Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

क्रोमोफोरस की उपस्थिति और अनुपस्थिति में सीयू (द्वितीय) और पेप्टाइड अवशेषों के बीच बाध्यकारी इंटरैक्शन की मात्रा निर्धारित करना

Published: April 5, 2022 doi: 10.3791/63668
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Chemistry, University of San Francisco, 2Department of Chemistry, University of California, Davis

Summary

यह लेख इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी और आइसोथर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री के उपयोग पर केंद्रित है ताकि पेप्टाइड्स और प्रोटीन के लिए बाध्यकारी सीयू (द्वितीय) के थर्मोडायनामिक्स की जांच और मात्रा निर्धारित की जा सके।

Abstract

कॉपर (II) जैविक प्रणालियों में एक आवश्यक धातु है, जो बायोमोलेक्यूल्स को अद्वितीय रासायनिक गुण प्रदान करता है जिसके साथ यह बातचीत करता है। यह सीधे विभिन्न पेप्टाइड्स से बांधने और मध्यस्थसंरचना से लेकर इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण गुणों से लेकर उत्प्रेरक कार्य प्रदान करने तक आवश्यक और रोग संबंधी भूमिकाएं निभाने की सूचना दी गई है। इन सीयू (द्वितीय) -पेप्टाइड परिसरों के बाध्यकारी आत्मीयता और थर्मोडायनामिक्स को मापने से बाध्यकारी ड्राइविंग बल, पेप्टाइड के लिए विभिन्न धातु आयनों के बीच या सीयू (द्वितीय) के लिए विभिन्न पेप्टाइड्स के बीच संभावित प्रतियोगिताओं और विवो में क्यू (द्वितीय) -पेप्टाइड कॉम्प्लेक्स की व्यापकता में अंतर्दृष्टि प्रदान की जाती है। हालांकि, बाध्यकारी थर्मोडायनामिक्स को परिमाणित करना असंख्य कारकों के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है, जिसमें अनुमापन प्रयोग के भीतर सभी प्रतिस्पर्धी संतुलन के लिए लेखांकन शामिल है, खासकर उन मामलों में जहां पेप्टाइड, डी-ब्लॉक धातु आयन और उनकी बातचीत का प्रतिनिधित्व करने वाले असतत स्पेक्ट्रोस्कोपिक हैंडल की कमी है।

यहां, क्यू (द्वितीय) -पेप्टाइड थर्मोडायनामिक्स के सटीक परिमाणीकरण के लिए प्रयोगों का एक मजबूत सेट प्रदान किया गया है। यह लेख क्रोमोफोरिक लिगेंड की उपस्थिति और अनुपस्थिति में इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी के उपयोग पर केंद्रित है ताकि सीयू (द्वितीय) पर आवश्यक स्पेक्ट्रोस्कोपिक हैंडल प्रदान किया जा सके और लेबल-मुक्त आइसोथर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री का उपयोग किया जा सके। दोनों प्रयोगात्मक तकनीकों में, सभी प्रतिस्पर्धी संतुलन के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। जबकि इस लेख का ध्यान सीयू (द्वितीय) पर है, प्रयोगों का वर्णित सेट सीयू (द्वितीय) -पेप्टाइड इंटरैक्शन से परे लागू हो सकता है, और शारीरिक रूप से प्रासंगिक स्थितियों के तहत अन्य धातु-पेप्टाइड प्रणालियों के सटीक परिमाणीकरण के लिए एक रूपरेखा प्रदान कर सकता है।

Introduction

जीव विज्ञान अपने आसपास के वातावरण में अनुकूलन और जीवित रहने के लिए जीवन के लिए आवश्यक धातु आयनों के विविध रसायन विज्ञान का उपयोग करने के लिए विकसित हुआ है। अनुमानित 25% -50% प्रोटीन संरचना और कार्य के लिए धातु आयनों का उपयोग करते हैं1. धातु आयन की विशेष भूमिका और रेडॉक्स स्थिति सीधे जैविक लिगेंड की संरचना और ज्यामिति से संबंधित है जो इसे समन्वयित करती है। इसके अलावा, रेडॉक्स-सक्रिय धातु आयनों जैसे कि सीयू (द्वितीय) को कसकर विनियमित किया जाना चाहिए ताकि वे प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) 2,3,4 बनाने के लिए फेंटन जैसी रसायन विज्ञान के माध्यम से ऑक्सीकरण एजेंटों के साथ बातचीत न करें। बाध्यकारी मोड और आत्मीयता को समझना जो इसके जैव रसायन को चलाते हैं, धातु आयन की जैविक भूमिका को स्पष्ट करने में मदद करनी चाहिए।

धातुओं और पेप्टाइड्स के बाध्यकारी इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए कई तकनीकों का उपयोग किया जाता है। ये ज्यादातर स्पेक्ट्रोस्कोपिक तकनीकें हैं, लेकिन आणविक गतिशीलता का उपयोग करके कंप्यूटर सिमुलेशन भी शामिल हैं, जैसा कि अमाइलॉइड बीटा (एβ)5 के एक टुकड़े के साथ सीयू (द्वितीय) इंटरैक्शन के माध्यम से देखा गया है। एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली स्पेक्ट्रोस्कोपिक तकनीक जो कई विश्वविद्यालयों के लिए सुलभ है, परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) है। क्यू (द्वितीय) की पैरामैग्नेटिक प्रकृति का उपयोग करके, गैगेली एट अल यह दिखाने में सक्षम थे कि धातु आयन पास के नाभिक6 की छूट के माध्यम से पेटाइड पर कहां बांधता है। इलेक्ट्रॉन पैरामैग्नेटिक अनुनाद (ईपीआर) का उपयोग पैरामैग्नेटिक धातु आयन बाइंडिंग 7 के स्थान और मोड की जांच करने के लिए भी किया जा सकताहै। अन्य स्पेक्ट्रोस्कोपिक तकनीकें जैसे परिपत्र द्विवर्णता (सीडी) ट्रिपेप्टाइड सिस्टम8 जैसी प्रणालियों में सीयू (द्वितीय) के बारे में समन्वय का वर्णन कर सकती हैं, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री स्टोइकोमेट्री दिखा सकती है और किस अवशेष के लिए धातु आयन को विखंडन पैटर्न 9,10 के माध्यम से समन्वित किया जाता है।

एनएमआर जैसी इन तकनीकों में से कुछ लेबल मुक्त हैं, लेकिन पेप्टाइड की बड़ी सांद्रता की आवश्यकता होती है, जो अध्ययन के लिए चुनौतियां पेश करती हैं। प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी नामक एक अन्य सामान्य तकनीक का उपयोग सीयू (द्वितीय) 11,12 से शमन के साथ टायरोसिन या ट्रिप्टोफैन की स्थिति से संबंधित करने के लिए किया गया है। इसी तरह, यह तकनीक सीयू (द्वितीय) बाध्यकारी13 के परिणामस्वरूप संरचनात्मक परिवर्तन दिखा सकती है। हालांकि, इन धातु-पेप्टाइड बाध्यकारी अध्ययनों के साथ चुनौतियां यह हैं कि वे क्रोमोफोरिक अमीनो एसिड जैसे टायरोसिन की जांच करते हैं जो सभी प्रणालियों में नहीं होते हैं, कि धातु आयन एक शास्त्रीय मॉडल के तहत बांधता है, और यह तकनीक शारीरिक परिस्थितियों में अनुकूल नहीं हो सकती है। दरअसल, कई पेप्टाइड्स उभर रहे हैं जिनमें ऐसे क्रोमोफोरिक अमीनो एसिड नहीं होते हैं या शास्त्रीय मॉडल के तहत बांधते हैं, इन तकनीकों के उपयोग कोरोकते हैं 14,15. यह लेख शारीरिक रूप से प्रासंगिक स्थितियों के तहत इन परिदृश्यों में बाध्यकारी गुणों का आकलन करने के लिए दृष्टिकोण का विवरण देता है।

जैविक लिगेंड विभिन्न प्रोटोनेशन राज्यों को अपना सकते हैं जो धातु आयन बंधन को प्रभावित कर सकते हैं जैसे कि हिस्टिडीन पर इमिडाज़ोल रिंग। यदि पीएच को लगातार बनाए नहीं रखा जाता है, तो परिणाम जटिल या परस्पर विरोधी हो सकते हैं। इस कारण से, धातु-प्रोटीन / पेप्टाइड इंटरैक्शन के अध्ययन में बफर एक आवश्यक घटक हैं। हालांकि, कई बफर धातु आयनों16,17 के साथ अनुकूल बातचीत करने के लिए दिखाए गए हैं। ब्याज के जैविक अणु के साथ प्रतिस्पर्धा करने के अलावा, बफर में समान समन्वय परमाणु हो सकते हैं जो पेप्टाइड या प्रोटीन के समन्वय परमाणुओं से अंतर करना मुश्किल हो सकता है। इस अध्ययन में, बफर विकल्प से संबंधित विशेष विचारों के साथ, सीयू (द्वितीय) -पेप्टाइड इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए दो पूरक तकनीकों के रूप में इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी और आइसोथर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री (आईटीसी) पर ध्यान केंद्रित किया गया है।

इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी धातु-बाध्यकारी इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक तेजी से, व्यापक रूप से सुलभ तकनीक है। पराबैंगनी (यूवी) या दृश्यमान तरंग दैर्ध्य में प्रकाश के साथ विकिरण धातु-केंद्रित डी-डी बैंड के अवशोषण का कारण बन सकता है, जो लिगैंड वर्गीकरण, धातु ज्यामिति और स्पष्ट बाध्यकारी आत्मीयता18,19 पर मूल्यवान जानकारी प्रदान करता है। इन परिसरों के लिए, प्रोटीन या पेप्टाइड समाधानों में धातु आयनों के प्रत्यक्ष अनुमापन बाध्यकारी स्टोइकोमेट्री और स्पष्ट बाध्यकारी आत्मीयता को माप सकते हैं। कुछ मामलों में, जैसे कि डी5 या डी10 इलेक्ट्रॉन कॉन्फ़िगरेशन, कॉम्प्लेक्स प्रकाश को अवशोषित नहीं करता है (यानी, स्पेक्ट्रोस्कोपिक रूप से चुप है)। इन स्पेक्ट्रोस्कोपिक रूप से मूक संक्रमण धातु परिसरों में, इन सीमाओं को एक प्रतिस्पर्धी लिगैंड का उपयोग करके दरकिनार किया जा सकता है, जो धातु आयन के समन्वय पर, पता लगाने योग्य चार्ज ट्रांसफर बैंड पैदा करता है। किसी भी मामले में, यह दृष्टिकोण केवल स्टोइकोमेट्री और स्पष्ट बाध्यकारी आत्मीयता को मापने तक सीमित है, और बाध्यकारी थैलेपी में कोई अंतर्दृष्टि सन्निकटन के बिना प्रदान नहीं की जाती है।

इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी से प्राप्त जानकारी के पूरक, आईटीसी बाध्यकारी थैलेपी20 के प्रत्यक्ष और कठोर मात्रा का ठहराव के लिए एक आकर्षक तकनीक है। आईटीसी सीधे एक बाध्यकारी घटना के दौरान जारी या खपत की गई गर्मी को मापता है और, चूंकि अनुमापन निरंतर दबाव पर होता है, इसलिए मापा गया गर्मी सभी संतुलन (ΔHआईटीसी) की थैलेपी है। इसके अलावा, बाध्यकारी घटना (एन) और स्पष्ट बाध्यकारी आत्मीयता (केआईटीसी) की स्टोइकोमेट्री की मात्रा निर्धारित की जाती है। इन मापदंडों से, मुक्त ऊर्जा (ΔGआईटीसी) और एन्ट्रापी (ΔS आईटीसी) निर्धारित किएजाते हैं, जो बाध्यकारी घटना का थर्मोडायनामिक स्नैपशॉट प्रदान करते हैं। चूंकि यह प्रकाश अवशोषण पर भरोसा नहीं करता है, आईटीसी स्पेक्ट्रोस्कोपिक रूप से मूक प्रजातियों के लिए एक आदर्श तकनीक है, उदाहरण के लिए, डी5 या डी10 धातु आयन परिसरों। हालांकि, चूंकि कैलोरीमेट्री गर्मी को मापता है, इसलिए किसी भी बेजोड़ बफर सिस्टम और बेहिसाब संतुलन धातु आयन बाध्यकारी थर्मोडायनामिक्स को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए विश्लेषण पर प्रतिकूल प्रभाव डाल सकता है, और इन कारकों को संबोधित करने के लिए बहुत सावधानी बरती जानी चाहिए20. यदि उपयुक्त कठोरता के साथ प्रदर्शन किया जाता है, तो आईटीसी धातु-प्रोटीन / पेप्टाइड परिसरों के थर्मोडायनामिक्स को निर्धारित करने के लिए एक मजबूत तकनीक है।

यहां, एक क्रोमोफोरिक रूप से मूक तांबा-बाध्यकारी पेप्टाइड, सी-पेप्टाइड का उपयोग दो तकनीकों के पूरक उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है। सी-पेप्टाइड इंसुलिन परिपक्वता के दौरान गठित एक 31 अवशेष दरार उत्पाद (ईएईडीएलक्यूवीजीजीएलजीएलईजी) है; इसमें क्रोमोफोरिक अवशेषों का अभाव है, लेकिन शारीरिक रूप से प्रासंगिक आत्मीयता14,15 के साथ सीयू (द्वितीय) को बांधने के लिए दिखाया गया है। सीयू (द्वितीय) बाध्यकारी साइट में एक ग्लूटामेट और एस्पार्टेट के साथ-साथ पेप्टाइड14,15 के एन-टर्मिनस की साइड चेन शामिल हैं। ये समन्वय परमाणु कई आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले बफर किए गए सिस्टम से मिलते जुलते हैं। यहां, सी-पेप्टाइड के लिए क्यू (द्वितीय) बाध्यकारी थर्मोडायनामिक्स को मापने में इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी और आईटीसी में डी-डी और चार्ज ट्रांसफर बैंड का अग्रानुक्रम उपयोग दिखाया गया है। सी-पेप्टाइड के लिए सीयू (द्वितीय) बाध्यकारी का अध्ययन करने से दृष्टिकोण अन्य धातु आयनों और प्रोटीन / पेप्टाइड सिस्टम पर लागू किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी: बफर प्रतियोगिता के साथ प्रत्यक्ष अनुमापन

  1. सैंपल की तैयारी
    1. अल्ट्राप्योर पानी (>18 एमΩ प्रतिरोध) का उपयोग करके पीएच 7.4 पर 50 एमएम 2-[बिस (2-हाइड्रोक्सीथिल) अमीनो] -2-(हाइड्रॉक्सीमिथाइल) प्रोपेन -1,3-डायोल (बिस्ट्रिस) का बफर समाधान तैयार करें। बाद के निस्पंदन के साथ कम से कम 2 घंटे के लिए एक उच्च आत्मीयता राल के साथ ऊष्मायन करके ट्रेस धातु आयनों निकालें।
    2. धातु मुक्त बफर में पेप्टाइड की एक ज्ञात मात्रा को भंग या पतला करें।
      नोट: छोटे विलुप्त होने गुणांक21 के साथ डी-डी बैंड की निगरानी करते समय, पेप्टाइड की उच्च सांद्रता का उपयोग किया जाना चाहिए। यहां, बफर किए गए समाधान में सी-पेप्टाइड की अंतिम एकाग्रता 300 μM थी (मात्रा क्युवेट के आकार पर निर्भर करती है)। सी-पेप्टाइड को ठोस-चरण पेप्टाइड संश्लेषण द्वारा संश्लेषित किया गया था और साहित्य14 में कहीं और विस्तृत है।
    3. 10-15 एमएम पर समाधान बनाने के लिए अल्ट्राप्योर पानी में सीयूसीएल2 के ज्ञात द्रव्यमान को भंग करें।
      नोट: वर्षा को रोकने के लिए शुरू में गैर-बफर किए गए पानी में धातु नमक को भंग करना महत्वपूर्ण है। अन्य सीयू (द्वितीय) लवण का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि आयन कमजोर समन्वय कर रहा है।
  2. प्रयोग चलाना
    1. इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोफोटोमीटर चालू करें और उपयोग करने से पहले ~ 15-20 मिनट के लिए इसे गर्म होने दें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर सॉफ़्टवेयर लॉन्च करें और स्कैनिंग रेंज (200-900 एनएम), स्कैन दर (200 एनएम / एस), और डबल बीम बेसलाइन-सही (अधिक पैरामीटर पूरक फ़ाइल में सूचीबद्ध हैं) जैसे मापदंडों को कॉन्फ़िगर करें।
    2. बीम पथ में कोई क्यूवेट्स या नमूने के साथ एक आधार रेखा इकट्ठा करें।
    3. डबल-बीम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में दो मिलान किए गए क्यूवेट का उपयोग करके, एक क्यूवेट को 115 μL अल्ट्राप्योर पानी के साथ लोड करें और दूसरे क्युवेट को पेप्टाइड नमूने के 115 μL के साथ लोड करें। सुनिश्चित करें कि क्यूवेट्स में कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं क्योंकि ये सिग्नल में हस्तक्षेप करेंगे।
    4. संदर्भ बीम में अल्ट्राप्योर पानी के साथ क्युवेट और नमूना बीम में पेप्टाइड के साथ क्युवेट रखें।
    5. धातु मुक्त (एपीओ) पेप्टाइड के अवशोषण स्पेक्ट्रम ले लीजिए।
    6. पेप्टाइड नमूने के साथ क्युवेट में क्यू (द्वितीय) समाधान के एक उप-स्टोइकोमेट्रिक राशि (0.5 समकक्ष, 150 μM) में जोड़ें। सुनिश्चित करें कि जोड़ा गया Cu(II) की मात्रा 3 μL से कम है और बाद में विश्लेषण के लिए वॉल्यूम रिकॉर्ड करें।
    7. धीरे विंदुक ऊपर और नीचे हवा के बुलबुले की पीढ़ी से परहेज करते हुए समाधान मिश्रण करने के लिए। समाधान प्रतिक्रिया और 5 मिनट के लिए संतुलित करते हैं और अवशोषण स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड करते हैं।
    8. निम्नलिखित समकक्षों के लिए पेप्टाइड समाधान में चरण 1.2.6 के रूप में सीयू (द्वितीय) विभाज्य के अलावा दोहराएं: 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, और 5.0 (या कुल 300, 450, 600, 900, और 1,500 μM)। जोड़ा गया क्यू (द्वितीय) की कुल मात्रा और क्युवेट की कुल मात्रा रिकॉर्ड करना सुनिश्चित करें।
      नोट: यदि अधिक रिज़ॉल्यूशन वांछित है, तो समकक्षों के बीच रिक्ति को कम करें।
    9. नमूना क्युवेट निकालें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार अच्छी तरह से साफ करें।
    10. पेप्टाइड के बिना बफर समाधान जोड़ें और अवशोषण स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड करें। चरण 1.2.5-1.2.8 के रूप में क्यू (द्वितीय) विभाज्य के अलावा दोहराएं, प्रत्येक सीयू (द्वितीय) समकक्ष के लिए अवशोषण स्पेक्ट्रम रिकॉर्डिंग।
    11. प्रसंस्करण के लिए सीएसवी फ़ाइलों के रूप में सभी स्पेक्ट्रा निर्यात करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार क्यूवेट्स को अच्छी तरह से साफ करें और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर को बिजली दें।
  3. डेटा को संसाधित करना
    1. स्प्रेडशीट प्रोग्राम पर सभी स्पेक्ट्रा लोड करें।
    2. बफर से किसी भी अवशोषण सुविधाओं को हटाने के लिए हर दूसरे स्पेक्ट्रम से बफर-केवल (0 μM Cu(II)) स्पेक्ट्रम घटाएं।
    3. क्यू (द्वितीय) समाधान (चरण 1.2.6) के अलावा के परिणामस्वरूप कमजोर पड़ने के लिए खाते में प्रत्येक स्पेक्ट्रम को सामान्य करें। सामान्यीकरण के उदाहरण के लिए पूरक फ़ाइल, समीकरण (1)14 देखें जहां वीप्रारंभिक क्युवेट में जोड़े गए पेप्टाइड की मात्रा (115 μL) है, vCu(II) चरण 1.2.6 में जोड़े गए Cu(II) समाधान की मात्रा है, और एबीएसबफर घटाया स्पेक्ट्रम चरण 1.2.7 में प्राप्त डेटा है।
    4. परिवर्तन के क्षेत्रों की पहचान करने के लिए सभी स्पेक्ट्रा को एक साथ ग्राफ करें।
      नोट: सीयू (द्वितीय) परिसरों से विशिष्ट डी-डी बैंड 500 से 750 एनएम तक होते हैं। यह स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक अनुमापन डी-डी बैंड से छोटे विलुप्त होने के गुणांक के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है, जो ऑक्टाहेड्रल ज्यामिति21 में लापोर्टे-निषिद्ध संक्रमण हैं। यदि अवशोषण बहुत कमजोर है, तो एक वैकल्पिक दृष्टिकोण क्रोमोफोरिक लिगेंड का उपयोग करना है जिसके परिणामस्वरूप सीयू (द्वितीय) के बंधन पर चार्ज ट्रांसफर बैंड होते हैं (अनुभाग 2 देखें)।

2. इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी: क्रोमोफोरिक लिगैंड के साथ पेप्टाइड प्रतियोगिता

  1. सैंपल की तैयारी
    1. ~ 1 एमएम की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए अल्ट्राप्योर पानी में 1,10-फेनान्थ्रोलिन (फेन) को भंग करें।
    2. पेप्टाइड (चरण 1.1.2) और सीयू (द्वितीय) (चरण 1.1.3) के लिए धारा 1.1 में वर्णित नमूना तैयारी के अलावा, बफर ([सीयू (फेन)3]2+) में 10 μM Cu(II) और 40 μM Phen समाधान तैयार करें। सुनिश्चित करें कि वॉल्यूम क्युवेट को भरता है।
  2. प्रयोग चलाना
    1. चरण 1.2.1 और 1.2.2 के रूप में इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोफोटोमीटर शुरू करें लेकिन स्कैनिंग रेंज को 200-400 एनएम पर सेट करें।
    2. दो मिलान किए गए क्यूवेट्स में, एक क्यूवेट को 115 μL अल्ट्राप्योर पानी के साथ लोड करें और दूसरे क्युवेट को [सीयू (Phen)3]2+ समाधान के 115 μL के साथ लोड करें। संदर्भ बीम में पानी के साथ क्युवेट रखें और नमूना बीम में [क्यू (फेन)3]2+ समाधान के साथ क्युवेट रखें।
    3. धातु-लिगैंड कॉम्प्लेक्स के अवशोषण स्पेक्ट्रम को इकट्ठा करें।
    4. [सीयू (फेन)3]2+ समाधान में पेप्टाइड की एक स्टोइकोमेट्रिक मात्रा (≈1 समकक्ष, ≈10 μM) जोड़ें। धीरे विंदुक ऊपर और नीचे अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए लेकिन हवा के बुलबुले पेश नहीं करने के लिए सावधान रहना। भविष्य के विश्लेषण के लिए जोड़े गए पेप्टाइड की मात्रा रिकॉर्ड करें।
      नोट: 115 μL धारण करने वाले क्यूवेट्स का उपयोग करना, 300 μM पेप्टाइड के 3.83 μL को जोड़ने से 9.7 μM की अंतिम पेप्टाइड एकाग्रता प्राप्त होती है।
    5. संतुलन तक पहुँचने के लिए 5 मिनट के लिए समाधान सेते हैं। अवशोषण स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड करें।
      नोट: यदि धातु-पेप्टाइड और धातु-लिगैंड की बाध्यकारी आत्मीयता समान है, तो जोड़े गए पेप्टाइड की एकाग्रता को बड़ी अधिकता में होने की आवश्यकता होगी। सामान्यीकरण के लिए जोड़े गए पेप्टाइड की कुल मात्रा के लिए खाते में सुनिश्चित करें।
    6. निम्नलिखित अनुमानित समकक्षों के लिए [सीयू (फेन)3]2+ समाधान में पेप्टाइड विभाज्य के अलावा दोहराएं: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 22 और 26। जोड़ा पेप्टाइड की मात्रा रिकॉर्ड करें ताकि पतला एकाग्रता निर्धारित की जा सके।
    7. नमूना निकालें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार क्युवेट को अच्छी तरह से साफ करें। बफर का एक स्पेक्ट्रम ले लीजिए। बफर में 50 μM पेप्टाइड का एक स्पेक्ट्रम ले लीजिए।
    8. प्रसंस्करण के लिए सीएसवी फ़ाइलों के रूप में सभी डेटा निर्यात करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार क्यूवेट्स को साफ करें।
  3. डेटा को संसाधित करना
    1. स्प्रेडशीट प्रोग्राम पर स्पेक्ट्रा लोड करें और अन्य स्पेक्ट्रा से बफर स्पेक्ट्रम घटाएं।
    2. पूरक फ़ाइल, Eq (2)14 के बाद स्पेक्ट्रा को सामान्य करें।
    3. 265 एनएम (εअधिकतम = 90,000 एम -1 सेमी -1)22 पर [सीयू (फेन)3]2 + के लिए विलुप्त होने गुणांक का उपयोग करते हुए, पेप्टाइड के प्रत्येक जोड़ के साथ [सीयू (फेन)3] 2 + की एकाग्रता निर्धारित करें।
    4. पेप्टाइड के प्रत्येक जोड़ के लिए, [क्यू (फेन)3]2+ की शेष एकाग्रता को घटाकर सीयू (द्वितीय) -पेप्टाइड कॉम्प्लेक्स की एकाग्रता निर्धारित करें, जैसा कि चरण 2.3.2 में निर्धारित किया गया है, [सीयू (फेन)3]2+ (0 μM पेप्टाइड पर) की प्रारंभिक एकाग्रता से।
    5. पूरक फ़ाइल, समीकरण (3)14 में समीकरण द्वारा मुक्त फेन लिगैंड की एकाग्रता की गणना करें।
    6. पूरक फ़ाइल, Eq (4)14 का उपयोग कर मुक्त पेप्टाइड की एकाग्रता की गणना करें, जहां [पेप्टाइड] स्टॉक क्युवेट में शीर्षक वाले अनियंत्रित पेप्टाइड का प्रतिनिधित्व करता है, वी1 स्टॉक पेप्टाइड की मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है, वी2 क्युवेट की कुल मात्रा है, और [सीयू2 +-पेप्टाइड] चरण 2.3.4 में निर्धारित किया जाता है।
    7. पूरक फ़ाइल23 में Eq (5) का उपयोग कर प्रयोगात्मक बाध्यकारी आत्मीयता (कश्मीरपूर्व) की गणना करें।
    8. पूरक फ़ाइल में समीकरण (6)23 द्वारा क्यू (द्वितीय) -पेप्टाइड के पृथक्करण स्थिरांक को केपूर्व से संबंधित करें, जहां केडी, क्यू (द्वितीय) -फेन = 1.0 × 10-9 (22 देखें)। सभी निर्धारित पृथक्करण स्थिरांक से औसत और मानक विचलन ज्ञात कीजिए।
      नोट: फेन के 4: 1 अनुपात के तहत: सीयू (द्वितीय), [सीयू (फेन)3]2+, [सीयू (फेन)2]2+, और [सीयू (फेन)]2+ समाधान मेंमौजूद हैं, और पेप्टाइड सबसे कमजोर बाध्यकारी 22 के साथ प्रजातियों ([सीयू (फेन)]2+) से दूर क्यू (द्वितीय) को केलेट करेगा।

3. इज़ोटेर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री

  1. सैंपल की तैयारी
    1. अल्ट्राप्योर पानी (>18 एमΩ प्रतिरोध) का उपयोग करके पीएच 7.4 पर 15 एमएम 3-मॉर्फोलिनोप्रोपेन -1-सल्फोनिक एसिड (एमओपीएस) का बफर समाधान तैयार करें। एक बोतल-शीर्ष 0.45 μm झिल्ली के माध्यम से बाद में वैक्यूम निस्पंदन के साथ कम से कम 2 घंटे के लिए एक उच्च आत्मीयता राल के साथ ऊष्मायन करके ट्रेस धातु आयनों निकालें।
    2. ≈50-100 एमएम का घोल तैयार करने के लिए अल्ट्राप्योर पानी में सीयूसीएल2 के ज्ञात द्रव्यमान को भंग करें। 1.4 एमएम सीयू (द्वितीय) की अंतिम एकाग्रता के साथ 1.0 एमएल समाधान प्राप्त करने के लिए बफर में इस सीयू (द्वितीय) समाधान को पतला करें। उपयोग किए गए सीयूसीएल2 समाधान की सटीक मात्रा रिकॉर्ड करें।
    3. 154 μM पेप्टाइड समाधान के 450 μL बनाने के लिए बफर में पेप्टाइड समाधान को भंग या पतला करें। सुनिश्चित करें कि चरण 3.1.2 से अतिरिक्त अल्ट्राप्योर पानी का एक ही अनुपात पेप्टाइड समाधान में जोड़ा जाता है, जो कमजोर पड़ने की गर्मी को कम करेगा और सिग्नल-टू-शोर में वृद्धि करेगा।
    4. नमूनों की तैयारी के बाद, सुनिश्चित करें कि समाधान एक ही पीएच पर हैं और यदि आवश्यक हो, तो तदनुसार समायोजित करें।
    5. वैकल्पिक चरण: आईटीसी में लोड किए गए माइक्रोबबल्स को कम करने के लिए समाधान ों को डीगास करें।
  2. प्रयोग चलाना
    1. आईटीसी चालू करें। साधन चलाने के लिए आईटीसी सॉफ्टवेयर लॉन्च करें। पहले आरंभीकरण की प्रतीक्षा करें, जो ब्यूरेट को फिर से शुरू करने के लिए कहेगा; फिर, स्क्रीन पर दिए गए निर्देशों का पालन करें।
    2. संदर्भ कक्ष से कवर निकालें। संदर्भ सेल से किसी भी पानी को निकालें और 450 μL डिगैस्ड अल्ट्राप्योर पानी के साथ तीन बार कुल्ला।
    3. धीरे-धीरे एक लोडिंग सिरिंज के 450 μL निशान पर अल्ट्राप्योर पानी खींचें, ध्यान रखें कि सिरिंज में हवा के बुलबुले पेश न करें। लोडिंग सिरिंज को संदर्भ सेल में तब तक डालें जब तक कि यह नीचे से ≈1 मिमी न हो, और धीरे-धीरे समाधान के हिस्से को इंजेक्ट करें जब तक कि लोडिंग सिरिंज में 150 μL न रह जाए। सेल की सतह पर किसी भी बुलबुले को हटाने के लिए कई बार ≈25 μL द्वारा लोडिंग सिरिंज सवार को जल्दी से ऊपर और नीचे ले जाएं। धीरे-धीरे इंजेक्ट करें जब तक कि प्लंजर लोडिंग सिरिंज पर 100 μL निशान तक नहीं पहुंच जाता है, जिससे संदर्भ सेल में कुल 350 μL अल्ट्राप्योर पानी निकलता है, और संदर्भ सेल कवर को प्रतिस्थापित करता है।
    4. नमूना सेल से किसी भी अवशिष्ट समाधान को निकालें और लोडिंग सिरिंज का उपयोग करके 10 एमएम एथिलीनडियामाइनटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) के 450 μL के साथ लोड करें। यह सुनिश्चित करने के लिए 10 मिनट के लिए भिगोएं कि ट्रेस धातु आयनों को हटा दिया जाता है क्योंकि ईडीटीए ट्रेस धातुओं को बांध देगा।
    5. ईडीटीए समाधान निकालें (बाध्य ट्रेस धातु आयनों के साथ) और अल्ट्राप्योर पानी की प्रचुर मात्रा के साथ लोडिंग सिरिंज को अच्छी तरह से कुल्ला।
    6. निर्माता के निर्देशों के अनुसार आईटीसी को साफ करें, अल्ट्राप्योर पानी के साथ नमूना सेल को धोएं।
    7. कम से कम तीन बार बफर के 450 μL के साथ कुल्ला करके नमूना सेल हालत।
    8. नमूना कक्ष कंडीशनिंग कर रहा है जो बफर निकालें। लोडिंग सिरिंज का उपयोग कर नमूना सेल में पेप्टाइड समाधान लोड (चरण 3.2.3 का पालन करें)।
    9. बफर समाधान के 200 μL के साथ अनुमापन सिरिंज कुल्ला। ऐसा करने के लिए, सवार को हटा दें और कांच अनुमापन सिरिंज के शीर्ष पर छेद के माध्यम से बफर को पिपेट करने के लिए एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करें, सिरिंज के माध्यम से, और नीचे सुई से बाहर।
    10. अनुमापन सिरिंज में सवार को पूरी तरह से डालें।
    11. अनुमापन सिरिंज सुई की नोक को धातु के घोल में डुबोएं और धीरे-धीरे सवार को ऊपर खींचें, जिससे धातु का घोल सिरिंज को भर सकता है और अनुमापन सिरिंज के कांच के हिस्से के शीर्ष पर एक शून्य मात्रा में परिणाम होता है। फर्श के समानांतर अनुमापन सिरिंज को घुमाकर अधिकांश शून्य मात्रा को हटा दें, सवार को हटा दें, और कांच के हिस्से को फर्श की ओर थोड़ा झुकाएं। अनुमापन सिरिंज को एक कोमल शेक दें ताकि समाधान अनुमापन सिरिंज के कांच के हिस्से के अंत में चले जाए और अधिकांश शून्य मात्रा को भर दे, लेकिन सुनिश्चित करें कि शून्य मात्रा का 2-3 μL बना रहे। सिरिंज को फर्श के समानांतर रखते हुए, प्लंजर को फिर से डालें।
    12. अनुमापन सिरिंज को सीधा रखें, सुई की नोक को धातु के घोल में वापस डुबोएं, और सवार को तब तक नीचे धकेलें जब तक कि सुई से हवा बाहर आना बंद न हो जाए। समाधान में सुई की नोक रखते हुए धीरे-धीरे सवार को 50 μL निशान से ऊपर खींचकर अनुमापन सिरिंज लोड करें।
    13. ध्यान से अनुमापन सिरिंज के कांच के हिस्से को ब्यूरेट में डालें और उंगली-तंग होने तक पेंच करें। जब प्लंजर के संपीड़न के कारण अनुमापन सिरिंज से थोड़ी मात्रा में समाधान निकलता है, तो सुई की नोक को छूने के बिना समाधान को सावधानीपूर्वक अवशोषित करने के लिए एक प्रकाश-कर्तव्य नाजुक वाइपर का उपयोग करें।
    14. नमूना सेल में अनुमापन सिरिंज के साथ ब्यूरेट डालें और इसे सुरक्षित रूप से जकड़ें।
    15. आईटीसी सॉफ़्टवेयर पर पैरामीटर सेट करें। साधन नियंत्रण पर शुरू, सरगर्मी दर (ठेठ सरगर्मी दरें 150 से 350 आरपीएम तक होती हैं) और तापमान जिस पर प्रयोग किया जाएगा (आमतौर पर 25 डिग्री सेल्सियस) सेट करें। प्रयोग विवरण के तहत मिलीमोलर इकाइयों में सिरिंज और सेल सांद्रता दर्ज करें।
    16. प्रयोग विधि अनुभाग में, वृद्धिशील अनुमापन का चयन करें। सेटअप पर क्लिक करें और 2.5 μL के 20 इंजेक्शन निर्दिष्ट करें। यदि बाध्यकारी घटना का निरीक्षण करने के लिए अधिक रिज़ॉल्यूशन की आवश्यकता होती है, तो इंजेक्शन की संख्या बढ़ाएं और प्रति इंजेक्शन वॉल्यूम कम करें। प्रत्येक इंजेक्शन के बीच समय रिक्ति इनपुट करें ताकि सिग्नल को संतुलित करने और बेसलाइन पर लौटने के लिए पर्याप्त समय हो, आमतौर पर 300 एस।
    17. प्रयोग प्रारंभ करने के लिए रन बटन पर क्लिक करें और निर्दिष्ट करें कि डेटा कहाँ सहेजा गया है।
    18. प्रयोग के पूरा होने पर, नमूना सेल और अनुमापन सिरिंज को साफ करें।
    19. सटीक डेटा संग्रह सुनिश्चित करने के लिए कम से कम ट्रिप्लिकेट में सभी प्रयोगों को चलाएं।
    20. एक नियंत्रण प्रयोग चलाएं जहां धातु के समाधान को बफर किए गए समाधान (पेप्टाइड की अनुपस्थिति में) में शीर्षक दिया जाता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि धातु आयन से कमजोर पड़ने की गर्मी छोटी है और संतुलन के लिए कोई बेहिसाब नहीं है। यदि कमजोर पड़ने की गर्मी बड़ी है, तो यदि संभव हो तो एक अलग बफर सिस्टम पर विचार करें।
  3. डेटा को संसाधित करना
    1. आईटीसी विश्लेषण सॉफ्टवेयर लॉन्च करें और विश्लेषण के लिए डेटा फ़ाइल लोड करें।
    2. बेसलाइन टैब पर नेविगेट करें और थर्मोग्राम का निरीक्षण करें। थर्मोग्राम में हवा के बुलबुले या अन्य कलाकृतियों से विकसित या अवशोषित किसी भी बहिर्जात गर्मी पर ध्यान दें। स्पाइक्स की तलाश करें जो धातु समाधान के इंजेक्शन के कारण नहीं हैं।
    3. सुनिश्चित करें कि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर द्वारा उत्पन्न आधाररेखा इंजेक्शन और संतुलन के बाद डेटा के हिस्से का अनुसरण करती है। यदि यह विचलित हो जाता है, तो बेसलाइन को समायोजित करने के लिए बेसलाइन पिवट पॉइंट्स का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि एकीकरण क्षेत्रों में धातु के इंजेक्शन से उत्पन्न चोटी शामिल है, लेकिन चरण 2 में पाए जाने वाले थर्मोग्राम में किसी भी हवा के बुलबुले या कलाकृतियों को रोकें। थर्मोग्राम से बेसलाइन घटाएं।
      नोट: इस प्रकार के हेरफेर की सिफारिश केवल कई थर्मोग्राम एकत्र करने के बाद की जाती है, इसलिए प्रयोगकर्ता जानता है कि वास्तविक डेटा क्या है और एक विरूपण साक्ष्य क्या है, क्योंकि बेसलाइन और एकीकरण क्षेत्रों को समायोजित करने से डेटा काफी प्रभावित हो सकता है।
    4. डेटा को फिट करना शुरू करने के लिए मॉडलिंग विंडो पर नेविगेट करें जहां विश्लेषण सॉफ़्टवेयर प्रत्येक इंजेक्शन के लिए एकीकृत और एकाग्रता-सामान्यीकृत डेटा दिखाएगा।
    5. फिटिंग एल्गोरिथ्म से इसे हटाने के लिए पहले इंजेक्शन के डेटम पर बाएं क्लिक करें।
      नोट: यह आम है क्योंकि पहले इंजेक्शन के असटीक दाढ़ वितरण के लिए अग्रणी टाइट्रेंट और नमूना सेल समाधान के बीच मामूली मिश्रण होगा।
    6. मॉडल अनुभाग में, स्टाइल ड्रॉपडाउन मेनू में रिक्त (स्थिर) का चयन करें, जो अंतिम इंजेक्शन थैलेपी पर आधारित है और कमजोर पड़ने की गर्मी के लिए लेखांकन, प्रत्येक डेटा बिंदु से घटाया जाएगा। इसके अलावा, डेटा फिट करने के लिए दूसरे स्टाइल ड्रॉपडाउन मेनू में स्वतंत्र (या सिस्टम के लिए सबसे अच्छा मॉडल) का चयन करें।
      नोट: मानक 1: 1 बाध्यकारी इंटरैक्शन के लिए, सबसे आम मॉडल स्वतंत्र है।
    7. एक Ω के साथ हरे रंग के प्ले बटन दबाकर दो मॉडलों का उपयोग करके डेटा फिट करें।
      नोट: आईटीसी डेटा को संसाधित करने के लिए एक और सॉफ्टवेयर सेडफैट24 है।
    8. पहले ग्रोसोहम एट अल द्वारा रिपोर्ट किए गए पोस्ट हॉक विश्लेषण में सभी प्रतिस्पर्धी संतुलन के लिए खाता। 20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

लक्ष्य इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी और आईटीसी की पूरक तकनीकों का उपयोग करके सी-पेप्टाइड के लिए बाध्यकारी सीयू (द्वितीय) के थर्मोडायनामिक्स को निर्धारित करना और पुष्टि करना था। इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी की मजबूत प्रकृति के कारण, 300 μM सी-पेप्टाइड में सीयू (द्वितीय) का एक सीधा अनुमापन किया गया था (चित्रा 1)। सीयू (द्वितीय) के 150 μM के अलावा 600 एनएम पर बैंड में तत्काल वृद्धि हुई, सीयू (द्वितीय) के डी-डी बैंड के लिए जिम्मेदार ठहराया गया, और 300 μM Cu (II) जोड़े जाने तक वृद्धि जारी रही। 300 μM Cu(II) से ऊपर इसके अलावा डी-डी बैंड के अवशोषण में वृद्धि नहीं हुई, जो संतृप्ति का संकेत देता है और यह कि सीयू (II) 1: 1 कॉम्प्लेक्स में सी-पेप्टाइड से बांधता है। इसके अलावा, क्यू (द्वितीय) (लॉग के = 5.27)16 के लिए बाध्यकारी के लिए बीआईएस-ट्रिस की अपेक्षाकृत उच्च आत्मीयता के कारण, क्यू (द्वितीय) / सी-पेप्टाइड आत्मीयता में माइक्रोमोलर रेंज (लॉग के > 6) में धातु आयन को बफर से दूर करने के लिए कम सीमा होनी चाहिए। इस प्रणाली में, छोटे विलुप्त होने गुणांक के कारण अवशोषण बैंड का सटीक परिमाणीकरण चुनौतीपूर्ण है।

डी-डी बैंड के छोटे विलुप्त होने के गुणांक को दरकिनार करने के लिए, एक क्रोमोफोरिक लिगैंड, फेन, का उपयोग ऊपर वर्णित के रूप में किया गया था। सी-पेप्टाइड को ≈10 μM [सीयू (फेन)3] 2 + (चित्रा 2 ए) में शीर्षक दिया गया था, और 265 एनएम पर चार्ज ट्रांसफर बैंड से अवशोषण कम हो गया (चित्रा 2 बी), यह दर्शाता है कि सी-पेप्टाइड फेन लिगैंड से क्यू (द्वितीय) को चेलेट करने में सक्षम था। करीब निरीक्षण पर, सी-पेप्टाइड (140 μM तक) की एक बड़ी एकाग्रता को फेन लिगैंड (तालिका 1) को मामूली रूप से पछाड़ने की आवश्यकता थी। यह आश्चर्य की बात नहीं है कि बड़े अनुक्रमिक गठन स्थिरांक को देखते हुए [क्यू (फेन)3]2+ (9.0, 15.7, और 20.8 लॉग के लिए1, β2, और β3, क्रमशः)22। स्पेक्ट्रा के विश्लेषण से पता चलता है कि क्यू (द्वितीय)/सी-पेप्टाइड बाध्यकारी आत्मीयता लॉग के = 7.4-7.8 (तालिका 1) की सीमा में है।

बाध्यकारी बातचीत के पूर्ण थर्मोडायनामिक्स को मापने का स्वर्ण मानक आईटीसी है। चित्रा 3 15 एमएम एमओपीएस, पीएच 7.4 में सी-पेप्टाइड में शीर्षक वाले सीयू (द्वितीय) का एक प्रतिनिधि थर्मोग्राम प्रदान करता है, जो सीयू (द्वितीय) के लिए प्रतिस्पर्धा प्रदान करता है। यहां, बीआईएस-ट्रिस बफर के बजाय एमओपीएस बफर का उपयोग किया गया था क्योंकि केक्यू (द्वितीय) -एमओपीएस < केक्यू (द्वितीय) -बीआईएस-ट्रिस16,25, और कम प्रतिस्पर्धा प्रदान करेगा ताकि आईटीसी आत्मीयता को सटीक रूप से माप सके (चर्चा देखें)। सभी संतुलनों के बीच खपत या विकसित गर्मी को मापने के माध्यम से, थर्मोग्राम एक सिग्मोइडल आकार प्रदान करता है। पेप्टाइड संतृप्त होने से पहले क्यू (द्वितीय) के प्रारंभिक इंजेक्शन कमजोर पड़ने की गर्मी की तुलना में बड़ी मात्रा में गर्मी का परिणाम देते हैं। ऊष्मा के इन मानों में अंतर ΔHआईटीसी है। विभक्ति बिंदु जानकारी के दो उपयोगी टुकड़ों का वर्णन करता है। पहला कोशिका में प्रजातियों की तुलना में सिरिंज में प्रजातियों की बाध्यकारी स्टोइकोमेट्री है (यानी, सीयू (द्वितीय): सी-पेप्टाइड 1: 1 है)। दूसरा, विभक्ति बिंदु पर फिट की ढलान सीधे केआईटीसी के आनुपातिक है। ट्रिप्लिकेट और कई बफर में डेटा एकत्र करने के बाद, एक पोस्ट हॉक विश्लेषण20 जहां सभी प्रतिस्पर्धी संतुलन का हिसाब लगाया जाता है (तालिका 2), और बफर-स्वतंत्र थर्मोडायनामिक्स निर्धारित किए जाते हैं। सी-पेप्टाइड के लिए सीयू (द्वितीय) बाध्यकारी के लिए, केक्यू (द्वितीय)/सी-पेप्टाइड = 1 (± 1) एक्स 108 और Δएचसीयू (द्वितीय)/सी-पेप्टाइड = -8 (± 4) केजे मोल -1। इनमें से, अन्य बाध्यकारी थर्मोडायनामिक पैरामीटर निर्धारित किए जाते हैं जहां Δजी ° सीयू (II)/सी-पेप्टाइड = -46 (± 4) केजे मोल -1 और ΔSCu(II)/C-पेप्टाइड = 120 (± 10) J mol-1 K-1 (15 देखें)।

Figure 1
चित्रा 1: 50 एमएम बिस-ट्रिस, पीएच 7.4 में 300 μM C-पेप्टाइड के लिए 150, 300, 450, 600, 900, और 1,500 μM सीयू (II) के अलावा सीयू (II) डी-डी बैंड की निगरानी। सीयू (द्वितीय) का डी-डी बैंड 600 एनएम पर बढ़ता है जब तक कि 1: 1 सीयू (द्वितीय): सी-पेप्टाइड कॉम्प्लेक्स नहीं बनता है। इससे पहले, मग्यार और गॉडविन ने बताया कि सीयू (द्वितीय) -बिस-ट्रिस आत्मीयता लॉग के = 5.2716 है। इस अनुमापन से पता चलता है कि सी-पेप्टाइड सीयू (द्वितीय) को बांधने के लिए बफर को पछाड़ सकता है और माइक्रोमोलर रेंज में सीयू (द्वितीय) / इस आंकड़े को स्टीवेन्सन एट अल 14 की अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: [क्यू (फेन)3]2+ का गठन और प्रतिनिधि इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रा सी-पेप्टाइड के अलावा चार्ज ट्रांसफर बैंड की कमी की निगरानी करता है। (ए) प्रतिक्रिया योजना [क्यू (फेन)3]2+ के गठन को दर्शाती है और इसके चार्ज ट्रांसफर बैंड 265 एनएम (ε ° ≈ 90,000 एम -1 सेमी -1)22 पर केंद्रित है। गठनस्थिरांक लॉग के 1, β 2 और β3 के लिए क्रमशः 9.0,15.7 और20.8 हैं। (बी) प्रतिनिधि इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रा सी-पेप्टाइड केलेट्स क्यू (द्वितीय) के रूप में [सीयू (फेन)3]2 + से चार्ज ट्रांसफर बैंड की कमी की निगरानी करता है। अनुमापन 50 एमएम बीआईएस-ट्रिस, पीएच 7.4 में आयोजित किया गया था। डेटा विश्लेषण तालिका 1 में दिखाया गया है। इस आंकड़े को स्टीवेन्सन एट अल 14 की अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित किया गया है। संक्षिप्त नाम: एमएलसीटी = लिगैंड चार्ज ट्रांसफर के लिए धातु। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: सी-पेप्टाइड और बफर में अनुमापनित सीयू (द्वितीय) के प्रतिनिधि थर्मोग्राम ( ए ) यह प्रतिनिधि थर्मोग्राम 15 एमएम एमओपीएस, पीएच 7.4 में 154 μM C-पेप्टाइड में 1.4 एमएम सीयू (II) के अनुमापन को दर्शाता है। डेटा निम्नलिखित मापदंडों के साथ एक-साइट मॉडल के लिए फिट हैं: एन = 1.2 ± 0.1; केडी, आईटीसी = 6 (± 3) एक्स 10-7; ΔHआईटीसी = −3.4 ± 0.2 केजे मोल-1। (बी) 15 एमएम एमओपीएस, पीएच 7.4 में 1.4 एमएम सीयू (द्वितीय) का एक प्रतिनिधि नियंत्रण अनुमापन, सी-पेप्टाइड की अनुपस्थिति में कोई बाध्यकारी थर्मोग्राम नहीं दिखा रहा है जो पैनल ए में देखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

[सी-पेप्टाइड] ए265 [क्यू (फेन)3] 2+ [फेन] उचित [सी-पेप्टाइड] उचित [सीयू (द्वितीय)/सी-पेप्टाइड] कश्मीरपूर्व (x108) केडीक्यू (द्वितीय) / सी-पेप्टाइड लॉग केडीक्यू (द्वितीय) / सी-पेप्टाइड
0.0 1.0649 11.83 4.5 0 0.00 मरोड़ना मरोड़ना मरोड़ना
9.7 0.9948 11.05 6.84 7.45 0.78 0.0543 1.84ई-08 7.75
18.7 0.9785 10.87 7.38 16.00 0.96 0.0367 2.73ई-08 7.56
27.3 0.9651 10.72 7.83 24.09 1.11 0.0310 3.23ई-08 7.49
35.3 0.9475 10.53 8.42 31.55 1.30 0.0307 3.26ई-08 7.49
42.8 0.9374 10.42 8.75 38.79 1.42 0.0288 3.48ई-08 7.46
50.0 0.9283 10.31 9.06 45.64 1.52 0.0275 3.63ई-08 7.44
56.7 0.9134 10.15 9.55 51.92 1.68 0.0288 3.47ई-08 7.46
63.1 0.9025 10.03 9.92 57.97 1.81 0.0291 3.43ई-08 7.46
69.2 0.8927 9.92 10.24 63.73 1.91 0.0294 3.40ई-08 7.47
75.0 0.878 9.76 10.73 69.04 2.08 0.0314 3.19ई-08 7.50
85.7 0.8542 9.49 11.53 78.99 2.34 0.0341 2.93ई-08 7.53
95.4 0.8316 9.24 12.28 88.01 2.59 0.0371 2.69ई-08 7.57
104.3 0.8151 9.06 12.83 96.38 2.78 0.0387 2.58ई-08 7.59
112.4 0.7976 8.86 13.41 103.98 2.97 0.0411 2.44ई-08 7.61
126.9 0.7809 8.68 13.97 117.87 3.16 0.0411 2.44ई-08 7.61
139.2 0.7586 8.43 14.71 129.53 3.40 0.0437 2.29ई-08 7.64
श्रेणी 7.4-7.8

तालिका 1: चित्रा 2 बी से समाधान में प्रजातियों की सांद्रता के लिए प्रतिनिधि गणना। सभी सांद्रता माइक्रोमोलर में हैं। इस तालिका को स्टीवेन्सन एट अल .14 की अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित किया गया है।

इकुलिब्रिया n ΔH (केजे मोल-1) द × ΔH (केजे मोल-1)
सीयू (द्वितीय) - एमओपीएस → सीयू (द्वितीय) + एमओपीएस 1 5.4 5.44
एमओपीएस + एच + → एमओपीएस-एच + 0.097 -21.0 -2.04
सीयू (द्वितीय) + सी-पेप्टाइड-एच + → सीयू (द्वितीय)/सी-पेप्टाइड + एच + 1 X X
ΔHआईटीसी = Χ + 3.40
Χ = ΔHआईटीसी − 3.40
Χ = ΔHघन(II)/C-पेप्टाइड = −6.8 kJ मोल-1

तालिका 2: ΔH Cu(II)/C-पेप्टाइड निर्धारित करने के लिए पोस्ट हॉक विश्लेषण। जैसा कि चित्र 3,1.4 एमएम सीयू (द्वितीय) में दिखाया गया है, 15 एमएम एमओपीएस, पीएच 7.4 में 154 μM C-पेप्टाइड में तीन गुना में शीर्षक दिया गया था। तालिका में दिखाए गए सभी प्रतिस्पर्धी संतुलन के लिए लेखांकन के बाद, ΔHCu(II)/C-पेप्टाइड -8.66 kJ mol-1 पाया जाता है। सीयू (II) द्वारा सी-पेप्टाइड से विस्थापित प्रोटॉन की संख्या (ΔHआईटीसी + ΔHसीयू (II) -बफर) बनाम ΔHबफर-एच की ढलान से निर्धारित की जाती है जहां डेटा कई बफर में एकत्र किया जाता है। सभी थैलेपी मान एनआईएसटी25 में पाए जाते हैं या साहित्य15 में कहीं और निर्धारित किए जाते हैं। सभी प्रतिस्पर्धी संतुलन को ग्रोसोहमे एट अल द्वारा वर्णित के रूप में जिम्मेदार ठहराया गया है 20 यह आंकड़ा स्टीवेन्सन एट अल .15 की अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित किया गया है।

पूरक फ़ाइल: प्रोटोकॉल अनुभाग में उपयोग किए जाने वाले प्रासंगिक समीकरण और इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और आईटीसी सेटअप के लिए अतिरिक्त पैरामीटर। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यह लेख पेप्टाइड्स के लिए सीयू (द्वितीय) बाध्यकारी की आत्मीयता और थर्मोडायनामिक्स को मापने के लिए एक मजबूत विधि प्रदान करता है। सीयू (द्वितीय) के साथ कॉम्प्लेक्स आदर्श रूप से अपने डी9 इलेक्ट्रॉन कॉन्फ़िगरेशन के कारण धातु साइट पर डी-डी अवशोषण बैंड की निगरानी के लिए अनुकूल हैं। यद्यपि विलुप्त होने का गुणांक छोटा है, इस प्रकार एक विश्वसनीय संकेत देने के लिए परिसर की बड़ी सांद्रता की आवश्यकता होती है, पेप्टाइड में सीयू (द्वितीय) के अनुमापन जल्दी से बाध्यकारी स्टोइकोमेट्री और अनुमानित बाध्यकारी आत्मीयता में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। हालांकि, स्पेक्ट्रा में अंतर को समझना चुनौतीपूर्ण हो सकता है यदि धातु बफर और पेप्टाइड दोनों से समान परमाणुओं और ज्यामिति द्वारा समन्वित है। बाध्यकारी आत्मीयता मात्रात्मक रूप से निर्धारित करने के लिए, क्रोमोफोरिक लिगेंड जैसे कि फेन का उपयोग अक्सर धातु आयनों के साथ उनके समरूपता-अनुमत चार्ज ट्रांसफर के कारण किया जाता है21. क्रोमोफोरिक लिगैंड और नॉनक्रोमोफोरिक पेप्टाइड के बीच एक प्रतियोगिता स्थापित करने के माध्यम से और लिगैंड के लिए धातु की आत्मीयता को जानकर, धातु-पेप्टाइड आत्मीयता सीधे निर्धारित की जा सकती है। इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके आगे थर्मोडायनामिक विश्लेषण चुनौतीपूर्ण है। यूवी-विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी जैसी तकनीक का उपयोग करके बाध्यकारी थैलेपी को मापने के लिए, बाध्यकारी आत्मीयता को कई तापमानों पर निर्धारित किया जाना चाहिए और एक वैन हॉफ विश्लेषण किया जाना चाहिए। यह विश्लेषण मानता है कि बाध्यकारी की विशिष्ट गर्मी शून्य है, जो शायद ही कभी सच है और इस प्रकार केवल बाध्यकारी थैलेपी20 का अनुमान प्रदान करता है।

धातु-पेप्टाइड इंटरैक्शन के थर्मोडायनामिक्स के अधिक पूर्ण अवलोकन को स्पष्ट करने के लिए आइसोथर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री बेहतर अनुकूल है। इस तकनीक में, एक धातु आयन को पेप्टाइड समाधान में शीर्षक दिया जाता है और विभिन्न संतुलन की गर्मी को सीधे मापा जाता है। चूंकि प्रयोग निरंतर दबाव पर आयोजित किया जाता है, आईटीसी द्वारा मापा गया गर्मी थैलेपी के बराबर होता है। आईटीसी इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी की कुछ सीमाओं को दूर कर सकता है जैसे स्पेक्ट्रोस्कोपिक रूप से मूक धातु आयनों का अध्ययन करना और वैन हॉफ विश्लेषण में किए गए मान्यताओं को बनाने की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, कभी-कभी, आईटीसी में होने वाली प्रतिक्रियाएं बहुत कम गर्मी उत्पन्न करती हैं और इसलिए नहीं देखी जाती हैं। इसे धातु और पेप्टाइड की बढ़ती सांद्रता के माध्यम से या प्रोटोनेशन के एक अलग थैलेपी के साथ एक अलग बफर का उपयोग करके बाईपास किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध विशेष रूप से उपयोगी है यदि धातु आयन पेप्टाइड से बंधने पर कई प्रोटॉन को विस्थापित करता है। हालांकि, दोनों तकनीकें - आईटीसी और इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी - एक ही प्रणाली का अध्ययन करने और एक दूसरे को अच्छी तरह से पूरक करने के लिए ऑर्थोगोनल तरीके प्रदान करती हैं।

पेप्टाइड्स के लिए बाध्यकारी धातु आयनों का अध्ययन करते समय दोनों तकनीकों में कई चुनौतीपूर्ण पहलू हैं। कई धातु आयन पानी में अघुलनशील या संयम से घुलनशील होते हैं। बफर में जोड़े जाने पर धातु आयन की वर्षा से यह और बढ़ जाता है। आईटीसी में, यह बेसलाइन में धीमी, क्रमिक बदलाव और धातु को इंजेक्ट करने पर उत्पन्न गर्मी की बड़ी मात्रा से प्रकट हो सकता है। यह पेप्टाइड धातु आयन द्वारा संतृप्त होने के बाद भी कमजोर पड़ने की गर्मी के बड़े मूल्यों का संकेत है। इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी में, धातु आयन वर्षा कम तरंग दैर्ध्य पर बढ़े हुए अवशोषण के माध्यम से प्रकट होती है और यूवी क्षेत्र में केंद्रित एक व्यापक शिखर जैसा दिखता है। दोनों तकनीकों में, प्रयोगकर्ता को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि धातु आयन पसंद की शर्तों (जैसे, बफर, पीएच, तापमान, एकाग्रता) के तहत घुलनशील है। दोनों विधियों की एक और सीमा अतिरिक्त क्रम की अवधारणा के माध्यम से खुद को दिखा सकती है। कुछ मामलों में, गठित एक धातु परिसर लेबिल हो सकता है, जबकि एक अलग क्रम में एक ही अभिकर्मकों को जोड़ने से एक और मध्यवर्ती प्रजाति निष्क्रिय हो जाएगी। गतिज बनाम थर्मोडायनामिक नियंत्रण का यह चित्रण सभी प्रतिस्पर्धी संतुलन के सटीक विश्लेषण में बाधा डालता है।

आईटीसी और इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी दोनों धातु आयन को बांधने के लिए पेप्टाइड और या तो बफर या लिगैंड के बीच प्रतियोगिताओं पर भरोसा करते हैं। यहां, सी-वैल्यू पेश किया गया है, जो यह पहचानने में मदद करता है कि क्या केआईटीसी को फिटिंग एल्गोरिदम द्वारा सटीक रूप से निर्धारित किया जा सकता है। सी-वैल्यू को पूरक फ़ाइल, ईक्यू (7) 20 में परिभाषित किया गया है, जहां एन स्टोइकोमेट्री है, केआईटीसी स्पष्ट बाध्यकारी आत्मीयता है, और [नमूना सेल] नमूना सेल में प्रजातियों की एकाग्रता है। जब सी-वैल्यू 1 और 1,000 के बीच होती है, तो निर्धारित के आईटीसी सटीकहोता है। हालांकि, 1 से नीचे सी-मान केवल केआईटीसी को ऊपरी सीमा प्रदान कर सकते हैं, जबकि 1,000 से ऊपर के सी-मान केवल निचली सीमा20 प्रदान कर सकते हैं। यह पूरक तकनीकों से डेटा एकत्र करने का मूल्य है: यदि इसकी सीमाओं के कारण एक तकनीक में कुछ याद किया जाता है, तो यह इसकी पूरक तकनीक में पकड़ा जा सकता है। इन प्रयोगों में, यदि प्रतिस्पर्धा एक प्रजाति के लिए बहुत इष्ट है (यानी, पेप्टाइड की धातु आयन आत्मीयता बफर की आत्मीयता से बहुत अधिक है), तो संतुलन को स्थानांतरित कर दिया जाएगा, जिससे व्याख्या करना मुश्किल हो जाएगा। यह कोसिला एट अल .23 द्वारा भी विस्तार से दिखाया गया है। इस चुनौती के आसपास काम करने के लिए, एक अलग प्रतिस्पर्धी लिगैंड के साथ परिचय या प्रतिस्थापन, या एक अलग बफर चुनना अक्सर सटीक मात्रा का ठहराव के लिए लिगैंड और पेप्टाइड के बीच प्रतिस्पर्धा को बढ़ाने के लिए उपयोग किया जाता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि धातु-बफर (या धातु-लिगैंड) और धातु-पेप्टाइड आत्मीयता का अंतर सी-वैल्यू को 1 से 1,000 की खिड़की के भीतर गिरने की अनुमति देगा। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक प्रतिस्पर्धी लिगैंड या किसी अन्य बफर के उपयोग के लिए आवश्यक है कि धातु-लिगैंड या धातु-बफर कॉम्प्लेक्स के थर्मोडायनामिक मापदंडों को जाना जाता है या अन्य साधनों द्वारा निर्धारित किया जा सकता है।

अंत में, पेप्टाइड एकाग्रता को सटीक रूप से निर्धारित करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। पेप्टाइड सांद्रता को मापने के कुछ सामान्य तरीके विशिष्ट अमीनो एसिड को मापने और पेप्टाइड के अनुक्रम के लिए उन अमीनो एसिड की मात्रा से संबंधित हैं। उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी सुगंधित अवशेषों जैसे टायरोसिन को माप सकती है, एलमैन का अभिकर्मक मुक्त थियोल्स26 की संख्या को माप सकता है, और ब्रैडफोर्ड परख इस बात का संकेत प्रदान करते हैं कि कितने अवशेष मौजूद हैं27. दुर्भाग्य से, इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले पेप्टाइड्स में सुगंधित अवशेष या मुक्त थियोल नहीं होते हैं, और ब्रैडफोर्ड परख ब्याज के छोटे पेप्टाइड के साथ बड़े पैमाने पर प्रोटीन से मानकों की तुलना करते समय चुनौतियां पैदा करते हैं। इसके बजाय, पेप्टाइड एकाग्रता शुष्क द्रव्यमान द्वारा निर्धारित की गई थी। यद्यपि आदर्श नहीं है और सांद्रता के लिए प्रवण है जो पेप्टाइड एकाग्रता के मामूली अतिरंजित हैं (क्योंकि स्पष्ट द्रव्यमान माप लवण की उपस्थिति के कारण वास्तविक पेप्टाइड द्रव्यमान से अधिक होने की संभावना है), माप के लिए सभी विभाज्य समान व्यवहार किए गए थे, जो अधिक सटीक तुलना की अनुमति देता है। स्पेक्ट्रोस्कोपिक अध्ययनों में, यदि मुक्त पेप्टाइड की एकाग्रता प्रत्याशित से कम है, तो गणना की गई बाध्यकारी आत्मीयता एक निचली सीमा (पूरक फ़ाइल, ईक्यू (5) और ईक्यू (6)) का प्रतिनिधित्व करती है। दोनों तकनीकों से जुड़ी चुनौतियां दिखाई गई हैं, लेकिन एक मार्गदर्शक के रूप में साहित्य के साथ, कई को दूर किया जा सकता है।

यहां विस्तृत प्रयोगात्मक दृष्टिकोण धातु-पेप्टाइड बाध्यकारी थर्मोडायनामिक्स के सटीक परिमाणीकरण की अनुमति देता है। आईटीसी और इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी दोनों ऑर्थोगोनल हैं और बाध्यकारी आत्मीयता में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, लेकिन आईटीसी प्रत्यक्ष थैलेपी परिमाणीकरण की अनुमति देता है। एक बार जब इन थर्मोडायनामिक्स की मात्रा निर्धारित हो जाती है, तो यह अनुमान लगाया जा सकता है कि क्या ये धातु-पेप्टाइड कॉम्प्लेक्स शारीरिक परिस्थितियों में बन सकते हैं। जैसे-जैसे शारीरिक धातु आयन प्रवाह की समझ बढ़ती है, भविष्यवाणी की जा सकती है कि विवो में जटिल गठन के लिए बाध्यकारी आत्मीयता पर्याप्त मजबूत है या नहीं। इसके अलावा, शोधकर्ता एक ही पेप्टाइड के लिए कई धातु आयनों या एक ही धातु आयन के लिए कई पेप्टाइड्स के बीच प्रतियोगिताओं के बारे में भविष्यवाणी कर सकता है। धातु आयन और पेप्टाइड्स के बीच इन प्रतियोगिताओं को देखते हुए, शोधकर्ता यह समझना शुरू कर सकता है कि मुक्त ऊर्जा को थैलेपी और एन्ट्रापी योगदान में पार्स करके धातु-पेप्टाइड कॉम्प्लेक्स की बाध्यकारी आत्मीयता में क्या योगदान देता है। थर्मोडायनामिक्स धातु आयनों और पेप्टाइड्स के बीच गतिशील परस्पर क्रिया की सराहना करने का एक अभिन्न अंग हैं, और आईटीसी और इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी इन प्रणालियों से पूछताछ करने के लिए हैंडल प्रदान कर रहे हैं। यहां वर्णित विधियों का विस्तार किया जा सकता है और मैक्रोमोलेक्यूल्स के साथ अन्य धातु आयन बाध्यकारी इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, और शारीरिक प्रक्रियाओं, दवा डिजाइन और बहुत कुछ में निहितार्थ हो सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

एससी व्हाइटहेड समर रिसर्च फैलोशिप का शुक्रिया अदा करता है। एमजेएस सैन फ्रांसिस्को विश्वविद्यालय में स्टार्टअप फंड और संकाय विकास निधि को धन्यवाद देता है। एमसीएच राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच एमआईआरए 5 आर 35 जीएम 133684-02) और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफ कैरियर 2048265) से वित्त पोषण स्वीकार करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,10-phenanthroline Sigma Aldrich 131377-25G
bis-Tris buffer Fisher BP301-100
Bottle-top 0.45 micron membrane Nalgene 296-4545 Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable
Copper(II) chloride Alfa Aesar 12458
EDTA Sigma Aldrich EDS-500G
Electronic absorption spectrophotometer Varian Cary 5000 Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable
high affinity resin Sigma Aldrich C7901-25G
Isothermal titration calorimeter (ITC) TA Instruments Nano ITC Low Volume
ITC analysis software TA Instruments NanoAnalyze SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used
ITC software TA Instruments ITCRun
light-duty delicate wiper Kimwipe 34155
loading syringe Hamilton Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL
matched cuvettes Starna Cells, Inc 16.100-Q-10/Z20 Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer
MOPS buffer Alfa Aesar A12914
spectrophotometer software Cary WinUV Scan
spreadsheet program Microsoft Excel Any suitable spreadsheet program will work
titration syringe TA Instruments 5346
ultrapure water Millipore Sigma Milli-Q Any water is okay as long as >18 MΩ resistance

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waldron, K. J., Robinson, N. J. How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal. Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).
  2. Puig, S., Thiele, D. J. Molecular mechanisms of copper uptake and distribution. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).
  3. Huffman, D. L., O'Halloran, T. V. Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins. Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).
  4. Kaplan, J. H., Lutsenko, S. Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs. Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).
  5. Makowska, J., et al. Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the Aβ (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations. Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).
  6. Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. 1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides. Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).
  7. García, J. E., et al. Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106−115: evaluating the role of protons and methionine residues. Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).
  8. Jakab, N. I., et al. Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy. Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).
  9. Keltner, Z., et al. Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants. Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).
  10. Whittal, R. M., et al. a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry. Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).
  11. Żamojć, K., et al. A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).
  12. Beuning, C. N., et al. Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-β complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching. Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).
  13. Makowska, J., Żamojć, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzyński, L. Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus. Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).
  14. Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization. ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).
  15. Stevenson, M. J., et al. Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity. Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).
  16. Magyar, J. S., Godwin, H. A. Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects. Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).
  17. Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. (Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions - a review. RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).
  18. Sigel, H., Martin, R. B. Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands. Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).
  19. Liu, J., et al. Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers. Chemical Reviews. 114 (8), 4366 (2014).
  20. Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).
  21. Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. Inorganic Chemistry. , Pearson. (2014).
  22. Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system. Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).
  23. Kocyła, A., Pomorski, A., Krężel, A. Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications. Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).
  24. Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions. Methods. 76, 137-148 (2015).
  25. NIST. Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).
  26. Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4′-dithiodipyridine. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).
  27. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).

Tags

जैव रसायन अंक 182
क्रोमोफोरस की उपस्थिति और अनुपस्थिति में सीयू (द्वितीय) और पेप्टाइड अवशेषों के बीच बाध्यकारी इंटरैक्शन की मात्रा निर्धारित करना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Choi, S., San Juan, J. A., Heffern,… More

Choi, S., San Juan, J. A., Heffern, M. C., Stevenson, M. J. Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores. J. Vis. Exp. (182), e63668, doi:10.3791/63668 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter