시험관 내에서 액토미오신 다발의 형성 및 광학 핀셋을 사용한 미오신 앙상블 힘 생성 측정이 제시되고 논의됩니다.
미오신은 ATP를 가수분해하여 액틴 필라멘트(AF) 트랙을 따라 이동하는 운동 단백질이며 운동성 및 근육 수축과 같은 세포 과정에 필수적입니다. 힘 생성 메커니즘을 이해하기 위해 미오신 II는 단일 분자 (SM) 수준과 광학 트래핑과 같은 생물 물리학 적 방법을 사용하는 시험관 내 모터 팀으로 조사되었습니다.
이 연구는 미오신 힘 생성 거동이 3 비드 배열의 단일 분자 수준에서 글라이딩 배열의 단단한 비드 또는 커버 슬립 표면에서 함께 작동하는 모터 그룹으로 이동할 때 크게 다를 수 있음을 보여주었습니다. 그러나 이러한 분석 구조는 세포 내에서와 같이 점탄성 구조 계층 내에서 미오신의 그룹 역학을 평가하는 것을 허용하지 않습니다. 우리는 여러 액틴 필라멘트와 상호 작용하는 미오신 앙상블에 의한 힘 생성 메커니즘을 조사하기 위해 광학 핀셋을 사용하는 방법을 개발했습니다.
이러한 액토미오신 번들은 모터 통신 및 앙상블 힘 출력을 캡처하는 계층적이고 규정을 준수하는 환경에서 조사를 용이하게 합니다. 분석의 사용자 정의 가능한 특성을 통해 실험 조건을 변경하여 미오신 앙상블, 액틴 필라멘트 번들 또는 주변 환경에 대한 수정이 어떻게 다른 힘 출력을 초래하는지 이해할 수 있습니다.
운동 단백질은 생명에 필수적이며 화학 에너지를 기계적 작업으로 변환합니다 1,2,3. 미오신 모터는 트랙과 유사한 필라멘트를 따라 단계를 밟아 액틴 필라멘트와 상호 작용하며, 액틴-미오신 네트워크의 역학은 근육 수축, 세포 운동성, 세포질 분열 중 수축 고리 및 세포 내부의화물 이동을 수행합니다. 3,4,5,6,7,8 . 미오신은 많은 필수 역할을 하기 때문에 미오신 액틴 네트워크의 기능 장애는 비대성 심근병증(HCM)에서 심장 과수축을 유발하는 미오신 중쇄의 돌연변이와 같은 질병 발병으로 이어질 수 있습니다.9,10,11,12,13,14 . 근육 수축에서 개별 미오신 모터는 AF 4,15,16,17,18의 상대 슬라이딩을 수행하는 데 필요한 기계적 에너지를 제공하기 위해 앙상블로 작동하여 서로 협력합니다. 미오신 모터는 AF 사이에 교차 다리를 형성하고 기계 화학적 주기로 인한 구조적 변화를 사용하여 정렬된 필라멘트17,18,19,20,21의 가시 끝을 향해 집합적으로 이동합니다.
광학 트래핑과 같은 기술을 사용하여 SM 수준에서 정량적 체외 운동성 분석을 개발함으로써 SM 힘 생성 및 스텝 크기 측정을 포함하여 개별 미오신 모터가 어떻게 작동하는지에 대한 전례 없는 세부 정보를 쉽게 수집할 수 있었습니다. 22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Finer et al.은 단일 미오신 II 모터23,31의 힘 발생 역학을 조사하기 위해 “3-비드” 또는 “덤벨” 광학 트래핑 분석을 개발했습니다. 근육 미오신 II는 AF를 수축시키기 위해 팀으로 작동하지만 SM 수준에서는 비과정적이기 때문에 광학 트래핑 분석 방향은 고전적인 모터 결합 비드 접근법(32)으로부터 재배열되어야 했습니다. 덤벨 분석을 형성하기 위해, 커버슬립-부착된 비드에 결합된 미오신 모터 위에 AF를 유지하기 위해 2개의 광학 트랩을 사용하였고, 단일 모터에 의해 출력된 힘은 트랩(23) 내의 AF의 이동을 통해 측정되었다.
그러나 SM 힘과 단일 모터 / 단일 필라멘트 분석 방향을 사용하면 myosin II를 포함한 많은 모터 단백질이 단독으로 작동하지 않고 종종 부분의 합으로 기능하지 않기 때문에 시스템 수준 힘 생성에 대한 전체 이미지를 제공하지 않습니다 15,16,17,32,33,34,35,36 . 하나 이상의 필라멘트와 상호 작용하는 하나 이상의 모터를 포함하는 더 복잡한 구조는 미오신 및 액틴 필라멘트의 네트워크(15,32)의 시너지 효과를 더 잘 이해하는 데 필요합니다. 덤벨 분석 방향은 비드에 여러 개의 미오신을 부착하거나 표면에 부착된 미오신 두꺼운 필라멘트를 사용하여 모터가 매달린 AF 4,23,34,37,38,39,40과 상호 작용할 수 있도록 함으로써 작은 앙상블 힘 생성을 조사하는 데 활용되었습니다.
다른 작은 앙상블 분석에는 미오신 모터가 커버슬립 표면에 코팅되고 AF에 결합된 비드가 모터 4,35,36,38,39,40,41,42,43 팀에 의해 생성된 힘을 프로브하는 시험관 내 필라멘트 글라이딩 분석이 포함됩니다. . 이 두 경우 모두 미오신은 단단한 표면(비드 또는 커버슬립)에 결합되어 하나의 AF를 사용합니다. 이러한 경우들에서, 모터들은 자유롭게 움직일 수 없거나 서로 통신할 수 없으며, 근육신이 단단히 결합된 것은 모터들이 sarcomere32에서 함께 동작할 수 있는 순응적이고 계층적인 환경을 반영하지 않는다. 이전 연구에서는 미오신 II가 환경을 감지하고 힘 생성 및 듀티 비율41,44,45와 같은 특성을 변경하여 변화하는 점탄성 또는 모터 집중 조건에 따라 적응할 수 있다고 제안했습니다. 따라서 미오신 II 앙상블 힘 생성의 기계론적 토대에 대한 보다 현실적인 그림을 그리기 위해 모터 통신 및 시스템 준수를 촉진하고 캡처하는 광학 트래핑 분석을 개발할 필요가 있습니다.
여기에서는 두 액틴 필라멘트 사이에 상호 작용하는 여러 개의 미오신 모터로 구성된 액토미오신 다발 또는 샌드위치를 형성하여 시험관 내 계층 구조와 광학 트래핑을 결합하는 방법을 개발했습니다. 이 모듈식 분석 기하학은 분자 및 환경 요인이 앙상블 미오신 힘 생성에 어떻게 영향을 미치는지 직접 조사할 수 있습니다. 또한 이러한 액틴-미오신 앙상블을 통한 힘 생성 메커니즘을 조사하면 근육 수축과 같은 대규모 세포 작업이 분자 수준 9,10,13에서 어떻게 전파되는지 모델링하고 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
액틴 필라멘트와 상호 작용하는 미오신 앙상블의 역학을 조사하기 위해 형광 이미징과 결합된 광학 핀셋을 사용한 시험관 내 연구가 수행되었습니다. 악틴-미오신 – 액틴 다발은 근육 미오신 II, 번들의 하단 및 커버 슬립 표면의 로다민 액틴, 번들 상단의 488 표지 된 비오틴 액틴 필라멘트를 사용하여 조립되었습니다. 토끼 근육으로부터의 액틴 단백질은 일반 액틴 완충액 (GAB) 및 액틴 중합…
The authors have nothing to disclose.
이 작업은 미시시피 대학교 대학원 학생위원회 연구 펠로우십 (OA), 미시시피 대학교 샐리 맥도넬-바크스데일 아너스 칼리지 (JCW, JER), 보조금 번호 NNX15AH78H (JCW, DNR)의 미시시피 우주 보조금 컨소시엄 및 보조금 번호 848586 (DNR)의 미국 심장 협회.
Actin protein (biotin): skeletal muscle | Cytoskeleton | AB07-A | Biotinylated actin protein |
Actin protein, rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99-A | Actin protein |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | Actin stabilizer and Alexa Fluor 488 stain |
ATP | Fisher scientific | BP413-25 | Required for actin assembly and myosin motility |
Beta-D-glucose | Fisher scientific | MP218069110 | Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging |
Blotting Grade Blocker (casein) | Biorad | 1706404 | Used to block surface from non-specific binding |
CaCl2 | Fisher scientific | C79500 | Calcium chloride, provides the necessary control over the dynamics of actin myosin network |
Catalase | Fisher scientific | ICN10040280 | Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging |
Coverslips | Fisher scientific | 12544C | Used to make flow cells |
DTT | Fisher scientific | AC327190010 | Used for buffer preparation |
Ethanol | Fisher scientific | A4094 | Regent used for cleaning coverslips |
Glucose oxidase | Fisher scientific | 34-538-610KU | Part of oxygen scavenging system used to reduce photobleaching during fluorescence imaging |
KCl | Fisher scientific | P217-500 | Used for buffer preparation |
KOH | Fisher scientific | P250-1 | Used to etch coverslips and adjust buffer pH |
MgCl2 | Fisher scientific | M33-500 | Used for buffer preparation |
Microscope slides | Fisher scientific | 12-544-2 | Used to make flow cells |
Myosin II protein: rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | MY02 | Full length myosin motor protein isolated from rabbit skeletal muscle |
Nanotracker2 | Bruker/JPK | NT2 | Optical trapping instrument |
Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Facilities adhesion of actin filaments onto glass surface of the coverslip |
Rhodamine Phalloidin | Cytoskeleton | PHDR1 | Actin stabilizer and rhodamine fluorescent stain |
Streptavidin beads, 1 μm | Spherotech | SVP-10-5 | Optical trapping handle |
Tris-HCl | Fisher scientific | PR H5121 | Used for buffer preparation |