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Summary
Questo articolo descrive le modifiche di una procedura per impiantare un catetere per dialisi peritoneale in un modello murino per evitare importanti problemi tecnici osservati con le tecniche convenzionali.
Abstract
I modelli murini sono impiegati per sondare vari aspetti della dialisi peritoneale (PD), come l'infiammazione peritoneale e la fibrosi. Questi eventi guidano l'insufficienza della membrana peritoneale negli esseri umani, che rimane un'area di intensa indagine a causa delle sue profonde implicazioni cliniche nella gestione dei pazienti con malattia renale allo stadio terminale (ESKD). Nonostante l'importanza clinica del PD e delle sue complicanze correlate, gli attuali modelli murini sperimentali soffrono di sfide tecniche chiave che compromettono le prestazioni dei modelli. Questi includono la migrazione e l'attorcigliamento del catetere PD e di solito giustificano la rimozione anticipata del catetere. Queste limitazioni determinano anche la necessità di un numero maggiore di animali per completare uno studio. Affrontando questi inconvenienti, questo studio introduce miglioramenti tecnici e sfumature chirurgiche per prevenire le complicanze comunemente osservate del catetere PD in un modello murino. Inoltre, questo modello modificato è convalidato inducendo infiammazione peritoneale e fibrosi utilizzando iniezioni di lipopolisaccaridi. In sostanza, questo articolo descrive un metodo migliorato per creare un modello sperimentale di PD.
Introduction
Carico di malattia renale allo stadio terminale
La malattia renale cronica (CKD) è un problema di salute mondiale1. Le stime attuali suggeriscono che più di 850 milioni di persone in tutto il mondo hanno malattie renali. La prevalenza delle malattie renali quasi raddoppia il numero di persone con diabete (422 milioni) ed è più di 20 volte la prevalenza di cancro (42 milioni) o HIV / AIDS (36,7 milioni) pazienti in tutto il mondo2. Circa uno su sette americani hanno CKD e due su 1.000 americani hanno ESKD che richiedono un trapianto di rene o supporto per dialisi3. Considerando il crescente onere dell'ESKD in tutto il mondo, l'ottimizzazione della tecnologia di dialisi è fondamentale3.
Dialisi peritoneale
Il PD è una modalità significativamente sottoutilizzata per il trattamento della ESKD negli Stati Uniti. Secondo lo United States Renal Data System (USRDS), la percentuale di pazienti PD prevalenti era solo dell'11% nel 2020 4,5. Il PD conferisce diversi vantaggi rispetto all'emodialisi in centro (HD), tra cui una migliore qualità della vita, meno visite cliniche e una diminuzione delle spese Medicare 6,7. Inoltre, il PD è una terapia domiciliare ed è associato a un rischio molto più basso di infezioni gravi come batteriemia ed endocardite che sono spesso correlate ai cateteri per emodialisi. Inoltre, la malattia di Parkinson può essere iniziata rapidamente con un protocollo di avvio urgente, riducendo la necessità di iniziare la dialisi con cateteri vascolari permanenti8. Il PD è considerato il metodo preferito di dialisi nella popolazione pediatrica ESKD9.
Compromissione peritoneale indotta dalla dialisi peritoneale
Il PD comporta l'introduzione di liquido PD (dializzato) nel peritoneo, che provoca infiammazione e rimodellamento della membrana peritoneale nel tempo. L'infiammazione peritoneale innesca la fibrosi, culminando nella potenziale perdita di capacità di ultrafiltrazione della membrana nel tempo. La conservazione della membrana peritoneale è una sfida significativa nel PD e ulteriori ricerche sono di fondamentale importanza per garantire che le migliori pratiche cliniche siano disponibili per i professionisti. Esistono modelli murini ben consolidati per aiutare ulteriormente la comprensione dei meccanismi fisiopatologici di infezione e infiammazione peritoneale, soluto, cinetica di trasporto dell'acqua e insufficienza di membrana; Tuttavia, i problemi tecnici con il catetere spesso limitano questi modelli10.
Analisi dei cambiamenti della membrana peritoneale
Nei pazienti con ESKD, il dializzato viene tradizionalmente introdotto nella cavità peritoneale attraverso un catetere Tenkhoff con bracciale profondo e superficiale. I pazienti possono potenzialmente manifestare complicanze correlate al catetere, tra cui migrazione del catetere, dolore da infusione e scarso drenaggio del dializzato11,12,13. Sono stati introdotti due tipi principali di cateteri peritoneali per l'uomo, arrotolati o dritti, per ridurre al minimo queste complicanze12. Diverse modifiche, tra cui un bracciale extra ai cateteri convenzionali a due cuffi, sono state aggiunte ai cateteri originali per prolungare la sopravvivenza del catetere PD11. La tecnica di inserimento varia in base a diversi fattori impedendo la migrazione del catetere da aggiungere dopo la sopravvivenza, compresa la disponibilità delle risorse e il livello di competenza14.
Al contrario, i modelli murini di dialisi peritoneale hanno differenze fondamentali nelle tecniche e nello scopo rispetto ai cateteri peritoneali umani. Ad esempio, i cateteri peritoneali nei modelli murini sono utilizzati principalmente per studiare le alterazioni della membrana e sono meno destinati alle funzioni di drenaggio bidirezionale. La tecnica attuale soffre di potenziale spostamento del porto e migrazione del catetere a causa della manipolazione degli animali. Nei modelli murini convenzionali, le porte di accesso non erano fissate alla pelle. Questo aspetto creava una porta di accesso instabile, che negli animali svegli poteva essere spostata, con conseguente migrazione del catetere. Data l'importanza dei modelli murini nella ricerca sulla membrana peritoneale, è imperativo creare tecniche chirurgiche efficaci per generare modelli affidabili. Pertanto, abbiamo deciso di ottimizzare il modello convenzionale di posizionamento del catetere PD. È importante notare che il catetere stesso provoca alterazioni istopatologiche nella membrana peritoneale e, quindi, qualsiasi conclusione riguardante l'effetto delle soluzioni PD negli studi sugli animali deve essere interpretata nel contesto del catetere PD come un corpo estraneo15,16,17.
Istopatologia della membrana peritoneale
Il fallimento della malattia di Parkinson è principalmente correlato alla fibrosi e all'eccesso di angiogenesi con conseguente perdita di un gradiente di concentrazione osmolare. Inoltre, la capacità di filtrazione della membrana peritoneale potrebbe essere influenzata dalla peritonite. Inoltre, la peritonite infettiva è una causa ben consolidata di cambiamento nella modalità di dialisi dalla dialisi peritoneale all'emodialisi. 18.
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Protocol
Per questo studio, sono stati utilizzati otto topi femmina C57BL / 6J, 8-12 settimane di età e un peso medio di 20 g. I topi sono stati alloggiati in condizioni standard e sono stati nutriti con chow e acqua ad libitum. Questo studio è stato eseguito con l'approvazione dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), Boston University Medical Center (AN-1549). Le procedure qui descritte sono state eseguite in condizioni sterili.
1. Anestetizzare il topo in una camera di isoflurano e iniettare l'analgesico per via sottocutanea
- Tieni l'animale dalla base della coda. Tenere l'animale sulla superficie dorsale della mano non dominante.
- Trasferire l'animale nella camera di induzione anestetica continua riempita con isoflurano al 3% -4%. Confermare un'adeguata anestesia generale dall'assenza del riflesso del pizzico degli arti posteriori destro e sinistro. Mantenere il mantenimento dell'anestesia generale con Isoflurano 1% -3%.
- Applicare unguento oftalmico su entrambi gli occhi.
- Somministrare un'iniezione sottocutanea di buprenorfina.
- Sciogliere lo stock di buprenorfina ad una concentrazione di 0,3 mg/ml in cloruro di sodio (NaCl) 0,9% per raggiungere la concentrazione finale di 0,03 mg/ml.
- Iniettare un dosaggio di 0,05-0,1 mg/kg di 0,03 mg/mL di buprenorfina, insieme a 500 μL di NaCl sterile 0,9%, 20 minuti prima dell'intervento chirurgico in un topo da 20 g (2 μg o 66 μL di 0,03 mg/ml di buprenorfina per topo).
2. Preparazione della pelle
- Posizionare il topo completamente anestetizzato in posizione laterale sinistra, esponendo il fianco destro alla coperta riscaldante. Rasare il lato destro dell'addome, appena vicino alla linea mediana dell'area paraspinale e giù fino alla coda dell'animale.
- Disinfettare l'area rasata tre volte usando un batuffolo di cotone con l'applicazione alternata della soluzione antisettica o dello scrub e alcool al 70% o soluzione salina sterile con un movimento circolare, iniziando dal sito di incisione chirurgica e spostandosi verso l'esterno. Eliminare il batuffolo di cotone dopo ogni utilizzo. Fare attenzione a non bagnare eccessivamente le aree non chirurgiche dell'animale con alcol o antisettico in quanto ciò può peggiorare l'ipotermia.
NOTA: È importante diluire correttamente le soluzioni antisettiche e non lasciare scrub chirurgici sulla pelle durante l'intervento chirurgico, poiché possono essere irritanti e devono essere risciacquati. Controllare frequentemente la temperatura della coperta riscaldante durante la procedura per assicurarsi che la temperatura non diminuisca.
3. Misurare la lunghezza del catetere e contrassegnare il punto di inserimento all'interno dell'addome e del tubo sopra la pelle preparata
- Assegnare la tasca della porta di accesso 1 cm sopra la coda dell'animale. Tenere il segmento di installazione con l'indice non dominante e il dito del pollice sull'area assegnata vicino alla coda.
- Posizionare il catetere sopra la pelle e stimare il luogo per l'inserimento del tubo del catetere all'interno della cavità addominale. Segnare il punto assegnato per l'inserimento del tubo, rispettando la flessione minima del tubo vicino alla linea mediana anteriore.
NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite con guanti sterili e il catetere deve essere mantenuto sterile durante la misurazione. Gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati in autoclave a 121 °C prima dell'uso. Fare riferimento alla figura supplementare S1 per gli strumenti necessari per la procedura.
4. Personalizzare la sezione del serbatoio del catetere peritoneale
- Perforare un foro laterale sul telaio della sezione del serbatoio con il targhiere auricolare del mouse (Figura 1 e Figura 2). Va notato che il pugno all'orecchio è uno strumento chirurgico e deve essere sterile.
5. Posizionare la porta di instillazione
- Fai un'incisione cutanea orizzontale larga 1 cm 1 cm sopra la coda. Sezionare bruscamente il piano sottocutaneo dallo strato muscolare sottostante per creare una sacca per il posizionamento del catetere per garantire che la porta di instillazione risieda liberamente nella tasca ideale della porta.
- Tenere la punta delle forbici del diaframma verso la linea mediana per creare un tunnel obliquo per il posizionamento del tubo (Figura 3A).
- Passare la sutura 3.0 dal foro laterale personalizzato. Fissare la porta di accesso al letto muscolare stringendo la sutura passata, mantenendo il tubo cefala.
6. Effettuare l'incisione del sito di inserimento della punta del catetere
- Fare un'incisione di 1 cm sull'area precedentemente contrassegnata vicino alla linea mediana. Confermare il tratto ben sviluppato passando le forbici attraverso il tratto.
- Prelevare delicatamente la punta del catetere con una pinza per posizionare il catetere in un corso retrogrado.
NOTA: Evitare di pizzicare i fori laterali del tubo. - Far passare il tubo del catetere attraverso il tratto preparato (Figura 3B). Fare un'incisione di 1 cm sullo strato muscolare vicino alla linea mediana destra.
7. Confermare il funzionamento del catetere
- Prima di chiudere tutte le incisioni, assicurarsi che il catetere posizionato sia funzionale. Controllare la funzione con una siringa da 1 mL collegata all'ago Huber specifico per la porta.
- Iniettare 200 μL di soluzione salina normale nella porta di instillazione. Cerca un flusso regolare con tolleranza zero per la resistenza.
- Lavare la porta e il catetere con eparina al 10% per mantenere la pervietà.
8. Chiudere le incisioni cutanee
- Chiudere le incisioni cutanee attorno al serbatoio del porto (Figura 3C) con punti di sutura riassorbibili 3-0.
9. Fissare la punta del catetere all'interno della cavità addominale
- Posizionare una sutura sciolta con una sutura assorbibile rotonda 4-0 attorno al muscolo della parete addominale inciso. Passare il feltro prossimale del catetere all'interno dell'incisione.
- Stringere la sutura del cordone della borsa preparata attorno al tubo mantenendo il secondo feltro al di fuori del cordone della borsa, sopra lo strato muscolare (Figura 3D) e chiudere la pelle con punti di sutura riassorbibili 3-0 (Figura 2).
10. Monitorare gli animali postoperatoriamente e quotidianamente, somministrare analgesia e fluidi postoperatori e mantenere i registri postoperatori giornalieri per un minimo di 7 giorni e fino al completo recupero
- Mantenere il catetere funzionante con un'iniezione giornaliera di 200 μL di soluzione salina normale attraverso il catetere.
11. Iniezioni di liquidi
- Confermare il processo post-procedurale senza incidenti ispezionando attentamente l'incisione cutanea.
- Preparare LPS 2 mg/kg di peso corporeo per iniezioni intraperitoneali (i.p.) diluendo 40 μg di LPS con soluzione salina tamponata fosfato sterile (PBS) alla concentrazione di lavoro di 0,2 μg/μL (in sostanza, 10 μL per 2 μg/g di peso corporeo e 200 μL di LPS per 20 g di topi).
- Iniziare le iniezioni nella seconda settimana successiva all'impianto del catetere.
- Tenere delicatamente l'animale con la mano non dominante e trattenere la porta di instillazione mentre si muovono l'indice e il pollice nella direzione del cefalo.
- Disinfettare la pelle sovrastante il serbatoio con alcool isopropilico al 70%. Usi la siringa attaccata all'ago Huber per iniettare l'LPS.
- Dopo essere entrati nella porta con l'ago Huber, iniettare 100 μL di soluzione salina normale nella porta per confermare il corso del brevetto.
- Iniettare i 200 μL di LPS preparati, seguiti dai 100 μL di soluzione salina normale per l'irrigazione del tubo, e assicurarsi che non vi sia resistenza.
12. Anestetizzare i topi prima di raccogliere il peritoneo e raccogliere il liquido peritoneale
- Dopo 7 giorni di iniezioni di LPS e 2 settimane di impianto del catetere, pianificare la biopsia peritoneale.
- Piano per l'anestesia generale.
- Anestetizzare il topo in una camera di isoflurano e iniettare l'analgesico per via sottocutanea.
- Tenere l'animale dalla base della coda e tenere l'animale sulla superficie dorsale della mano.
- Trasferire l'animale nella camera di induzione anestetica continua riempita con isoflurano al 3% -4%. Confermare un'adeguata anestesia generale dall'assenza del riflesso del pizzico degli arti posteriori destro e sinistro. Mantenere il mantenimento dell'anestesia generale con isoflurano 1% -3%.
13. Biopsia peritoneale
- Posizionare l'animale sulla coperta riscaldata in posizione supina. Fare un'incisione cutanea della linea mediana dal sub-xifoide alla vescica.
- Perfondere il piano sottofasciale con PBS freddo (Figura 3E).
- Assicurati che l'aereo sia completamente sezionato senza disturbare l'integrità del peritoneo. Inizia a sezionare il peritoneo dalla riflessione peritoneale laterale nel quadrante inferiore sinistro, a partire dall'ilo al fianco sinistro e dalla vescica nell'aspetto inferiore per mantenere i campioni coerenti tra gli animali (Figura 3F).
- Dopo la raccolta peritoneale, eutanasia l'animale per lussazione cervicale.
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Representative Results
Tutti i cateteri impiantati sono stati funzionanti fino alla fine dello studio e lo spostamento o l'attorcigliamento del catetere non hanno complicato nessuno dei cateteri impiantati. L'attuale tecnica modificata è stata ulteriormente convalidata con un modello indotto dalla peritonite utilizzando LPS. I topi di controllo hanno ricevuto 200 μL di iniezioni saline normali giornaliere, mentre i topi sperimentali sono stati iniettati con 200 μL di LPS, come discusso nella fase 11 del protocollo, per un totale di 7 giorni dopo l'impianto del catetere.
La membrana peritoneale è stata valutata per le caratteristiche istopatologiche mediante ematossilina ed eosina (H & E) e colorazione Masson Trichrome. L'analisi delle sezioni colorate con H & E ha mostrato un sostanziale aumento della matrice extracellulare (ECM) nello spazio sub-peritoneale (Figura 4A, contrassegnata da un asterisco), che è stato misurato utilizzando ImageJ. La media + SD di ECM nello spazio sub-peritoneale dei topi di controllo era 87,10 + 24,66 μm e raddoppiata nei topi esposti a LPS (148,9 + 60,85 μm, P = 0,008) (Figura 4B).
La colorazione tricromica rileva la fibrosi (colorazione blu in Figura 5 e Figura 6), che è stata stimata come densità di intensità normalizzata all'area superficiale (μm). La densità di intensità integra il numero di pixel e la loro intensità in una regione di interesse ed è un metodo validato per le caratteristiche istologiche quantitative di interesse19,20.
Successivamente, abbiamo ipotizzato che l'infiammazione indotta da LPS possa causare un'alterata vascolarizzazione e allargamento dello spazio sub-peritoneale. CD31 è stato utilizzato come marker per le cellule endoteliali (Figura 7) e quantificato come densità integrata in immagini HPF (High-Power Field) selezionate casualmente in ciascun topo in entrambi i gruppi (Figura 8B,C). I topi indotti da LPS hanno mostrato un aumento di tre volte della fibrosi sub-peritoneale (Figura 8A, P = 0,015). Tutte queste alterazioni nella membrana peritoneale sono coerenti con quelle osservate nei pazienti esposti a dializzati a lungo termine21. I risultati hanno mostrato un aumento di ~ 8-9 volte della vascolarizzazione (P = 0,0168) (Figura 7 e Figura 8B) e un aumento di ~ 2 volte nello spazio sub-peritoneale contrassegnato come SP (P = 0,008) (Figura 7 e Figura 8C). Questi risultati sono coerenti con la neovascolarizzazione osservata nei pazienti in PD dopo esposizione a lungo termine alla membrana peritoneale al dializzato 18,22,23.
Figura 1: Catetere PD e foro laterale personalizzato. Abbreviazione: PD = dialisi peritoneale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Metodi convenzionali e metodi modificati. Il metodo anterogrado convenzionale di posizionamento del catetere PD (a destra) inizia con il fissaggio dell'anello interno nel peritoneo parietale, mentre in questo metodo retrogrado modificato (a sinistra), la procedura inizia con la sutura della porta di accesso personalizzata sul letto muscolare sul dorso dei topi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Inserimento del catetere peritoneale. (A) Passare la sutura 3.0 dal foro laterale personalizzato e suturare il letto muscolare al foro laterale, mantenendo il tubo cefala. (B) Fare il tunnel del tubo PD con una meticolosa dissezione dello strato muscolare dalla pelle sovrastante e passare il tubo in modo retrogrado. (C) Chiudere le incisioni cutanee attorno al serbatoio del porto. (D) Stringere la sutura del cordone della borsa preparata attorno al tubo mantenendo il secondo feltro fuori dal cordone della borsa, sopra lo strato muscolare. (E) Irrigare la cavità peritoneale con 2 ml di PBS freddo mantenendo l'ago smussato. (F) Iniziare a sezionare il peritoneo dalla riflessione peritoneale laterale nel quadrante inferiore sinistro (freccia blu). Abbreviazioni: PD = dialisi peritoneale; PBS = soluzione salina tamponata con fosfato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Colorazione H&E. Immagini rappresentative (100x) delle membrane peritoneali di due singoli topi C57BL6 esposti a LPS nel gruppo sperimentale come indicato (N = 4 / gruppo). La punta di freccia nera indica il peritoneo e un asterisco raffigura lo spazio sub-peritoneale. Barre della scala = 100 μm. Abbreviazioni: H&E = ematossilina ed eosina; M = muscolo; LPS = lipopolisaccaride. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Colorazione H&E e Masson Trichrome. Immagini rappresentative (100x) delle membrane peritoneali di due topi C57BL6, uno nel gruppo di controllo (A) e uno esposto a LPS nel gruppo sperimentale (B). Barre della scala = 100 μm. Abbreviazioni: SP = spazio sub-peritoneale; P = spazio peritoneale; M = muscolo; H&E = ematossilina ed eosina; LPS = lipopolisaccaride. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Colorazione Masson Trichrome. Immagini rappresentative (100x) delle membrane peritoneali di due topi C57BL6, uno esposto a LPS e l'altro a controllo iniettato con soluzione salina. La punta della freccia nera indica il peritoneo e l'asterisco arancione raffigura lo spazio sub-peritoneale, N = 4 / gruppo. Barre della scala = 100 μm. Abbreviazioni: M = muscolo; LPS = lipopolisaccaride. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Vascolarizzazione alterata nello spazio sub-peritoneale nel contesto dell'infiammazione. Le sezioni incorporate in paraffina sono state colorate con CD31 e DAPI. Vengono mostrate immagini casuali ottenute con ingrandimento 400x. Barre della scala = 100 μm. Abbreviazioni: SP= spazio sub-peritoneale; P = spazio peritoneale; asterisco bianco = vaso subperitoneale; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: L'esposizione a LPS ha migliorato la neovascolarizzazione, la fibrosi nel peritoneo e l'espansione dello spazio sub-peritoneale . (A) Densità integrata della fibrosi. (B) Densità integrata di CD31. (C) È stato misurato lo spazio sub-peritoneale. Il t-test dello studente è stato eseguito per tutte le misure. Gli asterischi neri rappresentano il livello di significatività. Barre di errore = SEM. Abbreviazione: LPS = lipopolisaccaride. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare S1: Strumenti chirurgici necessari per eseguire la procedura. 1. Ear Tagger, 2. Porta del mouse minuto, 3. Ago puntiforme di Huber, 4. Sutura ritardata-assorbibile, 5. Morsetto ad angolo retto, 6. Pinza a punta dritta, 7. Pinza a punta curva, 8. Forbice Iris. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Sono descritti tre modelli murini di PD. Ciò include una puntura cieca della superficie peritoneale, un sistema aperto-permanente e un sistema chiuso10. La puntura cieca della superficie peritoneale comporta un accesso peritoneale diretto simile alle iniezioni intraperitoneali ma non consente il drenaggio del dializzato. Essendo una procedura in cieco, questo metodo può danneggiare gli organi viscerali addominali. Il modello di sistema aperto-permanente mantiene il catetere di dialisi e la porta di instillazione all'esterno del corpo. Tuttavia, questa tecnica nei topi è associata a complicazioni, come borse scollegate a causa del movimento degli animali, infezioni e incapacità di eseguire esperimenti a lungo termine. I cateteri peritoneali a sistema chiuso sono stati introdotti nel 2009. In questo sistema, sia la porta di accesso che il tubo sono impiantati nei corpi degli animali. L'instillazione diretta di liquidi percutanei diventa fattibile. Nell'uomo, le borse di dializzato peritoneale sono posizionate all'esterno del corpo, ma questo non è possibile nei topi a causa della loro mobilità. Inoltre, c'è spesso un'ostruzione meccanica del catetere correlata all'intasamento dei fori laterali e alla flessione del tubo20. Il serbatoio in un sistema chiuso è mobile e può capovolgersi, e questo evento può attorcigliare la giunzione del tubo del serbatoio.
Sono stati applicati diversi approcci per superare i suddetti limiti dei sistemi PD chiusi, tra cui l'omentectomia e l'infusione di eparina per prevenire l'intasamento del catetere PD. Sebbene queste soluzioni possano essere utili negli studi a breve termine, le sfide per salvare il catetere per esperimenti più lunghi in modelli murini persistono. Inoltre, l'omento nei topi è piccolo, a differenza degli esseri umani, spiegando la mancanza di successo con l'omentectomia per salvare le prestazioni del catetere peritoneale nei topi24,25.
In questo studio, due passaggi critici sono stati applicati al sistema di catetere PD chiuso per migliorare i limiti delle tecniche attuali. Questi includevano (a) perforare un foro laterale nel catetere e (b) un tubo retrogrado che passava attraverso un tunnel prefabbricato. (Figura 3B) La perforazione di un foro laterale nella porta di instillazione ha aiutato a fissare saldamente il catetere al letto muscolare e ha fornito mobilità durante le iniezioni. Pur affrontando le limitazioni di cui sopra, questa modifica ha ridotto la trazione del tubo e lo sforzo della pelle dei topi.
Tradizionalmente, la punta del catetere PD entra nella cavità peritoneale prima al momento dell'impianto (impianto anterogrado). Abbiamo introdotto un approccio di impianto retrogrado in cui la porta di instillazione è stata fissata prima sulla pelle e poi il catetere è stato posizionato nella cavità peritoneale. Poiché l'impianto del catetere ha seguito il posizionamento del serbatoio, è considerato impianto di catetere retrogrado. Questo metodo di impianto ha portato a un corso rettilineo del tubo e all'avvolgimento del tubo abrogato.
Una potenziale limitazione della tecnica può essere lo sforzo della pelle dei topi dalla sutura. L'importanza della tecnica modificata è sottolineata dal fatto che queste modifiche proposte impediscono la migrazione del catetere e la trazione del tubo. Permette un'instillazione precisa del fluido PD mentre il topo è sveglio. La riduzione dei problemi di cui sopra consente esperimenti a lungo termine ed evita fallimenti, precludendo così l'uso di un gran numero di topi. Oltre all'applicazione nella ricerca sulla malattia di Parkinson, queste modifiche possono essere sfruttate in altri contesti come modelli di cancro ovarico, carcinosi peritoneale o peritonite cronica per fornire con precisione agenti sperimentali.
L'iniezione di LPS è stata selezionata per la convalida di questo metodo di impianto modificato. I risultati sono stati coerenti con quelli osservati in risposta all'icodestrina e al liquido di dialisi peritoneale a base di glucosio26. Inoltre, l'uso di LPS è clinicamente rilevante in quanto la peritonite PD nell'uomo può provenire da batteri gram-negativi ed è frequentemente osservata nel contesto della diverticolite o della perforazione del visco. I batteri Gram-negativi secernono LPS che contribuiscono alla peritonite ed è un modello sperimentale accettato di peritonite26,27. Le caratteristiche patologiche del fallimento della malattia di Parkinson nell'uomo includono la fibrosi peritoneale e un aumento della microvascolarizzazione sub-peritoneale, che si traduce nella perdita del gradiente di soluto peritoneale nei pazienti PD27,28,29. Queste caratteristiche sono state ricapitolate nel modello di peritonite indotta da LPS. Studi futuri esamineranno ulteriormente questa tecnica in modelli in cui il liquido di dialisi peritoneale verrà applicato per almeno 1 mese nei topi per indurre la fibrosi peritoneale. Questo studio a lungo termine consentirà anche il follow-up delle complicanze, incluso l'avvolgimento dei cateteri PD.
In conclusione, l'impianto convenzionale di catetere peritoneale a sistema chiuso in un modello murino è stato modificato nel presente studio. Le attuali modifiche potrebbero aprire la strada alla generazione di modelli murini robusti e affidabili per studiare le conseguenze a lungo termine del fallimento della membrana peritoneale nei pazienti umani con ESKD.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da NIH 1R01HL132325 e R21 DK119740-01 (VCC) e AHA Cardio-oncology SFRN CAT-HD Center grant 857078 (VCC e SL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% heparin | Canada Inc., Boucherville, QC, Canada) | Pharmaceutical product | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Lab | IMSR_JAX:000664 | |
| CD31 | Abcam | Ab9498 | |
| Clamp | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Dumont Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Tools | 11282-11 | |
| Fine Scissors - Large Loops | Fine Science Tools | 14040-10 | |
| Fisherbrand Animal Ear-Punch | Fisher Scientific | 13-812-201 | |
| Hill Hemostat | Fine Science Tools | 13111-12 | |
| Huber point needle | Access technologies | PG25-500 | Needle for injections |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| Lipopolysaccharide from E.coli | SIGMA | L4391 | |
| Microscope | Nikon Eclipse Inverted Microscope | TE2000 | |
| Minute Mouse Port 4French with retention beads and cross holes | Access technologies | MMP-4S-061108A | |
| Posi-Grip Huber point needles 25 G x 1/2´´ | Access technologies | PG25-500 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14079-10 | |
| Vicryl Suture | AD-Surgical | #L-G330R24 |
References
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Medicina Numero 185 Catetere peritoneale tasca murina dialisi peritoneale lipopolisaccaride peritoneoErratum
Formal Correction: Erratum: A Retrograde Implantation Approach for Peritoneal Dialysis Catheter Placement in Mice
Posted by JoVE Editors on 03/22/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: A Retrograde Implantation Approach for Peritoneal Dialysis Catheter Placement in Mice. The Authors section was updated from:
Saran Lotfollahzadeh1
Mengwei Zhang1
Marc Arthur Napoleon1
Wenqing Yin1
Josephine Orrick1
Nagla Elzind1
Austin Morrissey1
Isaac E. Sellinger1
Lauren D. Stern1
Mostafa Belghasem2
Jean M. Francis1
Vipul C. Chitalia1,3,4
1Renal Section, Department of Medicine, Boston University School of Medicine
2Department of Biomedical Science, Kaiser Permanente Bernard J. Tyson School of Medicine
3Veterans Affairs Boston Healthcare System
4Institute of Medical Engineering and Sciences, Massachusetts Institute of Technology
to:
Saran Lotfollahzadeh1
Mengwei Zhang1
Marc Arthur Napoleon1
Wenqing Yin1
Josephine Orrick1
Nagla Elzind1
Austin Morrissey1
Isaac E. Sellinger1
Lauren D. Stern1
Mostafa Belghasem2
Jean M. Francis1
Vipul C. Chitalia1,3,4
1Renal Section, Department of Medicine, Boston University Aram V. Chobanian & Edward Avedisian School of Medicine
2Department of Biomedical Science, Kaiser Permanente Bernard J. Tyson School of Medicine
3Veterans Affairs Boston Healthcare System
4Institute of Medical Engineering and Sciences, Massachusetts Institute of Technology
