Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

מודל לאפילפסיה של אטיולוגיה זיהומית באמצעות וירוס Murine Encephalomyelitis של Theiler

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/63673
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1,2, 3
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Utah, 2Interdepartmental Program in Neuroscience, University of Utah, 3Faculty of Veterinary Medicine, Institute of Pharmacology and Toxicology, Freie Universität Berlin

Summary

זיהום תוך-מוחי בנגיף האנצפלומיאליטיס מורין (TMEV) בעכברי C57BL/6 משכפל רבים מהתסמינים הקליניים המוקדמים והכרוניים של דלקת המוח הנגיפית ואפילפסיה שלאחר מכן בחולים אנושיים. מאמר זה מתאר את זיהום הנגיף, הסימפטומים וההיסטופתולוגיה של מודל TMEV.

Abstract

אחד הגורמים העיקריים לאפילפסיה הוא זיהום של מערכת העצבים המרכזית (CNS); כ-8% מהחולים ששורדים זיהום כזה מפתחים אפילפסיה כתוצאה מכך, כאשר השיעורים גבוהים משמעותית במדינות פחות מפותחות כלכלית. עבודה זו מספקת סקירה כללית של מידול אפילפסיה של אטיולוגיה זיהומית ושימוש בה כפלטפורמה לבדיקות מורכבות אנטי-פרכוסיות חדשניות. מוצג פרוטוקול של השראת אפילפסיה על ידי הזרקה תוך-מוחית לא סטריאוטקטית של וירוס האנצפלומיאליטיס מורין (TMEV) של טיילר בעכברי C57BL/6, אשר משכפל רבים מהתסמינים הקליניים המוקדמים והכרוניים של דלקת המוח הנגיפית ואפילפסיה עוקבת בחולים אנושיים. מתוארת הערכה קלינית של עכברים במהלך דלקת המוח כדי לעקוב אחר פעילות ההתקפים ולזהות את ההשפעות האנטי-פרכוסיות האפשריות של תרכובות חדשות. יתר על כן, מוצגות השלכות היסטופתולוגיות של דלקת מוח נגיפית ופרכוסים כגון נזק להיפוקמפוס ודלקת עצבית, כמו גם השלכות ארוכות טווח כגון התקפים אפילפטיים ספונטניים. מודל TMEV הוא אחת הפלטפורמות הניסיוניות הראשונות המאפשרות לחקור את מנגנוני התפתחות האפילפסיה כתוצאה מזיהום במערכת העצבים המרכזית. לפיכך, הוא משמש גם לזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות ותרכובות עבור חולים בסיכון לפתח אפילפסיה בעקבות זיהום CNS.

Introduction

אחת התוצאות השכיחות של דלקת המוח הנגיפית היא התקפים אפילפטיים. זיהומים ויראליים רבים מעוררים התקפים סימפטומטיים במהלך השלב החריף של הזיהום; הסיכון להתקפים כאלה גדל ביותר מ-20% בקרב הציבור הרחב 1,2,3. חולים ששורדים את הזיהום נמצאים גם בסיכון מוגבר של 4%-20% לפתח אפילפסיה כרונית בחודשים עד שנים לאחר ההדבקה 1,4. נגיף האנצפלומיאליטיס מורין (TMEV) זוהה כנגיף מתאים לחקר התקפים חריפים וכרוניים במודל עכברי של דלקת מוח ויראלית 5,6,7. TMEV הוא נגיף RNA חד-גדילי לא עטוף, בעל חוש חיובי וחד-גדילי ממשפחת Picornaviridae, ובאופן מסורתי שימש לחקר דה-מיאלינציה בחוט השדרה של עכברי SJL, שעכברי C57BL/6 (B6) מוגנים מפניו מכיוון שיש להם את היכולת לנקות את הנגיף במהירות לאחר ההדבקה. עם זאת, TMEV גורם להתקפים חריפים אצל 50%-75% מעכברי B6 זכרים ונקבות בשבוע הראשון לאחר ההדבקה (pi), בעוד שכ -25%-40% מפתחים אפילפסיה כרונית שבועות עד חודשים pi 2,5,6,8,9. מלבד התקפים, העכברים מציגים גם את ההיסטופתולוגיה הנפוצה של היפוקמפוס אפילפטי עם ניוון עצבי וגליוזיס 5,6,8,10,11,12. יתר על כן, עכברי B6 נגועים ב- TMEV מתפקדים גרוע משמעותית במבחנים התנהגותיים ללמידה וזיכרון ויש להם תחלואה נלווית קוגניטיבית, אשר נראית גם בחולים קליניים עם אפילפסיה13,14,15.

באופן מסורתי, מודלים של אפילפסיה והתקפים משתמשים ביישום של חומרים כימו-פרכוסיים או בגירוי חשמלי כדי לגרום להתקפים; עם זאת, מודלים אלה חסרים תוקף מבני ולעתים קרובות מציגים התקפים חמורים יותר ונזק מוחי מאשר נראים בחולים קליניים16. אין מודל שמתאים לכל שאלת מחקר17. השימוש במודל TMEV מעניין במיוחד אם הגורמים המקדימים להתפתחות התקפים לאחר זיהום במערכת העצבים המרכזית נחקרים או אם תרכובות נבדקות ליעילותן נגד פרכוסים.

מאז שמודל TMEV הוקם ונעשה בו שימוש במספר מעבדות שונות ברחבי העולם, המחברים זיהו פרטים רבים המאפשרים יישום מוצלח של המודל, למשל, הספציפיות של זני וירוסים ועכברים שונים. השראת ההתקפים האמינה ביותר נוצרה עם זן דניאל של עכברי TMEV ו-B6J 2,5,6,8,9. המודל משמש כיום את המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי (NINDS) כפלטפורמה לזיהוי תרופות חדשות נגד אפילפסיה והתקפים18,19. מאמר זה כולל את הפרוטוקול המפורט של השראת וירוסים וניטור קליני כדי לאפשר לחוקרים אחרים להשתמש במודל זה של דלקת המוח הנגיפית כדי לקדם את ההבנה של מנגנוני המחלה, כמו גם לבדיקות סמים.

הפרוטוקול הבא משקף מחקר המיועד לבדיקות מורכבות במודל זה, אם כי ניתן לבצע סוגים רבים אחרים של מחקרים. עכברים מורדמים זמן קצר לפני הזרקה עם זן דניאל של TMEV באזור הרקתי של ההמיספרה הימנית (אחורית ומדיאלית לעין ימין). בהתאם לשאלת המחקר, אם יש צורך בחיות ביקורת שאינן נגועות, עכברים מקבלים מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS, pH 7.4, כולל KH 2 PO 4 [1.06 mM], NaCl [155.17 mM] ו-Na 2 HPO4·7H 2 O [2.97mM]) במקום TMEV. ניסיון קודם בעכברים נגועים ב-TMEV הצביע על כך שהתקפים הנגרמים על ידי טיפול מתרחשים בין היום השלישי ליום השביעי לאחר ההדבקה. תדירות ההזרקה, המסלול וזמן הבדיקה של תרכובות הניסוי משתנים בהתאם לתכונותיהן. מומלץ לבצע את החיסון נגד הנגיף ביום שישי, המאפשר מעקב אחר התקפים ביום 3-7 בשבוע שלאחר מכן, בימים שני עד שישי. במהלך שבוע ניטור ההתקפים, ניתן לתת תרכובות ניסיוניות (כלומר) פעמיים ביום (בהפרש של לפחות 4 שעות), אלא אם כן הוצע אחרת על ידי הקינטיקה או מנגנון הפעולה של התרכובת. ניטור התקפים במהלך הטיפול יכול להתבצע בנקודת זמן שנקבעה מראש. זמני ההזרקה וההסתכלות משתנים בהתאם לתרכובות הבודדות. לבעלי חיים מוזרקים תרכובת הבדיקה או רכב במקום תרכובת הסמים. ניתן לטפל בשתי קבוצות אלה ולצפות בהן באופן מקביל לקבוצת הניסוי. במהלך הניסוי, האדם היחיד המטפל בעכברים ומבקיע את ההתקפים צריך להיות עיוור לטיפול.

Protocol

כל הנהלים המתוארים אושרו על ידי הרשויות המתאימות. בעלי חיים מוחזקים בהתאם להמלצות ב"מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה" (המועצה הלאומית למחקר) ובהתאם למדיניות שירות בריאות הציבור והוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת יוטה, פרוטוקול בעלי חיים (מספר: 21-11009, המחלקה לפרמקולוגיה וטוקסיקולוגיה) ובאוניברסיטה החופשית בברלין (פרוטוקול: G0015/21, LAGeSo ברלין, המכון לפרמקולוגיה וטוקסיקולוגיה), בהתאמה. התוצאות המוצגות באיור 3 ובאיור 5 אושרו בתאריכים 33.9-42502-04-11/0516 ו-33.9-42502-04-15/1892 (LAVES Oldenburg, המחלקה לפרמקולוגיה, טוקסיקולוגיה ורוקחות, האוניברסיטה לרפואה וטרינרית הנובר).

1. שיקולים והכנות לעיצוב המחקר

  1. נגיף
    1. זן דניאל של TMEV סופק באדיבות על ידי רוברט פוג'ינאמי מאוניברסיטת יוטה. במקור, הוא בודד מעכבר במושבה הרווארד20. חפש את הסיווג והתקנות הספציפיים עבור חומרים ביולוגיים במדינות המתאימות לפני הטיפול ב- TMEV, ודון עם אנשי הבטיחות הביולוגית המוסדיים כדי להבטיח עמידה בתקנות. בדרך כלל, TMEV מסווג כ- BSL 2, בהתאם לזן ולשינויים גנטיים. המינון הסטנדרטי הדרוש כדי לגרום להתקפים ברוב בעלי החיים הוא 3 x 105 יחידות יוצרות פלאק (PFU).
      הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את המינון, לדוגמה, אם משתמשים בעכברים טרנסגניים. בסך הכל, טיטרים בין 2 x 104 PFU ו 2.44 x 107 PFU שימשו כדי לגרום בהצלחה להתקפים. חיות ביקורת מקבלות PBS סטרילי ואינן חוות התקפים. הנגיף אינו מדביק בני אדם; עם זאת, יש ללבוש ציוד הגנה אישי (מעיל מעבדה, כפפות, משקפי בטיחות) על ידי נסיינים בכל עת, ופגרי עכברים ומצעים צריכים להיות אוטומטיים לפני השלכה.
  2. חיות
    1. לגרימת התקפים וחקירתם, השתמשו בעכברי B6J, שכן זני עכברים אחרים אינם בהכרח מציגים התקפים, למשל, SJL/J, FVB/N או עכברי Balb/C5. אין הבדל בין עכברים נקבות לזכרים בתדירות התקפים חריפים5. בצע את הניסויים על עכברים מתבגרים עד בוגרים (החל מגיל 5-6 שבועות).
  3. דיאטה
    1. התזונה נקבעה כמקור אחד לשונות בין מעבדה למעבדה בחומרת המחלה; לפיכך, שקול את הדיאטה כגורם פוטנציאלי עבור וריאציה22.
  4. גודל קבוצה
    1. מאחר שלא כל בעלי החיים מפתחים התקפים חריפים או כרוניים במודל זה, השתמשו בכ-20 עכברים/קבוצה לניסויים מורכבים.
  5. רווחת בעלי חיים
    1. אם עכבר כלשהו מדגים תופעות לוואי משמעותיות מהזיהום או ממתן התרכובת המחקרית (למשל, עייפות, טיפוח לקוי, אדמומיות מוגזמת והפרשות מוגלתיות מהפצע) לאחר זמן תצפית שנקבע על ידי הנחיות IACUC המקומיות (למשל, 48 שעות), יש להרדים את העכבר באופן הומני.
    2. יש להרדים כל עכבר המדגים ירידה קיצונית במשקל הגוף (>20%) במהלך תקופת ההדבקה באופן הומני.
    3. אם בעלי חיים אינם אוכלים כראוי, תנו להם גישה לכדוריות משלימות הלחות בתמיסת אלקטרוליטים לילדים או דומה.

2. חיסון נגד וירוסים

  1. עיקור מזרק ההזרקה
    1. הסר את המכסה של מזרק האינסולין. הוסף צינורות פוליאתילן כקולר סביב המחט כדי להבטיח עומק הזרקה נאות של 2.5 מ"מ. טובלים את המזרק באתנול למשך 30 דקות. מניחים את המזרק תחת אור UV למשך 30 דקות.
    2. החזירו את הפקק למחט. עוטפים את המזרק בשקיק חיטוי וסוגרים אותו. תווית עם תאריך ההכנה.
  2. הזרקת וירוסים
    1. קבלו אליציטוטים של זן TMEV של דניאל מהמקפיא בטמפרטורה של 80°C-. הפשירו את הנגיף ושמרו אותו על קרח. הימנעו מהפשרה והקפאה מחדש של הנגיף. טען את המזרק עם השעיית וירוס (3 x 105 PFU מדולל ב 20 μL של PBS או DMEM תרבית בינוני).
      זהירות: הנגיף מדבק בעכברים אך לא בבני אדם.
    2. נקו את הספסל בחומר חיטוי ועבדו תחת סופג אדים. החיסון נגד הנגיף אינו סטרילי אלא נקי ככל האפשר.
    3. העבירו את העכבר לתא השראת ההרדמה, והשתמשו באיזופלורן 2% בחמצן כדי לגרום להרדמה. הגעה לסבילות כירורגית אורכת מספר דקות; התאימו את הריכוז בהתאם לנשימה ולעומק ההרדמה של החיה.
    4. העבירו את העכבר המרדים מקופסת ההרדמה שמתחת למכסה המנוע. בדוק סובלנות כירורגית, למשל, על ידי צביטת בוהן. ההליך כולו מבוצע בפחות מ -30 שניות, כך שהחיה אינה צריכה לשאוף איזופלורן במהלך ההזרקה. יש להוסיף משחת עיניים למניעת התייבשות הקרנית.
    5. נקו את ראש החיה עם כרית אלכוהול. הטה את ראש העכבר מעט שמאלה כך שאזור ההזרקה יצביע כלפי מעלה.
    6. משוך את העור מעט לאחור, הכנס את המחט לראש, והזריק 20 μL תוך קורטית לעומק של 2.5 מ"מ באזור הטמפורלי של ההמיספרה הימנית (אחורית ומדיאלית לעין ימין).
    7. בצע את הזריקה באופן חד צדדי באותה חצי כדור בכל בעלי החיים. השתמשו בעין ובאוזן כציוני דרך למיקום קליפת המוח הקודקודית. המיקום אומת בעבר מבחינה היסטולוגית; ראו איור 1. קואורדינטות ההזרקה על פי הזרקה סטריאוטקסית ביחס לברגמה הן -2.0 (AP); +3.0 (מ"ל); −1.5 (DV).
    8. השאירו את המזרק במקומו למשך 5-15 שניות. רשמו אם יש דליפה מההזרקה או אם רואים בועות אוויר - במקרה כזה, הכינו מזרק חדש. כאשר בזהירות מושך את המזרק החוצה, לסובב אותו מעט. יש למרוח משחת עיניים למניעת יובש בזמן הרדמה.
    9. אופציונלי: קודד את בעל החיים על הזנב או האוזן בהתאם לנהלים המקומיים (אופציונלי אך קל מכיוון שהחיה מחוסרת הכרה).
    10. העבירו את בעל החיים לכלוב חדש, אשר מונח חצי על / חצי כרית חימום (35-40 מעלות צלזיוס) במהלך ההתאוששות מההרדמה. אל תשאירו את בעלי החיים ללא השגחה עד שהם חזרו להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה.
      הערה: ניתן לשכן שוב את בעלי החיים בקבוצה לאחר ההחלמה (בעלי חיים נגועים אינם מעורבבים עם חיות נגועות בדמה). עכברים נגועים לא צריכים להיות מאוחסנים באותו חדר כמו עכברים שאינם נגועים.
    11. עקוב אחר משקל העכברים במשך 7 הימים הראשונים מכיוון שהם יורדים במשקל לאחר ההדבקה ועשויים לדרוש הזנה נוספת.

Figure 1
איור 1: סכמטי של הליך הזרקת TMEV. משמאל לימין: בהזרקת קליפת המוח הקודקודית הימנית, המחט מוזרקת מעט לרוחב של קו דמיוני בין העין לאוזן הנגדית. הצווארון לבקרת עומק מסומן בצהוב. ניתן לראות את דרכי ההזרקה באזור המוח העטרתי, המסומן בחץ. אתר ההזרקה מתאים לקואורדינטות שניתנו מעל החץ. התמונה הימנית מראה את התפלגות נגיף הטיילר (סגול) בתוך CA1 של היווצרות ההיפוקמפוס. הדמות הוכנה באמצעות biorender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. בדיקות מורכבות

  1. הכנת המתחם
    1. עיין בהוראות הניסוח. הכינו את פתרון הרכב בהתאם להמלצות או להוראות שסופקו. כדוגמה, ההליך עבור התרופה האנטיאפילפטית levetiracetam (LEV) מוצג. LEV מפחית את נטל ההתקפים ל-30%-40% מרמות הרכב במינון של 350 מ"ג/ק"ג. הרכב המשמש במחקר זה הוא 0.5% מתילצלולוז.
    2. חישוב מינונים בהתאם למתחם. לשקול את התרופה על פי החישוב. לטיפול 1 ק"ג של עכברים, לשקול 350 מ"ג של LEV.
    3. הכינו תמיסת מלאי עם נפח הרכב המתאים, בהתאם להוראות הניסוח (למשל, סוניקציה, חומרי עזר לרכב וכו'). בהתחשב בנפח הזרקה של 0.01 מ"ל / גרם עכבר, נפח ההזרקה עבור 1 ק"ג יהיה 10 מ"ל עם 350 מ"ג LEV, וכתוצאה מכך תמיסה של 35 מ"ג / מ"ל19. דווח על החישוב והמינון במ"ג/ק"ג ועל הנפח במ"ל.
      הערה: פרוטוקול מופתי ניתן למצוא בעמוד 2 של חומר משלים 1.
  2. ניהול המתחם
    1. חילקו כלובים באופן אקראי לרכב או לקבוצת המתחם. השתמשו בעכברים נגועים בדמה למחקרים על מנגנוני התפתחות אפילפסיה או למטרות תיקוף, אך לא לבדיקות סקר שגרתיות של תרופות.
    2. דווח על תנאי סביבה כגון טמפרטורה, לחות, שעה ביום וכו '.
    3. מערבלים את הפתרון עם התרכובת כמו גם את פתרון הרכב. שאפו את הרכב או התרכובת במזרק וצבעו את המזרקים כדי למנוע ערבוב.
    4. לשקול את החיות. ודא כי עכברי B6J הם >18 גרם ביום 3 pi (לא מעוגל). דווח על המשקל.
    5. מתן התרכובת (למשל, על ידי הזרקה תוך צפקית או מסלולים מתאימים אחרים). כתוב את הזמן ואת המסלול של הממשל.
    6. עקוב אחר בעלי החיים עבור כל שינוי התנהגותי לאחר מתן מורכב, במיוחד לאחר הזריקות הראשונות. אם מתרחשים התקפים, דווח על עוצמת ההתקפים לפי סולם ראסין23; ראה שלב 3.2.
      הערה: פרוטוקול מופתי למתן תרכובת ניתן למצוא בחומר משלים 1, עמוד 3, ואילו התקפים שנצפו במהלך מתן יתועדו בחומר משלים 1, עמודים 4-5.
  3. ניטור התקפים של התקפים הנגרמים על ידי טיפול
    1. בצע הליך זה על ידי נסיין עיוור לטיפול. הביאו את כל הכלובים לספסל. צפו בבעלי החיים להתקפים פעמיים ביום במהלך שלב האור.
    2. ציון פעילות ההתקפים על ידי סולם ראסין שונה23: 0 = אין שינוי בהתנהגות, 1 = תנועות פה ופנים, 2 = הנהון ראש, 3 = קלונוס גפיים קדמיות חד צדדיות, 4 = קלונוס גפיים קדמיות דו-צדדיות עם גידול, 5 = פעילות טונית-קלונית כללית עם אובדן טונוס יציבה, לפעמים קפיצה, 6 = קפיצות והיפראקטיביות ממושכות ומוגזמות. דווח על מספר ההתקפים ועוצמתם.
    3. החלק עט על פני הכלוב כדי להשמיע קצת רעש.
    4. מעבירים כל חיה לקופסה אחרת ובחזרה.
    5. נערו את הכלוב בעדינות בתנועה קדימה ואחורה, תוך הקפדה שלא לטלטל את הכלוב בעוצמה כה רבה עד שבעלי חיים יפגעו בצדדים או בחלק העליון של הכלוב ויהיו בסכנת פגיעה פיזית.
    6. לפקח על כל בעלי החיים בכלוב עבור התקפים. בכל עת, אם עכבר חווה התקף, העבר אותו בחזרה לכלוב הביתי ורשום את רמת ההתקף ללא גירוי נוסף של ההתקף על ידי רעש או טיפול.
    7. עבור בעלי חיים שלא תפסו באופן ספונטני או לאחר טלטול עדין בכלוב, הפעילו התקפים על ידי טיפול אינטנסיבי יותר: הפכו בזהירות את העכבר על ידי היפוך זנבו משמאל לימין.
      הערה: בעלי חיים עם התקפים הם בעלי רגישות יתר, ויכולים להיות קופצניים.
    8. התבוננו שוב בכל בעל חיים להתנהגות התקפית. חזור על התהליך עבור הכלובים הבאים.
      הערה: פרוטוקול מופתי לניטור התקפים ניתן למצוא בחומר משלים 1, עמודים 6-7.
  4. דו"ח נתונים על השפעות מורכבות
    1. נתח את משקלי הגוף היומיים באמצעות מדדים חוזרים ונשנים (RM) ANOVA.
    2. השתמש בערכי נטל ההתקפים המצטבר היומי לייצוג גרפי של הנתונים. הצג את נתוני היעילות (מספר בעלי החיים ללא התקפים בשלב ראסין 3-5) כמספר המוגן/המספר הנבדק בכל קבוצה בהתאמה (בדרך כלל N = 20). לכן, יש להשוות את הנתונים בין קבוצות הרכב והקבוצות שטופלו בתרופות עבור תגובות (תפיסה או אי-תפיסה) באמצעות הבדיקה המדויקת של פישר.
      הערה: בעל חיים נחשב "מוגן" מפני התקפים אם יש לו התקף של שלב 2 או פחות ובעלי חיים שאינם מוגנים יש התקפים של שלבים 3-5.
    3. נתח את נתוני הסבילות באופן דומה, כמספר בעלי החיים עם ליקויי התנהגות או השפעות רעילות / המספר הנבדק בכל קבוצה. שימו לב לתופעות לוואי, כולל מקרי מוות.
    4. אם פחות מ-50% מהעכברים המוזרקים לרכב תופסים בצורה חריפה, אל תתחשבו בנתונים.

Representative Results

השפעות מורכבות על התקפים חריפים
התקפים התנהגותיים נרשמים אם הם מתרחשים במהלך הזרקת סמים (DI) או במהלך מפגשי הטיפול/ניטור של התקפים בבוקר/PM שלאחר מכן. התקפים שנצפו במהלך הטיפול בהתקפים יכולים להיות מוצגים כמפת חום, אשר מוצגת באיור 2 עבור LEV (350 מ"ג/ק"ג). לצורך ניתוח נטל ההתקפים, נלקח הממוצע של ערכי נטל ההתקפים המצטבר הסופי (יום 7) עבור הקבוצה שטופלה ברכב והושווה על ידי מבחן Mann-Whitney U לקבוצה שטופלה במתחם (ערכי נטל ההתקפים כוללים את אלה שנאספו בתצפית שלאחר ההזרקה). עבור יעילות מורכבת, הבדיקה המדויקת של פישר קובעת אם יש הבדל סטטיסטי ביעילות בין קבוצות שטופלו ברכב לבין קבוצות שטופלו בתרופות. באופן דומה, נתוני הסבילות מנותחים באמצעות המבחן המדויק של פישר. ניתוח משקל הגוף מבוצע על ידי ANOVA במדידות חוזרות ונשנות כדי לקבוע שינויים במהלך הניסוי, כמו גם הבדלים בין עכברים שטופלו בתרכובת לבין עכברים שטופלו ברכב.

Figure 2
איור 2: מפת חום של התקפים התנהגותיים לאחר בדיקה ברכב (0.5% מתילצלולוז) או LEV (350 מ"ג/ק"ג). פעמיים ביום התרחשו זריקות שעה לפני הטיפול ותצפיות ההתקפים. התקפים התנהגותיים תועדו אם הם התרחשו במהלך הזרקת סמים (DI) או במהלך מפגשי הטיפול/ניטור של התקפים AM/PM שלאחר מכן. LEV (350 מ"ג/ק"ג) מפחית באופן משמעותי את ההתקפים שנצפו במהלך טיפולי הטיפול (35.9% מנטל תפיסת הרכב) במהלך תקופת ההשגחה בת 5 הימים. מפת החום נוצרת על ידי תיאור שלב ההתקפים 1-3 בירוק, 4 בצהוב ו-5 בכתום. נתון חדש זה נוצר מתוך מערך נתוניםשפורסם 19. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

אפילפסיה כרונית
מלבד נטל ההתקפים המדווח בשבוע הראשון pi, ישנם מספר קריאות שיכולות להיות שימושיות בהתאם למחקר ולהשערה. אם בעלי חיים מוחזקים לטווח ארוך, תת-קבוצה של בעלי חיים נגועים תפתח התקפים אפילפטיים ספונטניים לאחר מספר שבועות pi, אשר מתרחשים בתדירות נמוכה יותר מאשר התקפים חריפים, ולכן דורשים רישום EEG. על מנת להקליט EEG מעכברים, יש להשתיל אלקטרודות בניתוח סטריאוטקסי24. איור 3 מראה אירועים אפילפטיים שונים בשלב הכרוני על-ידי רישום EEG בעכברים שנדבקו ב-TMEV8.

Figure 3
איור 3: עקבות EEG אופייניים בשלב הכרוני (14 שבועות pi) לאחר הדבקה בנגיף DA בעכברים. (A-C) אירועי EEG מייצגים שבהם לא נצפתה קורלציה מוטורית התנהגותית, כלומר (A) קוצים בודדים, (B) אשכולות קוצים, (C) וכן התקף אלקטרוגרפי, ככל הנראה מוקדי. (ד-ו) אירועי EEG מייצגים עם קורלציה התנהגותית. לעכבר המתואר ב-D היו אירועים דמויי התקפים עם עוויתות מיוקלוניות (מסומנות על ידי "M", מלוות בחפצי תנועה), תנועות סטריאוטיפיות (מסומנות על ידי "לחיצת ראש", כאשר העכבר לחץ את הראש בצורה שטוחה על הקרקע), או מעצר התנהגותי; "Scr" מתאר חפץ תנועתי של גירוד, (E) ו-(F) מראים שינויים אופייניים ב-EEG במהלך התקפים עוויתיים כלליים: (E) התקף ראסין שלב 3 עם משך זמן של 22 שניות ו-1 הרץ, ו-(F) התקף שלב 5 עם משך של 34 שניות ו-5.4 הרץ. נתון זה פורסם לפני8 והודפס מחדש באישור Elsevier. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

היסטולוגיה
מכיוון שאפילפסיה והתקפים מלווים בדרך כלל בפתולוגיה של ההיפוקמפוס בחולים, אשר משוחזרת במודלים ניסיוניים, רוב המעבדות מנתחות גם שינויים בהיפוקמפוס או את ההשפעה של טיפול פוטנציאלי נגד פרכוסים על הפתולוגיה. פרמטרים שנבדקים בדרך כלל כוללים ניוון והתכווצות של מערכת העצבים בהיפוקמפוס, כמו גם דלקת על-ידי סימון אוכלוסיות ספציפיות של תאי מערכת החיסון. לצורך ניתוחים כאלה, בסוף הניסוי, עכברים מורדמים עמוקות עד שמתרחש דום נשימה וקצב הלב מאט משמעותית או מראה הפרעות קצב. הדם מוסר על ידי זילוח תוך לבבי של PBS ואחריו 4% paraformaldehyde (PFA)25 כדי לקבע את הרקמה. לאחר מכן הרקמה מעובדת על ידי הקפאה וצביעה (חיסונית)26, ולאחר מכן ניתוח מיקרוסקופי.

Figure 4
איור 4: ניוון היפוקמפוס בעכברים נגועים ב-TMEV אפילפטי. (A,B) קטעי עטרה מוכתמים בסגול של קרסיל מראים ציטוארכיטקטורה נורמלית בעכבר בקרה (PBS) (A) וניוון היפוקמפוס בעכבר TMEV (B) לאחר חודשיים pi. הערה: חדרים צדדיים מוגדלים, קריסת הנאדיות ודילול שכבת התא הפירמידלית. (C) כימות של נזק זה מראה ירידה משמעותית באזור ההיפוקמפוס ועלייה מקבילה בשטח החדר של עכברי TMEV (N = 7) לעומת עכברי PBS (N = 6; הנתונים ממוצעים ± SEM; p < 0.001; מבחן t של תלמיד). (ד,ה) תיוג NeuN ממחיש עוד יותר את גודל אובדן התאים העצביים במקטעים שנלקחו לאחר 6 חודשים pi. חצים מציינים אזורים עם אובדן תאים פירמידלי מוחלט. (E) הבליטה המשוננת נראית שלמה יחסית אפילו בעכברים אפילפטיים. סרגל קנה מידה = (A,B) 2 מ"מ; (D,E) 0.5 מ"מ. נתון זה פורסם לפני6 והודפס מחדש באישור הוצאת אוניברסיטת אוקספורד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: פוטומיקרוגרפים מייצגים של חומרות שונות של חדירת תאי T עקב דלקת מוח חריפה 7 ימים לאחר ההדבקה. חלקים סדרתיים המכילים את ההיפוקמפוס הגבי האיפסילטרלי הוכתמו בנוגדנים נגד CD3 על מנת לתייג לימפוציטים מסוג T. (א,ד) היפוקמפוס רגיל ללא חדירת תאי T כפי שהופיע בבעלי חיים נגועים בדמה. (ב, ה) חדירה מתונה של תאי T כפי שניתן לראות ברוב העכברים הנגועים ב-TMEV. (ג, ו) חדירה חמורה של לימפוציטים מסוג T, שנצפתה רק בחלק מהעכברים הנגועים. נתון זה פורסם לפני8 והודפס מחדש באישור Elsevier. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: הקובץ המשלים מורכב מהטופס המשמש לבדיקות מורכבות במודל TMEV. עמוד 1 נותן סקירה כללית של מערך הניסוי. מידע על הכנת התרכובת, הרכב והתמיסת המתחם נרשם בעמודים 1-2. הבקשה המורכבת נרשמת בעמוד 3. דפי הניקוד בעמודים 4-5 משמשים לרישום ההתקפים שנצפו וכומתו על ידי הנסיין המבצע את הזרקת התרכובת. בעמוד 4 ניתן לאסוף נתונים עבור כלובים 1-4 מתוך 5 עכברים כל אחד, ובעמוד 5 ניתן לרשום כלובים 5-8, שהוא המספר הסטנדרטי של בעלי חיים לניסויים מורכבים בידינו. דפי הניקוד בעמודים 6-7 משמשים את הצופה המסונוור המבצע את התצפית, הטיפול וטלטול הכלוב העדין שעה לאחר כל הזרקת תרכובת. שוב, ניתן לציין את ציוני ההתקפים עבור שמונה כלובים בסך הכל בדפי ניקוד מופתיים אלה. עמוד 8 האחרון יכול לשמש לרישום כל תצפית או הערות אחרות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

זהו מודל המכרסמים מבוסס הזיהום הראשון לאפילפסיה המאפשר חקירה של התפתחות התקפים חריפה וכרונית. זה יעזור לזהות מטרות סמים ותרכובות חדשות למניעת מחלות או שינוי עבור אחת האטיולוגיות הנפוצות ביותר של אפילפסיה.

כפי שתואר לעיל, ייתכן שיהיה צורך לשקול בזהירות את האצווה ואת הטיטר הנגיפי כדי להבטיח ששיעור הולם של עכברים שטופלו ב-TMEV יפגינו התקפים הנגרמים על ידי טיפול. אם לבעלי חיים יש פחות התקפים מהרגיל, השתמש בקבוצה של N = 20 בעלי חיים כדי לאמת את יעילות הנגיף. אם פעילותו מופחתת (פחות מ -50%), הגיע הזמן לעשות aliquots חדשים ולבדוק אותם עם N = 20 בעלי חיים. אם aliquots החדש אינם יעילים יותר, אצווה חדשה של הנגיף צריך להיות מטוהר. עבור כמה קווי עכבר מהונדס, ייתכן שיהיה צורך להשתמש titer ויראלי נמוך יותר; לכן, יש לדלל את הטיטר הנגיפי לפי הצורך לאחר ניסויים מקדימים. רוב הנתונים הזמינים על עכברי B6 מקורם במעבדות ג'קסון (בר הרבור, ME, ארה"ב או נהר צ'ארלס, זולצפלד, גרמניה); עם זאת, שיעורי התקפים דומים בעכברי B6 שהתקבלו מהרלן (Eystrup, גרמניה) אושרו8. שיעורי ההתקפים של בעלי חיים טרנסגניים עם רקע B6 דומים לעכברי B6 פראיים, אך עשויים להיות שונים אם לשינויים הגנטיים יש השפעה על פלישת וירוסים, תגובה דלקתית או ניוון עצבי21. התקפים חריפים נצפים באופן ספונטני אך מופעלים על ידי טיפול ורעש, ולכן יש חשיבות עליונה לטפל בכל בעלי החיים באופן דומה כאשר משווים את שיעורי ההתקפים. מפגשי טיפול פעמיים ביום סיפקו בעבר נטל התקפים גבוה ושיעור גבוה יותר של עכברים שהפגינו התקפים בימים 3-7 לאחר ההדבקה 6,8,19. ניתן להשתמש גם במפגשי טיפול נוספים (יום 1 ויום 2) כדי להגביר את נטל התפיסה. יתר על כן, ניתן לצפות בבעלי חיים לפני כל מפגש טיפול כדי להבטיח שהתקפים ספונטניים אינם מתרחשים. סביבת מעבדה רועשת, למשל, עלולה לייצר התקפים, אשר עשויים, בתורם, להפוך בעלי חיים עמידים לטיפול בהתקפים הנגרמים במהלך זמני הבדיקה.

בעוד שזיהום TMEV גורם להתקפים הנגרמים על ידי טיפול ברוב העכברים, לא ידוע מדוע בעלי חיים מסוימים עמידים לטיפול זה. כפי שתואר לעיל, ייתכן כי התקפים אלקטרוגרפיים (עם התנהגויות מינימליות או ללא התנהגויות הקשורות) מתרחשים ואינם מכומתים בדרך כלל ללא רישום EEG במקביל. ייתכן גם כי הבדלים קטנים במיקום ההזרקה להקל על השפעה ויראלית מופחתת במוח; עם זאת, התקפים דווחו לאחר זיהום קליפת המוח והסטריאטלי 5,6,8,9 עקב טרופיזם של הנגיף להיפוקמפוס. עבור מחקרי סינון תרופות במודל זה, כדי לזהות הפחתה בהתקפים (למשל, הפחתה של 50% בנטל ההתקפים), נדרש מספר גדול יותר של בעלי חיים עבור כל קבוצה (למשל, N = 20). יתר על כן, השונות בהתנהגויות ההתקפים במודל זה מחייבת הבדלים גדולים יותר בהשפעות סמים לעומת כלי רכב כדי לזהות הפחתה משמעותית בפרכוסים. לכן, מגבלה אחת של מודל זה היא הדרישה לגודל קבוצה גדול יותר. עם זאת, גודל קבוצה מספיק מאפשר גם זיהוי של השפעות נוגדות פרכוסים ואנטי דלקתיות במודל זה19.

הרוב המכריע של ההתקפים הנצפים במודל זה מתרחשים במהלך תקופת הזיהום החריף. למרות התרחשות של ניוון ההיפוקמפוס, הפעלת תאי מערכת החיסון וליקויים קוגניטיביים שנצפו בעכברים שטופלו ב-TMEV, רק חלק קטן מבעלי החיים שטופלו מפתחים בסופו של דבר התקפים כרוניים וספונטניים. נטל ההתקפים הכולל הנמוך הזה ידרוש מספר רב של עכברים נגועים על מנת לחקור כראוי התקפים ספונטניים במודל זה, שהוא מעבר להיקפם וליכולתם של פרויקטים רבים. השתלת אלקטרודות עומק וניטור EEG יגבירו גם הם את העומס על חיות הניסוי. בעוד אלקטרודות עומק עשויות לסייע בזיהוי פעילות התקפים ספונטנית, שינויים באנטומיה של ההיפוקמפוס בעקבות זיהום עשויים להפוך את מיקום האלקטרודות העקבי לאתגר.

הצורך הדחוף בזיהוי טיפולים חדשים לאפילפסיה מחייב פיתוח מודלים שיוכלו לשמש כשיטת סינון מהירה ליעילות נוגדת פרכוסים. מודל זה מספק תכונות לטיפול בבקשה דחופה זו. יתר על כן, העובדה שהוא אינו דורש כל ניתוח סטריאוטקטי הופכת אותו למודל מתאים וקל לביצוע לחקירת תרכובות נוגדות פרכוסים.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

SB נתמך על ידי מענק התחלתי של FU ברלין. KSW נתמך על ידי R37 NS065434 וקרן ALSAM. LAB נתמך על ידי פרס D-SPAN 1F99NS125773-01. אנו מודים לרוברט פוג'ינמי, Ph.D. על שסיפק לנו את נגיף טיילר ואת מתקן הליבה להדמיית תאים באוניברסיטת יוטה לתמיכה במיקרוסקופיה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbent paper - - any
Analytical balance Mettler Toledo (Columbus, OH, U.S.A.) 30216542 0. 1 mg–220 g 
Animal balance Ohaus (Parsippany, NJ, U.S.A.) STX2202 0.01 g–2200 g 
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes BD (Mississauga, ON, Canada)  BD329461 Lo-Dose sterile syringes with permanent BD Micro-Fine IV needle - 1 mL
Daniel's strain of TMEV kindly provided by Robert Fujinami (University of Utah) - 3 x 105 plaque-forming units aliquot(s)
Disinfectant, e.g. VennoVet 1 super Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Germany - Recommended by campus veterinarians with less than or equal to 5% alcohol
Fisherbrand medium sterile Alcohol prep pad C7  Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) 22-363-750
Fluriso VETone (Boise, ID, U.S.A) 502017 Isoflurane 250 mL, 2%–5%
Fume absorber  Labconco (Kansas City, MO, U.S.A.) - -
General Protection Disposable SMS White Lab Coats   Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) 17-100-810A
GraphPad Prism version 9  (La Jolla, CA, U.S.A.)
Ice bucket - - any
Microsoft Excel Microsoft  (Redmond, WA, U.S.A.)
Microsoft Word Microsoft  (Redmond, WA, U.S.A.)
Mouse cage - - any mouse cage holding at least 5 mice
PrecisionGlide needles  BD (Mississauga, ON, Canada) 329652 BD Slip Tip with PrecisionGlide Needle Insulin Syringes - 26 G x 3/8 - 0.45 mm x 10 mm
Self-Sealing Sterilizing Pouch  Fisher Scientific (Hampton, NY, U.S.A.) NC9241087  12.6 x 25.5 cm
Small glass flask - - any, volume 25 mL
sterile PBS Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) 10010056
Stir bar Carl Roth GmbH & CO. KG X171.1 size according to volume of solution
Stir plate Carl Roth GmbH & CO. KG AAN2.1
Syringe Luer-Lok BD (Mississauga, ON, Canada) 309628 1 mL syringe only
Ultrasonic Cleaner, Heater/Mechanical Timer Cole-Parmer (Vernon Hills, IL, U.S.A.) EW-08895-23 Bath sonicator - 0.5 gal, 115 V
Vehicle solution - - depending on compound vehicle
Vortex REAX  Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Germany 541-10000-00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Getts, D. R., Balcar, V. J., Matsumoto, I., Müller, M., King, N. J. Viruses and the immune system: their roles in seizure cascade development. Journal of Neurochemistry. 104 (5), 1167-1176 (2008).
  2. Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Neurotropic viral infections leading to epilepsy: Focus on Theiler's murine encephalomyelitis virus. Future Virology. 6 (11), 1339-1350 (2011).
  3. Vezzani, A., et al. Infections, inflammation and epilepsy. Acta Neuropathologica. 131 (2), 211-234 (2016).
  4. Misra, U. K., Tan, C. T., Kalita, J. Viral encephalitis and epilepsy. Epilepsia. 49, Suppl 6 13-18 (2008).
  5. Libbey, J. E., et al. Seizures following picornavirus infection). Epilepsia. 49 (6), 1066-1074 (2008).
  6. Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. Development of postinfection epilepsy after Theiler's virus infection of C57BL/6 mice. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (12), 1210-1219 (2010).
  7. Stewart, A. M., et al. Perspectives of zebrafish models of epilepsy: What, how and where next. Brain Research Bulletin. 87 (2-3), 135-143 (2012).
  8. Bröer, S., et al. Brain inflammation, neurodegeneration and seizure development following picornavirus infection markedly differ among virus and mouse strains and substrains. Experimental Neurology. 279, 57-74 (2016).
  9. Bröer, S., et al. Viral mouse models of multiple sclerosis and epilepsy: Marked differences in neuropathogenesis following infection with two naturally occurring variants of Theiler's virus BeAn strain. Neurobiology of Disease. 99, 121-132 (2017).
  10. Loewen, J. L., Barker-Haliski, M. L., Dahle, E. J., White, H. S., Wilcox, K. S. Neuronal Injury, gliosis, and glial proliferation in two models of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 75 (4), 366-378 (2016).
  11. Bell, L. A., Wallis, G. J., Wilcox, K. S. Reactivity and increased proliferation of NG2 cells following central nervous system infection with Theiler's murine encephalomyelitis virus. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 369 (2020).
  12. Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. Theiler's virus infection chronically alters seizure susceptibility. Epilepsia. 51 (8), 1418-1428 (2010).
  13. Buenz, E. J., Rodriguez, M., Howe, C. L. Disrupted spatial memory is a consequence of picornavirus infection. Neurobiology of Disease. 24 (2), 266-273 (2006).
  14. Tramoni-Negre, E., Lambert, I., Bartolomei, F., Felician, O. Long-term memory deficits in temporal lobe epilepsy. Revue Neurologique. 173 (7-8), 490-497 (2017).
  15. Ponds, R. W., Hendriks, M. Cognitive rehabilitation of memory problems in patients with epilepsy. Seizure. 15 (4), 267-273 (2006).
  16. Sloviter, R. S. Experimental status epilepticus in animals: What are we modeling. Epilepsia. 12, 11-13 (2009).
  17. Löscher, W. Animal models of seizures and epilepsy: Past, present, and future role for the discovery of antiseizure drugs. Neurochemical Research. 42 (7), 1873-1888 (2017).
  18. Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).
  19. Metcalf, C. S., et al. Screening of prototype antiseizure and anti-inflammatory compounds in the Theiler's murine encephalomyelitis virus model of epilepsy. Epilepsia Open. 7 (1), 46-58 (2021).
  20. Daniels, J. B., Pappenheimer, A. M., Richardson, S. Observations on encephalomyelitis of mice (DA strain). Journal of Experimental Medicine. 96 (6), 517-530 (1952).
  21. Käufer, C., et al. Chemokine receptors CCR2 and CX3CR1 regulate viral encephalitis-induced hippocampal damage but not seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (38), 8929-8938 (2018).
  22. Libbey, J. E., et al. The effects of diet on the severity of central nervous system disease: One part of lab-to-lab variability. Nutrition. 32 (7-8), 877-883 (2016).
  23. Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).
  24. Kim, J. E., Cho, K. O. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy and EEG monitoring using radiotelemetry system in mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831 (2018).
  25. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  26. Tu, L., et al. Free-floating immunostaining of mouse brains. Journal of Visualized Experiments. (176), e62876 (2021).

Tags

מדעי המוח גיליון 184
מודל לאפילפסיה של אטיולוגיה זיהומית באמצעות וירוס Murine Encephalomyelitis של Theiler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Batot, G., Metcalf, C. S., Bell, L.… More

Batot, G., Metcalf, C. S., Bell, L. A., Pauletti, A., Wilcox, K. S., Bröer, S. A Model for Epilepsy of Infectious Etiology using Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus. J. Vis. Exp. (184), e63673, doi:10.3791/63673 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter