מאוד על מין אחד (כלומר, זיקת יון המתכת של הפפטיד גדולה בהרבה מהזיקה של החיץ), שיווי המשקל ישתנה, מה שיקשה על פענוח. זה מוצג גם בפירוט על ידי Kocyla et al.23. כדי לעקוף את האתגר הזה, הקדמה או החלפה של ליגנד מתחרה אחר, או בחירת מאגר אחר משמשים לעתים קרובות כדי להגביר את התחרות בין ליגנד לפפטיד לכימות מדויק. הסיבה לכך היא שההבדל בין חיץ מתכת (או מתכת-ליגנד) לבין זיקות מתכת-פפטידיות יאפשר לערך c ליפול בתוך החלון של 1 עד 1,000. יש לציין, עם זאת, כי השימוש בליגנד מתחרה או במאגר אחר לניתוח כמותי דורש שהפרמטרים התרמודינמיים של קומפלקס המתכת-ליגנד או קומפלקס המתכת-חיץ ידועים או יכולים להיקבע באמצעים אחרים.
לבסוף, כימות מדויק של ריכוז הפפטידים יכול להיות מאתגר. כמה דרכים נפוצות לכמת ריכוזי פפטידים הן למדוד חומצות אמינו ספציפיות ולקשר את כמות חומצות האמינו הללו לרצף של הפפטיד. לדוגמה, ספקטרוסקופיה של ספיגה אלקטרונית יכולה למדוד שאריות ארומטיות כמו טירוזין, המגיב של אלמן יכול לכמת את מספר התיולים החופשיים26, ומבחני ברדפורד מספקים אינדיקציה לכמה שאריות קיימות27. למרבה הצער, לפפטידים כמו זה ששימש במחקר זה אין שאריות ארומטיות או תיולים חופשיים, ומבחני ברדפורד מציבים אתגרים כאשר משווים את הסטנדרטים של חלבונים מסיביים עם הפפטיד הקטן שמעניין אותו. במקום זאת, ריכוז הפפטיד נקבע על ידי מסה יבשה. אף על פי שאינם אידיאליים ונוטים לריכוזים שהם הערכות יתר קלות של ריכוז הפפטידים (מכיוון שמדידות המסה לכאורה ככל הנראה גבוהות יותר ממסות הפפטידים בפועל בשל נוכחותם של מלחים), כל האליקוטים למדידה טופלו באופן זהה, מה שמאפשר השוואות מדויקות יותר. במחקרים הספקטרוסקופיים, אם ריכוז הפפטיד החופשי נמוך מהצפוי, זיקת הקישור המחושבת מייצגת גבול תחתון (קובץ משלים, Eq (5) ו- Eq (6)). ישנם אתגרים הקשורים לשתי הטכניקות המוצגות, אך עם הספרות כמדריך, ניתן להתגבר על רבים מהם.
הגישה הניסויית המפורטת כאן מאפשרת כימות מדויק של תרמודינמיקה קושרת מתכות-פפטידים. הן ITC והן ספקטרוסקופיית ספיגה אלקטרונית הן אורתוגונליות ומספקות תובנה לגבי זיקת הקישור, אך ITC מאפשר כימות אנתלפיה ישיר. לאחר כימות התרמודינמיקה הזו, ניתן להסיק אם קומפלקסים אלה של מתכות-פפטידים יכולים להיווצר בתנאים פיזיולוגיים. ככל שההבנה של שטף יונים פיזיולוגי של מתכות גדלה, ניתן לחזות אם הזיקה המחייבת חזקה מספיק להיווצרות מורכבת in vivo . יתר על כן, החוקר יכול לבצע תחזיות לגבי תחרויות בין מספר יוני מתכת עבור אותו פפטיד או מספר פפטידים עבור אותו יון מתכתי. בהסתכלות על תחרויות אלה בין יונים מתכתיים לפפטידים, החוקר יכול להתחיל להבין מה תורם לזיקת הקישור של קומפלקס המתכת-פפטיד על ידי ניתוח האנרגיה החופשית לתרומות של אנתלפיה ואנטרופיה. תרמודינמיקה היא חלק בלתי נפרד מהערכת יחסי הגומלין הדינמיים בין יוני מתכת לפפטידים, ו-ITC וספקטרוסקופיית הקליטה האלקטרונית מספקות ידיות לחקירת מערכות אלה. ניתן להרחיב את השיטות המתוארות כאן ולהשתמש בהן כדי לחקור אינטראקציות אחרות של קשירת יוני מתכת עם מקרומולקולות, ועשויות להיות להן השלכות על תהליכים פיזיולוגיים, תכנון תרופות ועוד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
SC מודה למלגת מחקר הקיץ של וייטהד. MJS מודה לקרנות הסטארט-אפ ולקרן לפיתוח הפקולטה באוניברסיטת סן פרנסיסקו. MCH מכיר במימון מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH MIRA 5R35GM133684-02) ומהקרן הלאומית למדע (NSF CAREER 2048265).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,10-phenanthroline | Sigma Aldrich | 131377-25G | |
| bis-Tris buffer | Fisher | BP301-100 | |
| Bottle-top 0.45 micron membrane | Nalgene | 296-4545 | Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable |
| Copper(II) chloride | Alfa Aesar | 12458 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-500G | |
| Electronic absorption spectrophotometer | Varian | Cary 5000 | Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable |
| high affinity resin | Sigma Aldrich | C7901-25G | |
| Isothermal titration calorimeter (ITC) | TA Instruments | Nano ITC Low Volume | |
| ITC analysis software | TA Instruments | NanoAnalyze | SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used |
| ITC software | TA Instruments | ITCRun | |
| light-duty delicate wiper | Kimwipe | 34155 | |
| loading syringe | Hamilton | Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL | |
| matched cuvettes | Starna Cells, Inc | 16.100-Q-10/Z20 | Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer |
| MOPS buffer | Alfa Aesar | A12914 | |
| spectrophotometer software | Cary | WinUV Scan | |
| spreadsheet program | Microsoft | Excel | Any suitable spreadsheet program will work |
| titration syringe | TA Instruments | 5346 | |
| ultrapure water | Millipore Sigma | Milli-Q | Any water is okay as long as >18 MΩ resistance |
References
- Waldron, K. J., Robinson, N. J. How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal. Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).
- Puig, S., Thiele, D. J. Molecular mechanisms of copper uptake and distribution. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).
- Huffman, D. L., O'Halloran, T. V. Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins. Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).
- Kaplan, J. H., Lutsenko, S. Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs. Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).
- Makowska, J., et al. Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the Aβ (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations. Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).
- Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. 1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides. Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).
- García, J. E., et al. Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106−115: evaluating the role of protons and methionine residues. Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).
- Jakab, N. I., et al. Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy. Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).
- Keltner, Z., et al. Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants. Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).
- Whittal, R. M., et al. a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry. Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).
- Żamojć, K., et al. A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).
- Beuning, C. N., et al. Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-β complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching. Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).
- Makowska, J., Żamojć, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzyński, L. Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus. Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).
- Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization. ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).
- Stevenson, M. J., et al. Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity. Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).
- Magyar, J. S., Godwin, H. A. Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects. Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).
- Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. (Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions - a review. RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).
- Sigel, H., Martin, R. B. Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands. Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).
- Liu, J., et al. Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers. Chemical Reviews. 114 (8), 4366 (2014).
- Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).
- Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. Inorganic Chemistry. , Pearson. (2014).
- Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system. Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).
- Kocyła, A., Pomorski, A., Krężel, A. Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications. Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).
- Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions. Methods. 76, 137-148 (2015).
- NIST. Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).
- Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4′-dithiodipyridine. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
