Summary

Isolamento, coltura e caratterizzazione di cellule primarie di Schwann, cheratinociti e fibroblasti dal prepuzio umano

Published: March 23, 2022
doi:

Summary

Lo studio della guarigione delle ferite associata a lesioni muscoloscheletriche richiede spesso la valutazione delle interazioni in vitro tra cellule di Schwann (SC), cheratinociti e fibroblasti. Questo protocollo descrive l’isolamento, la coltura e la caratterizzazione di queste cellule primarie dal prepuzio umano.

Abstract

Questo protocollo descrive i metodi di isolamento, le condizioni di coltura e la caratterizzazione delle cellule primarie umane con alta resa e vitalità utilizzando una rapida dissociazione enzimatica della pelle. I cheratinociti primari, i fibroblasti e le cellule di Schwann sono tutti raccolti dal prepuzio neonato umano, che è disponibile seguendo le procedure standard di cura. La pelle rimossa viene disinfettata e il grasso sottocutaneo e il muscolo vengono rimossi usando un bisturi. Il metodo consiste nella separazione enzimatica e meccanica degli strati epidermico e dermico, seguita da un’ulteriore digestione enzimatica per ottenere sospensioni unicellulari da ciascuno di questi strati cutanei. Infine, le singole cellule vengono coltivate in terreni di coltura cellulare appropriati seguendo protocolli di coltura cellulare standard per mantenere la crescita e la vitalità per settimane. Insieme, questo semplice protocollo consente l’isolamento, la coltivazione e la caratterizzazione di tutti e tre i tipi di cellule da un singolo pezzo di pelle per la valutazione in vitro di modelli pelle-nervo. Inoltre, queste cellule possono essere utilizzate insieme in co-colture per valutare i loro effetti l’una sull’altra e le loro risposte al trauma in vitro sotto forma di graffi eseguiti roboticamente nella coltura associata alla guarigione delle ferite.

Introduction

Le cellule primarie derivate da tessuto vivente e coltivate in condizioni in vitro assomigliano molto allo stato fisiologico1, rendendole un modello ideale per indagare i processi fisiologici e fisiopatologici. La pelle contiene più tipi di cellule, tra cui cheratinociti, fibroblasti, sebociti, melanociti e cellule di Schwann (SC), che possono essere isolate e coltivate per esperimenti in vitro . Non sono stati descritti metodi per isolare e coltivare cheratinociti, fibroblasti e SC, da un singolo pezzo di pelle. L’obiettivo di questo protocollo è duplice: 1) stabilire un metodo affidabile e riproducibile per l’isolamento e la coltura di SC dermiche e 2) utilizzare un metodo efficiente e robusto per l’isolamento di cheratinociti, fibroblasti e SC da un singolo prepuzio umano.

Attualmente esistono protocolli consolidati per isolare i cheratinociti cutanei 2,3,4 e i fibroblasti 5,6. Questi studi descrivono l’isolamento di cheratinociti, fibroblasti o entrambi dalla pelle, ma nessun protocollo affronta come stabilire colture di SC primarie dalla pelle umana. Studi recenti suggeriscono che le SC neuronali modulano i processi cellulari dei cheratinociti e dei fibroblasti e regolano le normali funzioni fisiologiche della pelle7. Le SC sono quindi fondamentali per l’omeostasi cutanea e contribuiscono in modo sostanziale alla fisiologia regolata che influenza il comportamento dei tipi di cellule cutanee vicinepresenti 8. Pertanto, un protocollo che consente l’isolamento di ciascuno di questi tipi di cellule è ideale per esperimenti in vitro che coinvolgono la comunicazione cellula-cellula o cross-talk tra tipi di cellule.

Questo protocollo descrive la creazione di singole colture cellulari di cellule primarie da un singolo pezzo di pelle. Questo protocollo è particolarmente utile quando la quantità di tessuto disponibile è limitata. Inoltre, l’isolamento di tutti e tre i tipi di cellule da un singolo donatore consente solidi confronti tra tipi di cellule o esperimenti di co-coltura, mitigando al contempo l’influenza della genetica durante l’esperimento desiderato.

Protocol

L’acquisizione e l’uso di tessuto del prepuzio umano de-identificato a fini di ricerca è stato esaminato e ha ricevuto la determinazione di “ricerca non umana” dal Penn State College of Medicine Institutional Review Board (IRB # 17574). NOTA: Seguendo il protocollo riportato di seguito, 2,4 x 106 cheratinociti, 4,4 x 106 fibroblasti e 1,1 x 106 SC sono ottenuti da un singolo prepuzio. In generale, queste cellule primarie possono essere utilizzate per 3 passagg…

Representative Results

Il prepuzio neonatale normale è stato utilizzato per l’isolamento dei cheratinociti epidermici primari e delle SC e dei fibroblasti dermici. Le cellule primarie isolate sono state coltivate in rispettivi terreni di coltura cellulare contenenti fattori di crescita. Dopo la semina di SC e fibroblasti in palloni di coltura, la maggior parte delle cellule ha aderito al fondo del pallone entro 2 ore. Nel caso dei cheratinociti, la maggior parte dei cheratinociti ha aderito entro 24 ore. I cheratinociti primari epidermici iso…

Discussion

Questo protocollo descrive un metodo per isolare tre distinte popolazioni cellulari da un singolo pezzo del prepuzio, vale a dire cheratinociti, fibroblasti e cellule di Schwann. Sono disponibili alcuni protocolli di isolamento per isolare cheratinociti e fibroblasti 2,3,5,6, ma nessuno descrive l’isolamento SC. Oltre alle cellule strutturali chiave della pelle, dei cheratinociti e dei fibrobla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare la Dott.ssa Fadia Kamal e la Dott.ssa Reyad Elbarbary per averci permesso di utilizzare strumenti di laboratorio e supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del NIH (K08 AR060164-01A) e DOD (W81XWH-16-1-0725) a J. C. E. oltre al supporto istituzionale della Pennsylvania State University Hershey Medical Center.

Materials

0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) MilliporeSigma SLGPR33RS
70 µM cell strainers CELLTREAT 229483
100 µM cell strainers CELLTREAT 229485
1 mL disposable syringes BD Luer-Lok BD-309659
5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) BD Luer-Lok BD309646
10 mL disposable syringes BD Luer-Lok BD305462
1% TritonX-100 Sigma X100-1L Prepared at the time of use
4% paraformaldehyde solution ThermoFisher Scientific J19943.K2 Ready to use and store at 4 °C
5% BSA Sigma A7906-100G Prepared at the time of use
70% ethanol Pharmco 111000200
Antibiotic ScienCell Research 503
Chemometec Vial1-Cassette Fisher Scientific NC1420193
Collagenase Gibco 17018-029
Coverslip Fisherbrand 12544D 22*50-1.5
Dispase I Sigma-Aldrich D46693
DMEM basal medium ScienCell Research 9221
Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) Corning  21-031-CV)
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339653
1.5 mL micro-centrifuge tubes Fisherbrand 02-681-5
Fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher Scientific 10082147
Fibroblast complete medium ScienCell Research 2331
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Invitrogen A11032 Dilution (1:500)
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008 Dilution (1:500)
Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) Lonza CC-5022
Human foreskin De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574).
KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) Lonza 00192151 and 00192152
Mouse alpha-smooth muscle actin antibody ThermoFisher Scientific 14-9760-82 Dilution (1:200)
Mouse Cytokeratin14 antibody Abcam ab7800 Dilution (1:100)
Mouse S100 antibody ThermoFisher Scientific MA5-12969 Dilution (1:200)
Multi chambered (4 well glass slide) Tab-Tek 154526
NucleoCounter -Via1-Cassette Chemometec 941-0012
Poly-L-Lysisne (PLL) ScienCell Research 32503
ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI Invitrogen P36935
Rabbit K10 antibody Sigma-Aldrich SAB4501656 Dilution (1:100)
Rabbit p75-NTR antibody Millipore AB1554 Dilution (1:500)
Rabbit vimentin ProteinTech 10366-1-AP Dilution (1:200)
Schwann cell culture medium ScienCell Research 1701
Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 ROTH LH75.1 Sterilize with 70% alcohol before use
IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) Codman 54-6500 Sterilize with 70% alcohol before use
Sterilized surgical – sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) Razor blade company 94-0120 Sterilize with 70% alcohol before use
T25 culture flask Corning 353109
Trypsin neutralization buffer (TNS) Lonza CC-5002
Trypsin/EDTA Lonza CC-5012
Inverted microscope ZEISS Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells
Inverted microscope ZEISS Primovert For visulaizing/observing cell attachment or detachment

References

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Cite This Article
Jagadeeshaprasad, M. G., Govindappa, P. K., Nelson, A. M., Elfar, J. C. Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin. J. Vis. Exp. (181), e63776, doi:10.3791/63776 (2022).

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