Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Количественная оценка связывающих взаимодействий между Cu(II) и пептидными остатками в присутствии и отсутствии хромофоров

Published: April 5, 2022 doi: 10.3791/63668
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Chemistry, University of San Francisco, 2Department of Chemistry, University of California, Davis

Summary

Эта статья посвящена использованию электронной абсорбционной спектроскопии и изотермической титрующей калориметрии для исследования и количественной оценки термодинамики связывания Cu(II) с пептидами и белками.

Abstract

Медь (II) является важным металлом в биологических системах, придавая уникальные химические свойства биомолекулам, с которыми она взаимодействует. Сообщалось, что он напрямую связывается с различными пептидами и играет как необходимую, так и патологическую роль, начиная от опосредующей структуры до свойств переноса электронов и передачи каталитической функции. Количественная оценка сродства связывания и термодинамики этих Cu(II)-пептидных комплексов in vitro дает представление о термодинамической движущей силе связывания, потенциальных конкуренциях между различными ионами металлов для пептида или между различными пептидами для Cu(II) и распространенности Cu(II)-пептидного комплекса in vivo. Тем не менее, количественная оценка термодинамики связывания может быть сложной задачей из-за множества факторов, включая учет всех конкурирующих равновесий в эксперименте по титрованию, особенно в тех случаях, когда отсутствуют дискретные спектроскопические ручки, представляющие пептид, ион металла d-блока и их взаимодействия.

Здесь представлен надежный набор экспериментов для точной количественной оценки Cu(II)-пептидной термодинамики. Данная статья посвящена использованию электронной абсорбционной спектроскопии при наличии и отсутствии хромофорных лигандов для обеспечения необходимой спектроскопической обработки Cu(II) и использованию изотермической титрационной калориметрии без маркировки. В обоих экспериментальных методах описывается процесс, учитывающий все конкурирующие равновесия. Хотя основное внимание в этой статье уделяется Cu(II), описанный набор экспериментов может применяться за пределами Cu(II)-пептидных взаимодействий и обеспечивать основу для точной количественной оценки других металл-пептидных систем в физиологически значимых условиях.

Introduction

Биология эволюционировала, чтобы использовать разнообразную химию ионов металлов, необходимых для жизни, чтобы адаптироваться и выжить в окружающей среде. По оценкам, 25-50% белков используют ионы металлов для структуры и функции1. Особая роль и окислительно-восстановительное состояние иона металла напрямую связаны с составом и геометрией биологических лигандов, которые его координируют. Кроме того, окислительно-восстановительные активные ионы металлов, такие как Cu(II), должны жестко регулироваться, чтобы они не взаимодействовали с окислителями через Фентон-подобную химию с образованием активных форм кислорода (АФК)2,3,4. Понимание режимов связывания и сродства, которые управляют его биохимией, должно помочь прояснить биологическую роль иона металла.

Многие методы используются для изучения связывающих взаимодействий металлов и пептидов. Это в основном спектроскопические методы, но также включают компьютерное моделирование с использованием молекулярной динамики, как видно через взаимодействия Cu(II) с фрагментом бета-амилоида (Aβ)5. Широко используемым спектроскопическим методом, доступным для многих университетов, является ядерный магнитный резонанс (ЯМР). Используя парамагнитную природу Cu(II), Gaggelli et al. смогли показать, где ион металла связывается на петиде через расслабление близлежащих ядер6. Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) также может быть использован для исследования местоположения и режима ионного связывания парамагнитного металла7. Другие спектроскопические методы, такие как круговой дихроизм (CD), могут описывать координацию относительно Cu(II) в таких системах, как трипептидные системы8, а масс-спектрометрия может показать стехиометрию и то, с какими остатками координируется ион металла через схемы фрагментации 9,10.

Некоторые из этих методов, такие как ЯМР, не имеют меток, но требуют больших концентраций пептидов, что создает проблемы для изучения. Другой распространенный метод, называемый флуоресцентной спектроскопией, был использован для связи положения тирозина или триптофана с закалкой из Cu(II)11,12. Аналогичным образом, этот метод может показать структурные изменения в результате связывания Cu(II)13. Однако проблемы с этими исследованиями связывания металлов с пептидами заключаются в том, что они исследуют хромофорные аминокислоты, такие как тирозин, которые есть не во всех системах, что ион металла связывается в классической модели и что метод может быть неблагоприятным в физиологических условиях. Действительно, появляется несколько пептидов, которые не содержат таких хромофорных аминокислот или связываются по классическим моделям, что исключает использование этих методов 14,15. В этой статье подробно описываются подходы к оценке связывающих свойств в этих сценариях в физиологически значимых условиях.

Биологические лиганды могут принимать различные состояния протонирования, которые могут влиять на связывание ионов металлов, таких как имидазольное кольцо на гистидине. Если pH не поддерживается последовательно, результаты могут быть запутанными или противоречивыми. По этой причине буферы являются важным компонентом в изучении взаимодействия металл-белок/пептид. Однако было показано, что многие буферы благоприятно взаимодействуют с ионами металлов16,17. В дополнение к конкуренции с интересующей биологической молекулой, буфер может иметь аналогичные координирующие атомы, которые может быть трудно отличить от координирующих атомов пептида или белка. В этом исследовании основное внимание уделяется электронной абсорбционной спектроскопии и изотермической титрующей калориметрии (ITC) в качестве двух взаимодополняющих методов изучения Cu(II)-пептидных взаимодействий с особыми соображениями, касающимися выбора буфера.

Электронная абсорбционная спектроскопия является быстрым, широко доступным методом изучения металлосвязывающих взаимодействий. Облучение светом в ультрафиолетовых (УФ) или видимых длинах волн может привести к поглощению металлоцентричных d-d полос, которые предоставляют ценную информацию о классификации лигандов, геометрии металлов и кажущемся сродстве связывания18,19. Для этих комплексов прямое титрование ионов металлов в белковые или пептидные растворы может количественно определять стехиометрию связывания и кажущееся сродство связывания. В некоторых случаях, таких как d5 или d10 электронных конфигураций, комплекс не поглощает свет (т. е. спектроскопически бесшумен). В этих спектроскопически бесшумных комплексах переходных металлов эти ограничения можно обойти, используя конкурирующий лиганд, который при координации с ионом металла дает обнаруживаемые полосы переноса заряда. В любом случае этот подход ограничен количественной оценкой только стехиометрии и кажущегося сродства связывания, и никакое понимание энтальпии связывания не дается без приближений.

Дополняя информацию, полученную с помощью электронной абсорбционной спектроскопии, ITC является привлекательным методом для прямой и строгой количественной оценки энтальпиисвязывания 20. ITC непосредственно измеряет тепло, выделяемое или потребляемое во время события связывания, и, поскольку титрование происходит при постоянном давлении, измеренное тепло является энтальпией всех равновесий (ΔHITC). Кроме того, количественно определяется стехиометрия события связывания (n) и кажущееся сродство связывания (KITC). Из этих параметров определяют свободную энергию (ΔGITC) и энтропию (ΔSITC), обеспечивая термодинамический снимок события связывания. Поскольку ITC не полагается на поглощение света, он является идеальным методом для спектроскопически бесшумных видов, например, d5 или d10 комплексов ионов металлов. Однако, поскольку калориметрия измеряет теплоту, любые непревзойденные буферные системы и неучтенные равновесия могут отрицательно повлиять на анализ для точного определения термодинамики связывания ионов металлов, и необходимо проявлять большую осторожность для устранения этих факторов20. При выполнении с соответствующей строгостью ITC является надежным методом определения термодинамики металл-белково-пептидных комплексов.

Здесь хромофорически тихий медь-связывающий пептид, С-пептид, используется для демонстрации взаимодополняющего использования двух методов. С-пептид представляет собой продукт расщепления 31 остатка (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLGSL), образующийся при созревании инсулина; он не имеет хромофорных остатков, но было показано, что он связывает Cu(II) с физиологически значимым сродством14,15. Сайт связывания Cu(II) состоит из боковых цепей глутамата и аспартата, а также N-конца пептида14,15. Эти координирующие атомы очень похожи на атомы многих обычно используемых буферных систем. Здесь показано тандемное использование d-d и полос переноса заряда в электронной абсорбционной спектроскопии и ITC в количественной оценке термодинамики связывания Cu(II) с С-пептидом. Подход, основанный на изучении связывания Cu(II) с С-пептидом, может быть применен к другим ионам металлов и белково-пептидным системам.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Электронная абсорбционная спектроскопия: прямое титрование с буферной конкуренцией

  1. Пробоподготовка
    1. Готовят буферный раствор 50 мМ 2-[бис(2-гидроксиэтил)амино]-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол (бисТрис) при рН 7,4 с использованием сверхчистой воды (сопротивление >18 МОм). Удаляют следы ионов металлов путем инкубации с высокоаффинной смолой в течение не менее 2 ч с последующей фильтрацией.
    2. Растворите или разбавьте известное количество пептида в безметалловом буфере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При мониторинге d-d диапазонов с малыми коэффициентами вымирания21 необходимо использовать более высокие концентрации пептида. Здесь конечная концентрация С-пептида в буферном растворе составляла 300 мкМ (объем зависит от размера кюветы). С-пептид был синтезирован твердофазным синтезом пептидов и подробно описан в другом месте в литературе14.
    3. Растворите известную массу CuCl2 в сверхчистой воде, чтобы получить раствор при 10-15 мМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно изначально растворить соль металла в небуферизованной воде, чтобы предотвратить осаждение. Другие соли Cu(II) могут быть использованы, но необходимо позаботиться о том, чтобы анион слабо координировался.
  2. Запуск эксперимента
    1. Включите электронный абсорбционный спектрофотометр и дайте ему прогреться в течение ~ 15-20 минут перед использованием. Запустите программное обеспечение спектрофотометра и настройте такие параметры, как диапазон сканирования (200-900 нм), скорость сканирования (200 нм / с) и двойной луч с коррекцией базовой линии (дополнительные параметры перечислены в дополнительном файле).
    2. Соберите базовую линию без кювет или образцов на путях луча.
    3. Используя две совпадающие кюветы в двухлучевом спектрофотометре, загрузите одну кювету 115 мкл сверхчистой воды, а другую кювету 115 мкл пептидного образца. Убедитесь, что в кюветах нет пузырьков воздуха, так как они будут мешать сигналу.
    4. Поместите кювету со сверхчистой водой в опорный пучок и кювету с пептидом в пучок образца.
    5. Соберите спектр поглощения безметаллового (апо) пептида.
    6. Добавьте субстехиометрическое количество (0,5 эквивалента, 150 мкМ) раствора Cu(II) в кювету с образцом пептида. Убедитесь, что объем добавленного Cu(II) составляет менее 3 мкл, и запишите объем для анализа позже.
    7. Осторожно пипетку вверх и вниз, чтобы перемешать раствор, избегая образования пузырьков воздуха. Дайте раствору вступить в реакцию и уравновеситься в течение 5 мин и зафиксируйте спектр поглощения.
    8. Повторите добавление аликвот Cu(II), как на стадии 1.2.6, в пептидный раствор для следующих эквивалентов: 1,0, 1,5, 2,0, 3,0 и 5,0 (или в общей сложности 300, 450, 600, 900 и 1 500 мкМ). Обязательно запишите общий объем добавленного Cu(II) и общий объем кюветы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется большее разрешение, уменьшите интервал между эквивалентами.
    9. Извлеките образец кюветы и тщательно очистите в соответствии с указаниями производителя.
    10. Добавьте буферизованный раствор без пептида и запишите спектр абсорбции. Повторите добавление аликвот Cu(II), как показано на этапах 1.2.5-1.2.8, регистрируя спектр поглощения для каждого эквивалента Cu(II).
    11. Экспортируйте все спектры в виде csv-файлов для обработки. Тщательно очистите кюветы в соответствии с инструкциями производителя и выключите спектрофотометр.
  3. Обработка данных
    1. Загрузите все спектры в программу для работы с электронными таблицами.
    2. Вычтите только буферный (0 мкМ Cu(II)) спектр из любого другого спектра, чтобы удалить любые особенности поглощения из самого буфера.
    3. Нормализовать каждый спектр с учетом разбавления в результате добавления раствора Cu(II) (этап 1.2.6). См. Дополнительный файл, Eq (1)14 для примера нормализации, где vinitial - объем (115 мкл) пептида, добавленного в кювету, vCu(II) - объем раствора Cu(II), добавленный на шаге 1.2.6, аabs buffer вычитаемый спектр - данные, полученные на шаге 1.2.7.
    4. График всех спектров вместе, чтобы определить области изменения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичные d-d диапазоны от комплексов Cu(II) варьируются от 500 до 750 нм. Это спектрофотометрическое титрование может быть сложным из-за малого коэффициента вымирания от d-d диапазонов, которые являются запрещенными Переходами Лапорта в октаэдрической геометрии21. Если абсорбция слишком слабая, альтернативным подходом является использование хромофорных лигандов, которые приводят к полосам переноса заряда при связывании с Cu(II) (см. раздел 2).

2. Электронная абсорбционная спектроскопия: пептидная конкуренция с хромофорным лигандом

  1. Пробоподготовка
    1. Растворите 1,10-фенантролин (фен) в сверхчистой воде для получения конечной концентрации ~1 мМ.
    2. В дополнение к пробоподготовке, описанной в разделе 1.1 для пептида (стадия 1.1.2) и Cu(II) (стадия 1.1.3), готовят раствор фена 10 мкМ Cu(II) и 40 мкМ фена в буфере ([Cu(фен)3]2+). Убедитесь, что объем заполняет кювету.
  2. Запуск эксперимента
    1. Запустите электронный абсорбционный спектрофотометр, как в шагах 1.2.1 и 1.2.2, но установите диапазон сканирования на 200-400 нм.
    2. В двух подобранных кюветах загрузите одну кювету 115 мкл сверхчистой воды, а другую кювету 115 мкл раствора [Cu(phen)3]2+ . Поместите кювету с водой в опорный пучок, а кювету с раствором [Cu(phen)3]2+ в пучок образца.
    3. Соберите спектр поглощения металло-лигандного комплекса.
    4. Добавьте стехиометрическое количество (эквивалент ≈1, ≈10 мкМ) пептида в раствор [Cu(phen)3]2+ . Осторожно пипетку вверх и вниз, чтобы тщательно перемешать, но будьте осторожны, чтобы не вводить пузырьки воздуха. Запишите объем добавленного пептида для будущего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используя кюветы, которые содержат 115 мкл, добавление 3,83 мкл пептида 300 мкМ дает конечную концентрацию пептида 9,7 мкМ.
    5. Инкубировать раствор в течение 5 мин до достижения равновесия. Запишите спектр поглощения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если сродство связывания металл-пептид и металл-лиганд схоже, концентрация добавленного пептида должна быть в большом избытке. Обязательно учитывайте общий объем пептида, добавленного для нормализации.
    6. Повторите добавление пептидных аликвот в раствор [Cu(phen)3]2+ для следующих приблизительных эквивалентов: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 22 и 26. Запишите объем добавленного пептида, чтобы можно было определить разбавленную концентрацию.
    7. Извлеките образец и тщательно очистите кювету в соответствии с инструкциями производителя. Соберите спектр буфера. Соберите спектр пептида 50 мкМ в буфере.
    8. Экспортируйте все данные в виде csv-файлов для обработки и очистки кювет в соответствии с инструкциями производителя.
  3. Обработка данных
    1. Загрузите спектры в программу для работы с электронными таблицами и вычтите буферный спектр из других спектров.
    2. Нормализуйте спектры в соответствии с Дополнительным файлом, Eq (2)14.
    3. Используя коэффициент вымирания для [Cu(phen)3]2+ при 265 нм (εmax = 90 000 M-1 см-1)22, определяют концентрацию [Cu(фен)3]2+ при каждом добавлении пептида.
    4. Для каждого добавления пептида определяют концентрацию Cu(II)-пептидного комплекса путем вычитания оставшейся концентрации [Cu(фен)3]2+, как определено на этапе 2.3.2, из начальной концентрации [Cu(фен)3]2+ (при 0 мкМ пептида).
    5. Рассчитайте концентрацию свободного фен-лиганда по уравнению в дополнительном файле, Eq (3)14.
    6. Рассчитайте концентрацию свободного пептида с помощью дополнительного файла, Eq (4)14, где [пептид]запас представляет собой неразбавленный пептид, титрованный в кювету, V1 представляет объем добавленного исходного пептида, V2 - общий объем кюветы, а [Cu2+-пептид] определяется на этапе 2.3.4.
    7. Вычислите экспериментальное сродство связывания (Kex), используя Eq (5) в дополнительном файле23.
    8. Соотнесите константу диссоциации Cu(II)-пептида с Kex по Eq (6)23 в дополнительном файле, где Kd,Cu(II)-фен = 1,0 × 10-9 (см. 22). Определите среднее и стандартное отклонение от всех определяемых констант диссоциации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При соотношении 4:1 фен:Cu(II), [Cu(фен)3]2+, [Cu(фен)2]2+ и [Cu(фен)]2+ существуют в растворе, и пептид будет хелатировать Cu(II) от вида ([Cu(phen)]2+) с самым слабым связыванием22.

3. Изотермическая титрующая калориметрия

  1. Пробоподготовка
    1. Готовят буферный раствор 15 мМ 3-морфолинопропан-1-сульфоновой кислоты (МОПС) при рН 7,4 с использованием сверхчистой воды (сопротивление >18 МОм). Удаляют следовые ионы металлов путем инкубации с высокоаффинной смолой в течение не менее 2 ч с последующей вакуумной фильтрацией через мембрану с крышкой бутылки 0,45 мкм.
    2. Растворить известную массуCuCl2 в сверхчистой воде для приготовления раствора ≈50-100 мМ. Разбавьте этот раствор Cu(II) в буфер для получения раствора 1,0 мл с конечной концентрацией 1,4 мМ Cu(II). Запишите точный объем используемого раствора CuCl2 .
    3. Растворите или разбавьте раствор пептида в буфере, чтобы получить 450 мкл 154 мкМ пептидного раствора. Убедитесь, что в пептидный раствор добавлена та же пропорция дополнительной сверхчистой воды из стадии 3.1.2, что уменьшит теплоту разбавления и увеличит сигнал-шум.
    4. После подготовки образцов убедитесь, что растворы имеют одинаковый рН и, при необходимости, соответствующим образом отрегулируйте.
    5. Дополнительный шаг: Дегазируйте решения для минимизации микропузырьков, загружаемых в ITC.
  2. Запуск эксперимента
    1. Включите ITC. Запустите программное обеспечение ITC для запуска инструмента. Дождитесь первой инициализации, которая попросит вернуть бурет; затем следуйте инструкциям на экране.
    2. Снимите крышку со ссылочной ячейки. Удалите любую воду из эталонной ячейки и трижды промойте 450 мкл дегазированной сверхчистой воды.
    3. Медленно вытягивайте сверхчистую воду до отметки 450 мкл загрузочного шприца, следя за тем, чтобы в шприц не вносились пузырьки воздуха. Вставьте нагрузочный шприц в эталонную ячейку до тех пор, пока он не ≈1 мм от дна, и медленно впрыскивайте часть раствора до тех пор, пока в загрузочном шприце не останется 150 мкл. Быстро перемещайте плунжер загрузочного шприца вверх и вниз на ≈25 мкл несколько раз, чтобы выбить любые пузырьки на поверхности ячейки. Медленно впрыскивайте до тех пор, пока плунжер не достигнет отметки 100 мкл на загрузочном шприце, тем самым дозируя в общей сложности 350 мкл сверхчистой воды в эталонную ячейку, и замените крышку эталонного элемента.
    4. Удалите любой остаточный раствор из ячейки образца и нагрузите 450 мкл этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) 10 мМ с помощью загрузочного шприца. Замочите в течение 10 минут, чтобы убедиться, что следы металлов удаляются, потому что ЭДТА будет связывать следовые металлы.
    5. Удалите раствор ЭДТА (со связанными следовыми ионами металлов) и тщательно промойте загрузочный шприц обильным количеством сверхчистой воды.
    6. Очистите ITC в соответствии с указаниями производителя, промыв ячейку образца сверхчистой водой.
    7. Обусловите образец ячейки путем промывки 450 мкл буфера по меньшей мере три раза.
    8. Удалите буфер, который обусловливает ячейку образца. Загрузите пептидный раствор в пробную ячейку с помощью загрузочного шприца (выполните шаг 3.2.3).
    9. Промыть шприц титрования 200 мкл буферного раствора. Для этого снимите поршень и используйте микропипетку, чтобы пипетку буфера через отверстие в верхней части стеклянного титрационного шприца, через шприц и наружу иглу внизу.
    10. Полностью вставьте плунжер в шприц титрования.
    11. Опустите наконечник иглы шприца титрования в металлический раствор и медленно потяните плунжер вверх, в результате чего металлический раствор заполнит шприц и приведет к образованию пустотного объема в верхней части стеклянной части титрующего шприца. Удалите большую часть объема пустоты, повернув шприц титрования параллельно полу, снимите поршень и слегка наклоните стеклянную часть к полу. Мягко встряхните шприц титрования, чтобы раствор переместился к концу стеклянной части шприца титрования и заполнил большую часть объема пустоты, но убедитесь, что осталось 2-3 мкл пустого объема. Удерживая шприц параллельно полу, снова вставьте плунжер.
    12. Держите шприц титрования в вертикальном положении, окуните кончик иглы обратно в металлический раствор и толкайте плунжер вниз, пока воздух не перестанет выходить из иглы. Загрузите шприц титрования, медленно подтягивая плунжер чуть выше отметки 50 мкл, сохраняя кончик иглы в растворе.
    13. Осторожно вставьте стеклянную часть шприца титрования в бурет и завинтите до укутания пальца. Когда небольшое количество раствора выйдет из титрующего шприца из-за сжатия плунжера, используйте легкий тонкий стеклоочиститель, чтобы тщательно впитать раствор, не касаясь кончика иглы.
    14. Вставьте бурет со шприцем титрования в ячейку образца и надежно закрепите его.
    15. Настройте параметры в программном обеспечении ITC. Начиная с приборного управления, установите скорость перемешивания (типичная скорость перемешивания колеблется от 150 до 350 об/мин) и температуру , при которой будет проводиться эксперимент (обычно 25 °C). Введите концентрации шприца и клеток в миллимолярных единицах в разделе Подробности эксперимента.
    16. В разделе Метод эксперимента выберите Добавочное титрование. Нажмите «Настройка» и укажите 20 инъекций по 2,5 мкл. Если для наблюдения за событием связывания требуется большее разрешение, увеличьте количество инъекций и уменьшите объем за инъекцию. Введите временной интервал между каждой инъекцией, чтобы он был достаточно длинным, чтобы сигнал уравновешивался и возвращался к базовому уровню, обычно 300 с.
    17. Нажмите кнопку выполнить , чтобы начать эксперимент и указать, где хранятся данные.
    18. По завершении эксперимента очистите образец ячейки и шприц титрования.
    19. Выполняйте все эксперименты как минимум в трех экземплярах, чтобы обеспечить точный сбор данных.
    20. Проведите контрольный эксперимент, в котором металлический раствор титруется в буферный раствор (в отсутствие пептида), чтобы теплота разбавления от иона металла была небольшой и чтобы не было неучтенных равновесий. Если теплота разбавления велика, рассмотрите другую буферную систему, если это возможно.
  3. Обработка данных
    1. Запустите программное обеспечение для анализа ITC и загрузите файл данных для анализа.
    2. Перейдите на вкладку Базовые показатели и проверьте термограмму. Обратите внимание на любое экзогенное тепло, выделенное или поглощенное пузырьками воздуха или другими артефактами в термограмме. Ищите шипы, которые не связаны с впрыском металлического раствора.
    3. Убедитесь, что базовый уровень, сгенерированный аналитическим программным обеспечением, следует за частью данных после внедрения и уравновешивания. Если он отклоняется, используйте базовые опорные точки для корректировки базового уровня. Убедитесь, что области интеграции включают пик, полученный в результате впрыска металла, но закрывают любые пузырьки воздуха или артефакты в термограмме, обнаруженные на этапе 2. Вычтите базовую линию из термограммы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот тип манипуляции рекомендуется только после сбора нескольких термограмм, чтобы экспериментатор знал, что является реальными данными, а что артефактом, поскольку корректировка базового уровня и областей интеграции может резко повлиять на данные.
    4. Перейдите в окно Моделирование , чтобы начать подгонку данных, где программное обеспечение для анализа будет отображать интегрированные и нормализованные данные концентрации для каждой инъекции.
    5. Щелкните левой кнопкой мыши на данные первой инъекции, чтобы удалить ее из алгоритма подгонки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это распространено, поскольку будет незначительное смешивание между титрантом и раствором образца клеток, что приведет к неточному молярному дозированию первой инъекции.
    6. В разделе Модели выберите Пустой (постоянный) в раскрывающемся меню Стиль, которое основано на конечной энтальпии инъекции и будет вычитаться из каждой точки данных с учетом теплоты разбавления. Кроме того, выберите Независимая (или лучшая модель для системы) во втором раскрывающемся меню Стиль , чтобы соответствовать данным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для стандартных взаимодействий связывания 1:1 наиболее распространенной моделью является независимая.
    7. Подберите данные с помощью двух моделей, нажав зеленую кнопку воспроизведения с Σ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другим программным обеспечением для обработки данных ЦМТ является SEDPHAT24.
    8. Учитывайте все конкурирующие равновесия в пост-специальном анализе, о котором ранее сообщали Grossoehme et al. 20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Цель состояла в том, чтобы количественно оценить и подтвердить термодинамику связывания Cu(II) с С-пептидом с использованием дополнительных методов электронной абсорбционной спектроскопии и ITC. Из-за надежного характера электронной абсорбционной спектроскопии было выполнено прямое титрование Cu(II) в 300 мкМ C-пептид (рисунок 1). Добавление 150 мкМ Cu(II) вызвало немедленное увеличение диапазона на 600 нм, приписываемое d-d диапазону Cu(II), и продолжало увеличиваться до тех пор, пока не было добавлено 300 мкМ Cu(II). Дальнейшее добавление выше 300 мкМ Cu(II) не увеличивало поглощение d-d диапазона, указывая на насыщение и на то, что Cu(II) связывается с C-пептидом в комплексе 1:1. Кроме того, из-за относительно высокого сродства бис-триса для связывания с Cu(II) (log K = 5,27)16 сродство Cu(II)/C-пептида должно иметь нижний предел в микромолярном диапазоне (log K > 6) для хелатирования иона металла от буфера. В этой системе точная количественная оценка полос поглощения является сложной задачей из-за небольшого коэффициента вымирания.

Чтобы обойти малый коэффициент вымирания d-d диапазона, использовался хромофорный лиганд, фен, как описано выше. С-пептид титровали в ≈10 мкМ [Cu(фен)3]2+ (Рисунок 2A ), и абсорбция из полосы переноса заряда при 265 нм уменьшалась (Фиг.2В), что указывает на то, что С-пептид был способен хелатировать Cu(II) из фен-лиганда. При ближайшем рассмотрении требовалась большая концентрация С-пептида (до 140 мкМ), чтобы незначительно превзойти фен-лиганд (таблица 1). Это неудивительно, учитывая большие константы последовательного образования для [Cu(phen)3]2+ (9,0, 15,7 и 20,8 для log K1, β2 и β3 соответственно)22. Анализ спектров показывает, что сродство связывания Cu(II)/C-пептидов находится в диапазоне log K = 7,4-7,8 (таблица 1).

Золотым стандартом измерения полной термодинамики связующего взаимодействия является ITC. На рисунке 3 представлена репрезентативная термограмма Cu(II), титруемая в С-пептид в 15 мМ MOPS, рН 7,4, что обеспечивает конкуренцию за Cu(II). Здесь буфер MOPS был использован вместо буфера bis-Tris, поскольку KCu(II)-MOPS < KCu(II)-bis-Tris16,25 и обеспечит меньшую конкуренцию, чтобы ITC мог точно измерить сродство (см. обсуждение). Измеряя тепло, потребляемое или выделяемое среди всех равновесий, термограмма обеспечивает сигмоидальную форму. Начальные инъекции Cu(II) до насыщения пептида приводят к большому количеству тепла по сравнению с теплом разбавления. Разница в этих значениях тепла равна ΔHITC. Точка перегиба описывает две полезные части информации. Во-первых, это стехиометрия связывания вида в шприце по сравнению с видами в клетке (т.е. Cu(II):C-пептид равен 1:1). Во-вторых, наклон прилегания в точке перегиба прямо пропорционален KITC. После сбора данных в трех и в нескольких буферах был выполнен пост-специальный анализ20, где учитываются все конкурирующие равновесия (таблица 2), и определяется буферно-независимая термодинамика. Для связывания Cu(II) с С-пептидом KCu(II)/C-пептид = 1 (± 1) x 108 и ΔHCu(II)/C-пептид = -8 (± 4) кДж моль-1. Из них определяются другие термодинамические параметры связывания, где ΔG°Cu(II)/C-пептид = -46 (± 4) кДж моль-1 и ΔSCu(II)/C-пептид = 120 (± 10) J моль-1 K-1 (см. 15).

Figure 1
Рисунок 1: Мониторинг диапазона Cu(II) d-d при добавлении 150, 300, 450, 600, 900 и 1 500 мкМ Cu(II) к 300 мкМ C-пептида в 50 мМ бис-Трис, рН 7,4. D-d полоса Cu(II) увеличивается на 600 нм до тех пор, пока не образуется 1:1 Cu(II):C-пептидный комплекс. Ранее Мадьяр и Годвин сообщали, что сродство Cu(II)-бис-Трис составляет log K = 5,2716. Это титрование показывает, что С-пептид может превзойти буфер для связывания Cu(II) и указывает на сродство Cu(II)/C-пептида в микромолярном диапазоне. Эта цифра перепечатана с разрешения Stevenson et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Формирование [Cu(phen)3]2+ и репрезентативных электронных спектров поглощения, контролирующих уменьшение полосы переноса заряда при добавлении С-пептида. (A) Схема реакции, показывающая образование [Cu(phen)3]2+ и его полосы переноса заряда, центрированной на 265 нм (ε° ≈ 90 000 M-1 см-1)22. Константы формирования составляют 9,0, 15,7 и 20,8 для log K1, β2 и β3 соответственно22. (B) Репрезентативные электронные спектры поглощения, контролирующие уменьшение полосы переноса заряда от [Cu(фен)3]2+ в виде хелатов С-пептида Cu(II). Титрование проводили в 50 мМ бис-трис, рН 7,4. Анализ данных приведен в таблице 1. Эта цифра перепечатана с разрешения Stevenson et al.14. Аббревиатура: MLCT = перенос заряда металла на лиганд. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Репрезентативные термограммы Cu(II), титрованные в C-пептид и буфер. (A) Эта репрезентативная термограмма показывает титрование 1,4 мМ Cu(II) в 154 мкМ C-пептид в 15 мМ MOPS, рН 7,4. Данные подходят для односайтовой модели со следующими параметрами: n = 1,2 ± 0,1; Kd,ITC = 6 (± 3) x 10-7; ΔHITC = −3,4 ± 0,2 кДж моль-1. (B) Репрезентативное контрольное титрование 1,4 мМ Cu(II) в 15 мМ MOPS, рН 7,4, в отсутствие С-пептида, не показывающего связывания термограммы, что видно на панели А. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

[С-пептид] А265 [Cu(фен)3] 2+ [фен] свободный [С-пептид] свободный [Cu(II)/C-пептид] Kex (x108) KdCu(II)/C-пептид log KdCu(II)/C-пептид
0.0 1.0649 11.83 4.5 0 0.00 НД НД НД
9.7 0.9948 11.05 6.84 7.45 0.78 0.0543 1.84Е-08 7.75
18.7 0.9785 10.87 7.38 16.00 0.96 0.0367 2.73Е-08 7.56
27.3 0.9651 10.72 7.83 24.09 1.11 0.0310 3.23Е-08 7.49
35.3 0.9475 10.53 8.42 31.55 1.30 0.0307 3.26Е-08 7.49
42.8 0.9374 10.42 8.75 38.79 1.42 0.0288 3.48Э-08 7.46
50.0 0.9283 10.31 9.06 45.64 1.52 0.0275 3.63Е-08 7.44
56.7 0.9134 10.15 9.55 51.92 1.68 0.0288 3.47Е-08 7.46
63.1 0.9025 10.03 9.92 57.97 1.81 0.0291 3.43Е-08 7.46
69.2 0.8927 9.92 10.24 63.73 1.91 0.0294 3.40Е-08 7.47
75.0 0.878 9.76 10.73 69.04 2.08 0.0314 3.19Е-08 7.50
85.7 0.8542 9.49 11.53 78.99 2.34 0.0341 2.93Е-08 7.53
95.4 0.8316 9.24 12.28 88.01 2.59 0.0371 2.69Е-08 7.57
104.3 0.8151 9.06 12.83 96.38 2.78 0.0387 2.58Е-08 7.59
112.4 0.7976 8.86 13.41 103.98 2.97 0.0411 2.44Е-08 7.61
126.9 0.7809 8.68 13.97 117.87 3.16 0.0411 2.44Е-08 7.61
139.2 0.7586 8.43 14.71 129.53 3.40 0.0437 2.29Е-08 7.64
Диапазон 7.4-7.8

Таблица 1: Репрезентативные расчеты концентраций видов в растворе из рисунка 2В. Все концентрации находятся в микромолярах. Эта таблица перепечатана с разрешения Stevenson et al.14.

Эквилибрия n ΔH (кДж моль-1) n × ΔH (кДж моль-1)
Cu(II)-MOPS → Cu(II) + MOPS 1 5.4 5.44
MOPS + H+ → MOPS-H+ 0.097 −21,0 −2,04
Cu(II) + C-пептид-H+ → Cu(II)/C-пептид + H+ 1 X X
ΔHITC = Χ + 3,40
Χ = ΔHITC − 3,40
Χ = ΔHCu(II)/C-пептид = −6,8 кДж моль-1

Таблица 2: Пост-специальный анализ для определения ΔHCu(II)/C-пептида. Как показано на рисунке 3,1,4 мМ Cu(II), титровали в 154 мкМ С-пептида в 15 мМ MOPS, рН 7,4, в трех экземплярах. После учета всех конкурирующих равновесий, показанных в таблице, ΔHCu(II)/C-пептид обнаруживается на уровне −8,66 кДж моль-1. Количество протонов, вытесненных из С-пептида Cu(II), определяется по наклону (ΔHITC + ΔHCu(II)-буфер) против ΔHBuffer-H, где данные собираются в нескольких буферах. Все значения энтальпии найдены в NIST25 или определены в другом месте литературы15. Все конкурирующие равновесия учитываются так, как описано Grossoehme et al.20 Эта цифра перепечатана с разрешения Stevenson et al.15.

Дополнительный файл: Соответствующие уравнения, используемые в разделе протокола, и дополнительные параметры для электронного абсорбционного спектрофотометра и настройки ITC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье представлен надежный метод количественной оценки сродства и термодинамики связывания Cu(II) с пептидами. Комплексы с Cu(II) идеально подходят для мониторинга полосы поглощения d-d на металлическом участке из-за его электронной конфигурации d9 . Хотя коэффициент вымирания невелик, что требует больших концентраций комплекса для получения надежного сигнала, титрование Cu(II) в пептид может быстро дать представление о стехиометрии связывания и приблизительном сродстве связывания. Тем не менее, может быть сложно различить разницу в спектрах, если металл координируется аналогичными атомами и геометриями как из буфера, так и из пептида. Для количественного определения сродства связывания часто используют хромофорные лиганды, такие как фен, из-за их симметрично-допустимых переносов заряда с ионами металлов21. Установив конкуренцию между хромофорным лигандом и нехромофорным пептидом и зная сродство металла к лиганду, можно непосредственно определить сродство металла и пептида. Дальнейший термодинамический анализ с использованием электронной абсорбционной спектроскопии является сложной задачей. Чтобы количественно оценить энтальпию связывания с использованием такого метода, как спектроскопия UV-Vis, сродство связывания должно быть определено при нескольких температурах и выполнен анализ Хоффа. Этот анализ предполагает, что удельная теплоемкость связывания равна нулю, что редко верно и, таким образом, дает только оценку энтальпии связывания20.

Изотермическая титрующая калориметрия лучше подходит для выяснения более полного обзора термодинамики металл-пептидных взаимодействий. В этом методе ион металла титруется в пептидный раствор и непосредственно измеряется теплота различных равновесий. Поскольку эксперимент проводится при постоянном давлении, теплота, измеренная ITC, равна энтальпии. ITC может преодолеть некоторые ограничения электронной абсорбционной спектроскопии, такие как изучение спектроскопически бесшумных ионов металлов и отсутствие необходимости делать предположения, как это сделано в анализе Ван'т Хоффа. Однако иногда реакции, происходящие в ЦМТ, практически не выделяют тепла и поэтому не наблюдаются. Это может быть обойдено либо путем увеличения концентрации металла и пептида, либо путем использования другого буфера с другой энтальпией протонирования. Последнее особенно полезно, если ион металла вытесняет несколько протонов при связывании с пептидом. Тем не менее, оба метода - ITC и электронная абсорбционная спектроскопия - обеспечивают ортогональные методы для изучения одной и той же системы и хорошо дополняют друг друга.

Есть много сложных аспектов в обоих методах при изучении связывания ионов металлов с пептидами. Многие ионы металлов нерастворимы или слабо растворимы в воде. Это еще больше усугубляется осаждением иона металла при добавлении в буфер. В ITC это может проявляться медленным, постепенным сдвигом базового уровня и большим количеством тепла, выделяемого при впрыске металла. Это свидетельствует о больших значениях теплоты разбавления даже после того, как пептид будет насыщен ионом металла. В электронной абсорбционной спектроскопии осаждение ионов металлов проявляется через повышенное поглощение на более низких длинах волн и напоминает широкий пик, сосредоточенный в УФ-области. В обоих методах экспериментатор должен убедиться, что ион металла растворим в условиях выбора (например, буфер, pH, температура, концентрация). Еще одно ограничение обоих методов может проявиться через концепцию порядка сложения. В некоторых случаях один образующийся металлический комплекс может быть лабильным, в то время как добавление тех же реагентов в другом порядке сделает другой промежуточный вид инертным. Эта иллюстрация кинетического и термодинамического контроля препятствует точному анализу всех конкурирующих равновесий.

Как ITC, так и электронная абсорбционная спектроскопия полагаются на конкуренцию между пептидом и буфером или лигандом для связывания иона металла. Здесь вводится c-значение, которое помогает определить, может ли KITC быть точно определен алгоритмом подгонки. Значение c определено в Дополнительном файле, Eq (7)20, где n - стехиометрия, KITC - кажущееся сродство связывания, а [образец ячейки] - концентрация вида в образце клетки. Когда значение c составляет от 1 до 1000, определенный KITC является точным. Однако значения c ниже 1 могут обеспечивать только верхний предел для KITC, тогда как значения c выше 1 000 могут обеспечивать только нижний предел20. В этом и заключается ценность сбора данных из дополнительных методов: если что-то упущено в одном методе из-за его ограничений, это может быть поймано в его дополнительной технике. В этих экспериментах, если конкуренция будет в значительной степени благоприятствовать одному виду (т. Е. Сродство ионов металлов пептида намного больше, чем сродство буфера), равновесие будет смещено, что затруднит интерпретацию. Это также подробно показано Kocyla et al.23. Чтобы обойти эту проблему, введение или замена другим конкурирующим лигандом или выбор другого буфера часто используется для увеличения конкуренции между лигандом и пептидом для точной количественной оценки. Это связано с тем, что разница между металл-буфером (или металл-лигандом) и сродством металл-пептид позволила бы значению c упасть в пределах окна от 1 до 1000. Следует, однако, отметить, что использование конкурирующего лиганда или другого буфера для количественного анализа требует, чтобы термодинамические параметры металл-лиганд или металл-буферного комплекса были известны или могли быть определены другими способами.

Наконец, точная количественная оценка концентрации пептидов может быть сложной задачей. Некоторые распространенные способы количественной оценки концентраций пептидов заключаются в измерении конкретных аминокислот и связывании количества этих аминокислот с последовательностью пептида. Например, электронная абсорбционная спектроскопия может измерять ароматические остатки, такие как тирозин, реагент Эллмана может количественно оценить количество свободных тиолов26, а анализы Брэдфорда дают представление о том, сколько остатков присутствует27. К сожалению, пептиды, такие как тот, который используется в этом исследовании, не имеют ароматических остатков или свободных тиолов, и анализы Брэдфорда создают проблемы при сравнении стандартов массивных белков с небольшим пептидом, представляющим интерес. Вместо этого концентрацию пептидов определяли сухой массой. Несмотря на то, что они не являются идеальными и склонны к концентрациям, которые являются незначительными завышениями концентрации пептидов (поскольку измерения кажущейся массы, вероятно, выше, чем фактические массы пептидов из-за присутствия солей), все аликвоты для измерения были обработаны одинаково, что позволяет проводить более точные сравнения. В спектроскопических исследованиях, если концентрация свободного пептида ниже, чем ожидалось, рассчитанное сродство связывания представляет собой нижний предел (Supplemental File, Eq (5) и Eq (6)). Есть проблемы, связанные с обоими показанными методами, но с литературой в качестве руководства многие из них могут быть преодолены.

Экспериментальный подход, описанный здесь, позволяет точно количественно оценить термодинамику связывания металла с пептидом. Как ITC, так и электронная абсорбционная спектроскопия являются ортогональными и дают представление о сродстве связывания, но ITC позволяет проводить прямую количественную оценку энтальпии. Как только эта термодинамика количественно определена, можно сделать вывод, могут ли эти металл-пептидные комплексы образовываться в физиологических условиях. По мере того, как понимание физиологического потока ионов металлов растет, может быть сделано предсказание, является ли сродство связывания достаточно сильным для сложного образования in vivo . Кроме того, исследователь может делать прогнозы о конкуренции между несколькими ионами металлов для одного и того же пептида или несколькими пептидами для одного и того же иона металла. Глядя на эти соревнования между ионом металла и пептидами, исследователь может начать понимать, что способствует сродству связывания металл-пептидного комплекса, анализируя свободную энергию на энтальпию и энтропийные вклады. Термодинамика является неотъемлемой частью оценки динамического взаимодействия между ионами металлов и пептидами, а ITC и электронная абсорбционная спектроскопия предоставляют ручки для опроса этих систем. Методы, описанные здесь, могут быть расширены и использованы для изучения других взаимодействий связывания ионов металлов с макромолекулами и могут иметь последствия в физиологических процессах, разработке лекарств и многом другом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Acknowledgments

SC благодарит Летнюю исследовательскую стипендию Уайтхеда. MJS благодарит Фонды стартапов и Фонд развития факультета в Университете Сан-Франциско. MCH признает финансирование со стороны Национальных институтов здравоохранения (NIH MIRA 5R35GM133684-02) и Национального научного фонда (NSF CAREER 2048265).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,10-phenanthroline Sigma Aldrich 131377-25G
bis-Tris buffer Fisher BP301-100
Bottle-top 0.45 micron membrane Nalgene 296-4545 Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable
Copper(II) chloride Alfa Aesar 12458
EDTA Sigma Aldrich EDS-500G
Electronic absorption spectrophotometer Varian Cary 5000 Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable
high affinity resin Sigma Aldrich C7901-25G
Isothermal titration calorimeter (ITC) TA Instruments Nano ITC Low Volume
ITC analysis software TA Instruments NanoAnalyze SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used
ITC software TA Instruments ITCRun
light-duty delicate wiper Kimwipe 34155
loading syringe Hamilton Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL
matched cuvettes Starna Cells, Inc 16.100-Q-10/Z20 Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer
MOPS buffer Alfa Aesar A12914
spectrophotometer software Cary WinUV Scan
spreadsheet program Microsoft Excel Any suitable spreadsheet program will work
titration syringe TA Instruments 5346
ultrapure water Millipore Sigma Milli-Q Any water is okay as long as >18 MΩ resistance

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waldron, K. J., Robinson, N. J. How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal. Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).
  2. Puig, S., Thiele, D. J. Molecular mechanisms of copper uptake and distribution. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).
  3. Huffman, D. L., O'Halloran, T. V. Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins. Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).
  4. Kaplan, J. H., Lutsenko, S. Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs. Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).
  5. Makowska, J., et al. Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the Aβ (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations. Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).
  6. Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. 1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides. Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).
  7. García, J. E., et al. Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106−115: evaluating the role of protons and methionine residues. Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).
  8. Jakab, N. I., et al. Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy. Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).
  9. Keltner, Z., et al. Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants. Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).
  10. Whittal, R. M., et al. a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry. Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).
  11. Żamojć, K., et al. A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).
  12. Beuning, C. N., et al. Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-β complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching. Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).
  13. Makowska, J., Żamojć, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzyński, L. Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus. Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).
  14. Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization. ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).
  15. Stevenson, M. J., et al. Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity. Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).
  16. Magyar, J. S., Godwin, H. A. Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects. Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).
  17. Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. (Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions - a review. RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).
  18. Sigel, H., Martin, R. B. Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands. Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).
  19. Liu, J., et al. Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers. Chemical Reviews. 114 (8), 4366 (2014).
  20. Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).
  21. Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. Inorganic Chemistry. , Pearson. (2014).
  22. Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system. Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).
  23. Kocyła, A., Pomorski, A., Krężel, A. Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications. Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).
  24. Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions. Methods. 76, 137-148 (2015).
  25. NIST. Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).
  26. Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4′-dithiodipyridine. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).
  27. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).

Tags

Биохимия выпуск 182
Количественная оценка связывающих взаимодействий между Cu(II) и пептидными остатками в присутствии и отсутствии хромофоров
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Choi, S., San Juan, J. A., Heffern,… More

Choi, S., San Juan, J. A., Heffern, M. C., Stevenson, M. J. Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores. J. Vis. Exp. (182), e63668, doi:10.3791/63668 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter