Summary
Denne artikkelen fokuserer på bruk av elektronisk absorpsjonsspektroskopi og isotermisk titreringskalorimetri for å undersøke og kvantifisere termodynamikken til Cu(II)-binding til peptider og proteiner.
Abstract
Kobber (II) er et essensielt metall i biologiske systemer, som gir unike kjemiske egenskaper til biomolekylene som det samhandler med. Det har blitt rapportert å binde seg direkte til en rekke peptider og spille både nødvendige og patologiske roller som spenner fra medierende struktur til elektronoverføringsegenskaper for å gi katalytisk funksjon. Kvantifisering av bindingsaffiniteten og termodynamikken til disse Cu(II)-peptidkompleksene in vitro gir innsikt i den termodynamiske drivkraften til binding, potensielle konkurranser mellom forskjellige metallioner for peptidet eller mellom forskjellige peptider for Cu(II), og utbredelsen av Cu(II)-peptidkomplekset in vivo. Kvantifisering av bindingstermodynamikken kan imidlertid være utfordrende på grunn av en myriade av faktorer, inkludert å ta hensyn til alle konkurrerende likevekter i et titreringseksperiment, spesielt i tilfeller der det mangler diskrete spektroskopiske håndtak som representerer peptidet, d-blokkmetallionet og deres interaksjoner.
Her er et robust sett med eksperimenter gitt for nøyaktig kvantifisering av Cu (II) -peptid termodynamikk. Denne artikkelen fokuserer på bruk av elektronisk absorpsjonsspektroskopi i nærvær og fravær av kromoforiske ligander for å gi det nødvendige spektroskopiske håndtaket på Cu (II) og bruken av etikettfri isotermisk titreringskalorimetri. I begge eksperimentelle teknikker beskrives en prosess for å redegjøre for alle konkurrerende likevekter. Mens fokuset i denne artikkelen er på Cu (II), kan det beskrevne settet av eksperimenter gjelde utover Cu (II) -peptidinteraksjoner, og gi et rammeverk for nøyaktig kvantifisering av andre metallpeptidsystemer under fysiologisk relevante forhold.
Introduction
Biologi har utviklet seg til å utnytte den mangfoldige kjemien til metallioner som trengs for at livet skal tilpasse seg og overleve i omgivelsene. Anslagsvis 25% -50% av proteiner bruker metallioner for struktur og funksjon1. Den spesielle rollen og redokstilstanden til metallionen er direkte relatert til sammensetningen og geometrien til de biologiske ligandene som koordinerer den. I tillegg må redoksaktive metallioner som Cu (II) reguleres tett slik at de ikke interagerer med oksidasjonsmidler via Fenton-lignende kjemi for å danne reaktive oksygenarter (ROS) 2,3,4. Å forstå bindingsmodusene og affiniteten som driver biokjemien, bør bidra til å belyse metallionets biologiske rolle.
Mange teknikker brukes til å studere bindingsinteraksjonene mellom metaller og peptider. Disse er for det meste spektroskopiske teknikker, men inkluderer også datasimuleringer ved hjelp av molekylær dynamikk, sett gjennom Cu (II) interaksjoner med et fragment av amyloid beta (Aβ) 5. En mye brukt spektroskopisk teknikk som er tilgjengelig for mange universiteter er kjernemagnetisk resonans (NMR). Ved å bruke den paramagnetiske naturen til Cu (II), kunne Gaggelli og medarbeidere vise hvor metallionet binder seg på et petide gjennom avslapning av nærliggende kjerner6. Elektronparamagnetisk resonans (EPR) kan også benyttes til å undersøke plasseringen og modusen til den paramagnetiskemetallionbindingen 7. Andre spektroskopiske teknikker som sirkulær dikroisme (CD) kan beskrive koordinasjonen om Cu(II) i systemer som tripeptidsystemer8, og massespektrometri kan vise støkiometri og hvilke rester metallionet koordineres gjennom fragmenteringsmønstre 9,10.
Noen av disse teknikkene, som NMR, er etikettfrie, men krever store konsentrasjoner av peptid, noe som gir utfordringer for studier. En annen vanlig teknikk kalt fluorescensspektroskopi har blitt brukt til å relatere posisjonen til en tyrosin eller tryptofan med slukking fra en Cu (II) 11,12. På samme måte kan denne teknikken vise strukturelle endringer som følge av Cu (II) binding13. Utfordringer med disse metallpeptidbindingsstudiene er imidlertid at de undersøker kromoforaminosyrer som tyrosin som ikke alle systemer har, at metallionet binder seg under en klassisk modell, og at teknikken kanskje ikke bidrar under fysiologiske forhold. Faktisk dukker det opp flere peptider som ikke inneholder slike kromoforaminosyrer eller binder seg under klassiske modeller, og utelukker bruken av disse teknikkene14,15. Denne artikkelen beskriver tilnærminger for å vurdere bindingsegenskaper i disse scenariene under fysiologisk relevante forhold.
Biologiske ligander kan vedta forskjellige protoneringstilstander som kan påvirke metallionbinding som imidazolringen på histidin. Hvis pH ikke opprettholdes konsekvent, kan resultatene være innviklede eller motstridende. Av denne grunn er buffere en viktig komponent i studiet av metall-protein / peptid-interaksjoner. Imidlertid har mange buffere vist seg å samhandle gunstig med metallioner16,17. I tillegg til å konkurrere med det biologiske molekylet av interesse, kan bufferen ha lignende koordinerende atomer som kan være vanskelig å skille fra de koordinerende atomene i peptidet eller proteinet. I denne studien fokuseres det på elektronisk absorpsjonsspektroskopi og isotermisk titreringskalorimetri (ITC) som to komplementære teknikker for å studere Cu(II)-peptidinteraksjoner, med spesielle hensyn til buffervalg.
Elektronisk absorpsjonsspektroskopi er en rask, allment tilgjengelig teknikk for å studere metallbindende interaksjoner. Bestråling med lys i ultrafiolette (UV) eller synlige bølgelengder kan føre til absorpsjon av metallsentrerte d-d-bånd, som gir verdifull informasjon om ligandklassifisering, metallgeometrier og tilsynelatende bindingsaffiniteter 18,19. For disse kompleksene kan direkte titreringer av metallioner til protein- eller peptidløsninger kvantifisere bindende støkiometrier og tilsynelatende bindingsaffiniteter. I noen tilfeller, for eksempel d5 eller d10 elektronkonfigurasjoner, absorberer komplekset ikke lys (dvs. er spektroskopisk stille). I disse spektroskopisk stille overgangsmetallkompleksene kan disse begrensningene omgås ved å bruke en konkurrerende ligand som ved koordinering til metallionet gir detekterbare ladningsoverføringsbånd. I begge tilfeller er denne tilnærmingen begrenset til å kvantifisere bare støkiometri og tilsynelatende bindingsaffinitet, og ingen innsikt i bindende entalpi er gitt uten tilnærminger.
Komplementerende informasjon hentet fra elektronisk absorpsjonsspektroskopi, er ITC en attraktiv teknikk for direkte og streng kvantifisering av bindingsentalpien20. ITC måler direkte varmen som frigjøres eller forbrukes under en bindingshendelse, og siden titrering skjer ved konstant trykk, er den målte varmen entalpien til alle likevekter (ΔHITC). I tillegg kvantifiseres støkiometrien til bindingshendelsen (n) og den tilsynelatende bindingsaffiniteten (KITC). Fra disse parametrene bestemmes fri energi (ΔGITC) og entropi (ΔSITC), noe som gir et termodynamisk øyeblikksbilde av bindingshendelsen. Siden det ikke er avhengig av lysabsorpsjon, er ITC en ideell teknikk for spektroskopisk stille arter, for eksempel d5 eller d10 metallionkomplekser. Siden kalorimetri måler varme, kan imidlertid eventuelle uovertrufne buffersystemer og ikke-regnskapsførte likevekter påvirke analysen negativt for å nøyaktig bestemme metallionbindende termodynamikk, og det må utvises stor forsiktighet for å løse disse faktorene20. Hvis itc utføres med riktig strenghet, er itc en robust teknikk for å bestemme termodynamikken til metallprotein/peptidkomplekser.
Her brukes et kromoforisk stille kobberbindende peptid, C-peptid, for å demonstrere komplementær bruk av de to teknikkene. C-peptid er et 31 rester spaltningsprodukt (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) dannet under insulinmodning; den mangler kromoforrester, men har vist seg å binde Cu(II) med fysiologisk relevant affinitet14,15. Cu(II)-bindingsstedet består av sidekjedene til et glutamat og et aspartat samt N-enden av peptidet14,15. Disse koordinerende atomene ligner på mange vanlige bufrede systemer. Her vises tandembruken av d-d- og ladningsoverføringsbåndene i elektronisk absorpsjonsspektroskopi og ITC for å kvantifisere Cu (II) bindende termodynamikk til C-peptid. Tilnærmingen fra å studere Cu (II) binding til C-peptid kan brukes på andre metallioner og protein / peptid systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Elektronisk absorpsjonsspektroskopi: direkte titrering med bufferkonkurranse
- Prøve forberedelse
- Forbered en bufret løsning av 50 mM 2-[bis(2-hydroksyetyl)amino]-2-(hydroksymetyl)propan-1,3-diol (bisTris) ved pH 7.4 ved bruk av ultrarent vann (>18 MΩ motstand). Fjern spormetallioner ved å inkubere med en høyaffinitetsharpiks i minst 2 timer med påfølgende filtrering.
- Løs opp eller fortynn en kjent mengde av peptidet i den metallfrie bufferen.
MERK: Ved overvåking av d-d-bånd med små utryddelseskoeffisienter21, må høyere konsentrasjoner av peptid brukes. Her var den endelige konsentrasjonen av C-peptid i bufret løsning 300 μM (volumet avhenger av størrelsen på kyvetten). C-peptid ble syntetisert ved fastfase peptidsyntese og er beskrevet andre steder i litteratur14. - Løs opp en kjent masse CuCl2 i ultrarent vann for å lage en løsning ved 10-15 mM.
MERK: Det er viktig å først oppløse metallsaltet i ikke-bufret vann for å forhindre nedbør. Andre Cu(II)-salter kan brukes, men det må utvises forsiktighet for å sikre at anionen er svakt koordinerende.
- Kjøre eksperimentet
- Slå på det elektroniske absorpsjonsspektrofotometeret og la det varme opp i ~ 15-20 minutter før bruk. Start spektrofotometerprogramvaren og konfigurer parametrene som skanneområde (200-900 nm), skannehastighet (200 nm / s) og dobbeltstråle grunnlinjekorrigert (flere parametere er oppført i tilleggsfilen).
- Samle en grunnlinje uten kyvetter eller prøver i strålebanene.
- Bruk to matchede kyvetter i dobbeltstrålespektrofotometeret til å fylle den ene kyvetten med 115 μL ultrarent vann og den andre kyvetten med 115 μL av peptidprøven. Forsikre deg om at det ikke er luftbobler i kyvettene, da disse vil forstyrre signalet.
- Plasser kyvetten med ultrarent vann i referansestrålen og kyvetten med peptid i prøvestrålen.
- Samle absorpsjonsspekteret til det metallfrie (apo) peptidet.
- Tilsett en sub-støkiometrisk mengde (0,5 ekvivalenter, 150 μM) av Cu(II)-løsningen i kyvetten med peptidprøven. Forsikre deg om at volumet av Cu (II) tilsatt er mindre enn 3 μL og registrer volumet for analyse senere.
- Pipetter forsiktig opp og ned for å blande oppløsningen samtidig som du unngår generering av luftbobler. La løsningen reagere og balansere i 5 minutter og registrere absorpsjonsspekteret.
- Gjenta tilsetningen av Cu(II)aliquots som i trinn 1.2.6 i peptidoppløsningen for følgende ekvivalenter: 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 og 5.0 (eller totalt 300, 450, 600, 900 og 1,500 μM). Sørg for å registrere det totale volumet av Cu (II) lagt til og det totale volumet av kyvetten.
MERK: Hvis du ønsker mer oppløsning, reduserer du avstanden mellom ekvivalenter. - Fjern prøvekyvetten og rengjør grundig i henhold til produsentens anvisninger.
- Tilsett den bufrede løsningen uten peptid og registrer absorpsjonsspekteret. Gjenta tilsetningen av Cu(II)aliquots som i trinn 1.2.5-1.2.8, og registrer absorpsjonsspekteret for hver Cu(II)-ekvivalent.
- Eksporter alle spektrene som csv-filer for behandling. Rengjør kyvettene grundig i henhold til produsentens instruksjoner og slå av spektrofotometeret.
- Behandling av dataene
- Last inn alle spektra på et regnearkprogram.
- Trekk bufferspekteret (0 μM Cu(II)) fra alle andre spektrum for å fjerne eventuelle absorbansfunksjoner fra selve bufferen.
- Normaliser hvert spektrum for å ta hensyn til fortynningen som følge av tilsetningen av Cu(II)-løsningen (trinn 1.2.6). Se tilleggsfilen, Eq (1)14 for et eksempel på normaliseringen der vinitial er volumet (115 μL) av peptid tilsatt kyvetten, vCu(II) er volumet av Cu(II)-løsning tilsatt i trinn 1.2.6, og Absbuffer subtrahert spektrum er dataene oppnådd i trinn 1.2.7.
- Graf alle spektra sammen for å identifisere regioner av endring.
MERK: Typiske d-d-bånd fra Cu (II) komplekser varierer fra 500 til 750 nm. Denne spektrofotometriske titreringen kan være utfordrende på grunn av den lille utryddelseskoeffisienten fra d-d-bånd, som er Laporte-forbudte overganger i oktaedrisk geometri21. Hvis absorbansen er for svak, er en alternativ tilnærming å benytte kromoforiske ligander som resulterer i ladningsoverføringsbånd ved binding til Cu (II) (se avsnitt 2).
2. Elektronisk absorpsjonsspektroskopi: peptidkonkurranse med kromoforligand
- Prøve forberedelse
- Løs opp 1,10-fenantrolin (fen) i ultrarent vann for å oppnå en endelig konsentrasjon på ~ 1 mM.
- I tillegg til prøvepreparatet beskrevet i pkt. 1.1 for peptidet (trinn 1.1.2) og Cu(II) (trinn 1.1.3), klargjør du en 10 μM Cu(II) og 40 μM fenoppløsning i buffer ([Cu(phen)3]2+). Sørg for at volumet fyller kyvetten.
- Kjøre eksperimentet
- Start det elektroniske absorpsjonsspektrofotometeret som i trinn 1.2.1 og 1.2.2, men sett skanneområdet til 200–400 nm.
- I to matchede kyvetter legger du på den ene kyvetten med 115 μL ultrarent vann og den andre kyvetten med 115 μL av [Cu(phen)3]2+- løsningen. Plasser kyvetten med vann i referansestrålen og kyvetten med [Cu(phen)3]2+ løsning i prøvestrålen.
- Samle absorpsjonsspekteret til metallligandkomplekset.
- Tilsett en støkiometrisk mengde (≈1 ekvivalenter, ≈10 μM) peptid til [Cu(phen)3]2+- løsningen. Pipetter forsiktig opp og ned for å blandes grundig, men vær forsiktig så du ikke introduserer luftbobler. Registrer volumet av peptid tilsatt for fremtidig analyse.
MERK: Ved å bruke kyvetter som holder 115 μL, gir tilsetning av 3,83 μL 300 μM peptid en endelig peptidkonsentrasjon på 9,7 μM. - Inkuber løsningen i 5 minutter for å nå likevekt. Registrer absorpsjonsspekteret.
MERK: Hvis bindingsaffiniteten til metallpeptidet og metallliganden er lik, må konsentrasjonen av tilsatt peptid være i stort overskudd. Pass på å ta hensyn til det totale volumet av peptid tilsatt for normalisering. - Gjenta tilsetningen av peptid aliquots i [Cu (phen) 3] 2 + løsning for følgende omtrentlige ekvivalenter: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 22 og 26. Registrer volumet av tilsatt peptid slik at den fortynnede konsentrasjonen kan bestemmes.
- Fjern prøven og rengjør kyvetten grundig i henhold til produsentens instruksjoner. Samle et spekter av bufferen. Samle et spektrum på 50 μM peptid i bufferen.
- Eksporter alle data som csv-filer for behandling og rengjør kyvettene i henhold til produsentens instruksjoner.
- Behandling av dataene
- Last inn spektrene på et regnearkprogram og trekk bufferspekteret fra de andre spektrene.
- Normaliser spektrene etter Tilleggsfil, Eq (2)14.
- Ved å bruke ekstinksjonskoeffisienten for [Cu(phen)3]2+ ved 265 nm (εmax = 90 000 M-1 cm-1)22, bestem konsentrasjonen av [Cu(phen)3]2+ med hver tilsetning av peptidet.
- For hver addisjon av peptidet, bestem konsentrasjonen av Cu(II)-peptidkomplekset ved å trekke den gjenværende konsentrasjonen av [Cu(phen)3]2+, som bestemt i trinn 2.3.2, fra den opprinnelige konsentrasjonen av [Cu(phen)3]2+ (ved 0 μM peptid).
- Beregn konsentrasjonen av fri fenligand ved ligningen i Supplemental File, Eq (3) 14.
- Beregn konsentrasjonen av fritt peptid ved hjelp av Supplemental File, Eq (4)14, der [peptid]stock representerer det ufortynnede peptidet titrert inn i kyvetten, V1 representerer volumet av tilsatt stampeptid, V2 er kyvettens totale volum, og [Cu2+-peptide] bestemmes i trinn 2.3.4.
- Beregn den eksperimentelle bindingsaffiniteten (Kex) ved hjelp av Eq (5) i tilleggsfil23.
- Relatere dissosiasjonskonstanten til Cu(II)-peptidet til Kex ved Eq (6)23 i Supplemental File, hvor Kd,Cu(II)-phen = 1,0 × 10-9 (se 22). Bestem gjennomsnittet og standardavviket fra alle bestemte dissosiasjonskonstanter.
MERK: Under et 4: 1-forhold mellom fen: Cu (II), [Cu (phen) 3] 2 +, [Cu (phen) 2] 2 + og [Cu (phen) ] 2 + eksisterer i løsningen, og peptidet vil chelat Cu (II) vekk fra arten ([Cu (phen)] 2 +) med den svakeste bindingen22.
3. Isotermisk titreringskalorimetri
- Prøve forberedelse
- Forbered en bufret løsning av 15 mM 3-morfolinopropan-1-sulfonsyre (MOPS) ved pH 7,4 ved bruk av ultrarent vann (>18 MΩ motstand). Fjern spormetallioner ved å inkubere med en høyaffinitetsharpiks i minst 2 timer med påfølgende vakuumfiltrering gjennom en flasketopp 0,45 μm membran.
- Løs opp en kjent masse CuCl2 i ultrarent vann for å fremstille en løsning på ≈50-100 mM. Fortynn denne Cu(II)-løsningen til buffer for å oppnå en 1,0 ml løsning med endelig konsentrasjon på 1,4 mM Cu(II). Registrer det nøyaktige volumet av CuCl2-løsningen som brukes.
- Løs opp eller fortynn peptidoppløsningen i buffer for å lage 450 μL av en 154 μM peptidløsning. Sørg for at samme andel ekstra ultrarent vann fra trinn 3.1.2 tilsettes peptidløsningen, noe som vil redusere fortynningsvarmen og øke signal-til-støy.
- Etter klargjøring av prøvene, sørg for at løsningene har samme pH og, om nødvendig, juster deretter.
- Valgfritt trinn: Degas løsningene for å minimere mikrobobler lastet inn i ITC.
- Kjøre eksperimentet
- Slå på ITC. Start ITC-programvaren for å kjøre instrumentet. Vent til den første initialiseringen, som vil be om å omplassere buret; Følg deretter instruksjonene på skjermen.
- Fjern omslaget fra referansecellen. Fjern eventuelt vann fra referansecellen og skyll tre ganger med 450 μL avgasset ultrarent vann.
- Trekk sakte opp ultrarent vann til 450 μL-merket på en lastesprøyte, og pass på at luftbobler ikke føres inn i sprøyten. Stikk sprøyteinnsprøyten inn i referansecellen til den er ≈1 mm fra bunnen, og injiser en del av oppløsningen langsomt til det gjenstår 150 μL i sprøytesprøyten. Beveg sprøytestemplet raskt opp og ned med ≈25 μL flere ganger for å løsne eventuelle bobler på celleoverflaten. Injiser langsomt til stempelet når 100 μL-merket på sprøytesprøyten, og derved dispenseres totalt 350 μL ultrarent vann inn i referansecellen, og erstatt referansecelledekselet.
- Fjern eventuell gjenværende oppløsning fra prøvecellen og last med 450 μL 10 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) ved hjelp av en lastesprøyte. Bløtlegg i 10 minutter for å sikre at spormetallioner fjernes fordi EDTA vil binde spormetaller.
- Fjern EDTA-oppløsningen (med bundne spormetallioner) og skyll startsprøyten grundig med store mengder ultrarent vann.
- Rengjør ITC i samsvar med produsentens anvisninger, skyll prøvecellen med ultrarent vann.
- Kondisjoner prøvecellen ved å skylle med 450 μL buffer minst tre ganger.
- Fjern bufferen som betinger eksempelcellen. Legg peptidoppløsningen inn i prøvecellen ved hjelp av startsprøyten (følg trinn 3.2.3).
- Skyll titreringssprøyten med 200 μL bufret oppløsning. For å gjøre dette, fjern stempelet og bruk en mikropipette til å pipettere bufferen gjennom hullet på toppen av glasstitreringssprøyten, gjennom sprøyten og ut nålen under.
- Sett stempelet helt inn i titreringssprøyten.
- Dypp tuppen av titreringssprøytålen i metalloppløsningen og trekk stempelet sakte opp, slik at metalloppløsningen fyller sprøyten og resulterer i et tomromsvolum på toppen av glassdelen av titreringssprøyten. Fjern det meste av tomrommet ved å rotere titreringssprøyten parallelt med gulvet, fjern stempelet og vipp glassdelen litt mot gulvet. Ristingssprøyten forsiktig slik at oppløsningen beveger seg til enden av glassdelen av titreringssprøyten og fyller det meste av tomrommet, men sørg for at 2-3 μL tomromsvolum forblir. Mens du holder sprøyten parallelt med gulvet, setter du stempelet inn igjen.
- Hold titreringssprøyten loddrett, dypp nålespissen tilbake i metalloppløsningen og skyv stempelet ned til det ikke lenger kommer luft ut av nålen. Legg i titreringssprøyten ved å trekke stempelet sakte opp til rett over 50 mikrolitersmerket mens du holder nålespissen i oppløsningen.
- Sett glassdelen av titreringssprøyten forsiktig inn i buret og skru den til den er stram med fingeren. Når en liten mengde oppløsning kommer ut av titreringssprøyten på grunn av kompresjon av stempelet, bruk en lett, delikat visker for å absorbere oppløsningen forsiktig uten å berøre nålespissen.
- Sett buret med titreringssprøyte inn i prøvecellen og fest den sikkert.
- Sett opp parametrene på ITC-programvaren. Start på Instrument Control, still inn omrøringshastigheten (typiske omrøringshastigheter varierer fra 150 til 350 RPM) og temperaturen der eksperimentet skal utføres (typisk 25 ° C). Angi sprøyte- og cellekonsentrasjoner i millimolarenheter under Eksperimentdetaljer.
- I delen Eksperimentmetode velger du Trinnvis titrering. Klikk på Oppsett og angi 20 injeksjoner på 2,5 μL. Hvis det er behov for mer bedring for å observere bindingshendelsen, øker du antall injeksjoner og reduserer volumet per injeksjon. Angi tidsavstanden mellom hver injeksjon slik at den er lang nok til at signalet kan balanseres og gå tilbake til baseline, vanligvis 300 s.
- Klikk kjør-knappen for å starte eksperimentet og angi hvor dataene skal lagres.
- Når eksperimentet er fullført, rengjør prøvecellen og titreringssprøyten.
- Kjør alle eksperimenter i minst tre eksemplarer for å sikre presis datainnsamling.
- Kjør et kontrolleksperiment der metallløsningen titreres i den bufrede løsningen (i fravær av peptid) for å sikre at fortynningsvarmen fra metallionet er liten og at det ikke er noen uavklarte likevekter. Hvis fortynningsvarmen er stor, bør du vurdere et annet buffersystem, hvis mulig.
- Behandling av dataene
- Start ITC-analyseprogramvaren og last inn datafilen for analyse.
- Gå til kategorien Grunnlinje , og inspiser termogrammet. Legg merke til eventuell eksogen varme utviklet eller absorbert fra luftbobler eller andre gjenstander i termogrammet. Se etter pigger som ikke skyldes injeksjon av metallløsningen.
- Sørg for at grunnlinjen som genereres av analyseprogramvaren, følger den delen av dataene etter injeksjon og likevekt. Hvis det avviker, bruker du opprinnelige pivotpunkter til å justere grunnlinjen. Sørg for at integrasjonsregionene inkluderer toppen som genereres fra injeksjon av metallet, men okkluderer eventuelle luftbobler eller artefakter i termogrammet som ble funnet i trinn 2. Trekk grunnlinjen fra termogrammet.
MERK: Denne typen manipulasjon anbefales bare etter at flere thermogrammer er samlet inn, slik at eksperimentøren vet hva som er reelle data og hva som er en artefakt, da justering av grunnlinjen og integrasjonsregionene kan påvirke dataene drastisk. - Naviger til modelleringsvinduet for å begynne å tilpasse dataene der analyseprogramvaren viser de integrerte og konsentrasjonsnormaliserte dataene for hver injeksjon.
- Venstreklikk på datumet til den første injeksjonen for å fjerne det fra tilpasningsalgoritmen.
MERK: Dette er vanlig siden det vil være mindre blanding mellom titranten og prøvecelleoppløsningen som fører til unøyaktig molar dispensering av den første injeksjonen. - I Modeller-delen velger du Tom (konstant) i rullegardinmenyen Stil , som er basert på den endelige injeksjonsentalpien og trekkes fra hvert datapunkt, og tar hensyn til fortynningsvarmen. I tillegg velger du Uavhengig (eller den beste modellen for systemet) i den andre rullegardinmenyen Stil for å få plass til dataene.
MERK: For standard 1:1-bindingssamhandlinger er den vanligste modellen Uavhengig. - Tilpass dataene ved hjelp av de to modellene ved å trykke på den grønne avspillingsknappen med en Σ.
MERK: En annen programvare for å behandle ITC-data er SEDPHAT24. - Redegjøre for alle konkurrerende likevekter i post hoc-analyser tidligere rapportert av Grossoehme et al. 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet var å kvantifisere og bekrefte termodynamikken til Cu (II) binding til C-peptid ved hjelp av komplementære teknikker for elektronisk absorpsjonsspektroskopi og ITC. På grunn av den robuste karakteren av elektronisk absorpsjonsspektroskopi ble det utført en direkte titrering av Cu(II) til 300 μM C-peptid (figur 1). Tilsetning av 150 μM Cu (II) forårsaket en umiddelbar økning i båndet ved 600 nm, tilskrevet d-d-båndet til Cu (II), og fortsatte å øke til 300 μM Cu (II) ble tilsatt. Ytterligere tillegg over 300 μM Cu (II) økte ikke absorpsjonen av d-d-båndet, noe som indikerer metning og at Cu (II) binder seg til C-peptid i et 1: 1-kompleks. Videre, på grunn av den relativt høye affiniteten til bis-Tris for binding til Cu(II) (log K = 5,27)16, bør Cu(II)/C-peptid affinitet ha en nedre grense i mikromolarområdet (log K > 6) for å chelatere metallionet bort fra bufferen. I dette systemet er nøyaktig kvantifisering av absorpsjonsbåndene utfordrende på grunn av den lille utryddelseskoeffisienten.
For å omgå den lille utryddelseskoeffisienten til d-d-båndet ble en kromoforisk ligand, fen, brukt som beskrevet ovenfor. C-peptid ble titrert til ≈10 μM [Cu(phen)3]2+ (figur 2A), og absorpsjonen fra ladningsoverføringsbåndet ved 265 nm ble redusert (figur 2B), noe som indikerer at C-peptid var i stand til å chelatere Cu(II) fra fenliganden. Ved nærmere ettersyn var det behov for en stor konsentrasjon av C-peptid (opptil 140 μM) for beskjedent å utkonkurrere fenliganden (tab 1). Dette er ikke overraskende gitt de store sekvensielle formasjonskonstantene for [Cu(phen)3]2+ (henholdsvis 9,0, 15,7 og 20,8 for log K1, β2 og β3)22. Analyse av spektrene viser at Cu(II)/C-peptidbindingsaffiniteten ligger i området log K = 7,4-7,8 (tabell 1).
Gullstandarden for å måle den komplette termodynamikken til en bindende interaksjon er ITC. Figur 3 gir et representativt termogram av Cu(II) titrert til C-peptid i 15 mM MOPS, pH 7,4, som gir konkurransen om Cu(II). Her ble MOPS-buffer brukt i stedet for bis-Tris-buffer fordi KCu(II)-MOPS < KCu(II)-bis-Tris16,25, og ville gi mindre konkurranse slik at ITC nøyaktig kan måle affiniteten (se diskusjon). Gjennom å måle varmen som forbrukes eller utvikles blant alle likevekter, gir thermogrammet en sigmoidal form. Innledende injeksjoner av Cu(II) før peptidet er mettet resulterer i store mengder varme sammenlignet med fortynningsvarmen. Forskjellen i disse verdiene av varme er ΔHITC. Bøyningspunktet beskriver to nyttige opplysninger. Den første er bindingsstøkiometrien til arten i sprøyten sammenlignet med arten i cellen (dvs. Cu(II):C-peptid er 1:1). For det andre er hellingen på passformen ved bøyningspunktet direkte proporsjonal med KITC. Etter innsamling av data i tre eksemplarer og i flere buffere ble det utført en post hoc-analyse20 der alle konkurrerende likevekter er regnskapsført (tabell 2), og den bufferuavhengige termodynamikken bestemmes. For Cu(II)-binding til C-peptid, KCu(II)/C-peptid = 1 (± 1) x 108 og ΔHCu(II)/C-peptid = -8 (± 4) kJ mol-1. Fra disse bestemmes andre bindende termodynamiske parametere der ΔG°Cu(II)/C-peptide = -46 (± 4) kJ mol-1 og ΔSCu(II)/C-peptide = 120 (± 10) J mol-1 K-1 (se 15).
Figur 1: Overvåking av Cu(II) d-d-båndet ved tilsetning av 150, 300, 450, 600, 900 og 1 500 μM Cu(II) til 300 μM C-peptid i 50 mM bis-Tris, pH 7,4. D-d-båndet til Cu (II) øker ved 600 nm til et 1: 1 Cu (II): C-peptidkompleks dannes. Tidligere rapporterte Magyar og Godwin at Cu(II)-bis-Tris affinitet er log K = 5,2716. Denne titreringen viser at C-peptid kan utkonkurrere bufferen for å binde Cu(II) og indikerer en Cu(II)/C-peptid affinitet i mikromolarområdet. Denne figuren er gjengitt med tillatelse fra Stevenson et al.14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Dannelse av [Cu(phen)3]2+ og representative elektroniske absorpsjonsspektra som overvåker reduksjonen av ladningsoverføringsbåndet ved tilsetning av C-peptid. (A) Reaksjonsskjemaet som viser dannelsen av [Cu(phen)3]2+ og dets ladningsoverføringsbånd sentrert ved 265 nm (ε° ≈ 90 000 M-1 cm-1)22. Formasjonskonstantene er 9,0, 15,7 og 20,8for henholdsvis logg K1, β2 og β3. (B) Representative elektroniske absorpsjonsspektra som overvåker reduksjonen av ladningsoverføringsbånd fra [Cu (phen) 3] 2 + som C-peptid chelater Cu (II). Titreringen ble utført i 50 mM bis-Tris, pH 7,4. Dataanalyse er vist i tabell 1. Denne figuren er gjengitt med tillatelse fra Stevenson et al.14. Forkortelse: MLCT = metall til ligand ladningsoverføring. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative termogrammer av Cu(II) titrert til C-peptid og buffer. (A) Dette representative termogrammet viser titrering av 1,4 mM Cu(II) til 154 μM C-peptid i 15 mM MOPS, pH 7,4. Dataene passer til en ettstedsmodell med følgende parametere: n = 1,2 ± 0,1; Kd,ITC = 6 (± 3) x 10-7; ΔHITC = −3,4 ± 0,2 kJ mol-1. (B) En representativ kontrolltitrering av 1,4 mM Cu(II) til 15 mM MOPS, pH 7,4, i fravær av C-peptid som ikke viser noe bindende termogram som ses i panel A. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| [C-peptid] | En265 | [Cu(fen)3] 2+ | [Fen] gratis | [C-peptid] gratis | [Cu(II)/C-peptid] | Kex (x108) | KdCu (II) / C-peptid | logg KdCu (II) / C-peptid | |
| 0.0 | 1.0649 | 11.83 | 4.5 | 0 | 0.00 | Nd | Nd | Nd | |
| 9.7 | 0.9948 | 11.05 | 6.84 | 7.45 | 0.78 | 0.0543 | 1.84E-08 | 7.75 | |
| 18.7 | 0.9785 | 10.87 | 7.38 | 16.00 | 0.96 | 0.0367 | 2.73E-08 | 7.56 | |
| 27.3 | 0.9651 | 10.72 | 7.83 | 24.09 | 1.11 | 0.0310 | 3.23E-08 | 7.49 | |
| 35.3 | 0.9475 | 10.53 | 8.42 | 31.55 | 1.30 | 0.0307 | 3.26E-08 | 7.49 | |
| 42.8 | 0.9374 | 10.42 | 8.75 | 38.79 | 1.42 | 0.0288 | 3.48E-08 | 7.46 | |
| 50.0 | 0.9283 | 10.31 | 9.06 | 45.64 | 1.52 | 0.0275 | 3.63E-08 | 7.44 | |
| 56.7 | 0.9134 | 10.15 | 9.55 | 51.92 | 1.68 | 0.0288 | 3.47E-08 | 7.46 | |
| 63.1 | 0.9025 | 10.03 | 9.92 | 57.97 | 1.81 | 0.0291 | 3.43E-08 | 7.46 | |
| 69.2 | 0.8927 | 9.92 | 10.24 | 63.73 | 1.91 | 0.0294 | 3.40E-08 | 7.47 | |
| 75.0 | 0.878 | 9.76 | 10.73 | 69.04 | 2.08 | 0.0314 | 3.19E-08 | 7.50 | |
| 85.7 | 0.8542 | 9.49 | 11.53 | 78.99 | 2.34 | 0.0341 | 2.93E-08 | 7.53 | |
| 95.4 | 0.8316 | 9.24 | 12.28 | 88.01 | 2.59 | 0.0371 | 2.69E-08 | 7.57 | |
| 104.3 | 0.8151 | 9.06 | 12.83 | 96.38 | 2.78 | 0.0387 | 2.58E-08 | 7.59 | |
| 112.4 | 0.7976 | 8.86 | 13.41 | 103.98 | 2.97 | 0.0411 | 2.44E-08 | 7.61 | |
| 126.9 | 0.7809 | 8.68 | 13.97 | 117.87 | 3.16 | 0.0411 | 2.44E-08 | 7.61 | |
| 139.2 | 0.7586 | 8.43 | 14.71 | 129.53 | 3.40 | 0.0437 | 2.29E-08 | 7.64 | |
| Rekkevidde | 7.4-7.8 | ||||||||
Tabell 1: Representative beregninger for konsentrasjoner av arter i løsning fra figur 2B. Alle konsentrasjoner er i mikromolar. Denne tabellen er gjengitt med tillatelse fra Stevenson et al.14.
| Equlibria | n | ΔH (kJ mol-1) | n × ΔH (kJ mol-1) |
| Cu(II)-MOPS → Cu(II) + MOPS | 1 | 5.4 | 5.44 |
| MOPS + H + → MOPS-H + | 0.097 | -21,0 | -2,04 |
| Cu (II) + C-peptid-H + → Cu (II) / C-peptid + H + | 1 | X | X |
| ΔHITC = Χ + 3,40 | |||
| Χ = ΔHITC − 3,40 | |||
| Χ = ΔHCu(II)/C-peptid = −6,8 kJ mol-1 |
Tabell 2: Post hoc-analyse for å bestemme ΔHCu(II)/C-peptid. Som vist i figur 3 ble 1,4 mM Cu(II) titrert til 154 μM C-peptid i 15 mM MOPS, pH 7,4, i tre eksemplarer. Etter å ha regnet med alle konkurrerende likevekter vist i tabellen, er ΔHCu (II) / C-peptid funnet å være -8,66 kJ mol-1. Antall protoner forskjøvet fra C-peptid av Cu (II) bestemmes fra skråningen til (ΔHITC + ΔHCu (II) -Buffer) vs ΔHBuffer-H hvor data samles inn i flere buffere. Alle entalpiverdier finnes i NIST25 eller bestemmes andre steder i litteratur15. Alle konkurrerende likevekter er redegjort for som beskrevet av Grossoehme et al.20 Dette tallet er gjengitt med tillatelse fra Stevenson et al.15.
Tilleggsfil: Relevante ligninger som brukes i protokolldelen og tilleggsparametere for elektronisk absorpsjonsspektrofotometer og ITC-oppsett. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen gir en robust metode for å kvantifisere affiniteten og termodynamikken til Cu(II)-bindingen til peptider. Komplekser med Cu (II) er ideelt egnet til å overvåke d-d absorpsjonsbåndet på metallstedet på grunn av sin d9 elektronkonfigurasjon. Selv om ekstinksjonskoeffisienten er liten, og dermed krever større konsentrasjoner av komplekset for å gi et pålitelig signal, kan titreringer av Cu(II) til peptid raskt gi innsikt i bindende støkiometri og omtrentlig bindingsaffinitet. Det kan imidlertid være utfordrende å skille en forskjell i spektra hvis metallet koordineres av lignende atomer og geometrier fra både buffer og peptid. For å bestemme bindingsaffiniteten kvantitativt, brukes kromoforiske ligander som fen ofte på grunn av deres symmetri-tillatte ladningsoverføringer med metallioner21. Gjennom å sette opp en konkurranse mellom en kromoforisk ligand og et ikke-kromoforisk peptid og ved å kjenne metallets affinitet til liganden, kan metallpeptidaffiniteten direkte bestemmes. Videre termodynamisk analyse ved bruk av elektronisk absorpsjonsspektroskopi er utfordrende. For å kvantifisere bindingsentalpien ved hjelp av en teknikk som UV-Vis-spektroskopi, må bindingsaffiniteten bestemmes ved flere temperaturer og en van't Hoff-analyse utføres. Denne analysen antar at den spesifikke bindingsvarmen er null, noe som sjelden er sant og dermed bare gir en estimering av bindingsentalpien20.
Isotermisk titreringskalorimetri er bedre egnet til å belyse en mer fullstendig oversikt over termodynamikken til metall-peptid-interaksjoner. I denne teknikken titreres et metallion i peptidoppløsningen, og varmen fra forskjellige likevekter måles direkte. Siden eksperimentet utføres ved konstant trykk, er varmen målt av ITC lik entalpi. ITC kan overvinne noen av begrensningene ved elektronisk absorpsjonsspektroskopi, for eksempel å studere spektroskopisk stille metallioner og ikke trenger å gjøre antagelsene som gjort i van't Hoff-analysen. Noen ganger genererer imidlertid reaksjonene som finner sted i ITC liten eller ingen varme og blir derfor ikke observert. Dette kan omgås gjennom enten økende konsentrasjoner av metall og peptid eller ved å bruke en annen buffer med en annen entalpi av protonering. Sistnevnte er spesielt nyttig hvis metallionet fortrenger flere protoner ved binding til peptidet. Imidlertid gir begge teknikkene - ITC og elektronisk absorpsjonsspektroskopi - ortogonale metoder for å studere det samme systemet og utfylle hverandre godt.
Det er mange utfordrende aspekter i begge teknikkene når man studerer metallioner som binder seg til peptider. Mange metallioner er uoppløselige eller sparsomt oppløselige i vann. Dette forverres ytterligere av utfelling av metallionet når det tilsettes buffer. I ITC kan dette manifesteres ved en langsom, gradvis endring i grunnlinjen og store mengder varme som genereres når metallet injiseres. Dette indikerer store verdier av fortynningsvarme selv etter at peptidet ville bli mettet av metallion. I elektronisk absorpsjonsspektroskopi manifesterer metallionutfelling seg gjennom økt absorpsjon ved lavere bølgelengder og ligner en bred topp sentrert i UV-regionen. I begge teknikkene må eksperimentøren sørge for at metallionet er løselig under de valgte forholdene (f.eks. Buffer, pH, temperatur, konsentrasjon). En annen begrensning for begge metodene kan vise seg gjennom begrepet tilleggsordre. I noen tilfeller kan et metallkompleks dannet være labilt, mens tilsetning av de samme reagensene i en annen rekkefølge vil gjøre en annen mellomliggende art inert. Denne illustrasjonen av kinetisk versus termodynamisk kontroll hindrer nøyaktig analyse av alle konkurrerende likevekter.
Både ITC og elektronisk absorpsjonsspektroskopi er avhengige av konkurranser mellom peptidet og enten buffer eller ligand for binding av metallionet. Her introduseres c-verdien, som bidrar til å identifisere om KITC kan bestemmes nøyaktig av tilpasningsalgoritmen. C-verdien er definert i Supplemental File, Eq (7)20, hvor n er støkiometri, KITC er den tilsynelatende bindingsaffiniteten, og [prøvecelle] er konsentrasjonen av arten i prøvecellen. Når c-verdien er mellom 1 og 1000, er den bestemte KITC nøyaktig. C-verdier under 1 kan imidlertid bare gi en øvre grense til KITC, mens c-verdier over 1 000 bare kan gi en nedre grense20. Dette er verdien av å samle inn data fra komplementære teknikker: Hvis noe blir savnet i en teknikk på grunn av begrensningene, kan det bli fanget i sin komplementære teknikk. I disse forsøkene, hvis konkurransen er sterkt favorisert til en art (dvs. metallionaffiniteten til peptidet er mye større enn bufferens affinitet), vil likevektene bli forskjøvet, noe som gjør det vanskelig å tolke. Dette er også vist i detalj av Kocyla et al.23. For å omgå denne utfordringen brukes ofte innføring av eller erstatning med en annen konkurrerende ligand, eller valg av en annen buffer for å øke konkurransen mellom ligand og peptid for nøyaktig kvantifisering. Dette skyldes at forskjellen mellom metallbuffer (eller metallligand) og metallpeptid affiniteter vil tillate at c-verdien faller innenfor vinduet på 1 til 1000. Det skal imidlertid bemerkes at bruken av en konkurrerende ligand eller en annen buffer for kvantitativ analyse krever at de termodynamiske parametrene til metallligand- eller metallbufferkomplekset er kjent eller kan bestemmes på annen måte.
Til slutt kan det være utfordrende å kvantifisere peptidkonsentrasjonen nøyaktig. Noen vanlige måter å kvantifisere peptidkonsentrasjoner på er å måle spesifikke aminosyrer og relatere mengden av disse aminosyrene til sekvensen av peptidet. For eksempel kan elektronisk absorpsjonsspektroskopi måle aromatiske rester som tyrosin, Ellmans reagens kan kvantifisere antall frie tioler26, og Bradford-analyser gir en indikasjon på hvor mange rester som er tilstede27. Dessverre har peptider som den som ble brukt i denne studien ikke aromatiske rester eller frie tioler, og Bradford-analyser gir utfordringer når man sammenligner standarder fra massive proteiner med det lille peptidet av interesse. I stedet ble peptidkonsentrasjonen bestemt av tørr masse. Selv om det ikke er ideelt og utsatt for konsentrasjoner som er små overestimeringer av peptidkonsentrasjon (da de tilsynelatende massemålingene sannsynligvis er høyere enn faktiske peptidmasser på grunn av tilstedeværelsen av salter), ble alle aliquots for måling behandlet likt, noe som muliggjør mer nøyaktige sammenligninger. Hvis konsentrasjonen av fritt peptid er lavere enn forventet, representerer den beregnede bindingsaffiniteten i de spektroskopiske studiene en nedre grense (Supplemental File, Eq (5) og Eq (6)). Det er utfordringer knyttet til begge teknikkene som vises, men med litteraturen som rettesnor kan mange overvinnes.
Den eksperimentelle tilnærmingen som er beskrevet her, muliggjør nøyaktig kvantifisering av metall-peptidbindende termodynamikk. Både ITC og elektronisk absorpsjonsspektroskopi er ortogonale og gir innsikt i bindingsaffiniteten, men ITC muliggjør direkte entalpikvantifisering. Når disse termodynamikkene er kvantifisert, kan det utledes om disse metallpeptidkompleksene kan dannes under fysiologiske forhold. Etter hvert som forståelsen av fysiologisk metallionfluks vokser, kan man forutsi om bindingsaffiniteten er sterk nok til kompleksdannelse in vivo . Videre kan forskeren lage prediksjoner om konkurranser mellom flere metallioner for samme peptid eller flere peptider for samme metallion. Når man ser på disse konkurransene mellom metallion og peptider, kan forskeren begynne å forstå hva som bidrar til bindingsaffiniteten til metallpeptidkomplekset ved å analysere den frie energien i entalpi- og entropibidrag. Termodynamikk er en integrert del av å sette pris på det dynamiske samspillet mellom metallioner og peptider, og ITC og elektronisk absorpsjonsspektroskopi gir håndtak for å forhøre disse systemene. Metodene beskrevet her kan utvides og brukes til å studere andre metallionbindende interaksjoner med makromolekyler, og kan ha implikasjoner i fysiologiske prosesser, legemiddeldesign og mer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
SC takker Whitehead Summer Research Fellowship. MJS takker oppstartsfondene og fakultetets utviklingsfond ved University of San Francisco. MCH anerkjenner finansiering fra National Institutes of Health (NIH MIRA 5R35GM133684-02) og National Science Foundation (NSF CAREER 2048265).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,10-phenanthroline | Sigma Aldrich | 131377-25G | |
| bis-Tris buffer | Fisher | BP301-100 | |
| Bottle-top 0.45 micron membrane | Nalgene | 296-4545 | Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable |
| Copper(II) chloride | Alfa Aesar | 12458 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-500G | |
| Electronic absorption spectrophotometer | Varian | Cary 5000 | Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable |
| high affinity resin | Sigma Aldrich | C7901-25G | |
| Isothermal titration calorimeter (ITC) | TA Instruments | Nano ITC Low Volume | |
| ITC analysis software | TA Instruments | NanoAnalyze | SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used |
| ITC software | TA Instruments | ITCRun | |
| light-duty delicate wiper | Kimwipe | 34155 | |
| loading syringe | Hamilton | Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL | |
| matched cuvettes | Starna Cells, Inc | 16.100-Q-10/Z20 | Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer |
| MOPS buffer | Alfa Aesar | A12914 | |
| spectrophotometer software | Cary | WinUV Scan | |
| spreadsheet program | Microsoft | Excel | Any suitable spreadsheet program will work |
| titration syringe | TA Instruments | 5346 | |
| ultrapure water | Millipore Sigma | Milli-Q | Any water is okay as long as >18 MΩ resistance |
References
- Waldron, K. J., Robinson, N. J. How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal. Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).
- Puig, S., Thiele, D. J. Molecular mechanisms of copper uptake and distribution. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).
- Huffman, D. L., O'Halloran, T. V. Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins. Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).
- Kaplan, J. H., Lutsenko, S. Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs. Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).
- Makowska, J., et al. Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the Aβ (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations. Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).
- Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. 1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides. Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).
- García, J. E., et al. Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106−115: evaluating the role of protons and methionine residues. Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).
- Jakab, N. I., et al. Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy. Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).
- Keltner, Z., et al. Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants. Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).
- Whittal, R. M., et al. a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry. Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).
- Żamojć, K., et al. A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).
- Beuning, C. N., et al. Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-β complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching. Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).
- Makowska, J., Żamojć, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzyński, L. Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus. Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).
- Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization. ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).
- Stevenson, M. J., et al. Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity. Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).
- Magyar, J. S., Godwin, H. A. Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects. Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).
- Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. (Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions - a review. RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).
- Sigel, H., Martin, R. B. Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands. Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).
- Liu, J., et al. Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers. Chemical Reviews. 114 (8), 4366 (2014).
- Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).
- Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. Inorganic Chemistry. , Pearson. (2014).
- Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system. Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).
- Kocyła, A., Pomorski, A., Krężel, A. Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications. Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).
- Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions. Methods. 76, 137-148 (2015).
- NIST. Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).
- Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4′-dithiodipyridine. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
