במאמר זה אנו מתארים שיטה ליצירת אורגנואידים של גליובלסטומה (GBM) מדגימות של מטופלים ראשוניים או מתרביות תאים שמקורן בחולה, ושמירה עליהם עד לבגרות. אורגנואידים אלה של GBM מכילים אוכלוסיות תאים מגוונות מבחינה פנוטיפית ויוצרים מחדש מיקרו-סביבה של גידולים ex vivo.
גליובלסטומה (GBM) היא סרטן המוח הממאיר הראשוני השכיח ביותר עם פרוגנוזה גרועה ביותר. מגוון תאי ומולקולרי תוך-גידולי, כמו גם אינטראקציות מורכבות בין מיקרו-סביבה של גידולים, יכולים להפוך את מציאת הטיפולים היעילים לאתגר. שיטות מסורתיות של תרבות דבק או כדור יכולות להסוות מורכבויות כאלה, בעוד שתרבות אורגנואידית תלת-ממדית יכולה לשחזר שיפועים מיקרו-סביבתיים אזוריים. אורגנואידים הם שיטה של תרבית GBM תלת-ממדית המחקה טוב יותר את ארכיטקטורת הגידול של המטופלים, מכילה אוכלוסיות תאים מגוונות מבחינה פנוטיפית, ויכולה לשמש לניסויים בתפוקה בינונית. למרות שתרבות אורגנואידית תלת-ממדית היא מייגעת וגוזלת זמן רב יותר בהשוואה לתרבות המסורתית, היא מציעה יתרונות ייחודיים ויכולה לשמש לגישור על הפער בין מערכות in vitro ו-in vivo הנוכחיות. אורגנואידים ביססו את עצמם ככלים יקרי ערך בארסנל של ביולוגים של סרטן כדי להבין טוב יותר את התנהגות הגידול ואת מנגנוני העמידות, והיישומים שלהם רק ממשיכים לגדול. כאן, פרטים מסופקים על שיטות ליצירה ושמירה על אורגנואידים GBM. מתוארות גם הוראות כיצד לבצע הטבעה וחיתוך של דגימות אורגנואידים תוך שימוש בטכניקות של הטבעה קפואה ושל פרפין, כמו גם המלצות לפרוטוקולים של אימונוהיסטוכימיה ואימונופלואורסצנציה על מקטעים אורגנואידיים, ומדידה של הכדאיות הכוללת של תאים אורגנואידיים.
גליובלסטומה (GBM) היא הגידול העיקרי השכיח ביותר במוח עם פרוגנוזה קודרת של כ -15 חודשים מאבחון1. טיפולים יעילים במחקרים פרה-קליניים יכולים לעתים קרובות להיות יעילים בצורה גרועה בחולים 2,3. תגובה קלינית ירודה מיוחסת לגורמים רבים, כולל ההטרוגניות המיקרו-סביבתית של GBM ואינטראקציות פנים-טיפוליות מורכבות. אלה יכולים להיות קשים לשחזור בסביבת המעבדה עם שיטות מסורתיות של תרבית דבק או כדור4. נוכחות של תת-קבוצה של תאי גזע סרטניים המתחדשים בעצמם (CSCs) בתוך GBM עשויה גם היא לתרום למורכבות זו 5,6. CSCs חיוניים להתפשטות הגידול ולשמירה על צמיחת הגידול על ידי קידום אנגיוגנזה פעילה, פלישת סרטן ועמידות לטיפולים כולל קרינה 7,8,9. תאי CSCs אינם מפוזרים באופן אחיד בין גידולים, אלא מועשרים בתוך מיקרו-סביבה ספציפית, כולל נישה פריווסקולרית ואזורים פרינקריטיים, שכל אחד מהם מספק ויסות מולקולרי מובהק של מצבי התאים שלהם 10,11,12,13,14. CSCs אינם נמענים פסיביים של רמזים מיקרו-סביבתיים, אלא בעלי יכולת לעצב מחדש את המיקרו-סביבה שלהם 7,15,16. המיקרו-סביבה של CSC יכולה לקדם תחזוקה של מצב תאי גזע בתגובה ללחצים כגון מחסור בחומרים מזינים, pH והיפוקסיה17,18,19,20, מה שמרמז על החשיבות של תנאים אלה במערכת מודל. לפיכך, שחזור של המיקרו-סביבה התאית המגוונת בתוך גידולים הוא קריטי להבנת העמידות הטיפולית ולזיהוי טיפולים חדשניים.
תרבות התלת מימד עלתה בפופולריות בשנים האחרונות21,22. אורגנואידים שימשו בסוגים אחרים של סרטן, והמטרה העיקרית של שמירה על תאים כאורגנואידים היא לאפשר צמיחה של אוכלוסיות תאים הטרוגניות (שרבות מהן עשויות בדרך כלל להיות מחוץ לתרבית כדור הומוגנית יותר) ומגוון מרחבי, הנתפס כמיקרו-סביבה אזורית של גידולים עם ספציפיות גנטית 4,23,24,25,26 . ישנן שיטות רבות לתרבית תלת מימדית של תאים סרטניים, שלכל אחת מהן יתרונות וחסרונות27,28,29. התרבות האורגנואידית לא נועדה להוות תחליף לתרבות החסידות או המרחב המסורתית. הוא משמש בצורה הטובה ביותר כטכניקה משלימה לשיטות דו-ממדיות כאשר יש שאלות ספציפיות שבהן האינטראקציה בין מיקרו-סביבה של תאים לתגובות תאי גידול היא קריטית.
מאמר זה מתאר שיטות אמינות וחוזרות על עצמן ליצירת אורגנואידים של GBM מדגימות מטופלים ראשוניות או מתרביות שמקורן בחולה. אנו מתייחסים לשתי מטרות שונות לתרבית אורגנואידית תלת-ממדית: (1) הקמת אורגנואידים מרקמת המטופל הראשונית, עם פוטנציאל השתלה מקסימלי ללא קשר לאחידות, או (2) גידול אורגנואידים אחידים לשימוש ניסיוני כמותי יותר. בעת הקמת דגימה ראשונית כאורגנואידים, אין צורך לסנן תאים בודדים או לספור תאים, מכיוון ששמירה על מספר וסוגי תאים מרביים כדי לקבוע את התרבית הראשונית היא בראש סדר העדיפויות. עם זאת, כאשר מגדלים אורגנואידים לניסויים השוואתיים, יש צורך בסינון חד-תאי ובספירת תאים כדי להבטיח שהאורגנואידים המשוכפלים יהיו ברי השוואה לצורך עקביות ניסויית. פרוטוקול זה מפרט כיצד להקים תרביות אורגנואידים וליצור אורגנואידים אחידים, כמו גם שיטות מעודנות להטמעה ושימור של אורגנואידים וניסויים סטנדרטיים בתרביות תאים, כולל אימונוהיסטוכימיה, אימונופלואורסצנציה והערכת הכדאיות הכוללת של התאים באורגנואידים GBM.
אורגנואידים GBM הם שיטת תרבית משלימה לתחומים מסורתיים הכוללים הטרוגניות תאית ומיקרו-סביבתית גדולה יותר 4,22,30. למרות שהיא דורשת יותר זמן ומשאבים, התרבות האורגנואידית יכולה להציע תובנות חשובות לגבי התנהגות תוך-סרטנית ומנגנונים של עמידות לסמים.
GBM מונע על ידי אוכלוסייה של CSCs 5,31, ושיטות אלה פותחו כדי לאפשר המשך צמיחה והתחדשות עצמית של אוכלוסיית CSC זו. גורם גדילה אפידרמלי (EGF) וגורם גדילה פיברובלסט (FGF) ידועים כמשפרים את התחזוקה והצמיחה של תאי גזע ומספקים איתות קולטן פעיל טירוזין קינאז (RTK). היווצרותן של אוכלוסיות תאים הטרוגניות ומיקרו-סביבה של גידולים מובחנים בתוך גידולי GBM מסתמכת על תמיכה בהתנהגויות CSC. הבחירה של lrECM מחקה את סביבת המוח העשירה בלמינינים ותומכת בתאים בתרבית אורגנואידית להתארגן בעצמם ולהגר על ידי פלישה. למרות שקבוצות מסוימות ביססו תרבית אורגנואידית ללא שימוש במדיה מועשרת lrECM או EGF/FGF24,28, שעשויה להציע דרך יעילה יותר בזמן של שיטת תרבית זו ובחירה חזקה יותר של איתות אונקוגני כדי להניע צמיחה, שיטות אלה נבחרו כדי לייעל את הסביבה הפרו-תאי כדי לבסס בצורה הטובה ביותר את ההטרוגניות התאית של אורגנואידים. גם אורגנואידים מוחיים וגם אורגנואידים GBM נעשו עם lrECM בספרות בעבר 21,32,33. למרות שביססנו נתונים לגבי אוכלוסיות הגידולים שנמצאו בתוך האורגנואידים והשונות המרחבית, פחות ידוע על אוכלוסיות שאינן גידוליות בתוך האורגנואידים וכמה זמן הם שורדים מדגימות החולה המקוריות. כתמי IHC מסוימים (כגון CD45) עשויים לספק נתונים אלה, ועשויים להיות נקודת מחקר מעניינת בעתיד עם אורגנואידים.
ידיעת השימוש המיועד לתרבית אורגנואידית חשובה לבחירת שיטות מתאימות. לביסוס אורגנואידים מדגימות ראשוניות לעומת גידול אורגנואידים אחידים לניסויים ספציפיים יש הליכים מעט שונים. הערכה לאופן שבו אורגנואידים מתבגרים וממלאים חזותית את פיגום lrECM חשובה ליכולת להקצות זמן ומשאבים מתאימים לתרבות אורגנואידית. אזורים דלילים של תאים באורגנואידים יתרחבו באיטיות ויגדלו כדי למלא את ה-lrECM, מה שיכול להימשך בין 2-8 שבועות, תלוי בהתנהגות הדגימה. קצב גידול זה הוא מהותי במקצת לכל דגימה; הוא נשמר על פני קבוצות שונות של אורגנואידים ועקבי למדי עם הקצב היחסי של צמיחת הכדור. אורגנואידים יכולים להישמר במשך יותר משנה אחת ולשמור על יכולות היווצרות הגידול על xenograft לתוך עכברים; עם זאת, מומלץ לגדל אותם במטרה ברורה לא לבזבז משאבי מעבדה (הן חומרים והן זמן)4. גידול אורגנואידי נבדק במספר גדלים ופורמטים של בארות, ומראה כי צלחת בגודל 10 ס”מ היא ההגדרה האידיאלית לשמירה על כדאיות תאים אופטימלית, ואחריה צלחת של 6 בארות עם שלושה אורגנואידים לכלבאר 34. אורגנואידים צורכים יותר מדיה בהשוואה למקביליהם התרבית הדו-ממדית, ושימוש בפורמט באר קטן יותר אינו מוביל לתחזוקה נאותה. לדוגמה, לבאר אחת של לוח בפורמט 96 בארות אין מספיק שטח או נפח מדיה ביחס לגודל של אורגנואיד כדי לקיים צמיחה אורגנואידית.
כפי שהאורגנואידים קובעים, להיות שומר מצוות חשוב להגברת ההצלחה. בתחילה, אורגנואידים יצרכו מדיה לאט, אך ככל שהם נעשים צפופים ובוגרים יותר, הם יצרכו מדיה מהר יותר. הוספת פנול אדום למדיה יכולה לעזור לשמש אינדיקטור לצריכת מדיה. כאשר המדיה צהובה יותר, זה עשוי לגרום לנו להתאים את דפוס ההזנה, בין אם זה להחליף נפח גבוה יותר של מדיה, להגדיל את כמות המדיה הכוללת בצלחת, לחלק אורגנואידים בין מספר צלחות תרבית תאים כדי לעמוד בקצב הצמיחה שלהם, או אפילו להתאים את ציר הזמן לניסויים.
במובנים רבים, אורגנואידים הם דרך לא יעילה לביצוע מחקר סרטן. הם כרוכים בסקאלות זמן ארוכות, והם יקרים ועתירי משאבים בהשוואה לתרבות הספירה של GBM. עם זאת, בהשוואה לקסנוגרפטים שמקורם בחולה, שיטה חלופית ליצירה מחדש של מגוון תאי ומיקרו-סביבתי, הם פשוטים יותר, זולים יותר וניתנים לשליטה. הבחירה מתי להשתמש בצורה הטובה ביותר באורגנואידים חשובה לחוקרי סרטן. הם לא נועדו להחליף את המרחב המסורתי או את התרבות החסידית ולא להחליף מודלים של קסנוגרפט. אורגנואידים יכולים, כאשר הם מיושמים בשאלה המדעית הנכונה, לשלב את היתרונות של שתי המערכות הללו ועשויים לאפשר לנו להתבונן בביולוגיה של תאי הגידול שאחרת היו נשארים מוסתרים. הקהילה המדעית רק מתחילה להבין אילו הזדמנויות למידה אורגנואידים מציעים, אך ברור שהם יהיו כלי רב ערך בעתיד להבנת הביולוגיה המורכבת של GBM.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות לד”ר ג’סטין לת’יה על עצתו שלא תסולא בפז ותמיכתו המתמשכת. אנו מודים גם לקטרינה פייף, ליסה וואלאס ומאיה קמחי על התמיכה הטכנית המצוינת שלהן.
3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets | MP Biomedicals | 08980681 | 3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets |
96-well PCR plates | ThermoFisher Scientific | 96-well PCR plates | |
Accutase | ThermoFisher Scientific | SCR005 | Cell detachment solution |
Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | Antibiotic-antimycotic |
B-27 supplement minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587001 | B-27 supplement minus vitamin A (50x) |
GelCode Blue Stain Reagent | ThermoFisher Scientific | 24590 | Bluing reagent |
Cell strainer (70 µm) | CellTreat Scientific | 229483 | Cell strainer (70 µm) |
CellTiter-Glo 3D | Promega | G9681 | Luminescent cell viability assay |
Clarifier 2 | ThermoFisher Scientific | 7301 | Nuclear hematoxylin clarifying reagent |
Clear-Rite 3 | ThermoFisher Scientific | 6901 | xylene substitute |
Epredia Gill 2 Hematoxylin | ThermoFisher Scientific | 72504 | Hematoxylin |
Glutamine in 0.85% NaCl | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Glutamine in 0.85% NaCl (200 mM) |
Matrigel | ThermoFisher Scientific | 354234 | Laminin-enriched extracellular matrix |
Mini PAP pen | ThermoFisher Scientific | 008877 | Hydrophobic barrier pen |
Mounting medium | ThermoFisher Scientific | 22-050-102 | Mounting medium |
Neurobasal media minus phenol red | ThermoFisher Scientific | 12349015 | Neurobasal media minus phenol red (500 mL) |
Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Normal donkey serum (NDS) |
Paraformaldehyde 4% in PBS | ThermoFisher Scientific | AAJ19943K2 | Paraformaldehyde 4% in PBS |
Phenol red | Sigma | P0290 | Phenol red (0.5%) |
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P10144 | Liquid curing mountant |
Recombinant human EGF protein | R&D systems | 236-EG-01M | Recombinant human EGF protein (250 µg/mL) |
Recombinant human FGF basic | R&D systems | 4144-TC-01 | Recombinant human FGF basic (250 µg/mL) |
SignalStain Antibody Diluent | Cell Signaling | 8112 | Antibody diluent |
SignalStain Boost IHC Detection Reagent | Cell Signaling | 8114 | Immunohistochemistry detection reagent |
SignalStain Citrate Unmasking Solution | Cell Signaling | 14746 | Citrate unmasking solution |
Single edge razor blade | Uline | H-595B | Single edge razor blade |
Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360070 | Sodium pyruvate (100 mM) |
Tissue-Tek Cryomolds | VWR | 25608-916 | Disposable cryomolds |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | VWR | 25608-930 | Optimal cutting temperature compound |
Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | T10282 | Cell impermeant stain (0.4%) |
Xylene | ThermoFisher Scientific | X3P-1GAL | Xylene |