I denna studie tillhandahåller vi en detaljerad teknik för ett enkelt men robust kortikalt organoidodlingssystem med standardmatarfria hPSC-kulturer. Detta är ett snabbt, effektivt och reproducerbart protokoll för att generera organoider som modellerar aspekter av hjärnans åldrande in vitro.
Hjärnorganoider är tredimensionella modeller av den utvecklande mänskliga hjärnan och ger en övertygande, banbrytande plattform för sjukdomsmodellering och storskalig genomisk och läkemedelsscreening. På grund av den självorganiserande naturen hos celler i hjärnorganoider och det växande utbudet av tillgängliga protokoll för deras generation har problem med heterogenitet och variation mellan organoider identifierats. I detta protokollpapper beskriver vi ett robust och replikerbart protokoll som till stor del övervinner dessa problem och genererar kortikala organoider från neuroektodermala förfäder inom 1 månad, och som kan bibehållas i mer än 1 år. Detta mycket reproducerbara protokoll kan enkelt utföras i ett vanligt vävnadsodlingsrum och resulterar i organoider med en rik mångfald av celltyper som vanligtvis finns i den utvecklande mänskliga cortexen. Trots deras tidiga utvecklingsmakeup kommer neuroner och andra mänskliga hjärncellstyper att börja uppvisa de typiska tecknen på åldrande i neuronala celler efter långvarig in vitro-odling , vilket gör dem till en värdefull och användbar plattform för att studera åldrande-relaterade neuronala processer. Detta protokoll beskriver också en metod för att detektera sådana åldrande celler i kortikala hjärnorganoider med hjälp av åldrande-associerad beta-galaktosidasfärgning.
Vår nuvarande kunskap om den mänskliga hjärnan har till stor del baserats på djurmodeller och obduktion av hjärnprover. Stamcellsbiologi är ett snabbt framåtskridande område som ger nya insikter i den grundläggande biologin för mänsklig hjärnutveckling och de patologiska drivkrafterna för mänskliga hjärnsjukdomar. Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) är ett ovärderligt verktyg för att modellera den mänskliga hjärnan via generering av organoider, organliknande tredimensionell (3D) vävnad som vanligtvis rekapitulerar utvecklingsbanorna, cellulär smink och arkitektur i den utvecklande mänskliga hjärnan. Hjärnorganoider är självmonterade och består av neurala stamceller, specificerade neurala förfäder, mogna neuroner och glialcelltyper. Organoider ger därför en unik möjlighet att studera den tidiga mänskliga hjärnan, som ofta är otillgänglig för direkta experiment men också har inneboende begränsningar som frånvaro av kärl och ett immunsystem.
Metoder för att generera hjärnorganoider har drivits på två olika sätt: ostyrd och guidad differentiering. Ostyrda hjärnorganoidmetoder förlitar sig på den spontana inneboende differentieringskapaciteten hos stamcellerna som driver vävnadsmorfogenes 1,2 och möjliggör framväxten av en mängd olika cellinjeidentiteter som sträcker sig från framhjärna, mellanhjärna och bakhjärna till koroidplexus, näthinna och mesoderm. Däremot kräver styrda hjärnorganoidmetoder betydande användning av externa faktorer för att driva hPSCs mot önskad mönstring av neuronala linjer som representerar en hjärnregiontyp, såsom medial ganglionic eminens3, framhjärna4, midbrain5, hypotalamus6, cerebellum7 och choroid plexus8. Denna förmåga att generera olika hjärnregioner med olika cellinjer, och potentialen att smälta samman dessa efter behag, gör hjärnorganoider till en utmärkt modell för att undersöka mänsklig hjärnutveckling och dechiffrera de underliggande mekanismerna för hjärnrelaterade sjukdomar. Även om dessa metoder för att generera hjärnorganoider erbjuder ett genombrott i modellering av mänskliga hjärnregioner, är variationen och heterogeniteten mellan organoider fortfarande en betydande begränsning för systematiska och kvantitativa studier, såsom läkemedelsscreening.
Det nuvarande protokollet är baserat på en metod som utvecklats i vår senaste artikel9 och involverar selektiv differentiering av hPSC-kolonier mot neuroektoderm (NEct) identitet med dubbla SMAD-hämmare (SB-431542 och LDN 193189), som sedan har förmågan att självorganisera inom 4 dagar till 3D-neuroepitelsfäroider under påverkan av FGF2-signalering. Dessa neuroepitelsfäroider genererar på ett tillförlitligt sätt homogena kortikala organoider med en in vivo-liknande cellulär komposition inom 4 veckor efter differentiering. Protokollet som beskrivs här bygger på våra tidigare resultat som visar att hämning av dubbla SMAD -signalering (Suppressor of Mothers Against Decapentaplegic) främjar differentieringen av hPSCs mot rostrala neurala stamceller härledda från neuroektodermala förfäder10 genom att bland annat hämma endodermal, mesodermal och trophectoderm cell fate choice11 . Vidare utlöser inbäddningen av neuroepitelsfäroiderna i den hESC-kvalificerade källarmembranmatrisen signifikant spirande av neuroepithelia och bildar ventriklar med apikobasal polaritet. Storskalig odling visade reproducerbarhet och homogenitet hos kortikala organoider oberoende av cellinjer, kloner eller satser, och representerar därmed ett tillförlitligt och stabilt stamcellssystem för att efterlikna tidig mänsklig kortikal utveckling inom hälsa och sjukdom in vitro. Vi beskriver vidare ett protokoll för att detektera senescenta neuronala cellmarkörer i hPSCs-härledda kortikala hjärnorganoider som har odlats under längre tidsperioder.
Efter plätering av hPSCs vid en sådddensitet på 20% -30% behandlas cellerna med dubbla SMAD-hämmare i 3 dagar för att differentiera hPSC-kolonier mot neuroektodermala kolonier. Dessa kolonier lyfts sedan försiktigt med dispas och sås in i ultralåga 6-brunnsplattor kompletterade med FGF2. De flytande 2D-kolonierna självorganiserar sig i 3D-neuroektodermala sfäroider över natten och upprätthålls i 4 dagar i N2-medium kompletterat dagligen med FGF2. När sfäroiderna har etablerat det neuroepiteliella skiktet kan de bäddas in i källarmembranmatrisen. Genom att rutinmässigt lägga till färskt terminalt differentieringsmedium kommer forskarna att observera progressiv expansion och spirande av neuroepithelia i kortikala organoider. Forskare kanske vill dissociera dessa organoider för att genomföra transkriptionell och proteomisk profilering. Dessutom rekommenderas ljusfältsavbildning för övervakning av kvaliteten på de kortikala organoiderna. Analys kan utföras genom fixering, kryosektion och immunfärgning. Beskrivningar och metoder för dessa tekniker har tidigare beskrivits12. I slutändan tillåter detta protokoll forskare att snabbt och robust generera homogena kortikala hjärnorganoider för modellering av den utvecklande mänskliga kortikala hjärnan, med låg kostnad och begränsad utrustning, och för att studera aspekter av cellulär neuronal åldrande, som beskrivs i detta papper.
För att möjliggöra användning av hPSC-härledda hjärnorganoider vid läkemedelsscreening och sjukdomsmodellering är det avgörande att göra organoider efter ett replikerbart och tillförlitligt protokoll15. Hjärnorganoider genereras vanligtvis från embryoidkroppar härledda från hPSCs, som sedan är inbäddade i en extracellulär matris som främjar vävnadsutvidgning och neural differentiering. Jämfört med sådana protokoll som Lancasters 1,16,17 och Velasco18, som börjar från embryoidkroppar och möjliggör en standarddifferentieringsväg som kan följas av de utvecklande organoiderna, har vi funnit att påbörjande kortikal hjärnorganoidbildning med humana NEct-celler snarare än med embryoidkroppar förbättrar konsistensen av kortikal hjärnorganoidbildning. Detta möjliggör följaktligen också den skalning som krävs för läkemedels- och fenotypisk screening. Eftersom humana NEct-celler inte bara kan expanderas till betydande mängder utan också lätt kan kryokonserveras, förbättrar detta tillvägagångssätt också replikerbarheten mellan experiment. Det bör också noteras att jämfört med andra protokoll som har antagit användningen av bioreaktorer och liknande tekniker krävs ingen specialutrustning för detta protokoll, vilket gör den lämplig för allalaboratorier 6. Slutligen reduceras den tid som krävs för att generera mogna organoider som är positiva för kortikala skiktmarkörer som SATB2 jämfört med både Lancaster1 och bioreaktorprotokoll 6,19 vilket gör det mer lämpligt för att studera utvecklingsbanan för mänsklig kortikal utveckling inom hälsa och sjukdomar 1,6,16.
Dessutom, med tanke på den ständigt växande globala hälso- och sjukvårdseffekten av åldranderelaterade sjukdomar som demens, som är förknippade med en ökning av åldrande celltyper i hjärnan som bidrar till patogenes, är förmågan att identifiera och testa föreningar som kan förbättra hjärnans åldrande av enormt intresse. Trots att hPSCs är kända för att vara epigenetiskt föryngrade under omprogrammeringsprocessen20, finner vi robusta ökningar av åldrande celler i kortikala hjärnorganoider odlade under längre perioder. Detta är en lovande utveckling som nu möjliggör screening av läkemedel som eliminerar sådana åldrande celler från hjärnan (senolytika) eller som saktar ner denna process (senostatika)21. Eftersom humana NEct-härledda kortikala hjärnorganoider är av mänskligt ursprung, kommer detta tillvägagångssätt sannolikt att förkorta den traditionella vägen till marknaden för sådana nya terapier.
Det finns två kritiska steg i detta protokoll. Den första är den korrekta sammanflödesnivån för hPSC-kolonierna vid tidpunkten för differentieringen. hPSC-kolonier måste vara högst 30% konfluenta för att säkerställa att genererade NEct-kolonier inte smälter samman med angränsande kolonier och att enskilda organoider drivs klonalt. Det andra kritiska steget innebär korrekt användning av dispas för att lyfta NEct-kolonierna och producera neurala sfäroider. Tidpunkten för inkubation med dispas är avgörande för den slutliga kvaliteten på de neurala sfäroider som genereras. Detta beror på att överexponering av kolonier med dispas är giftigt för cellerna22 och så småningom påverkar kvaliteten på genererade organoider. Begränsningen av detta protokoll är att det är svårt att kontrollera storleken på de neurala sfäroiderna eftersom det är beroende av storleken på de ursprungliga kolonierna som lyfts med dispas. Detta problem kan dock övervinnas genom att välja neurala sfäroider som är av samma storlek när de går vidare till inbäddningssteget.
Slutligen kan framtida tillämpningar utvidgas till att omfatta användningen av dessa reproducerbara kortikala organoider i robotanalys och biofarmaceutiska screeningmetoder som vanligtvis används i den industrin. Detta stöds av preliminära data från vårt laboratorium som indikerar att genereringen av kortikala hjärnorganoider från mänskliga NEct-celler lätt kan automatiseras, vilket gör den kompatibel med dessa metoder.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av Medical Research Future Fund-Accelerated Research, Leukodystrofi flaggskepp Massimo’s Mission (EPCD000034), Medical Research Future Fund-Stem Cell Mission (APP2007653). Författare vill tacka Dr. Ju-Hyun Lee (Korea University) för att ha genererat data i kompletterande video 1.
16% Formaldehyde (W/V) Methanol-free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | 4% of PFA are diluted in 1x PBS |
2-Mercaptoethanol 50 mL(1000x) | Life Technologies Australia (TFS) | 21985023 | Used in NM and DM media |
B 27 Supplement 10 mL | Life Technologies Australia (TFS) | 17504044 | Used in NM and DM media |
CKX53 microscope with SC50 camera | Olympus | ||
Corning Costar 6 well cell culture plates | Sigma Aldrich Pty Ltd | CLS3516-50EA | |
Dispase II powder | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | Powder is dissolve in HBSS, filtered through 0.22 µm filter, aliquote at 10 mL and store at -20 °C |
DMEM Nutrient Mix F12 10x 500 mL (DMEM/F-12) | Thermofisher | 11320082 | Used in NM and DM media |
DMSO Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich Pty Ltd | D2650-100ML | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich Pty Ltd | D1408-500ML | |
Falcon Matrigel hESC-qualified Matrix | In Vitro Technologies Pty Ltd | FAL354277 | Make aliquotes of 100 µL and stored at -20 °C |
GlutaMAX Supplement 100x | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used in NM and DM media |
Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich Pty Ltd | H8264 | |
Human induced pluripotent stem cells (EU79) | In-house reporogrammed from skin fibroblast | ||
Human induced pluripotent stem cells (G22) | Genea Biocells | Obtained from Genea Biocells (San Diego, United States) | |
Human induced pluripotent stem cells (WTC) | Gift from Professor Bruce Conklin | ||
InSolution TGF-Β RI Kinase Inhibitor VI, SB431542 | Merck | US1616464-5MG | |
Insulin Solution Human Recombinant | Sigma Aldrich Pty Ltd | I9278 | Used in NM and DM media |
LDN193189 Dihydrochloride | Sigma Aldrich Pty Ltd | SML0559-5MG | Used during differentiation |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used in NM and DM media |
mTeSR Plus | STEMCELL TECHNOLOGIES | 100-0276 | Used to maintain hiPSC colonies prior to differentiation with NM media |
N2 Supplement 5 mL (100x) | Life Technologies Australia Pty Ltd | 17502048 | Used in NM and DM media |
Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Used in DM media |
OCT Embedding Compound Sakura Clear (118 mL/Bottle) | Tissue Tek | 4583 | |
Parafilm M Roll Size 4 in. x 125 Ft | Sigma Aldrich Pty Ltd | P7793 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used in NM and DM media |
Potassium Hexacyanoferrate (II) Trihydrate | Sigma Aldrich Pty Ltd | CP1087 | |
Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma Aldrich Pty Ltd | 455946 | |
Prolong Glass Antifade Mountant | Life Technologies Australia (TFS) | P36980 | |
Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-01M | Aliquotes are made at 20 µg/mL and stored at -20 °C |
SB431542 | Tocris | 1614 | Used during differentiation |
Sucrose | Sigma Aldrich Pty Ltd | PHR1001-1G | 30% of sucrose are diluted in 1x PBS |
Ultra-Low attachment multiwell plates , 24 well plate, polystyrene | Sigma Aldrich Pty Ltd | CLS3473-24EA | |
X-GAL EA | Life Technologies Australia (TFS) | R0404 | Make aliquotes of 20 mg/mL and storde at -80 °C |