Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

نهج الزرع الرجعي لوضع قسطرة غسيل الكلى البريتوني في الفئران

Published: July 20, 2022 doi: 10.3791/63689
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1,3,4
1Renal Section, Department of Medicine, Boston University Aram V. Chobanian & Edward Avedisian School of Medicine, 2Department of Biomedical Science, Kaiser Permanente Bernard J. Tyson School of Medicine, 3Veterans Affairs Boston Healthcare System, 4Institute of Medical Engineering and Sciences, Massachusetts Institute of Technology

ERRATUM NOTICE

Summary

توضح هذه المقالة تعديلات على إجراء لزرع قسطرة غسيل الكلى البريتوني في نموذج الفئران لتجنب المشكلات الفنية الرئيسية التي لوحظت مع التقنيات التقليدية.

Abstract

يتم استخدام نماذج الفئران لاستكشاف جوانب مختلفة من غسيل الكلى البريتوني (PD) ، مثل التهاب الصفاق والتليف. تؤدي هذه الأحداث إلى فشل الغشاء البريتوني لدى البشر ، والذي لا يزال مجالا للتحقيق المكثف بسبب آثاره السريرية العميقة في إدارة المرضى الذين يعانون من مرض الكلى في المرحلة النهائية (ESKD). على الرغم من الأهمية السريرية لمرض باركنسون والمضاعفات المرتبطة به، فإن نماذج الفئران التجريبية الحالية تعاني من تحديات تقنية رئيسية تؤثر على أداء النماذج. وتشمل هذه هجرة قسطرة PD والالتواء وعادة ما تستدعي إزالة القسطرة في وقت مبكر. تدفع هذه القيود أيضا الحاجة إلى عدد أكبر من الحيوانات لإكمال الدراسة. لمعالجة هذه العيوب ، تقدم هذه الدراسة تحسينات تقنية وفروق جراحية دقيقة لمنع مضاعفات قسطرة PD التي لوحظت بشكل شائع في نموذج الفئران. علاوة على ذلك ، يتم التحقق من صحة هذا النموذج المعدل عن طريق إحداث التهاب الصفاق والتليف باستخدام حقن عديد السكاريد الدهني. في جوهرها ، تصف هذه الورقة طريقة محسنة لإنشاء نموذج تجريبي ل PD.

Introduction

المرحلة النهائية من عبء مرض الكلى
مرض الكلى المزمن (CKD) هو مشكلة صحية في جميع أنحاء العالم1. تشير التقديرات الحالية إلى أن أكثر من 850 مليون شخص في جميع أنحاء العالم يعانون من أمراض الكلى. يضاعف انتشار أمراض الكلى تقريبا عدد مرضى السكري (422 مليون) وهو أكثر من 20 ضعف معدل انتشار السرطان (42 مليون) أو فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز (36.7 مليون) في جميع أنحاء العالم2. ما يقرب من واحد من كل سبعة أمريكيين يعانون من مرض الكلى المزمن ، واثنان من كل 1000 أمريكي لديهم ESKD تتطلب زراعة الكلى أو دعم غسيل الكلى3. بالنظر إلى العبء المتصاعد ل ESKD في جميع أنحاء العالم ، فإن تحسين تقنية غسيل الكلى أمر بالغ الأهمية3.

غسيل الكلى البريتوني
PD هي طريقة غير مستغلة بشكل كبير لعلاج ESKD في الولايات المتحدة. وفقا لنظام بيانات الكلى بالولايات المتحدة (USRDS) ، كانت النسبة المئوية لمرضى PD السائدين 11٪ فقط في عام 2020 4,5. يمنح PD العديد من المزايا على غسيل الكلى في المركز (HD) ، بما في ذلك نوعية حياة أفضل ، وعدد أقل من زيارات العيادة ، وانخفاض في نفقات Medicare 6,7. بالإضافة إلى ذلك ، PD هو علاج منزلي ويرتبط بخطر أقل بكثير للإصابة بالتهابات شديدة مثل تجرثم الدم والتهاب الشغاف التي غالبا ما ترتبط بقسطرة غسيل الكلى. علاوة على ذلك ، يمكن بدء PD بسرعة من خلال بروتوكول البدء العاجل ، مما يقلل من الحاجة إلى بدء غسيل الكلى باستخدام القسطرة الوعائية الساكنة8. يعتبر PD الطريقة المفضلة لغسيل الكلى في مجموعة ESKD للأطفال9.

ضعف الصفاق الناجم عن غسيل الكلى البريتوني
يستلزم PD إدخال سائل PD (الديالة) في الصفاق ، مما يؤدي إلى التهاب وإعادة تشكيل الغشاء البريتوني بمرور الوقت. يؤدي الالتهاب البريتوني إلى التليف ، ويبلغ ذروته في الخسارة المحتملة لقدرات الترشيح الفائق للغشاء بمرور الوقت. يمثل الحفاظ على الغشاء البريتوني تحديا كبيرا في مرض باركنسون، ومن المهم إجراء المزيد من الأبحاث لضمان توفر أفضل الممارسات السريرية للممارسين. هناك نماذج راسخة للفئران للمساعدة في زيادة فهم الآليات الفيزيولوجية المرضية للعدوى البريتونية والالتهابات ، والمذاب ، وحركية نقل المياه ، وفشل الغشاء. ومع ذلك ، فإن المشكلات الفنية في القسطرة غالبا ما تحد من هذه النماذج10.

تحليل تغيرات الغشاء البريتوني
في مرضى ESKD ، يتم إدخال غسيل الكلى تقليديا في التجويف البريتوني من خلال قسطرة Tenkhoff ذات الكفة العميقة والسطحية. يمكن أن يعاني المرضى من مضاعفات مرتبطة بالقسطرة ، بما في ذلك هجرة القسطرة وألم التسريب وسوء تصريف الديالة11،12،13. تم إدخال نوعين رئيسيين من القسطرة البريتونية للبشر ، ملفوفة أو مستقيمة ، لتقليل هذه المضاعفات12. تمت إضافة العديد من التعديلات ، بما في ذلك الكفة الإضافية للقسطرة التقليدية ذات الأصفاد ، إلى القسطرة الأصلية لإطالة بقاء قسطرة PD11. تختلف تقنية الإدخال وفقا لعدة عوامل عن طريق منع هجرة القسطرة المراد إضافتها بعد البقاء على قيد الحياة ، بما في ذلك توفر الموارد ومستوى الخبرة14.

في المقابل ، فإن نماذج الفئران لغسيل الكلى البريتوني لها اختلافات جوهرية في التقنيات والغرض مقارنة بالقسطرة البريتونية البشرية. على سبيل المثال ، تستخدم القسطرة البريتونية في نماذج الفئران في المقام الأول لدراسة التغيرات الغشائية وهي أقل مخصصة لوظائف الصرف ثنائية الاتجاه. تعاني التقنية الحالية من احتمال إزاحة الميناء وهجرة القسطرة بسبب التعامل مع الحيوانات. في نماذج الفئران التقليدية ، لم يتم تثبيت منافذ الوصول على الجلد. خلق هذا الجانب منفذ وصول غير مستقر ، والذي قد يتم إزاحته في الحيوانات المستيقظة ، مما يؤدي إلى هجرة القسطرة. نظرا لأهمية نماذج الفئران في أبحاث الغشاء البريتوني ، من الضروري إنشاء تقنيات جراحية فعالة لتوليد نماذج موثوقة. لذلك ، شرعنا في تحسين النموذج التقليدي لوضع قسطرة PD. من المهم ملاحظة أن القسطرة نفسها تسبب تغيرات نسيجية مرضية في الغشاء البريتوني ، وبالتالي ، يجب تفسير أي استنتاجات تتعلق بتأثير محاليل PD في الدراسات على الحيوانات في سياق قسطرة PD كجسم غريب15،16،17.

الغشاء البريتوني التشريح المرضي
يرتبط فشل PD بشكل أساسي بالتليف وتكوين الأوعية الزائدة مما يؤدي إلى فقدان تدرج التركيز الأسمولي. بالإضافة إلى ذلك، قد تتأثر قدرة ترشيح الغشاء البريتوني بالتهاب الصفاق. بالإضافة إلى ذلك ، يعد التهاب الصفاق المعدي سببا راسخا للتغيير في طريقة غسيل الكلى من غسيل الكلى البريتوني إلى غسيل الكلى. 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

في هذه الدراسة ، تم استخدام ثماني إناث من الفئران C57BL / 6J ، تتراوح أعمارهن بين 8 و 12 أسبوعا ، ومتوسط وزن 20 جم. تم إيواء الفئران في ظل ظروف قياسية وتم إطعامها بالطعام والماء حسب الطلب. تم إجراء هذه الدراسة بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) ، المركز الطبي بجامعة بوسطن (AN-1549). تم تنفيذ الإجراءات الموضحة هنا في ظل ظروف معقمة.

1. تخدير الفأر في غرفة إيزوفلوران ، وحقن المسكن تحت الجلد

  1. امسك الحيوان من قاعدة الذيل. الحفاظ على الحيوان على السطح الظهري لليد غير المهيمنة.
  2. نقل الحيوان إلى غرفة تحريض التخدير المستمر مليئة 3٪ -4٪ إيزوفلوران. تأكد من التخدير العام الكافي من خلال عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم في الأطراف الخلفية اليمنى واليسرى. الحفاظ على الحفاظ على التخدير العام مع إيزوفلوران 1٪ -3٪.
  3. ضع مرهم العيون على كلتا العينين.
  4. تطبيق حقنة تحت الجلد من البوبرينورفين.
    1. قم بإذابة مخزون البوبرينورفين بتركيز 0.3 مجم / مل في كلوريد الصوديوم (NaCl) بنسبة 0.9٪ لتحقيق التركيز النهائي البالغ 0.03 مجم / مل.
    2. حقن جرعة من 0.05-0.1 ملغ / كغ من 0.03 ملغ / مل البوبرينورفين ، جنبا إلى جنب مع 500 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم المعقم 0.9 ٪ ، قبل 20 دقيقة من الجراحة في 20 غرام من الفئران (2 ميكروغرام أو 66 ميكرولتر من 0.03 ملغ / مل البوبرينورفين لكل فأر).

2. إعداد الجلد

  1. ضع الماوس المخدر بالكامل في وضع جانبي أيسر ، مع تعريض جناحه الأيمن لبطانية التدفئة. حلق الجانب الأيمن من البطن ، بالقرب من خط الوسط إلى منطقة النخاع الشوكي ، وصولا إلى ذيل الحيوان.
  2. تطهير المنطقة المحلوقة ثلاث مرات باستخدام قطعة قطن مع التطبيق البديل للمحلول المطهر أو المقشر وإما 70٪ كحول أو محلول ملحي معقم بحركة دائرية ، بدءا من موقع الشق الجراحي والانتقال إلى الخارج. تخلص من قطعة القطن بعد كل استخدام. احرص على عدم تبليل المناطق غير الجراحية بشكل مفرط من الحيوان بالكحول أو المطهر لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى تفاقم انخفاض حرارة الجسم.
    ملاحظة: من المهم تخفيف المحاليل المطهرة بشكل صحيح وعدم ترك الدعك الجراحي على الجلد أثناء الجراحة ، لأنها يمكن أن تكون مزعجة وتحتاج إلى شطفها. تحقق بشكل متكرر من درجة حرارة بطانية التدفئة أثناء الإجراء للتأكد من عدم انخفاض درجة الحرارة.

3. قياس طول القسطرة ووضع علامة على نقطة الإدخال داخل البطن والقناة الأنبوبية فوق الجلد المحضر

  1. قم بتعيين جيب منفذ الوصول 1 سم فوق ذيل الحيوان. امسك جزء التثبيت بالسبابة غير المهيمنة وإصبع الإبهام فوق المنطقة المخصصة بالقرب من الذيل.
  2. ضع القسطرة فوق الجلد وقم بتقدير مكان إدخال أنبوب القسطرة داخل تجويف البطن. حدد المكان المخصص لإدخال الأنبوب ، مع احترام الحد الأدنى من الانحناء للأنبوب بالقرب من خط الوسط الأمامي.
    ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الإجراءات بقفازات معقمة ، ويجب أن تبقى القسطرة معقمة أثناء القياس. يجب تعقيم الأدوات الجراحية عند 121 درجة مئوية قبل الاستخدام. راجع الشكل التكميلي S1 لمعرفة الأدوات المطلوبة للإجراء.

4. تخصيص قسم خزان القسطرة البريتوني

  1. قم بعمل ثقب جانبي فوق إطار قسم الخزان باستخدام علامة أذن الماوس (الشكل 1 والشكل 2). تجدر الإشارة إلى أن لكمة الأذن هي أداة جراحية ، ويجب أن تكون معقمة.

5. ضع منفذ التقطير

  1. قم بعمل شق أفقي بعرض 1 سم فوق الذيل. قم بتشريح المستوى تحت الجلد بصراحة من الطبقة العضلية الأساسية لعمل كيس لوضع القسطرة لضمان وجود منفذ التقطير في جيب المنفذ المثالي بحرية.
  2. حافظ على طرف مقص القزحية باتجاه خط الوسط لعمل نفق مائل لوضع الأنبوب (الشكل 3 أ).
  3. مرر خياطة 3.0 من الفتحة الجانبية المخصصة. قم بإصلاح منفذ الوصول إلى السرير العضلي عن طريق شد الخيط الذي تم تمريره ، مع الحفاظ على مسار الأنبوب cephalad.

6. قم بعمل شق موقع إدخال طرف القسطرة

  1. قم بعمل شق 1 سم فوق المنطقة المحددة سابقا بالقرب من خط الوسط. تأكد من المسالك المتطورة عن طريق تمرير المقص عبر المسالك.
  2. اختر طرف القسطرة برفق باستخدام ملقط لوضع القسطرة في مسار رجعي.
    ملاحظة: تجنب الضغط على الثقوب الجانبية للأنبوب.
  3. مرر أنبوب القسطرة عبر القناة المعدة (الشكل 3 ب). قم بعمل شق 1 سم فوق الطبقة العضلية بالقرب من خط الوسط الأيمن.

7. تأكيد عمل القسطرة

  1. قبل إغلاق جميع الشقوق ، تأكد من أن القسطرة الموضوعة تعمل. تحقق من الوظيفة باستخدام حقنة سعة 1 مل متصلة بإبرة هوبر المحددة للمنفذ.
  2. حقن 200 ميكرولتر من المحلول الملحي العادي في منفذ التقطير. ابحث عن تدفق سلس مع عدم التسامح مطلقا مع المقاومة.
  3. اغسل المنفذ والقسطرة بنسبة 10٪ هيبارين للحفاظ على المباح.

8. أغلق شقوق الجلد

  1. أغلق شقوق الجلد حول خزان المنفذ (الشكل 3C) بخيوط قابلة للامتصاص 3-0.

9. إصلاح طرف القسطرة داخل تجويف البطن

  1. ضع خياطة خيط محفظة فضفاضة مع خياطة مستديرة قابلة للامتصاص 4-0 حول عضلة جدار البطن المقطوعة. مرر اللباد القريب للقسطرة داخل الشق.
  2. شد خياطة خيط المحفظة المحضرة حول الأنبوب مع الحفاظ على اللباد الثاني خارج خيط المحفظة ، فوق الطبقة العضلية (الشكل 3D) ، وأغلق الجلد بخيوط قابلة للامتصاص 3-0 (الشكل 2).

10. مراقبة الحيوانات بعد الجراحة ويوميا ، وإدارة التسكين والسوائل بعد العملية الجراحية ، والاحتفاظ بسجلات يومية بعد الجراحة لمدة لا تقل عن 7 أيام وحتى الشفاء التام

  1. حافظ على عمل القسطرة بحقنة يومية تبلغ 200 ميكرولتر من المحلول الملحي العادي من خلال القسطرة.

11. حقن السوائل

  1. تأكد من عملية ما بعد الإجراء الهادئة عن طريق فحص شق الجلد بعناية.
  2. تحضير LPS 2 ملغم / كغم من وزن الجسم للحقن داخل الصفاق (i.p.) عن طريق تخفيف 40 ميكروغرام من LPS مع محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) إلى تركيز عمل قدره 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر (في جوهره ، 10 ميكرولتر ل 2 ميكروغرام / غرام من وزن الجسم و 200 ميكرولتر من LPS ل 20 غرام من الفئران).
  3. ابدأ الحقن في الأسبوع الثاني بعد زرع القسطرة.
    1. أمسك الحيوان برفق باليد غير المهيمنة وقم بتقييد منفذ التقطير أثناء تحريك السبابة والإبهام في اتجاه الرأس.
    2. تطهير الجلد الذي يغطي الخزان مع 70 ٪ من كحول الأيزوبروبيل. استخدم المحقنة المرفقة بإبرة هوبر لحقن LPS.
      1. بعد دخول الميناء بإبرة هوبر ، قم بحقن 100 ميكرولتر من المحلول الملحي العادي في المنفذ لتأكيد مسار براءة الاختراع.
      2. قم بحقن 200 ميكرولتر من LPS المحضرة ، متبوعة ب 100 ميكرولتر من المحلول الملحي العادي للري الأنبوبي ، وتأكد من عدم وجود مقاومة.

12. تخدير الفئران قبل حصاد الصفاق وجمع السائل البريتوني

  1. بعد 7 أيام من حقن LPS و 2 أسابيع من زرع القسطرة ، خطط للخزعة البريتونية.
  2. خطة للتخدير العام.
    1. تخدير الفأر في غرفة إيزوفلوران وحقن المسكن تحت الجلد.
    2. امسك الحيوان من قاعدة الذيل ، واحتفظ بالحيوان على السطح الظهري لليد.
    3. نقل الحيوان إلى غرفة تحريض التخدير المستمر مليئة 3٪ -4٪ إيزوفلوران. تأكد من التخدير العام الكافي من خلال عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم في الأطراف الخلفية اليمنى واليسرى. الحفاظ على الحفاظ على التخدير العام مع إيزوفلوران 1٪ -3٪.

13. خزعة البريتوني

  1. ضع الحيوان على البطانية الساخنة في وضع ضعيف. قم بعمل شق جلدي في خط الوسط من شبه الخنجري إلى المثانة.
  2. قم بتزويد الطائرة تحت اللفافة مع PBS البارد (الشكل 3E).
  3. تأكد من تشريح الطائرة بالكامل دون الإخلال بسلامة الصفاق. ابدأ في تشريح الصفاق من الانعكاس البريتوني الجانبي في الربع السفلي الأيسر ، بدءا من الهيلوم إلى الجناح الأيسر ، والمثانة في الجانب السفلي للحفاظ على اتساق العينات بين الحيوانات (الشكل 3F).
  4. بعد الحصاد البريتوني ، القتل الرحيم للحيوان عن طريق خلع عنق الرحم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كانت جميع القسطرة المزروعة تعمل حتى نهاية الدراسة ، ولم يؤدي إزاحة القسطرة أو التواءها إلى تعقيد أي من القسطرة المزروعة. تم التحقق من صحة التقنية الحالية المعدلة بشكل أكبر باستخدام نموذج ناتج عن التهاب الصفاق باستخدام LPS. تلقت الفئران الضابطة 200 ميكرولتر من الحقن الملحي العادي اليومي ، بينما تم حقن الفئران التجريبية ب 200 ميكرولتر من LPS ، كما تمت مناقشته في بروتوكول الخطوة 11 ، لمدة 7 أيام بعد زرع القسطرة.

تم تقييم الغشاء البريتوني للخصائص النسيجية المرضية بواسطة تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) وماسون تريكروم. أظهر تحليل المقاطع الملطخة ب H& E زيادة كبيرة في المصفوفة خارج الخلية (ECM) في الفضاء تحت الصفاق (الشكل 4A ، المميز بعلامة النجمة) ، والتي تم قياسها باستخدام ImageJ. كان متوسط + SD ل ECM في الفضاء تحت الصفاق للفئران الضابطة 87.10 + 24.66 ميكرومتر وتضاعف في الفئران المعرضة ل LPS (148.9 + 60.85 ميكرومتر ، P = 0.008) (الشكل 4B).

تكتشف صبغة ثلاثية الألوان التليف (البقعة الزرقاء في الشكل 5 والشكل 6) ، والتي تم تقديرها على أنها كثافة شدة طبيعية لمساحة السطح (ميكرومتر). تدمج كثافة الكثافة عدد وحدات البكسل وكثافتها في منطقة الاهتمام وهي طريقة تم التحقق من صحتها للميزات النسيجية الكمية ذات الأهمية19,20.

بعد ذلك ، افترضنا أن الالتهاب الناجم عن LPS قد يؤدي إلى تغيير الأوعية الدموية وتوسيع المساحة تحت الصفاق. تم استخدام CD31 كعلامة للخلايا البطانية (الشكل 7) وتم قياسه كميا ككثافة متكاملة في صور المجال عالي الطاقة (HPF) المختارة عشوائيا في كل فأر في كلا المجموعتين (الشكل 8B ، C). أظهرت الفئران التي يسببها LPS زيادة بمقدار ثلاثة أضعاف في التليف تحت الصفاق (الشكل 8A ، P = 0.015). كل هذه التغيرات في الغشاء البريتوني تتفق مع تلك التي لوحظت في المرضى المعرضين لغسيل الكلى على المدى الطويل21. أظهرت النتائج زيادة ~ 8-9 أضعاف في الأوعية الدموية (P = 0.0168) (الشكل 7 والشكل 8B) وزيادة ~ 2 أضعاف في الفضاء تحت الصفاقي الذي تم تمييزه على أنه SP (P = 0.008) (الشكل 7 والشكل 8C). تتوافق هذه النتائج مع الأوعية الدموية الجديدة التي لوحظت في المرضى الذين يعانون من مرض باركنسون بعد التعرض طويل الأمد للغشاء البريتوني لغسيل الكلى18،22،23.

Figure 1
الشكل 1: قسطرة PD والفتحة الجانبية المخصصة. اختصار: PD = غسيل الكلى البريتوني. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: الطرق التقليدية مقابل الطرق المعدلة. تبدأ الطريقة التقليدية لوضع قسطرة PD (يمين) بتأمين الحلقة الداخلية في الصفاق الجداري ، بينما في هذه الطريقة الرجعية المعدلة (يسار) ، يبدأ الإجراء بخياطة منفذ الوصول المخصص فوق السرير العضلي على ظهر الفئران. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: إدخال القسطرة البريتونية. (أ) تمرير خياطة 3.0 من الفتحة الجانبية المخصصة وخياطة السرير العضلي إلى الفتحة الجانبية ، والحفاظ على مسار الأنبوب cephalad. (ب) اصنع نفق أنبوب PD مع تشريح دقيق للطبقة العضلية من الجلد المغطي وتمرير الأنبوب بطريقة رجعية. (ج) أغلق شقوق الجلد حول خزان الميناء. (د) شد خياطة خيط المحفظة المعدة حول الأنبوب مع إبقاء اللباد الثاني خارج خيط المحفظة ، فوق الطبقة العضلية. (ه) ري التجويف البريتوني ب 2 مل من PBS البارد مع الحفاظ على شطبة الإبرة. (و) ابدأ في تشريح الصفاق من الانعكاس البريتوني الجانبي في الربع السفلي الأيسر (السهم الأزرق). الاختصارات: PD = غسيل الكلى البريتوني. PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: تلطيخ H&E. صور تمثيلية (100x) للأغشية البريتونية لفأرين فرديين C57BL6 تعرضا ل LPS في المجموعة التجريبية كما هو موضح (N = 4 / مجموعة). يشير رأس السهم الأسود إلى الصفاق ، وتصور العلامة النجمية الفضاء تحت الصفاق. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: H&E = الهيماتوكسيلين ويوزين. م = العضلات. LPS = عديد السكاريد الدهني. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: تلطيخ H&E وماسون تريكروم. صور تمثيلية (100x) للأغشية البريتونية لفئران C57BL6 ، أحدهما في المجموعة الضابطة (A) والآخر معرض ل LPS في المجموعة التجريبية (B). قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: SP = الفضاء تحت الصفاق ؛ P = الفضاء البريتوني ؛ م = العضلات. H&E = الهيماتوكسيلين ويوزين. LPS = عديد السكاريد الدهني. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 6
الشكل 6: تلطيخ ماسون تريكروم. صور تمثيلية (100x) للأغشية البريتونية لفئران C57BL6 ، أحدهما معرض ل LPS والآخر عنصر تحكم محقون بالمحلول الملحي. يشير رأس السهم الأسود إلى الصفاق ، وتصور العلامة النجمية البرتقالية الفضاء تحت الصفاق ، N = 4 / مجموعة. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: M = العضلات. LPS = عديد السكاريد الدهني. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 7
الشكل 7: تغير الأوعية الدموية في الفضاء تحت الصفاقي في سياق الالتهاب. كانت المقاطع المدمجة بالبارافين ملطخة ب CD31 و DAPI. يتم عرض صور عشوائية تم الحصول عليها بتكبير 400x. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: SP= الفضاء تحت البريتوني؛ P = الفضاء البريتوني ؛ علامة النجمة البيضاء = وعاء تحت الصفاق ؛ DAPI = 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 8
الشكل 8: أدى التعرض ل LPS إلى تعزيز الأوعية الدموية الجديدة والتليف في الصفاق وتوسيع الفضاء تحت الصفاق. أ: الكثافة المتكاملة للتليف. (ب) الكثافة المتكاملة ل CD31. (ج) تم قياس الفضاء تحت الصفاق. تم إجراء اختبار t للطالب لجميع التدابير. تصور العلامات النجمية السوداء مستوى الأهمية. أشرطة الخطأ = SEM. اختصار: LPS = عديد السكاريد الدهني. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي S1: الأدوات الجراحية اللازمة لإجراء العملية. 1. الأذن تاغر ، 2. منفذ الماوس دقيقة ، 3. إبرة نقطة هوبر ، 4. خياطة قابلة للامتصاص المتأخر ، 5. المشبك الزاوية اليمنى ، 6. ملقط طرف مستقيم ، 7. ملقط منحني الطرف ، 8. مقص القزحية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم وصف ثلاثة نماذج الفئران من PD. يتضمن ذلك ثقبا أعمى للسطح البريتوني ، ونظام مفتوح دائم ، ونظام مغلق10. يتضمن الثقب الأعمى للسطح البريتوني وصولا بريتوني مباشرا مشابها للحقن داخل الصفاق ولكنه لا يسمح بتصريف الديالة. كونها إجراء أعمى ، يمكن لهذه الطريقة أن تجرح الأعضاء الحشوية في البطن. يحافظ نموذج النظام المفتوح الدائم على قسطرة غسيل الكلى ومنفذ التقطير خارج الجسم. ومع ذلك ، ترتبط هذه التقنية في الفئران بمضاعفات ، مثل الأكياس المنفصلة بسبب حركة الحيوانات ، والعدوى ، وعدم القدرة على إجراء تجارب طويلة الأجل. تم إدخال القسطرة البريتونية ذات النظام المغلق في عام 2009. في هذا النظام ، يتم زرع كل من منفذ الوصول والأنبوب في أجسام الحيوانات. يصبح تقطير السوائل المباشر عن طريق الجلد ممكنا. في البشر ، يتم وضع أكياس الديالة البريتوني خارج الجسم ، ولكن هذا غير ممكن في الفئران بسبب حركتها. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يكون هناك انسداد ميكانيكي للقسطرة المرتبطة بانسداد الثقوب الجانبية وثني الأنبوب20. الخزان في نظام مغلق متحرك ويمكن أن ينقلب ، ويمكن لهذا الحدث أن يشبك تقاطع أنبوب الخزان.

تم تطبيق العديد من الأساليب للتغلب على القيود المذكورة أعلاه لأنظمة PD المغلقة ، بما في ذلك استئصال الثرب وتسريب الهيبارين لمنع انسداد قسطرة PD. على الرغم من أن هذه الحلول قد تكون مفيدة في الدراسات قصيرة المدى ، إلا أن التحديات التي تواجه إنقاذ القسطرة لإجراء تجارب أطول في نماذج الفئران لا تزال قائمة. علاوة على ذلك ، فإن الثرب في الفئران صغير ، على عكس البشر ، مما يفسر عدم نجاح استئصال الثرب لإنقاذ أداء القسطرة البريتونية في الفئران24,25.

في هذه الدراسة ، تم تطبيق خطوتين حاسمتين على نظام قسطرة PD المغلق لتحسين قيود التقنيات الحالية. وشملت هذه (أ) ثقب ثقب جانبي في القسطرة و (ب) أنبوب رجعي يمر عبر نفق مسبق الصنع. (الشكل 3 ب) ساعد ثقب جانبي في منفذ التقطير في تثبيت القسطرة بشكل آمن على السرير العضلي وتوفير الحركة أثناء الحقن. أثناء معالجة القيود المذكورة أعلاه ، قلل هذا التعديل من شد الأنبوب وإجهاد جلد الفئران.

تقليديا ، يذهب طرف قسطرة PD إلى التجويف البريتوني أولا في وقت الزرع (زرع antigrade). قدمنا نهج الزرع الرجعي حيث تم تثبيت منفذ التقطير على الجلد أولا ، ثم تم وضع القسطرة في التجويف البريتوني. نظرا لأن زرع القسطرة يتبع وضع الخزان ، فإنه يعتبر زرع قسطرة رجعية. أدت طريقة الزرع هذه إلى مسار مستقيم للأنبوب ولف الأنبوب الملغى.

يمكن أن يكون الحد المحتمل لهذه التقنية هو إجهاد جلد الفئران من الخياطة. يتم التأكيد على أهمية التقنية المعدلة من خلال حقيقة أن هذه التعديلات المقترحة تمنع هجرة القسطرة وسحب الأنبوب. يسمح بتقطير دقيق لسائل PD أثناء استيقاظ الماوس. الحد من المشاكل المذكورة أعلاه يسمح بإجراء تجارب طويلة الأجل ويتجنب الفشل ، وبالتالي يحول دون استخدام عدد كبير من الفئران. بالإضافة إلى التطبيق في أبحاث PD ، يمكن الاستفادة من هذه التعديلات في سياقات أخرى مثل نماذج سرطان المبيض أو السرطان البريتوني أو التهاب الصفاق المزمن لتقديم عوامل تجريبية بدقة.

تم اختيار حقن LPS للتحقق من صحة طريقة الزرع المعدلة هذه. كانت النتائج متسقة مع تلك التي لوحظت استجابة ل icodextrin وسائل غسيل الكلى البريتوني القائم على الجلوكوز26. علاوة على ذلك ، فإن استخدام LPS مهم سريريا لأن التهاب الصفاق PD في البشر يمكن أن يكون من البكتيريا سالبة الجرام وكثيرا ما يتم ملاحظته في وضع التهاب الرتج أو ثقب اللزج. تفرز البكتيريا سالبة الجرام LPS المساهمة في التهاب الصفاق وهي نموذج تجريبي مقبول لالتهاب الصفاق26,27. تشمل السمات المرضية لفشل PD في البشر التليف البريتوني وزيادة في الأوعية الدموية الدقيقة تحت الصفاق ، مما يؤدي إلى فقدان تدرج المذاب البريتوني في مرضى PD27،28،29. تم تلخيص هذه الميزات في نموذج التهاب الصفاق الناجم عن LPS. ستدرس الدراسات المستقبلية هذه التقنية في النماذج التي سيتم فيها تطبيق سائل غسيل الكلى البريتوني لمدة 1 شهر على الأقل في الفئران للحث على التليف البريتوني. ستمكن هذه الدراسة طويلة الأجل أيضا من متابعة المضاعفات ، بما في ذلك لف قسطرة PD.

في الختام ، تم تعديل زرع القسطرة البريتونية التقليدية ذات النظام المغلق في نموذج الفئران في الدراسة الحالية. قد تمهد التعديلات الحالية الطريق لتوليد نماذج الفئران القوية والموثوقة للتحقيق في العواقب طويلة المدى لفشل الغشاء البريتوني في مرضى ESKD من البشر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل NIH 1R01HL132325 و R21 DK119740-01 (VCC) و AHA لأمراض القلب والأورام SFRN CAT-HD CENTER GRANT 857078 (VCC و SL).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% heparin  Canada Inc., Boucherville, QC, Canada) Pharmaceutical product
     Buprenorphine 0.3 mg/mL      PAR Pharmaceutical            NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice The Jackson Lab IMSR_JAX:000664
CD31 Abcam Ab9498
            Clamp      Fine Science Tools                13002-10
            Forceps      Fine Science Tools                11002-12
Dumont #5SF Forceps Fine Science Tools 11252-00
Dumont Vessel Cannulation Forceps Fine Science Tools 11282-11
Fine Scissors - Large Loops Fine Science Tools 14040-10
Fisherbrand Animal Ear-Punch Fisher Scientific 13-812-201
Hill Hemostat Fine Science Tools 13111-12
Huber point needle  Access  technologies  PG25-500 Needle for injections
            Isoflurane, USP             Covetrus             NDC 11695-6777-2
       Lipopolysaccharide from E.coli             SIGMA               L4391
Microscope Nikon Eclipse Inverted Microscope TE2000
Minute Mouse Port 4French with retention beads and cross holes     Access  technologies         MMP-4S-061108A
 Posi-Grip Huber point needles 25 G x 1/2´´    Access  technologies                PG25-500
            Scissors      Fine Science Tools                14079-10
Vicryl Suture AD-Surgical #L-G330R24

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saran, R., et al. US Renal Data System 2019 Annual Data Report: Epidemiology of Kidney Disease in the United States. American Journal of Kidney Diseases. 75, 1 Suppl 1 6-7 (2020).
  2. ESRD, U.S.R.D.S.M. 2017 USRDS Annual Data Report: Epidemiology of Kidney Disease in the United States, Bethesda, MD, National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases. USRD. , (2017).
  3. Center of Disease Control, U.S.D.o.H.a.H.S. Chronic Kidney Disease in the United States, 2019. CDC Publications and Resources. , (2019).
  4. Cho, Y., et al. Peritoneal dialysis use and practice patterns: An international survey study. American Journal of Kidney Diseases. 77 (3), 315-325 (2021).
  5. Xieyi, G., Xiaohong, T., Xiaofang, W., Zi, L. Urgent-start peritoneal dialysis in chronic kidney disease patients: A systematic review and meta-analysis compared with planned peritoneal dialysis and with urgent-start hemodialysis. Peritoneal Dialysis International. 41 (2), 179-193 (2021).
  6. Gokal, R., Figueras, M., Olle, A., Rovira, J., Badia, X. Outcomes in peritoneal dialysis and haemodialysis--a comparative assessment of survival and quality of life. Nephrology Dialysis Transplantation. 14, Suppl 6 24-30 (1999).
  7. Gardezi, A. I., Sequeira, A., Narayan, R. Going home: Access for home modalities. Advances in Chronic Kidney Disease. 27 (3), 253-262 (2020).
  8. van de Luijtgaarden, M. W., et al. Trends in dialysis modality choice and related patient survival in the ERA-EDTA Registry over a 20-year period. Nephrology Dialysis Transplantation. 31 (1), 120-128 (2016).
  9. Schaefer, F., Warady, B. A. Peritoneal dialysis in children with end-stage renal disease. Nature Reviews. Nephrology. 7 (11), 659-668 (2011).
  10. Gonzalez-Mateo, G. T., Pascual-Anton, L., Sandoval, P., Aguilera Peralta, A., Lopez-Cabrera, M. Surgical techniques for catheter placement and 5/6 nephrectomy in murine Models of Peritoneal Dialysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e56746 (2018).
  11. Chow, K. M., et al. Straight versus coiled peritoneal dialysis catheters: A randomized controlled trial. American Journal of Kidney Diseases. 75 (1), 39-44 (2020).
  12. LaPlant, M. B., et al. Peritoneal dialysis catheter placement, outcomes and complications. Pediatric Surgery International. 34 (11), 1239-1244 (2018).
  13. Al-Hwiesh, A. K. A modified peritoneal dialysis catheter with a new technique: Farewell to catheter migration. Saudi Journal of Kidney Diseases and Transplantation. 27 (2), 281-289 (2016).
  14. Crabtree, J. H., Chow, K. M. Peritoneal dialysis catheter insertion. Seminars Nephrology. 37 (1), 17-29 (2017).
  15. Flessner, M. F., et al. Peritoneal changes after exposure to sterile solutions by catheter. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (8), 2294-2302 (2007).
  16. Kowalewska, P. M., Margetts, P. J., Fox-Robichaud, A. E. Peritoneal dialysis catheter increases leukocyte recruitment in the mouse parietal peritoneum microcirculation and causes Fibrosis. Peritonial Dialysis International: Journal of the International Society for Peritonial Dialysis. 36 (1), 7-15 (2016).
  17. Kowalewska, P. M., Patrick, A. L., Fox-Robichaud, A. E. Syndecan-1 in the mouse parietal peritoneum microcirculation in inflammation. PLoS One. 9 (9), 104537 (2014).
  18. Yanez-Mo, M., et al. Peritoneal dialysis and epithelial-to-mesenchymal transition of mesothelial cells. The New England Journal of Medicine. 348 (5), 403-413 (2003).
  19. Arinze, N. V., et al. Tryptophan metabolites suppress Wnt pathway and promote adverse limb events in CKD patients. The Journal of Clinical Investigation. 132 (1), (2021).
  20. Belghasem, M., et al. Metabolites in a mouse cancer model enhance venous thrombogenicity through the aryl hydrocarbon receptor-tissue factor axis. Blood. 134 (26), 2399-2413 (2019).
  21. Krediet, R. T. The peritoneal membrane in chronic peritoneal dialysis. Kidney International. 55 (1), 341-356 (1999).
  22. Gonzalez-Mateo, G. T., et al. Chronic exposure of mouse peritoneum to peritoneal dialysis fluid: structural and functional alterations of the peritoneal membrane. Peritonial Dialysis International: Journal of the International Society for Peritonial Dialysis. 29 (2), 227-230 (2009).
  23. Sukul, N., et al. Patient-reported advantages and disadvantages of peritoneal dialysis: results from the PDOPPS. BMC Nephrology. 20 (1), 116 (2019).
  24. Lu, Y., et al. A method for islet transplantation to the omentum in mouse. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e57160 (2019).
  25. Gotloib, L., Wajsbrot, V., Shostak, A. A short review of experimental peritoneal sclerosis: from mice to men. The International Journal of Artificial Organs. 28 (2), 97-104 (2005).
  26. Tateda, K., Matsumoto, T., Miyazaki, S., Yamaguchi, K. Lipopolysaccharide-induced lethality and cytokine production in aged mice. Infection and Immunity. 64 (3), 769-774 (1996).
  27. Vila Cuenca, M., et al. Differences in peritoneal response after exposure to low-GDP bicarbonate/lactate-buffered dialysis solution compared to conventional dialysis solution in a uremic mouse model. International Urology and Nephrology. 50 (6), 1151-1161 (2018).
  28. Penar, J., et al. Selected indices of peritoneal fibrosis in patients undergoing peritoneal dialysis. Postepy Higieny Medycyny Doswiadczalnej (Online). 63, 200-204 (2009).
  29. Yung, S., Chan, T. M. Pathophysiological changes to the peritoneal membrane during PD-related peritonitis: the role of mesothelial cells. Mediators of Inflammation. 2012, 484167 (2012).

Tags

الطب ، العدد 185 ، القسطرة البريتونية ، الجيب ، المورين ، غسيل الكلى البريتوني ، عديد السكاريد الدهني ، الصفاق

Erratum

Formal Correction: Erratum: A Retrograde Implantation Approach for Peritoneal Dialysis Catheter Placement in Mice
Posted by JoVE Editors on 03/22/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: A Retrograde Implantation Approach for Peritoneal Dialysis Catheter Placement in Mice. The Authors section was updated from:

Saran Lotfollahzadeh1
Mengwei Zhang1
Marc Arthur Napoleon1
Wenqing Yin1
Josephine Orrick1
Nagla Elzind1
Austin Morrissey1
Isaac E. Sellinger1
Lauren D. Stern1
Mostafa Belghasem2
Jean M. Francis1
Vipul C. Chitalia1,3,4
1Renal Section, Department of Medicine, Boston University School of Medicine
2Department of Biomedical Science, Kaiser Permanente Bernard J. Tyson School of Medicine
3Veterans Affairs Boston Healthcare System
4Institute of Medical Engineering and Sciences, Massachusetts Institute of Technology

to:

Saran Lotfollahzadeh1
Mengwei Zhang1
Marc Arthur Napoleon1
Wenqing Yin1
Josephine Orrick1
Nagla Elzind1
Austin Morrissey1
Isaac E. Sellinger1
Lauren D. Stern1
Mostafa Belghasem2
Jean M. Francis1
Vipul C. Chitalia1,3,4
1Renal Section, Department of Medicine, Boston University Aram V. Chobanian & Edward Avedisian School of Medicine
2Department of Biomedical Science, Kaiser Permanente Bernard J. Tyson School of Medicine
3Veterans Affairs Boston Healthcare System
4Institute of Medical Engineering and Sciences, Massachusetts Institute of Technology

نهج الزرع الرجعي لوضع قسطرة غسيل الكلى البريتوني في الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lotfollahzadeh, S., Zhang, M.,… More

Lotfollahzadeh, S., Zhang, M., Napoleon, M. A., Yin, W., Orrick, J., Elzind, N., Morrissey, A., Sellinger, I. E., Stern, L. D., Belghasem, M., Francis, J. M., Chitalia, V. C. A Retrograde Implantation Approach for Peritoneal Dialysis Catheter Placement in Mice. J. Vis. Exp. (185), e63689, doi:10.3791/63689 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter