Summary
Bu makale, peptitlere ve proteinlere bağlanan Cu(II)'nin termodinamiğini araştırmak ve ölçmek için elektronik absorpsiyon spektroskopisi ve izotermal titrasyon kalorimetrisinin kullanımına odaklanmaktadır.
Abstract
Bakır (II), biyolojik sistemlerde temel bir metaldir ve etkileşime girdiği biyomoleküllere benzersiz kimyasal özellikler kazandırır. Çeşitli peptitlere doğrudan bağlandığı ve aracılık yapısından elektron transfer özelliklerine ve katalitik fonksiyon vermeye kadar hem gerekli hem de patolojik rolleri oynadığı bildirilmiştir. Bu Cu(II)-peptid komplekslerinin in vitro bağlanma afinitesini ve termodinamiğini ölçmek, bağlanmanın termodinamik itici gücü, peptid için farklı metal iyonları veya Cu(II) için farklı peptitler arasındaki potansiyel rekabetler ve in vivo olarak Cu(II)-peptid kompleksinin prevalansı hakkında fikir verir. Bununla birlikte, bağlayıcı termodinamiğin nicelleştirilmesi, özellikle peptidi, d-blok metal iyonunu ve bunların etkileşimlerini temsil eden ayrı spektroskopik tutamakların bulunmadığı durumlarda, bir titrasyon deneyi içindeki tüm rakip dengelerin hesaplanması da dahil olmak üzere sayısız faktör nedeniyle zor olabilir.
Burada, Cu (II) -peptid termodinamiğinin doğru bir şekilde ölçülmesi için sağlam bir deney seti sağlanmıştır. Bu makalede, Cu(II) üzerinde gerekli spektroskopik tutamağı sağlamak için kromoforik ligandların varlığında ve yokluğunda elektronik absorpsiyon spektroskopisinin kullanımı ve etiketsiz izotermal titrasyon kalorimetrisinin kullanımı üzerinde durulmaktadır. Her iki deneysel teknikte de, tüm rakip dengeleri hesaba katacak bir süreç tanımlanmıştır. Bu makalenin odak noktası Cu(II) üzerinde olsa da, açıklanan deney seti Cu(II)-peptid etkileşimlerinin ötesine geçebilir ve fizyolojik olarak ilgili koşullar altında diğer metal-peptid sistemlerinin doğru bir şekilde ölçülmesi için bir çerçeve sağlayabilir.
Introduction
Biyoloji, yaşamın çevresindeki çevreye uyum sağlaması ve hayatta kalması için gereken metal iyonlarının çeşitli kimyasını kullanmak için gelişmiştir. Proteinlerin tahmini% 25 -% 50'si yapı ve işlev için metal iyonları kullanır1. Metal iyonunun özel rolü ve redoks durumu, onu koordine eden biyolojik ligandların bileşimi ve geometrisi ile doğrudan ilgilidir. Ek olarak, Cu(II) gibi redoks-aktif metal iyonları, reaktif oksijen türleri (ROS) 2,3,4 oluşturmak için Fenton benzeri kimya yoluyla oksitleyici ajanlarla etkileşime girmemeleri için sıkı bir şekilde düzenlenmelidir. Biyokimyasını yönlendiren bağlanma modlarını ve afinitesini anlamak, metal iyonunun biyolojik rolünü aydınlatmaya yardımcı olmalıdır.
Metallerin ve peptitlerin bağlanma etkileşimlerini incelemek için birçok teknik kullanılır. Bunlar çoğunlukla spektroskopik tekniklerdir, ancak aynı zamanda bir amiloid beta (Aβ) 5 parçası ile Cu (II) etkileşimlerinde görüldüğü gibi moleküler dinamiği kullanan bilgisayar simülasyonlarını da içerir. Birçok üniversite tarafından erişilebilen yaygın olarak kullanılan spektroskopik bir teknik, nükleer manyetik rezonanstır (NMR). Cu (II)'nin paramanyetik doğasını kullanarak, Gaggelli ve ark. metal iyonunun yakındaki çekirdekleringevşemesi yoluyla bir petide nereye bağlandığını gösterebildiler 6. Elektron paramanyetik rezonansı (EPR), paramanyetik metal iyonu bağlama7'nin yerini ve modunu araştırmak için de kullanılabilir. Dairesel dikroizm (CD) gibi diğer spektroskopik teknikler, tripeptit sistemleri8 gibi sistemlerde Cu(II) ile ilgili koordinasyonu tanımlayabilir ve kütle spektrometrisi stokiyometriyi ve metal iyonunun parçalanma kalıpları 9,10 ile hangi kalıntıların koordine edildiğini gösterebilir.
NMR gibi bu tekniklerden bazıları etiketsizdir, ancak büyük konsantrasyonlarda peptid gerektirir ve bu da çalışma için zorluklar yaratır. Floresan spektroskopisi adı verilen bir başka yaygın teknik, bir tirozin veya triptofanın pozisyonunu bir Cu(II)11,12'den söndürme ile ilişkilendirmek için kullanılmıştır. Benzer şekilde, bu teknik Cu(II) bağlama13'ün bir sonucu olarak yapısal değişiklikler gösterebilir. Bununla birlikte, bu metal-peptit bağlama çalışmalarındaki zorluklar, tüm sistemlerin sahip olmadığı tirozin gibi kromoforik amino asitleri araştırmaları, metal iyonunun klasik bir model altında bağlanması ve tekniğin fizyolojik koşullar altında elverişli olmayabilmesidir. Gerçekten de, bu tür kromoforik amino asitleri içermeyen veya klasik modellere bağlanmayan, bu tekniklerin kullanılmasını engelleyen birkaç peptit ortaya çıkmaktadır14,15. Bu makalede, fizyolojik olarak ilgili koşullar altında bu senaryolardaki bağlanma özelliklerini değerlendirmek için yaklaşımlar ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
Biyolojik ligandlar, histidin üzerindeki imidazol halkası gibi metal iyon bağlanmasını etkileyebilecek farklı protonasyon durumlarını benimseyebilir. pH tutarlı bir şekilde korunmazsa, sonuçlar kıvrımlı veya çelişkili olabilir. Bu nedenle, tamponlar metal-protein / peptit etkileşimlerinin incelenmesinde önemli bir bileşendir. Bununla birlikte, birçok tamponun metal iyonları16,17 ile olumlu etkileşime girdiği gösterilmiştir. İlgilenilen biyolojik molekülle rekabet etmenin yanı sıra, tampon, peptid veya proteinin koordine edici atomlarından ayırt edilmesi zor olabilecek benzer koordine edici atomlara sahip olabilir. Bu çalışmada, tampon seçimi ile ilgili özel hususlar göz önünde bulundurularak, Cu(II)-peptid etkileşimlerini incelemek için iki tamamlayıcı teknik olarak elektronik absorpsiyon spektroskopisi ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) üzerinde durulmuştur.
Elektronik absorpsiyon spektroskopisi, metal bağlama etkileşimlerini incelemek için hızlı, yaygın olarak erişilebilir bir tekniktir. Ultraviyole (UV) veya görünür dalga boylarında ışıkla ışınlama, ligand sınıflandırması, metal geometrileri ve görünür bağlanma afiniteleri hakkında değerli bilgiler sağlayan metal merkezli d-d bantlarının emilimine yol açabilir18,19. Bu kompleksler için, metal iyonlarının protein veya peptit çözeltilerine doğrudan titrasyonları, bağlanma stokiyometrilerini ve görünür bağlanma afinitelerini ölçebilir. D5 veya d10 elektron konfigürasyonları gibi bazı durumlarda, kompleks ışığı emmez (yani, spektroskopik olarak sessizdir). Bu spektroskopik olarak sessiz geçiş metal komplekslerinde, bu sınırlamalar, metal iyonuna koordine edildikten sonra, tespit edilebilir yük transfer bantları veren rakip bir ligand kullanılarak aşılabilir. Her iki durumda da, bu yaklaşım sadece stokiyometriyi ve görünür bağlanma afinitesini ölçmekle sınırlıdır ve bağlayıcı entalpiye ilişkin hiçbir içgörü yaklaşımlar olmadan sağlanmamıştır.
Elektronik absorpsiyon spektroskopisinden elde edilen bilgileri tamamlayan ITC, bağlayıcı entalpi20'nin doğrudan ve titiz bir şekilde ölçülmesi için çekici bir tekniktir. ITC, bir bağlama olayı sırasında salınan veya tüketilen ısıyı doğrudan ölçer ve titrasyon sabit basınçta gerçekleştiği için ölçülen ısı, tüm dengelerin entalpisidir (ΔHITC). Ek olarak, bağlanma olayının (n) stokiyometrisi ve görünür bağlanma afinitesi (KITC) ölçülür. Bu parametrelerden, serbest enerji (ΔG ITC) ve entropi (ΔSITC) belirlenir ve bağlanma olayının termodinamik bir anlık görüntüsü sağlanır. Işık emilimine dayanmadığı için ITC, spektroskopik olarak sessiz türler, örneğin d5 veya d10 metal iyon kompleksleri için ideal bir tekniktir. Bununla birlikte, kalorimetri ısıyı ölçtüğünden, herhangi bir eşsiz tampon sistemi ve hesaplanmamış denge, metal iyonu bağlayıcı termodinamiği doğru bir şekilde belirlemek için analizi olumsuz yönde etkileyebilir ve bu faktörleri ele almak için büyük özen gösterilmelidir20. Uygun titizlikle gerçekleştirilirse, ITC metal-protein / peptit komplekslerinin termodinamiğini belirlemek için sağlam bir tekniktir.
Burada, iki tekniğin tamamlayıcı kullanımını göstermek için kromoforik olarak sessiz bir bakır bağlayıcı peptid olan C-peptid kullanılır. C-peptid, insülin olgunlaşması sırasında oluşan 31 kalıntı bölünme ürünüdür (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ); kromoforik kalıntılardan yoksundur, ancak Cu(II)'yi fizyolojik olarak ilişkili afinite14,15 ile bağladığı gösterilmiştir. Cu (II) bağlanma bölgesi, bir glutamat ve bir aspartatın yan zincirlerinden ve ayrıca peptid 14,15'in N-terminusundan oluşur. Bu koordine edici atomlar, yaygın olarak kullanılan birçok tamponlu sisteminkine çok benzer. Burada, elektronik absorpsiyon spektroskopisinde d-d ve yük transfer bantlarının ve ITC'nin C-peptide bağlanan Cu (II) termodinamiğini ölçmede tandem kullanımı gösterilmiştir. Cu(II) bağlanmasının C-peptide bağlanmasını incelemekten yaklaşım, diğer metal iyonlarına ve protein / peptid sistemlerine uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Elektronik absorpsiyon spektroskopisi: tampon rekabeti ile doğrudan titrasyon
- Numune hazırlama
- Ultra saf su (>18 MΩ direnç) kullanarak pH 7.4'te 50 mM 2-[bis (2-hidroksietil) amino]-2-(hidroksimetil) propan-1,3-diol (bisTris) tamponlu bir çözelti hazırlayın. Eser metal iyonlarını, yüksek afiniteli bir reçine ile müteakip filtrasyon ile en az 2 saat boyunca inkübe ederek çıkarın.
- Peptitin bilinen bir miktarını metalsiz tampona çözün veya seyreltin.
NOT: Küçük yok olma katsayıları21 olan d-d bantlarını izlerken, daha yüksek konsantrasyonlarda peptit kullanılmalıdır. Burada, tamponlanmış çözeltideki C-peptidin son konsantrasyonu 300 μM idi (hacim küvetin boyutuna bağlıdır). C-peptid, katı faz peptid sentezi ile sentezlenmiştir ve literatür14'ün başka bir yerinde detaylandırılmıştır. - 10-15 mM'de bir çözelti yapmak için bilinen bir CuCl2 kütlesini ultra saf suda çözün.
NOT: Yağışı önlemek için metal tuzunun başlangıçta tamponsuz suda çözülmesi önemlidir. Diğer Cu(II) tuzları kullanılabilir, ancak anyonun zayıf bir şekilde koordine olduğundan emin olmak için dikkatli olunmalıdır.
- Denemeyi çalıştırma
- Elektronik absorpsiyon spektrofotometresini açın ve kullanmadan önce ~ 15-20 dakika ısınmasına izin verin. Spektrofotometre yazılımını başlatın ve tarama aralığı (200-900 nm), tarama hızı (200 nm / s) ve çift ışın taban çizgisi düzeltilmiş ( Ek Dosyada daha fazla parametre listelenmiştir) gibi parametreleri yapılandırın.
- Kiriş yollarında küvet veya numune içermeyen bir taban çizgisi toplayın.
- Çift ışınlı spektrofotometrede iki eşleşen küvet kullanarak, bir küveti 115 μL ultra saf su ile ve diğer küveti 115 μL peptid numunesi ile yükleyin. Küvetlerde hava kabarcığı olmadığından emin olun, çünkü bunlar sinyale müdahale edecektir.
- Küveti referans ışınına ultra saf su ile ve numune ışınına peptidli küvet yerleştirin.
- Metal içermeyen (apo) peptidin absorpsiyon spektrumunu toplayın.
- Peptit örneği ile küvete Cu(II) çözeltisinin sub-stokiyometrik bir miktarına (0.5 eşdeğeri, 150 μM) ekleyin. Eklenen Cu(II) hacminin 3 μL'den az olduğundan emin olun ve hacmi daha sonra analiz edilmek üzere kaydedin.
- Hava kabarcıklarının oluşmasını önlerken çözeltiyi karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı pipet uygulayın. Çözeltinin 5 dakika boyunca reaksiyona girmesine ve dengelenmesine izin verin ve absorpsiyon spektrumunu kaydedin.
- Aşağıdaki eşdeğerler için peptit çözeltisine adım 1.2.6'daki gibi Cu(II) alikotlarının eklenmesini tekrarlayın: 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 ve 5.0 (veya toplam 300, 450, 600, 900 ve 1.500 μM). Eklenen Cu(II)'nin toplam hacmini ve küvetin toplam hacmini kaydettiğinizden emin olun.
NOT: Daha fazla çözünürlük isteniyorsa, eşdeğerleri arasındaki boşluğu azaltın. - Numune küveti çıkarın ve üreticinin talimatlarına göre iyice temizleyin.
- Peptit içermeyen tamponlanmış çözeltiyi ekleyin ve absorpsiyon spektrumunu kaydedin. Her Cu(II) eşdeğeri için absorpsiyon spektrumunu kaydederek 1.2.5-1.2.8 adımlarında olduğu gibi Cu(II) alikotlarının eklenmesini tekrarlayın.
- Tüm spektrumları işlenmek üzere csv dosyaları olarak dışa aktarın. Küvetleri üreticinin talimatlarına göre iyice temizleyin ve spektrofotometreyi kapatın.
- Verilerin işlenmesi
- Tüm spektrumları bir elektronik tablo programına yükleyin.
- Yalnızca tampon (0 μM Cu(II)) spektrumunu diğer tüm spektrumlardan çıkararak tamponun kendisinden herhangi bir absorbans özelliğini kaldırın.
- Cu(II) çözeltisinin eklenmesinden kaynaklanan seyreltmeyi hesaba katmak için her spektrumu normalleştirin (adım 1.2.6). vbaşlangıcının küvete eklenen peptidin hacmi (115 μL), v Cu(II) adım 1.2.6'da eklenenCu(II) çözeltisinin hacmi ve Abstamponu çıkarılan spektrumun adım 1.2.7'de elde edilen veriler olduğu normalizasyon örneği için Ek Dosya, Eq (1)14'e bakınız.
- Değişim bölgelerini tanımlamak için tüm spektrumları birlikte grafiklendirin.
NOT: Cu(II) komplekslerinden tipik d-d bantları 500 ila 750 nm arasında değişmektedir. Bu spektrofotometrik titrasyon, oktahedral geometri21'de Laporte tarafından yasaklanan geçişler olan d-d bantlarından gelen küçük yok olma katsayısı nedeniyle zor olabilir. Absorbans çok zayıfsa, alternatif bir yaklaşım, Cu(II)'ye bağlandıktan sonra yük transfer bantlarıyla sonuçlanan kromoforik ligandları kullanmaktır (bkz. bölüm 2).
2. Elektronik absorpsiyon spektroskopisi: kromoforik ligand ile peptid rekabeti
- Numune hazırlama
- ~1 mM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 1,10-fenantrolin (fen) ultra saf suda çözün.
- Peptit (adım 1.1.2) ve Cu(II) (adım 1.1.3) için bölüm 1.1'de açıklanan numune preparatına ek olarak, tamponda ([Cu(fen)3]2+) 10 μM Cu(II) ve 40 μM fen çözeltisi hazırlayın. Hacmin küvetin doldurduğundan emin olun.
- Denemeyi çalıştırma
- Elektronik absorpsiyon spektrofotometresini 1.2.1 ve 1.2.2 adımlarında olduğu gibi başlatın, ancak tarama aralığını 200-400 nm olarak ayarlayın.
- Eşleşen iki küvette, bir küveti 115 μL ultra saf su ile ve diğer küveti 115 μL [Cu(phen)3]2+ çözeltisi ile yükleyin. Küvetin referans kirişine su ile ve küvetin numune kirişine [Cu(phen)3]2+ çözeltisi ile yerleştirin.
- Metal ligand kompleksinin absorpsiyon spektrumunu toplayın.
- [Cu(phen)3]2+ çözeltisine stokiyometrik miktarda (≈1 eşdeğeri, ≈10 μM) peptid ekleyin. İyice karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı pipet uygulayın, ancak hava kabarcıkları sokmamaya dikkat edin. Gelecekteki analizler için eklenen peptid hacmini kaydedin.
NOT: 115 μL tutan küvetler kullanıldığında, 3.83 μL 300 μM peptid eklenmesi, 9.7 μM'lik bir nihai peptid konsantrasyonu verir. - Dengeye ulaşmak için çözeltiyi 5 dakika boyunca inkübe edin. Absorpsiyon spektrumunu kaydedin.
NOT: Metal-peptid ve metal-ligandın bağlanma afinitesi benzerse, eklenen peptid konsantrasyonunun büyük miktarda olması gerekecektir. Normalizasyon için eklenen toplam peptit hacmini hesaba kattığınızdan emin olun. - Aşağıdaki yaklaşık eşdeğerler için [Cu(phen)3]2+ çözeltisine peptid alikotlarının eklenmesini tekrarlayın: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 22 ve 26 . Seyreltilmiş konsantrasyonun belirlenebilmesi için eklenen peptidin hacmini kaydedin.
- Numuneyi çıkarın ve küvetleri üreticinin talimatlarına göre iyice temizleyin. Arabelleğin bir spektrumunu toplayın. Tamponda 50 μM peptid spektrumu toplayın.
- Tüm verileri işlemek için csv dosyaları olarak dışa aktarın ve küvetleri üreticinin talimatlarına göre temizleyin.
- Verilerin işlenmesi
- Spektrumları bir elektronik tablo programına yükleyin ve arabellek spektrumunu diğer spektrumlardan çıkarın.
- Ek Dosya, Eq (2)14'ü izleyerek spektrumları normalleştirin.
- 265 nm'de [Cu(phen)3]2+ için yok olma katsayısını kullanarak (εmax = 90.000 M-1 cm-1)22, peptidin her ilavesiyle [Cu(phen)3]2+ konsantrasyonunu belirleyin.
- Peptitin her bir ilavesi için, 2.3.2 adımında belirlenen [Cu(phen)3]2+ 'nın kalan konsantrasyonunu, [Cu(phen)3]2+ 'nın başlangıç konsantrasyonundan (0 μM peptidde) çıkararak Cu(II)-peptid kompleksinin konsantrasyonunu belirleyin.
- Serbest fen ligandının konsantrasyonunu Ek Dosya, Eq (3)14'teki denklemle hesaplayın.
- Ek Dosya, Eq (4) 14 kullanarak serbest peptit konsantrasyonunu hesaplayın, burada [peptid] stok, küvete titre edilmiş seyreltilmemiş peptidi temsil eder, V 1, eklenen stok peptidinin hacmini temsil eder, V 2, küvetin toplam hacmidir ve [Cu 2 + -peptid] adım2.3.4'te belirlenir.
- Ek Dosya23'teki Eq (5)'i kullanarak deneysel bağlama afinitesini (Kex) hesaplayın.
- Cu(II)-peptidin ayrışma sabitini Ek Dosyada Eq (6)23 ile Kex ile ilişkilendirin, burada Kd,Cu(II)-phen = 1.0 × 10-9 (bkz. 22). Belirlenen tüm ayrışma sabitlerinden ortalama ve standart sapmayı belirleyin.
NOT: 4: 1 phen oranı altında: Cu (II), [Cu(phen)3]2+, [Cu(phen)2]2+ ve [Cu(phen)]2+ çözeltide bulunur ve peptid, Cu(II)'yi türlerden ([Cu(phen)]2+) en zayıf bağlanma 22 ile şelatlar.
3. İzotermal titrasyon kalorimetrisi
- Numune hazırlama
- Ultra saf su (>18 MΩ direnç) kullanarak pH 7.4'te 15 mM 3-morfolinopropan-1-sülfonik asit (MOPS) tamponlu bir çözelti hazırlayın. Eser metal iyonlarını, şişe üstü 0,45 μm'lik bir membrandan daha sonra vakum filtrasyonu ile en az 2 saat boyunca yüksek afiniteli bir reçine ile inkübe ederek çıkarın.
- ≈50-100 mM'lik bir çözelti hazırlamak için bilinen bir CuCl2 kütlesini ultra saf suda çözün. Son konsantrasyonu 1,4 mM Cu(II) olan 1,0 mL'lik bir çözelti elde etmek için bu Cu(II) çözeltisini tampon halinde seyreltin. Kullanılan CuCl 2 çözeltisinin tamhacmini kaydedin.
- 154 μM'lik bir peptid çözeltisinin 450 μL'sini yapmak için peptid çözeltisini tamponda çözün veya seyreltin. Peptit çözeltisine, 3.1.2 adımındaki aynı oranda ilave ultra saf suyun eklendiğinden emin olun, bu da seyreltme ısısını azaltacak ve sinyal-gürültüyü artıracaktır.
- Numunelerin hazırlanmasından sonra, çözeltilerin aynı pH'ta olduğundan emin olun ve gerekirse buna göre ayarlayın.
- İsteğe bağlı adım: ITC'ye yüklenen mikro kabarcıkları en aza indirmek için çözeltilerin gazını çözün.
- Denemeyi çalıştırma
- ITC'yi açın. Cihazı çalıştırmak için ITC yazılımını başlatın. Böreği yeniden eve döndürmeyi isteyecek ilk başlatmayı bekleyin; tıklayın, sonra ekrandaki yönergeleri izleyin.
- Kapağı referans hücresinden çıkarın. Referans hücresinden herhangi bir suyu çıkarın ve 450 μL gazdan arındırılmış ultra saf su ile üç kez durulayın.
- Bir yükleme şırıngasının 450 μL işaretine yavaşça ultra saf su çekin, şırıngaya hava kabarcıkları sokmamaya dikkat edin. Yükleme şırıngasını alttan ≈1 mm uzakta olana kadar referans hücresine yerleştirin ve yükleme şırıngasında 150 μL kalana kadar çözeltinin bir kısmını yavaşça enjekte edin. Hücre yüzeyindeki kabarcıkları yerinden çıkarmak için yükleme şırıngası pistonunu birkaç kez ≈25 μL hızla yukarı ve aşağı hareket ettirin. Piston yükleme şırıngasındaki 100 μL işaretine ulaşana kadar yavaşça enjekte edin, böylece referans hücresine toplam 350 μL ultra saf su dağıtın ve referans hücre kapağını değiştirin.
- Herhangi bir kalıntı çözeltiyi numune hücresinden çıkarın ve bir yükleme şırıngası kullanarak 450 μL 10 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile yükleyin. EDTA eser metalleri bağlayacağı için eser metal iyonlarının uzaklaştırıldığından emin olmak için 10 dakika bekletin.
- EDTA çözeltisini (bağlı eser metal iyonları ile) çıkarın ve yükleme şırıngasını bol miktarda ultra saf su ile iyice durulayın.
- ITC'yi üreticinin talimatlarına uygun olarak temizleyin, numune hücresini ultra saf suyla durulayın.
- Numune hücresini en az üç kez 450 μL tamponla durulayın.
- Örnek hücreyi koşullandıran arabelleği çıkarın. Yükleme şırıngasını kullanarak peptid çözeltisini numune hücresine yükleyin (adım 3.2.3'ü izleyin).
- Titrasyon şırıngasını 200 μL tamponlu çözelti ile durulayın. Bunu yapmak için, pistonu çıkarın ve tamponu cam titrasyon şırıngasının üstündeki delikten, şırıngadan ve aşağıdaki iğneden pipetle çıkarmak için bir mikropipet kullanın.
- Pistonu titrasyon şırıngasına tamamen takın.
- Titrasyon şırınga iğnesinin ucunu metal çözeltiye batırın ve pistonu yavaşça yukarı çekerek metal çözeltinin şırıngayı doldurmasına neden olur ve titrasyon şırıngasının cam kısmının üstünde bir boşluk hacmine neden olur. Titrasyon şırıngasını zemine paralel olarak döndürerek boşluk hacminin çoğunu çıkarın, pistonu çıkarın ve cam kısmı hafifçe zemine doğru eğin. Titrasyona şırıngayı hafifçe sallayın, böylece çözelti titrasyon şırıngasının cam kısmının sonuna doğru hareket eder ve boşluk hacminin çoğunu doldurur, ancak 2-3 μL boşluk hacminin kaldığından emin olun. Şırıngayı zemine paralel tutarken, pistonu tekrar takın.
- Titrasyon şırıngasını dik tutun, iğnenin ucunu tekrar metal çözeltiye batırın ve iğneden hava çıkmayı bırakana kadar pistonu aşağı doğru itin. İğnenin ucunu çözeltide tutarken pistonu yavaşça yukarı çekerek titrasyon şırıngasını 50 μL işaretinin hemen üstüne doğru yükleyin.
- Titrasyon şırıngasının cam kısmını dikkatlice böreğe yerleştirin ve parmağınızı sıkana kadar vidalayın. Pistonun sıkıştırılması nedeniyle titrasyon şırıngasından az miktarda çözelti çıktığında, iğnenin ucuna dokunmadan çözeltiyi dikkatlice emmek için hafif hizmet tipi hassas bir silecek kullanın.
- Böreği titrasyon şırıngalı numune hücresine yerleştirin ve güvenli bir şekilde sabitleyin.
- ITC yazılımındaki parametreleri ayarlayın. Cihaz Kontrolünden başlayarak, karıştırma hızını (tipik karıştırma hızları 150 ila 350 RPM arasında değişir) ve deneyin gerçekleştirileceği sıcaklığı (tipik olarak 25 ° C) ayarlayın. Şırınga ve hücre konsantrasyonlarını milimolar birimler halinde Deney Ayrıntıları altında girin.
- Deneme Yöntemi bölümünde, Artımlı Titrasyon'u seçin. Kurulum'a tıklayın ve 20 adet 2,5 μL'lik enjeksiyon belirtin. Bağlanma olayını gözlemlemek için daha fazla çözünürlük gerekiyorsa, enjeksiyon sayısını artırın ve enjeksiyon başına hacmi azaltın. Her enjeksiyon arasındaki zaman aralığını girin, böylece sinyalin dengelenmesi ve taban çizgisine, tipik olarak 300 s'ye dönmesi için yeterince uzun olur.
- Denemeyi başlatmak ve verilerin nereye kaydedileceğini belirtmek için çalıştır düğmesini tıklayın.
- Deneyin tamamlanmasının ardından, numune hücresini ve titrasyon şırıngasını temizleyin.
- Kesin veri toplama sağlamak için tüm denemeleri en az üç kat halinde çalıştırın.
- Metal iyonundan seyreltme ısısının küçük olduğundan ve hesaplanmamış denge olmadığından emin olmak için metal çözeltinin tamponlu çözeltiye (peptid yokluğunda) titre edildiği bir kontrol deneyi çalıştırın. Seyreltme ısısı büyükse, mümkünse farklı bir tampon sistemi düşünün.
- Verilerin işlenmesi
- ITC analiz yazılımını başlatın ve analiz için veri dosyasını yükleyin.
- Temel sekmesine gidin ve termogramı inceleyin. Hava kabarcıklarından veya termogramdaki diğer eserlerden evrimleşen veya emilen herhangi bir eksojen ısıya dikkat edin. Metal çözeltinin enjeksiyonundan kaynaklanmayan sivri uçları arayın.
- Analiz yazılımı tarafından oluşturulan taban çizgisinin, enjeksiyon ve dengelemeden sonra verilerin bir kısmını takip ettiğinden emin olun. Sapma olursa, taban çizgisini ayarlamak için Temel Pivot Noktaları'nı kullanın. Entegrasyon Bölgelerinin , metalin enjeksiyonundan üretilen tepe noktasını içerdiğinden emin olun, ancak adım 2'de bulunan termogramdaki hava kabarcıklarını veya eserleri engelleyin. Taban çizgisini termogramdan çıkarın.
NOT: Bu tür bir manipülasyon yalnızca birden fazla termogram toplandıktan sonra önerilir, bu nedenle deneyci gerçek verilerin ne olduğunu ve bir yapının ne olduğunu bilir, çünkü taban çizgisini ve Entegrasyon Bölgelerini ayarlamak verileri büyük ölçüde etkileyebilir. - Analiz yazılımının her enjeksiyon için entegre ve konsantrasyon normalleştirilmiş verileri göstereceği verileri sığdırmaya başlamak için Modelleme penceresine gidin.
- Montaj algoritmasından çıkarmak için ilk enjeksiyonun verisine sol tıklayın.
NOT: Bu yaygındır, çünkü titrant ve numune hücre çözeltisi arasında küçük bir karışım olacaktır ve bu da ilk enjeksiyonun kesin olmayan azı dişlerinin dağıtılmasına yol açacaktır. - Modeller bölümünde, son enjeksiyon entalpisi temel alınarak her veri noktasından çıkarılacak olan ve seyreltme ısısını hesaba katarak Stil açılır menüsünde Boş (sabit) seçeneğini belirleyin. Ayrıca, verileri sığdırmak için ikinci Stil açılır menüsünde Bağımsız'ı (veya sistem için en iyi modeli) seçin.
NOT: Standart 1:1 bağlama etkileşimleri için en yaygın model Bağımsız'dır. - Yeşil oynat düğmesine Σ ile basarak iki modeli kullanarak verileri sığdırın.
NOT: ITC verilerini işlemek için başka bir yazılım SEDPHAT24'tür. - Daha önce Grossoehme ve ark. tarafından bildirilen post hoc analizdeki tüm rakip dengeleri hesaba katın. 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Amaç, elektronik absorpsiyon spektroskopisi ve ITC'nin tamamlayıcı tekniklerini kullanarak C-peptide bağlanan Cu (II) termodinamiğini ölçmek ve doğrulamaktı. Elektronik absorpsiyon spektroskopisinin sağlam doğası nedeniyle, Cu(II)'nin 300 μM C-peptide doğrudan titrasyonu gerçekleştirilmiştir (Şekil 1). 150 μM Cu(II) ilavesi, Cu(II)'nin d-d bandına atfedilen 600 nm'de bantta ani bir artışa neden oldu ve 300 μM Cu(II) eklenene kadar artmaya devam etti. 300 μM Cu(II)'nin üzerindeki ilave eklemeler, d-d bandının emilimini arttırmadı, bu da doygunluğu ve Cu(II)'nin 1:1 kompleksinde C-peptide bağlandığını gösterdi. Ayrıca, bis-Tris'in Cu(II)'ye bağlanma için nispeten yüksek afinitesi nedeniyle (log K = 5.27)16, Cu(II)/C-peptid afinitesinin metal iyonunu tampondan uzaklaştırmak için mikromolar aralıkta (log K > 6) daha düşük bir limiti olmalıdır. Bu sistemde, küçük yok olma katsayısı nedeniyle absorpsiyon bantlarının hassas bir şekilde ölçülmesi zordur.
D-d bandının küçük yok olma katsayısını atlatmak için, yukarıda tarif edildiği gibi kromoforik bir ligand, fen kullanılmıştır. C-peptid ≈10 μM [Cu(phen)3]2+ (Şekil 2A) içine titre edildi ve 265 nm'deki yük transfer bandından emilim azaldı (Şekil 2B), bu da C-peptidin fen ligandından Cu(II)'yi şelatlayabildiğini gösterdi. Daha yakından incelendiğinde, fen ligandını mütevazı bir şekilde geride bırakmak için büyük bir C-peptid konsantrasyonuna (140 μM'ye kadar) ihtiyaç duyulmuştur (Tablo 1). [Cu(phen)3]2+ (sırasıyla log K 1, β 2 ve β3 için 9.0,15.7 ve 20.8)22 için büyük sıralı oluşum sabitleri göz önüne alındığında bu şaşırtıcı değildir. Spektrumların analizi, Cu(II)/C-peptid bağlanma afinitesinin log K = 7.4-7.8 aralığında olduğunu göstermektedir (Tablo 1).
Bir bağlama etkileşiminin tüm termodinamiğini ölçmenin altın standardı ITC'dir. Şekil 3, 15 mM MOPS, pH 7.4'te C-peptide titre edilmiş ve Cu(II) için rekabeti sağlayan temsili bir Cu(II) termogramı sunmaktadır. Burada, bis-Tris tamponu yerine MOPS tamponu kullanılmıştır, çünkü K Cu(II)-MOPS, K Cu(II)-bis-Tris 16,25'i < ve ITC'nin afiniteyi doğru bir şekilde ölçebilmesi için daha az rekabet sağlayacaktır (tartışmaya bakınız). Tüm dengeler arasında tüketilen veya evrimleşen ısıyı ölçerek, termogram sigmoidal bir şekil sağlar. Peptit doygunluğa ulaşmadan önce Cu(II)'nin ilk enjeksiyonları, seyreltme ısısına kıyasla büyük miktarda ısı ile sonuçlanır. Bu ısı değerlerindeki fark ΔHITC'dir. Bükülme noktası iki yararlı bilgi parçasını tanımlar. Birincisi, şırıngadaki türlerin hücredeki türlere kıyasla bağlayıcı stokiyometrisidir (yani, Cu(II):C-peptid 1:1'dir). İkincisi, bükülme noktasındaki uyumun eğimi KITC ile doğru orantılıdır. Üçlü ve çoklu tamponlarda veri toplandıktan sonra, tüm rakip dengelerin hesaba katıldığı, post hoc analiz20 gerçekleştirilmiş (Tablo 2) ve tampondan bağımsız termodinamik belirlenmiştir. C-peptide Cu(II) bağlanması için, K Cu(II)/C-peptid = 1 (± 1) x 10 8 ve ΔHCu(II)/C-peptid = -8 (± 4) kJmol-1. Bunlardan, ΔG°Cu(II)/C-peptide = -46 (± 4) kJ mol-1 ve ΔSCu(II)/C-peptide = 120 (± 10) J mol-1 K-1 (bkz. 15) diğer bağlayıcı termodinamik parametreler belirlenir.
Şekil 1: 50 mM bis-Tris, pH 7.4'te 150, 300, 450, 600, 900 ve 1.500 μM Cu(II) ila 300 μM C-peptid ilavesiyle Cu(II) d-d bandının izlenmesi. Cu(II)'nin d-d bandı, 1:1 Cu(II):C-peptid kompleksi oluşana kadar 600 nm'de artar. Daha önce, Magyar ve Godwin, Cu(II)-bis-Tris afinitesinin log K = 5.2716 olduğunu bildirmişti. Bu titrasyon, C-peptidin Cu(II)'yi bağlamak için tampondan daha fazla rekabet edebileceğini ve mikromolar aralıkta bir Cu(II)/C-peptid afinitesini gösterdiğini gösterir. Bu şekil Stevenson ve ark.14'ün izniyle yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: [Cu(phen)3]2+ oluşumu ve C-peptid ilavesi üzerine yük transfer bandının azalmasını izleyen temsili elektronik absorpsiyon spektrumları. (A) [Cu(phen)3]2+ oluşumunu gösteren reaksiyon şeması ve 265 nm (ε° ≈ 90.000 M-1 cm-1)22 merkezli yük transfer bandı. Formasyon sabitleri günlük K 1, β 2 ve β3 için sırasıyla 9.0, 15.7 ve20.8'dir. (B) C-peptid şelatları Cu(II) olarak [Cu(phen)3]2+'dan yük transfer bandının azalmasını izleyen temsili elektronik absorpsiyon spektrumları. Titrasyon, 50 mM bis-Tris, pH 7.4 olarak gerçekleştirildi. Veri analizi Tablo 1'de gösterilmiştir. Bu şekil Stevenson ve ark.14'ün izniyle yeniden basılmıştır. Kısaltma: MLCT = metalden ligand'a yük transferi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Cu(II)'nin C-peptid ve tampona titre edilmiş temsili termogramları. (A) Bu temsili termogram, 15 mM MOPS, pH 7.4'te 1.4 mM Cu(II)'nin 154 μM C-peptide titrasyonunu göstermektedir. Veriler aşağıdaki parametrelerle tek siteli bir modele uygundur: n = 1,2 ± 0,1; Kd,ITC = 6 (± 3) x 10-7; ΔHITC = −3.4 ± 0.2 kJ mol-1. (B) Panel A'da görülen bağlayıcı termogram göstermeyen C-peptidin yokluğunda, 1,4 mM Cu(II)'nin 15 mM MOPS, pH 7,4'e temsili bir kontrol titrasyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| [C-peptid] | A265 | [Cu(phen)3] 2+ | [fen] serbest | [C-peptid] serbest | [Cu(II)/C-peptid] | Keski (x108) | KdCu(II)/C-peptid | log KdCu(II)/C-peptid | |
| 0.0 | 1.0649 | 11.83 | 4.5 | 0 | 0.00 | Nd | Nd | Nd | |
| 9.7 | 0.9948 | 11.05 | 6.84 | 7.45 | 0.78 | 0.0543 | 1.84E-08 | 7.75 | |
| 18.7 | 0.9785 | 10.87 | 7.38 | 16.00 | 0.96 | 0.0367 | 2.73E-08 | 7.56 | |
| 27.3 | 0.9651 | 10.72 | 7.83 | 24.09 | 1.11 | 0.0310 | 3.23E-08 | 7.49 | |
| 35.3 | 0.9475 | 10.53 | 8.42 | 31.55 | 1.30 | 0.0307 | 3.26E-08 | 7.49 | |
| 42.8 | 0.9374 | 10.42 | 8.75 | 38.79 | 1.42 | 0.0288 | 3,48E-08 | 7.46 | |
| 50.0 | 0.9283 | 10.31 | 9.06 | 45.64 | 1.52 | 0.0275 | 3.63E-08 | 7.44 | |
| 56.7 | 0.9134 | 10.15 | 9.55 | 51.92 | 1.68 | 0.0288 | 3.47E-08 | 7.46 | |
| 63.1 | 0.9025 | 10.03 | 9.92 | 57.97 | 1.81 | 0.0291 | 3.43E-08 | 7.46 | |
| 69.2 | 0.8927 | 9.92 | 10.24 | 63.73 | 1.91 | 0.0294 | 3.40E-08 | 7.47 | |
| 75.0 | 0.878 | 9.76 | 10.73 | 69.04 | 2.08 | 0.0314 | 3.19E-08 | 7.50 | |
| 85.7 | 0.8542 | 9.49 | 11.53 | 78.99 | 2.34 | 0.0341 | 2.93E-08 | 7.53 | |
| 95.4 | 0.8316 | 9.24 | 12.28 | 88.01 | 2.59 | 0.0371 | 2,69E-08 | 7.57 | |
| 104.3 | 0.8151 | 9.06 | 12.83 | 96.38 | 2.78 | 0.0387 | 2.58E-08 | 7.59 | |
| 112.4 | 0.7976 | 8.86 | 13.41 | 103.98 | 2.97 | 0.0411 | 2.44E-08 | 7.61 | |
| 126.9 | 0.7809 | 8.68 | 13.97 | 117.87 | 3.16 | 0.0411 | 2.44E-08 | 7.61 | |
| 139.2 | 0.7586 | 8.43 | 14.71 | 129.53 | 3.40 | 0.0437 | 2.29E-08 | 7.64 | |
| Aralık | 7.4-7.8 | ||||||||
Tablo 1: Şekil 2B'den çözelti içindeki türlerin konsantrasyonları için temsili hesaplamalar. Tüm konsantrasyonlar mikromolar içindedir. Bu tablo Stevenson et al.14'ün izniyle yeniden basılmıştır.
| Equlibria | n | ΔH (kJ mol-1) | n × ΔH (kJ mol-1) |
| Cu(II)-MOPS → Cu(II) + MOPS | 1 | 5.4 | 5.44 |
| MOPS + H + → MOPS-H+ | 0.097 | −21,0 | −2,04 |
| Cu(II) + C-peptid-H+ → Cu(II)/C-peptid + H+ | 1 | X | X |
| ΔHITC = Χ + 3,40 | |||
| Χ = ΔHITC − 3,40 | |||
| Χ = ΔHCu(II)/C-peptid = −6.8 kJ mol-1 |
Tablo 2: ΔHCu(II)/C-peptidi belirlemek için post hoc analiz. Şekil 3,1.4'te gösterildiği gibi Cu(II), 15 mM MOPS'ta 154 μM C-peptide, üçlü olarak pH 7.4'e titre edildi. Tabloda gösterilen tüm rakip dengeler hesaba katıldıktan sonra, ΔHCu(II)/C-peptidin -8.66 kJ mol-1 olduğu bulunmuştur. C-peptidinden Cu(II) ile yer değiştiren protonların sayısı, verilerin çoklu tamponlarda toplandığı (ΔHITC + ΔHCu(II)-Buffer) ile ΔHBuffer-H'nin eğiminden belirlenir. Tüm entalpi değerleri NIST 25'te bulunur veya literatür15'te başka bir yerde belirlenir. Tüm rakip dengeler Grossoehme ve ark. tarafından tanımlandığı gibi muhasebeleştirilmiştir.20 Bu rakam Stevenson ve ark.15'in izniyle yeniden basılmıştır.
Ek Dosya: Protokol bölümünde kullanılan ilgili denklemler ve elektronik absorpsiyon spektrofotometresi ve ITC kurulumu için ek parametreler. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makale, peptitlere bağlanan Cu(II)'nin afinitesini ve termodinamiğini ölçmek için sağlam bir yöntem sunmaktadır. Cu(II) içeren kompleksler, d9 elektron konfigürasyonu nedeniyle metal sahasındaki d-d absorpsiyon bandını izlemek için idealdir. Her ne kadar yok olma katsayısı küçük olsa da, bu nedenle güvenilir bir sinyal vermek için kompleksin daha büyük konsantrasyonlarını gerektirse de, Cu(II)'nin peptide titrasyonları, bağlanma stokiyometrisi ve yaklaşık bağlanma afinitesi hakkında hızlı bir şekilde fikir verebilir. Bununla birlikte, metal hem tampon hem de peptitten benzer atomlar ve geometriler tarafından koordine edilirse, spektrumlardaki bir farkı ayırt etmek zor olabilir. Bağlanma afinitesini kantitatif olarak belirlemek için, fen gibi kromoforik ligandlar, metal iyonları21 ile simetriye izin verilen yük transferleri nedeniyle sıklıkla kullanılır. Bir kromoforik ligand ve kromoforik olmayan bir peptid arasında bir rekabet kurarak ve metalin ligand'a olan afinitesini bilerek, metal-peptid afinitesi doğrudan belirlenebilir. Elektronik absorpsiyon spektroskopisi kullanılarak daha ileri termodinamik analizler zordur. UV-Vis spektroskopisi gibi bir teknik kullanarak bağlanma entalpiyi ölçmek için, bağlanma afinitesi çoklu sıcaklıklarda belirlenmeli ve bir van't Hoff analizi yapılmalıdır. Bu analiz, bağlanmanın özgül ısısının sıfır olduğunu varsayar, bu nadiren doğrudur ve bu nedenle yalnızca bağlanma entalpisi20'nin bir tahminini sağlar.
İzotermal titrasyon kalorimetrisi, metal-peptit etkileşimlerinin termodinamiğine daha eksiksiz bir genel bakışı aydınlatmak için daha uygundur. Bu teknikte, bir metal iyonu peptid çözeltisine titre edilir ve çeşitli dengelerin ısısı doğrudan ölçülür. Deney sabit basınçta yapıldığından, ITC tarafından ölçülen ısı entalpiye eşittir. ITC, spektroskopik olarak sessiz metal iyonlarını incelemek ve van't Hoff analizinde yapıldığı gibi varsayımlarda bulunmaya gerek kalmamak gibi elektronik absorpsiyon spektroskopisinin bazı sınırlamalarının üstesinden gelebilir. Bununla birlikte, bazen, ITC'de meydana gelen reaksiyonlar çok az ısı üretir veya hiç ısı üretmez ve bu nedenle gözlenmez. Bu, artan metal ve peptit konsantrasyonları yoluyla veya farklı bir protonasyon entalpisi ile farklı bir tampon kullanılarak atlanabilir. İkincisi, metal iyonu peptide bağlandıktan sonra birden fazla protonun yerini alırsa özellikle yararlıdır. Bununla birlikte, her iki teknik de - ITC ve elektronik absorpsiyon spektroskopisi - aynı sistemi incelemek ve birbirlerini iyi tamamlamak için ortogonal yöntemler sağlar.
Peptitlere bağlanan metal iyonlarını incelerken her iki teknikte de birçok zorlu yön vardır. Birçok metal iyonu suda çözünmez veya az miktarda çözünür. Bu, tampona eklendiğinde metal iyonunun çökelmesiyle daha da şiddetlenir. ITC'de bu, taban çizgisinde yavaş, kademeli bir kayma ve metal enjekte edildiğinde üretilen büyük miktarda ısı ile kendini gösterebilir. Bu, peptid metal iyonu tarafından doyurulduktan sonra bile seyreltme ısısının büyük değerlerinin göstergesidir. Elektronik absorpsiyon spektroskopisinde, metal iyonu çökeltmesi, daha düşük dalga boylarında artan absorpsiyon yoluyla kendini gösterir ve UV bölgesinde merkezlenmiş geniş bir zirveye benzer. Her iki teknikte de, deneyci metal iyonunun seçim koşulları altında (örneğin, tampon, pH, sıcaklık, konsantrasyon) çözünür olmasını sağlamalıdır. Her iki yöntemin bir başka sınırlaması, ekleme sırası kavramıyla kendini gösterebilir. Bazı durumlarda, oluşan bir metal kompleksi kararsız olabilirken, aynı reaktiflerin farklı bir sırayla eklenmesi başka bir ara türü etkisiz hale getirecektir. Kinetik ve termodinamik kontrolün bu gösterimi, tüm rakip dengelerin doğru analizini engellemektedir.
Hem ITC hem de elektronik absorpsiyon spektroskopisi, metal iyonunu bağlamak için peptid ile tampon veya ligand arasındaki rekabetlere dayanır. Burada, K ITC'nin montaj algoritması tarafından doğru bir şekilde belirlenip belirlenemeyeceğini belirlemeye yardımcı olanc-değeri tanıtılmıştır. C-değeri, Ek Dosya, Eq (7)20'de tanımlanmıştır, burada n stokiyometridir, KITC görünür bağlanma afinitesidir ve [örnek hücre] örnek hücredeki türlerin konsantrasyonudur. C-değeri 1 ile 1.000 arasında olduğunda, belirlenen KITC doğrudur. Bununla birlikte, 1'in altındaki c-değerleri yalnızca KITC'ye bir üst sınır sağlayabilirken, 1.000'in üzerindeki c-değerleri yalnızca20 alt sınır sağlayabilir. Tamamlayıcı tekniklerden veri toplamanın değeri budur: sınırlamaları nedeniyle bir teknikte bir şey kaçırılırsa, tamamlayıcı tekniğinde yakalanabilir. Bu deneylerde, rekabet bir türe büyük ölçüde tercih edilirse (yani, peptidin metal iyon afinitesi tamponun afinitesinden çok daha büyüktür), denge değişecek ve yorumlanması zorlaşacaktır. Bu aynı zamanda Kocyla ve ark.23 tarafından ayrıntılı olarak gösterilmiştir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, farklı bir rakip ligandın tanıtılması veya değiştirilmesi veya farklı bir tamponun seçilmesi, doğru niceleme için ligand ve peptid arasındaki rekabeti arttırmak için sıklıkla kullanılır. Bunun nedeni, metal-tampon (veya metal-ligand) ve metal-peptit afinitelerinin farkının, c-değerinin 1 ila 1000 aralığına düşmesine izin vermesidir. Bununla birlikte, kantitatif analiz için rakip bir ligand veya başka bir tamponun kullanılmasının, metal-ligand veya metal-tampon kompleksinin termodinamik parametrelerinin bilinmesini veya başka yollarla belirlenebilmesini gerektirdiği belirtilmelidir.
Son olarak, peptid konsantrasyonunu doğru bir şekilde ölçmek zor olabilir. Peptit konsantrasyonlarını ölçmenin bazı yaygın yolları, spesifik amino asitleri ölçmek ve bu amino asitlerin miktarını peptidin dizisiyle ilişkilendirmektir. Örneğin, elektronik absorpsiyon spektroskopisi tirozin gibi aromatik kalıntıları ölçebilir, Ellman'ın reaktifi serbest tiollerin sayısınıölçebilir 26 ve Bradford analizleri kaç tane kalıntı bulunduğunun bir göstergesidir27. Ne yazık ki, bu çalışmada kullanılanlar gibi peptitlerin aromatik kalıntıları veya serbest tiolleri yoktur ve Bradford tahlilleri, büyük proteinlerden gelen standartları ilgilenilen küçük peptitle karşılaştırırken zorluklar ortaya koymaktadır. Bunun yerine, peptid konsantrasyonu kuru kütle tarafından belirlendi. İdeal olmasa da ve peptid konsantrasyonunun hafif abartılması olan konsantrasyonlara eğilimli olsa da (görünür kütle ölçümleri, tuzların varlığı nedeniyle gerçek peptid kütlelerinden daha yüksek olduğu için), ölçüm için tüm alikotlar aynı şekilde muamele edilmiştir, bu da daha doğru karşılaştırmalara izin verir. Spektroskopik çalışmalarda, serbest peptit konsantrasyonu beklenenden düşükse, hesaplanan bağlanma afinitesi bir alt sınırı temsil eder (Ek Dosya, Eq (5) ve Eq (6)). Gösterilen her iki teknikle ilgili zorluklar vardır, ancak bir rehber olarak edebiyat ile birçoğunun üstesinden gelinebilir.
Burada detaylandırılan deneysel yaklaşım, metal-peptit bağlayıcı termodinamiğin doğru bir şekilde ölçülmesini sağlar. Hem ITC hem de elektronik absorpsiyon spektroskopisi ortogonaldir ve bağlanma afinitesi hakkında fikir verir, ancak ITC doğrudan entalpi nicelemesine izin verir. Bu termodinamikler ölçüldükten sonra, bu metal-peptit komplekslerinin fizyolojik koşullar altında oluşup oluşmayacağı sonucuna varılabilir. Fizyolojik metal iyonu akısının anlaşılması arttıkça, bağlanma afinitesinin in vivo kompleks oluşum için yeterince güçlü olup olmadığı tahmini yapılabilir. Ayrıca, araştırmacı aynı peptit için çoklu metal iyonları veya aynı metal iyonu için çoklu peptitler arasındaki rekabetler hakkında tahminlerde bulunabilir. Metal iyonu ve peptitler arasındaki bu yarışmalara bakıldığında, araştırmacı, serbest enerjiyi entalpi ve entropi katkılarına ayrıştırarak metal-peptit kompleksinin bağlanma afinitesine neyin katkıda bulunduğunu anlamaya başlayabilir. Termodinamik, metal iyonları ve peptitler arasındaki dinamik etkileşimi takdir etmenin ayrılmaz bir parçasıdır ve ITC ve elektronik absorpsiyon spektroskopisi, bu sistemleri sorgulamak için tutamaklar sağlamaktadır. Burada açıklanan yöntemler, makromoleküllerle diğer metal iyonu bağlayıcı etkileşimleri incelemek için genişletilebilir ve kullanılabilir ve fizyolojik süreçlerde, ilaç tasarımında ve daha fazlasında etkileri olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
SC, Whitehead Yaz Araştırma Bursu'na teşekkür eder. MJS, San Francisco Üniversitesi'ndeki Başlangıç Fonlarına ve Fakülte Geliştirme Fonu'na teşekkür eder. MCH, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH MIRA 5R35GM133684-02) ve Ulusal Bilim Vakfı'ndan (NSF KARİYER 2048265) gelen fonları kabul etmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,10-phenanthroline | Sigma Aldrich | 131377-25G | |
| bis-Tris buffer | Fisher | BP301-100 | |
| Bottle-top 0.45 micron membrane | Nalgene | 296-4545 | Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable |
| Copper(II) chloride | Alfa Aesar | 12458 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-500G | |
| Electronic absorption spectrophotometer | Varian | Cary 5000 | Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable |
| high affinity resin | Sigma Aldrich | C7901-25G | |
| Isothermal titration calorimeter (ITC) | TA Instruments | Nano ITC Low Volume | |
| ITC analysis software | TA Instruments | NanoAnalyze | SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used |
| ITC software | TA Instruments | ITCRun | |
| light-duty delicate wiper | Kimwipe | 34155 | |
| loading syringe | Hamilton | Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL | |
| matched cuvettes | Starna Cells, Inc | 16.100-Q-10/Z20 | Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer |
| MOPS buffer | Alfa Aesar | A12914 | |
| spectrophotometer software | Cary | WinUV Scan | |
| spreadsheet program | Microsoft | Excel | Any suitable spreadsheet program will work |
| titration syringe | TA Instruments | 5346 | |
| ultrapure water | Millipore Sigma | Milli-Q | Any water is okay as long as >18 MΩ resistance |
References
- Waldron, K. J., Robinson, N. J. How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal. Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).
- Puig, S., Thiele, D. J. Molecular mechanisms of copper uptake and distribution. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).
- Huffman, D. L., O'Halloran, T. V. Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins. Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).
- Kaplan, J. H., Lutsenko, S. Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs. Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).
- Makowska, J., et al. Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the Aβ (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations. Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).
- Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. 1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides. Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).
- García, J. E., et al. Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106−115: evaluating the role of protons and methionine residues. Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).
- Jakab, N. I., et al. Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy. Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).
- Keltner, Z., et al. Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants. Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).
- Whittal, R. M., et al. a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry. Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).
- Żamojć, K., et al. A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).
- Beuning, C. N., et al. Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-β complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching. Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).
- Makowska, J., Żamojć, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzyński, L. Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus. Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).
- Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization. ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).
- Stevenson, M. J., et al. Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity. Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).
- Magyar, J. S., Godwin, H. A. Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects. Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).
- Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. (Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions - a review. RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).
- Sigel, H., Martin, R. B. Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands. Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).
- Liu, J., et al. Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers. Chemical Reviews. 114 (8), 4366 (2014).
- Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).
- Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. Inorganic Chemistry. , Pearson. (2014).
- Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system. Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).
- Kocyła, A., Pomorski, A., Krężel, A. Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications. Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).
- Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions. Methods. 76, 137-148 (2015).
- NIST. Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).
- Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4′-dithiodipyridine. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
