MALDI-TOF ble brukt til å karakterisere fragmenter oppnådd fra reaktivitet mellom oksidert RNA og exoribonuclease Xrn-1. Den nåværende protokollen beskriver en metodikk som kan brukes på andre prosesser som involverer RNA og/eller DNA.
RNA er en biopolymer tilstede på alle områder av livet, og dens interaksjoner med andre molekyler og / eller reaktive arter, for eksempel DNA, proteiner, ioner, narkotika og frie radikaler, er allestedsnærværende. Som et resultat gjennomgår RNA ulike reaksjoner som inkluderer spalting, nedbrytning eller modifikasjon, noe som fører til biologisk relevante arter med distinkte funksjoner og implikasjoner. Et eksempel er oksidasjon av guanin til 7,8-dihydro-8-oksoguanin (8-oksoG), som kan oppstå i nærvær av reaktive oksygenarter (ROS). Totalt sett er prosedyrer som karakteriserer slike produkter og transformasjoner i stor grad verdifulle for det vitenskapelige samfunnet. For dette formål er matriseassistert laserdesorpsjonsionionisering tid-of-flight (MALDI-TOF) massespektrometri en mye brukt metode. Den nåværende protokollen beskriver hvordan man karakteriserer RNA-fragmenter dannet etter enzymatisk behandling. Den valgte modellen bruker en reaksjon mellom RNA og exoribonuclease Xrn-1, hvor enzymatisk fordøyelse stoppes på oksiderte steder. To 20-nukleotid lange RNA-sekvenser [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] og [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] ble oppnådd via solidfasesyntese, kvantifisert av UV-vis spektroskopier, og karakterisert via MALDI-TOF. De oppnådde trådene ble da (1) 5′-fosforylatert og karakterisert via Maldiv-TOF; (2) behandlet med Xrn-1; (3) filtrert og avsaltet; (4) analysert via Maldiven-TOF. Dette eksperimentelle oppsettet førte til en utvetydig identifisering av fragmentene knyttet til stansingen av Xrn-1: [5′-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5′-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], og [5′-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. De beskrevne eksperimentene ble utført med 200 picomols av RNA (20 pmol brukt til MALDI-analyser); Lavere mengder kan imidlertid føre til påvisbare topper med spektrometre som bruker laserkilder med mer kraft enn den som brukes i dette arbeidet. Det er viktig at den beskrevne metodikken generaliseres og potensielt utvides til produktidentifikasjon for andre prosesser som involverer RNA og DNA, og kan hjelpe til med karakterisering/belysning av andre biokjemiske veier.
MALDI-TOF 1,2,3 er en mye brukt teknikk for karakterisering og / eller deteksjon av molekyler av varierende størrelse og egenskaper. Noen av bruksområdene inkluderer forskjellige bruksområder som å oppdage tanniner fra naturressurs4, avbildning av metabolitter i mat5, oppdagelse eller overvåking av cellulære narkotikamål eller markører6, og klinisk diagnostikk7, for å nevne noen. Av relevans for det nåværende arbeidet er bruken av MALDIV-TOF med DNA eller RNA, med bruk på oligonukleotider som dateres tilbake til over tre tiår8, hvor flere begrensninger ble notert. Denne teknikken har nå utviklet seg til en pålitelig, vanlig brukt måte å karakterisere både biopolymerer9 og identifisere / forstå kjemiske og biokjemiske reaksjoner, for eksempel karakterisering av platinerte steder i RNA10, identifisering av RNA-fragmenter etter strandspalting11,12, eller dannelse av protein-DNA krysskoblinger13 . Dermed er det verdifullt å illustrere og fremheve viktige aspekter ved å bruke denne teknikken. Det grunnleggende om MALDI-TOF er beskrevet i videoformat også14 og vil ikke bli nærmere utdypet heri. Videre har anvendelsen i en DNA- eller proteinkontekst tidligere blitt beskrevet og illustrert i nevnte format 15,16,17.
Protokollen for å oppdage RNA-fragmenter dannet etter enzymatisk hydrolyse rapporteres heri. Den eksperimentelle modellen ble valgt basert på et nylig funn publisert av vår gruppe18, hvor MALDI-TOF ble brukt til å bestemme den unike reaktivitet mellom exoribonuclease Xrn-1 og oligonukleotider av RNA som inneholder den oksidative lesjonen 8-oksidasjon. De 20-nukleotid lange trådene ble oppnådd via fastfasesyntese19, [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] og [5′-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], mens Xrn-1 ble uttrykt og renset etter den tidligere beskrevnerapporten. Kort sagt, Xrn-121 er en 5′-3′ exoribonuclease med ulike viktige biologiske roller som nedbryter flere typer RNA, inkludert oksidert RNA22. Det ble funnet at prosesjonen til enzymet stopper ved møte med 8-oksoG, noe som førte til RNA-fragmenter som inneholder 5′-fosforylater [5′-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5′-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], og [5′-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.
Til slutt er det viktig å merke seg at massespektrometri er en kraftig metode som gjennom ulike metoder kan tilpasses andre formål23,24; Dermed er det av største betydning å velge riktig ioniseringsmetode så vel som andre eksperimentelle oppsett.
Hovedutfordringen i denne arbeidsflyten oppsto mellom å ferdigstille forsøkene og gjennomføre massespektrometriske analyser. Eksperimenter ble utført og fullført ved University of Colorado Denver og sendt (over natten) til Colorado State University fasiliteter. Datainnsamling ble utført ved mottak, i henhold til bekvemmelighet. Flere uventede omstendigheter førte til tidsforsinkelser i prosessen. I ett tilfelle krevde uventede instrumentfeil at prøvene ble frosset (en gang i 21 dager) før de oppdaget og anskaffe…
The authors have nothing to disclose.
Det er viktig å merke seg at dette arbeidet var et samarbeid mellom tre institusjoner, to forskningsgrupper og ett kjerneanlegg. Fordelingen og arbeidsmengden ble utført som følger: Proteinuttrykk (Xrn-1) ble utført ved University of Denver (Denver, CO). Oligonukleotidsyntese, kvantifisering og eksperimentering (hovedsakelig enzymatisk nedbrytning) ble utført ved University of Colorado Denver (Denver, CO). Optimalisering ble også utført der. MALDI-TOF spotting, oppkjøp og analyse ble utført ved Analytical Resources Core Facility ved Colorado State University. (Fort Collins, CO). SS ønsker å anerkjenne en UROP Award (CU Denver) og Eureca tilskudd (CU Denver) for støtte. E. G.C. anerkjenner støtte fra NIGMS, via R00GM115757. MJER erkjenner støtte fra NIGMS, via 1R15GM132816. K.B. bekrefter ressurs-ID: SCR_021758. Verket ble også støttet av en Teacher-Scholar Award (MJER), TH-21-028, fra Henry Dreyfus Foundation.
0.6 mL MCT Graduated Violet | Fisher Scientific | 05-408-127 | |
6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
Acetonitrile 99.9%, HPLC grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
Adenosine triphosphate, 10 mM | New Englang Bioscience | P0756S | |
Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
Bruker bacterial test standard | Bruker Daltonics | 8255343 | |
Commercial source of Xrn-1 | New England BioLabs | M0338S | |
Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
Flex analysis software | Bruker daltonics | FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics | |
Lambda 365 UV-vis spectrophotometer | Perkin Elmer | ||
MALDI plate: MSP 96 ground steel target | Bruker Daltonics | 280799 | |
Mass Spectrometer | Bruker | Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA) | |
Mili-Q IQ 7000 | Milipore Sigma | A Mili-Q system was used to purify all water used in this work | |
Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) | Pall Corporation | OD010C33 | filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size |
NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | This is solution B |
Oligo Analyzer tool | IDT-DNA | https://www.idtdna.com/calc/analyzer | |
Pipette tips P10 | Fisher Scientific | 02-707-441 | |
Pipette tips P200 | Fisher Scientific | 02-707-419 | |
RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0201S | This is solution A |
Triflouroacetic Acid | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
Xrn-1 exoribonuclease | Expressed in house | See ref. 20 | |
ZipTip Pipette Tips for Sample preparation | Millipore | ZTC 18S 096 | 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed |