Summary

Etablera organoider från mänsklig tand som ett kraftfullt verktyg mot mekanistisk forskning och regenerativ terapi

Published: April 13, 2022
doi:

Summary

Vi presenterar ett protokoll för att utveckla epitelorganoidkulturer med utgångspunkt från mänsklig tand. Organoiderna är robust expanderbara och rekapitulerar tandens epitelstamceller, inklusive deras ameloblastdifferentieringskapacitet. Den unika organoidmodellen ger ett lovande verktyg för att studera människans tandbiologi med perspektiv för tandregenerativa metoder.

Abstract

Tänder är av avgörande betydelse i livet, inte bara för matmastik och tal utan också för psykologiskt välbefinnande. Kunskap om mänsklig tandutveckling och biologi är knapp. I synnerhet är inte mycket känt om tandens epitelstamceller och deras funktion. Vi lyckades utveckla en ny organoidmodell med utgångspunkt från mänsklig tandvävnad (dvs. tandfollikel, isolerad från extraherade visdomständer). Organoiderna är robust och långsiktigt expanderbara och rekapitulerar det föreslagna humana tandepiteliala stamcellsfacket när det gäller marköruttryck såväl som funktionell aktivitet. I synnerhet kan organoiderna utveckla en ameloblastdifferentieringsprocess som förekommer in vivo under amelogenes. Denna unika organoidmodell kommer att ge ett kraftfullt verktyg för att studera inte bara mänsklig tandutveckling utan också tandpatologi och kan bana väg för tandregenerativ terapi. Att ersätta förlorade tänder med en biologisk tand baserad på denna nya organoidmodell kan vara ett tilltalande alternativ till den nuvarande standardimplantationen av syntetiska material.

Introduction

Tänder har viktiga roller i matmasticering, tal och psykologiskt välbefinnande (självbild). Den mänskliga tanden består av mycket mineraliserade vävnader med varierande densitet och hårdhet1. Tandemaljen, huvudkomponenten i tandkronan, är den högsta mineraliserade vävnaden i människokroppen. Under emaljbildning (amelogenes), när tänderna utvecklas, differentieras tandepitelstamceller (DESC) till emaljbildande celler (ameloblaster). När den väl har bildats repareras eller förnyas emaljen sällan på grund av den apoptotiska förlusten av ameloblasterna vid början av tandutbrott1. Restaurering av skadad emaljvävnad, orsakad av trauma eller bakteriell sjukdom, utförs för närvarande med hjälp av syntetiska material; dessa är dock oroliga med viktiga brister som mikroleakage, sämre osseointegration och förankring, ändlig livslängd och brist på fullt fungerande reparation2. Därför skulle en robust och pålitlig odling av humana DESC med kapacitet att generera ameloblaster och potential att producera mineraliserad vävnad vara ett stort steg framåt inom det dentala regenerativa området.

Kunskap om human DESC fenotyp och biologisk funktion är knapp 3,4,5. Intressant nog har DESC av mänskliga tänder föreslagits att existera i Epitelcellsvila i Malassez (ERM), cellkluster som finns i tandfollikeln (DF), som omger oeruperade tänder och förblir närvarande i det parodontala ligamentet runt roten när tanden bryter ut1. ERM-celler samodlade med tandmassa har visat sig differentieras till ameloblastliknande celler och generera emaljliknande vävnad6. Djupgående studier av ERM-cellernas specifika roll i emaljgenerering (åter) har dock begränsats på grund av bristen på tillförlitliga studiemodeller7. Nuvarande ERM-in vitro-odlingssystem hämmas av begränsad livslängd och snabb förlust av fenotyp under de 2D-förhållanden som vanligtvis används 8,9,10,11,12. Därför behövs ett lätthanterligt in vitro-system för att troget expandera, studera och differentiera humana DESC.

Under det senaste decenniet har en kraftfull teknik för att odla epitelstamceller in vitro framgångsrikt tillämpats på flera typer av (mänskliga) epitelvävnader för att studera deras biologi såväl som sjukdom 13,14,15,16. Denna teknik gör det möjligt för vävnadsepitelstamcellerna att självutvecklas till 3D-cellkonstruktioner (dvs. organoider) när de sås in i en extracellulär matris (ECM) -härmande ställning (vanligtvis Matrigel) och odlas i ett definierat medium som replikerar vävnadens stamcellsnischsignalering och / eller embryogenes. Typiska tillväxtfaktorer som behövs för organoidutveckling inkluderar epidermal tillväxtfaktor (EGF) och mmtv-integrationsställen (WNT) av vinglös typ 14,15,16. De resulterande organoiderna kännetecknas av varaktig trohet när det gäller att efterlikna vävnadens ursprungliga epitelstamceller, liksom hög expanderbarhet samtidigt som de behåller sin fenotyp och funktionella egenskaper och därigenom övervinner den ofta begränsade primära mänskliga vävnadstillgängligheten som förvärvats från kliniken. För att etablera organoider krävs inte isolering av epitelstamcellerna från den heterogena vävnaden (dvs. innefattande andra celltyper såsom mesenkymala celler) före odling eftersom mesenkymala celler inte fäster vid eller trivs i ECM, vilket så småningom resulterar i rent epitelorganoider 13,16,17,18,19 . Denna lovande och mångsidiga teknik har lett till utvecklingen av mångfaldiga organoidmodeller från olika mänskliga epitelvävnader. Emellertid var mänskliga tand-härledda organoider, värdefulla för djup studie av tandutveckling, regenerering och sjukdom, inte etablerade ännu20,21. Vi lyckades nyligen utveckla en sådan ny organoidmodell med utgångspunkt från DF-vävnad från tredje molar (visdomständer) extraherade från ungdomar19.

Här beskriver vi protokollet för att utveckla epitelorganoidkulturer från den vuxna mänskliga tanden (dvs från DF för tredje molar) (Figur 1A). De resulterande organoiderna uttrycker ERM-associerade stamhetsmarkörer samtidigt som de är långsiktigt expanderbara. Intressant nog, i motsats till de flesta andra organoidmodeller, är den vanligtvis nödvändiga EGF överflödig för robust organoidutveckling och tillväxt. Intressant nog visar stamorganoiderna ameloblastdifferentieringsegenskaper och efterliknar därmed ERM / DESC-egenskaper och processer som förekommer in vivo. Den nya och unika organoidmodellen som beskrivs här gör det möjligt att utforska DESC-biologi, plasticitet och differentieringskapacitet och öppnar dörren för att ta de första stegen mot tandregenerativa tillvägagångssätt.

Protocol

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av etikkommittén Research UZ/KU Leuven (13/0104U). Extraherade tredje molarer (visdomständer) erhölls efter patienternas informerade samtycke. 1. Förberedelser Förvarma en odlingsplatta med 48 brunnar i 15-20 timmar i en 1,9%CO2-inkubator vid 37 °C. Kondensera en Matrigel alikvot (tillväxtfaktorreducerad; fenol rödfri; vidare kallad källarmembranmatris; BMM) på is (4 °C) i minst 2 timmar fö…

Representative Results

Tandorganoid utvecklingVi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för att etablera organoidkulturer från mänsklig DF-vävnad som förvärvats efter extraktion av visdomstand (figur 1A). Isolerad DF dissocieras enzymatiskt och mekaniskt. De erhållna cellerna odlas inom BMM i media som empiriskt definierades för optimal organoidutveckling och tillväxt (tandorganoidmedium; TOM)19. Organoiderna utvecklas vanligtvis …

Discussion

Detta protokoll beskriver den effektiva och reproducerbara genereringen av organoider med utgångspunkt från den mänskliga tanden. Såvitt vi vet är detta den första metoden för att etablera nuvarande koncept (epiteliala) organoider med utgångspunkt från mänsklig tandvävnad. Organoiderna är långsiktigt expanderbara och uppvisar en tandepitelstamhetsfenotyp, som duplicerar DESC som tidigare rapporterats i ERM-facket i DF7. Dessutom replikerar organoiderna funktionella DESC / ERM-egenskap…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi är tacksamma för alla anställda vid oral och maxillofacial kirurgi (MKA) av UZ Leuven, liksom patienterna, för deras ovärderliga hjälp med att samla in nyligen extraherade tredje molarer. Vi vill också tacka Dr. Reinhilde Jacobs och Dr. Elisabeth Tijskens för deras hjälp med provinsamlingen. Detta arbete stöddes av bidrag från KU Leuven (BOF) och FWO-Flandern (G061819N). L.H. är en FWO Ph.D. Fellow (1S84718N).

Materials

1.5 mL Microcentrifuge tube Eppendorf 30120.086
15 mL Centrifuge tube Corning 430052
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M-6250
48-well flat bottom plates Corning 3548
50 mL Centrifuge tube Corning 430290
A83-01 Sigma-Aldrich SML0788
Agarose Lonza 50004
Albumin Bovine (cell culture grade) Serva 47330.03
AMELX antibody Santa Cruz sc-365284
Amphotericin B Gibco 15200018
B27 (without vitamin A) Gibco 12587-010
Cassette VWR 7202191
Catalase from bovine liver Sigma-Aldrich C100
CD44 antibody Abcam ab34485
Cell strainer, 40 µm Falcon 352340
Cholera Toxin Sigma-Aldrich C8052
Citric acid Sigma-Aldrich C0759
CK14 antibody Thermo Fisher Scientific MA5-11599
Collagenase IV Gibco 17104-019
Cover glass VWR 6310146
Cryobox Thermo Scientific 5100-0001
Cryovial Thermo Fisher Scientific 375353
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Dispase II Sigma-Aldrich D4693
DMEM 1:1 F12 without Fe Invitrogen 074-90715A
DMEM powder high glucose Gibco 52100039
Dnase Sigma-Aldrich D5025-15KU
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663 – 10ML
Embedding workstation, 220 to 240 Vac Thermo Fisher Scientific 12587976
Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH) Fisher Chemical E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
FGF10 Peprotech 100-26
FGF2 (= basic FGF) R&D Systems 234-FSE-025
FGF8 Peprotech AF-100-25
GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit Sigma-Aldrich RTN350-1KT Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer
Glass Pasteur pipette Niko Mechanisms 170-40050
Glycine VWR 101194M
HEPES Sigma-Aldrich H4034
IGF-1 PeproTech 100-11
InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI) Sigma-Aldrich 688001
Insulin from bovine pancreas Sigma-Aldrich I6634
ITGA6 antibody Sigma-Aldrich HPA012696
L-Glutamine Gibco 25030024
Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free) Corning 15505739
Microscope slide Thermo Fisher Scientific J1800AMNZ
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm Millipore SLGV033R
Minimum essential medium eagle (αMEM) Sigma-Aldrich M4526
mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-31570
N2 Gibco 17502-048
N-acetyl L-cysteine Sigma-Aldrich A7250
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
Noggin PeproTech 120-10C
P63 antibody Abcam ab124762
Pap Pen Sigma-Aldrich Z377821-1EA Marking pen
Paraformaldehyde (PFA), 16% Merck 8.18715
Penicillin G sodium salt Sigma-Aldrich P3032
Penicillin-streptomycin (Pen/Strep) Gibco 15140-122
Petri dish Corning 353002
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010-015
Pipette (P20, P200, P1000) Eppendorf or others 2231300006
Plastic transfer pipette (3.5 mL) Sarstedt 86.1171.001
Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody Thermo Fisher Scientific A21206
RSPO1 PeproTech 120-38
SB202190 (p38i) Biotechne (Tocris) 1264
Scalpel (surgical blade) Swann-Morton 207
SHH R&D Systems 464-SH-200
Silicone molds (Heating block) VWR 720-1918
Sodium Chloride (NaCl) BDH 102415K
Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) Merck 106329
Sodium-pyruvate (C3H3NaO3) Sigma-Aldrich P-5280
SOX2 antibody Abcam ab92494
StepOnePlus Thermo Fisher Scientific Real-Time PCR System
Stericup-GP, 0.22 µm Millipore SCGPU02RE
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm Millipore SCGP00525
Sterile 1000 μL pipette tips with filter Greiner 740288
Sterile 20 μL pipette tips with filter Greiner 774288
Sterile 200 μL pipette tips with and without filter Greiner 739288
Sterile H2O Fresenius B230531
Streptomycin sulfate salt Sigma-Aldrich S6501
Superscript III first-strand synthesis supermix Invitrogen 11752-050 Reverse transcription kit
Tissue processor Thermo Scientific 12505356
Transferrin Serva 36760.01
Triton X-100 Sigma T8787-50ML
TrypLE express Gibco 12605-010
Vectashield mounting medium+DAPI Labconsult NV H-1200 Antifade mounting medium with DAPI
WNT3a Biotechne (Tocris) 5036-WN-500
Xylenes, 99%, for biochemistry and histology VWR 2,89,75,325

References

  1. Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
  2. Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health-related quality of life: a cohort study. Australian Dental Journal. 62 (2), 165-172 (2017).
  3. Mitsiadis, T. A., Orsini, G., Jimenez-Rojo, L., Zavan, B., Bressan, E. Dental Stem Cells for Tooth Regeneration. Dental Stem Cells: Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. , (2016).
  4. Mitsiadis, T. A., Orsini, G. Editorial: a new era in dentistry: stem cell-based approaches for tooth and periodontal tissue regeneration. Frontiers in Physiology. 7, 357 (2016).
  5. Miran, S., Mitsiadis, T. A., Pagella, P. Innovative dental stem cell-based research approaches: the future of dentistry. Stem Cells International. 2016, 7231038 (2016).
  6. Shinmura, Y., Tsuchiya, S., Hata, K. I., Honda, M. J. Quiescent epithelial cell rests of malassez can differentiate into ameloblast-like cells. Journal of Cellular Physiology. 217 (3), 728-738 (2008).
  7. Davis, E. M. A review of the epithelial cell rests of Malassez on the bicentennial of their description. Journal of Veterinary Dentistry. 35 (4), 290-298 (2018).
  8. Athanassiou-Papaefthymiou, M., Papagerakis, P., Papagerakis, S. Isolation and characterization of human adult epithelial stem cells from the periodontal ligament. Journal of Dental Research. 94 (11), 1591-1600 (2015).
  9. Kim, G. -. H., et al. Differentiation and establishment of dental epithelial-like stem cells derived from human ESCs and iPSCs. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-16 (2020).
  10. Nam, H., et al. Establishment of Hertwig’s epithelial root sheath/ epithelial rests of malassez cell line from human periodontium. Molecules and Cells. 37 (7), 562-567 (2014).
  11. Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human hertwig’s epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecules and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
  12. Tsunematsu, T., et al. Human odontogenic epithelial cells derived from epithelial rests of Malassez possess stem cell properties. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1063-1075 (2016).
  13. Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).
  14. Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
  15. Cox, B., et al. Organoids from pituitary as a novel research model toward pituitary stem cell exploration. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
  16. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  17. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development (Cambridge). 144 (10), 1775-1786 (2017).
  18. Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: tools for understanding biology and treating diseases). Annual Review of Pathology. 15, 211-234 (2020).
  19. Hemeryck, L., et al. Organoids from human tooth showing epithelial stemness phenotype and differentiation potential. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (3), 153 (2022).
  20. Gao, X., Wu, Y., Liao, L., Tian, W. Oral organoids: progress and challenges. Journal of Dental Research. 100 (5), 454-463 (2021).
  21. Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Scientific Reports. 10 (1), 4963 (2020).
  22. Xiong, J., Mrozik, K., Gronthos, S., Bartold, P. M. Epithelial cell rests of malassez contain unique stem cell populations capable of undergoing epithelial-mesenchymal transition. Stem Cells and Development. 21 (11), 2012-2025 (2012).
  23. Luan, X., Ito, Y., Diekwisch, T. G. H. Evolution and development of Hertwig’s epithelial root sheath. Developmental Dynamics. 235 (5), 1167-1180 (2006).
  24. Fukumoto, S., et al. New insights into the functions of enamel matrices in calcified tissues. Japanese Dental Science Review. 50 (2), 47-54 (2014).
  25. Consolaro, A., Consolaro, M. F. M. O. ERM functions, EGF and orthodontic movement or Why doesn’t orthodontic movement cause alveolodental ankylosis. Dental Press Journal of Orthodontics. 15 (2), 24-32 (2010).
  26. Guajardo, G., et al. Immunohistochemical localization of epidermal growth factor in cat paradental tissues during tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 118 (2), 210-219 (2000).
  27. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  28. Gonçalves, J., Sasso-Cerri, E., Cerri, P. Cell death and quantitative reduction of rests of Malassez according to age. Journal of Periodontal Research. 43 (4), 478-481 (2008).
  29. Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
  30. Razmi, M. T., Narang, T., Handa, S. ADULT (acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth) syndrome: a case report from India. Indian Dermatology Online Journal. 9 (3), 194 (2018).
  31. . Future Health Biobank Available from: https://futurehealthbiobank.com/ch-en/ (2022)
  32. Schreurs, R. R. C. E., Baumdick, M. E., Drewniak, A., Bunders, M. J. In vitro co-culture of human intestinal organoids and lamina propria-derived CD4+ T cells. STAR Protocols. 2 (2), 100519 (2021).
  33. Fiorini, E., Veghini, L., Corbo, V. Modeling cell communication in cancer with organoids: Making the complex simple. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 166 (2020).
  34. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  35. Zhang, Y., et al. Polyisocyanide hydrogels as a tunable platform for mammary gland organoid formation. Advanced Science. 7 (18), 2001797 (2020).
  36. Mollaki, V. Ethical challenges in organoid use. BioTech. 10 (3), 12 (2021).

Play Video

Cite This Article
Hemeryck, L., Lambrichts, I., Bronckaers, A., Vankelecom, H. Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy. J. Vis. Exp. (182), e63671, doi:10.3791/63671 (2022).

View Video