Summary

Identifisering av RNA Fragments som følge av enzymatisk nedbrytning ved bruk av MALDI-TOF massespektrometri

Published: April 11, 2022
doi:

Summary

MALDI-TOF ble brukt til å karakterisere fragmenter oppnådd fra reaktivitet mellom oksidert RNA og exoribonuclease Xrn-1. Den nåværende protokollen beskriver en metodikk som kan brukes på andre prosesser som involverer RNA og/eller DNA.

Abstract

RNA er en biopolymer tilstede på alle områder av livet, og dens interaksjoner med andre molekyler og / eller reaktive arter, for eksempel DNA, proteiner, ioner, narkotika og frie radikaler, er allestedsnærværende. Som et resultat gjennomgår RNA ulike reaksjoner som inkluderer spalting, nedbrytning eller modifikasjon, noe som fører til biologisk relevante arter med distinkte funksjoner og implikasjoner. Et eksempel er oksidasjon av guanin til 7,8-dihydro-8-oksoguanin (8-oksoG), som kan oppstå i nærvær av reaktive oksygenarter (ROS). Totalt sett er prosedyrer som karakteriserer slike produkter og transformasjoner i stor grad verdifulle for det vitenskapelige samfunnet. For dette formål er matriseassistert laserdesorpsjonsionionisering tid-of-flight (MALDI-TOF) massespektrometri en mye brukt metode. Den nåværende protokollen beskriver hvordan man karakteriserer RNA-fragmenter dannet etter enzymatisk behandling. Den valgte modellen bruker en reaksjon mellom RNA og exoribonuclease Xrn-1, hvor enzymatisk fordøyelse stoppes på oksiderte steder. To 20-nukleotid lange RNA-sekvenser [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] og [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] ble oppnådd via solidfasesyntese, kvantifisert av UV-vis spektroskopier, og karakterisert via MALDI-TOF. De oppnådde trådene ble da (1) 5′-fosforylatert og karakterisert via Maldiv-TOF; (2) behandlet med Xrn-1; (3) filtrert og avsaltet; (4) analysert via Maldiven-TOF. Dette eksperimentelle oppsettet førte til en utvetydig identifisering av fragmentene knyttet til stansingen av Xrn-1: [5′-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5′-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], og [5′-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. De beskrevne eksperimentene ble utført med 200 picomols av RNA (20 pmol brukt til MALDI-analyser); Lavere mengder kan imidlertid føre til påvisbare topper med spektrometre som bruker laserkilder med mer kraft enn den som brukes i dette arbeidet. Det er viktig at den beskrevne metodikken generaliseres og potensielt utvides til produktidentifikasjon for andre prosesser som involverer RNA og DNA, og kan hjelpe til med karakterisering/belysning av andre biokjemiske veier.

Introduction

MALDI-TOF 1,2,3 er en mye brukt teknikk for karakterisering og / eller deteksjon av molekyler av varierende størrelse og egenskaper. Noen av bruksområdene inkluderer forskjellige bruksområder som å oppdage tanniner fra naturressurs4, avbildning av metabolitter i mat5, oppdagelse eller overvåking av cellulære narkotikamål eller markører6, og klinisk diagnostikk7, for å nevne noen. Av relevans for det nåværende arbeidet er bruken av MALDIV-TOF med DNA eller RNA, med bruk på oligonukleotider som dateres tilbake til over tre tiår8, hvor flere begrensninger ble notert. Denne teknikken har nå utviklet seg til en pålitelig, vanlig brukt måte å karakterisere både biopolymerer9 og identifisere / forstå kjemiske og biokjemiske reaksjoner, for eksempel karakterisering av platinerte steder i RNA10, identifisering av RNA-fragmenter etter strandspalting11,12, eller dannelse av protein-DNA krysskoblinger13 . Dermed er det verdifullt å illustrere og fremheve viktige aspekter ved å bruke denne teknikken. Det grunnleggende om MALDI-TOF er beskrevet i videoformat også14 og vil ikke bli nærmere utdypet heri. Videre har anvendelsen i en DNA- eller proteinkontekst tidligere blitt beskrevet og illustrert i nevnte format 15,16,17.

Protokollen for å oppdage RNA-fragmenter dannet etter enzymatisk hydrolyse rapporteres heri. Den eksperimentelle modellen ble valgt basert på et nylig funn publisert av vår gruppe18, hvor MALDI-TOF ble brukt til å bestemme den unike reaktivitet mellom exoribonuclease Xrn-1 og oligonukleotider av RNA som inneholder den oksidative lesjonen 8-oksidasjon. De 20-nukleotid lange trådene ble oppnådd via fastfasesyntese19, [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] og [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], mens Xrn-1 ble uttrykt og renset etter den tidligere beskrevnerapporten. Kort sagt, Xrn-121 er en 5′-3′ exoribonuclease med ulike viktige biologiske roller som nedbryter flere typer RNA, inkludert oksidert RNA22. Det ble funnet at prosesjonen til enzymet stopper ved møte med 8-oksoG, noe som førte til RNA-fragmenter som inneholder 5′-fosforylater [5′-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5′-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], og [5′-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.

Til slutt er det viktig å merke seg at massespektrometri er en kraftig metode som gjennom ulike metoder kan tilpasses andre formål23,24; Dermed er det av største betydning å velge riktig ioniseringsmetode så vel som andre eksperimentelle oppsett.

Protocol

RNasefritt ultra rent vann (tabell 1) ble brukt til denne studien. 1. Konsentrasjonsbestemmelse av RNA-løsning Forbered RNA-eksemplet ved å følge trinnene nedenfor. Bruk et mikrocentrifugerør (0,6 ml) til å lage en løsning av RNA ved å fortynne 1 μL lagerløsning (oppnådd via fastfasesyntese)19 til 159 μL RNase-fri H2O. Bland oppløsningen ved å pipetter blandingen opp og ned gjentatte ga…

Representative Results

Oligonukleotidene som ble brukt i dette arbeidet ble syntetisert, karakterisert og kvantifisert før bruk. Konsentrasjonen av alle oligonukleotider ble bestemt via UV-vis spektroskopi registrert ved 90 °C for å unngå feilaktige avlesninger som følge av den potensielle dannelsen av sekundærstrukturene. Figur 3 viser spektra av modellen oligonukleotider av RNA som brukes i dette arbeidet, tatt ved romtemperatur og etter påføring av varme. Den generel…

Discussion

Hovedutfordringen i denne arbeidsflyten oppsto mellom å ferdigstille forsøkene og gjennomføre massespektrometriske analyser. Eksperimenter ble utført og fullført ved University of Colorado Denver og sendt (over natten) til Colorado State University fasiliteter. Datainnsamling ble utført ved mottak, i henhold til bekvemmelighet. Flere uventede omstendigheter førte til tidsforsinkelser i prosessen. I ett tilfelle krevde uventede instrumentfeil at prøvene ble frosset (en gang i 21 dager) før de oppdaget og anskaffe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Det er viktig å merke seg at dette arbeidet var et samarbeid mellom tre institusjoner, to forskningsgrupper og ett kjerneanlegg. Fordelingen og arbeidsmengden ble utført som følger: Proteinuttrykk (Xrn-1) ble utført ved University of Denver (Denver, CO). Oligonukleotidsyntese, kvantifisering og eksperimentering (hovedsakelig enzymatisk nedbrytning) ble utført ved University of Colorado Denver (Denver, CO). Optimalisering ble også utført der. MALDI-TOF spotting, oppkjøp og analyse ble utført ved Analytical Resources Core Facility ved Colorado State University. (Fort Collins, CO). SS ønsker å anerkjenne en UROP Award (CU Denver) og Eureca tilskudd (CU Denver) for støtte. E. G.C. anerkjenner støtte fra NIGMS, via R00GM115757. MJER erkjenner støtte fra NIGMS, via 1R15GM132816. K.B. bekrefter ressurs-ID: SCR_021758. Verket ble også støttet av en Teacher-Scholar Award (MJER), TH-21-028, fra Henry Dreyfus Foundation.

Materials

0.6 mL MCT Graduated Violet Fisher Scientific 05-408-127
6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% Sigma Aldrich 480-66-0
Acetonitrile 99.9%, HPLC grade Fisher Scientific 75-05-8
Adenosine triphosphate, 10 mM New Englang Bioscience P0756S
Ammonium citrate, dibasic 98% Sigma Aldrich 3012-65-5
Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade Alfa Aesar 12125-01-8
Bruker bacterial test standard Bruker Daltonics 8255343
Commercial source of Xrn-1 New England BioLabs M0338S
Diethyl pyrocarbonate, 97% ACROS Organics A0368487
Flex analysis software Bruker daltonics FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics
Lambda 365 UV-vis spectrophotometer Perkin Elmer
MALDI plate: MSP 96 ground steel target Bruker Daltonics 280799
Mass Spectrometer Bruker Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA)
Mili-Q IQ 7000 Milipore Sigma A Mili-Q system was used to purify all water used in this work
Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) Pall Corporation OD010C33 filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size
NEBuffer 3 New England Biolabs B7003S This is solution B
Oligo Analyzer tool IDT-DNA https://www.idtdna.com/calc/analyzer
Pipette tips P10 Fisher Scientific 02-707-441
Pipette tips P200 Fisher Scientific 02-707-419
RNase Away Molecular BioProducts 7005-11
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer New England BioLabs B0201S This is solution A
Triflouroacetic Acid Alfa Aesar 76-05-1
Xrn-1 exoribonuclease Expressed in house See ref. 20
ZipTip Pipette Tips for Sample preparation Millipore ZTC 18S 096 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed

References

  1. Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
  2. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).
  3. Zenobi, R. Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry. Chimia. 57, 73 (2003).
  4. Aristri, M. A., et al. Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application. Forests. 12 (11), 1516 (2021).
  5. Pedrazzani, C., et al. 5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).
  6. Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry. Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).
  7. Croxatto, A., Prod’hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).
  8. Kaufmann, R. Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology. Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).
  9. Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer. ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).
  10. Chapman, E. G., DeRose, V. J. Enzymatic processing of platinated RNAs. Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).
  11. Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical. Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).
  12. Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry. Nucleic Acids Research. 41 (1), 2 (2013).
  13. Ghodke, P. P., Guengerich, P. DNA polymerases η and κ bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides. Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124 (2021).
  14. JoVE. JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
  15. Schrötner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176 (2016).
  16. Su, K. -. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862 (2018).
  17. Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577 (2021).
  18. Phillips, C. N., et al. Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315 (2021).
  19. Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2′-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189 (2017).
  20. Langeberg, C. J., et al. Biochemical characterization of yeast Xrn1. Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).
  21. Stevens, A. Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5′-mononucleotides by a 5′ leads to 3′ mode of hydrolysis. Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).
  22. Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control. Nature Communications. 10 (1), 5611 (2019).
  23. Fasnacht, M., et al. Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress. Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).
  24. Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149 (2021).
  25. Tomar, R., et al. DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct. Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).
  26. Gaffney, A., et al. HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates. ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).
  27. Sikorski, E. L., et al. Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells. ChemBioChem. , 202100521 (2022).
  28. Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency. ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).

Play Video

Cite This Article
Schowe, S. W., Langeberg, C. J., Chapman, E. G., Brown, K., Resendiz, M. J. E. Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (182), e63720, doi:10.3791/63720 (2022).

View Video