For at undgå de begrænsninger, der er forbundet med enzymatisk eller mekanisk overførsel af humane embryonale stamceller (hESC’er) og humant inducerede pluripotente stamceller (hiPSC’er), der dyrkes på fødeceller, har vi etableret en hurtig, effektiv, omkostningseffektiv metode med højt udbytte til høst af hESC- eller hiPSC-kolonier, der opretholdes på et fødecellelag af humane forhudsfibroblaster ved hjælp af EDTA-medieret dis-adhæsion.
Humane pluripotente stamceller (humane embryonale stamceller, hESC’er og humant inducerede pluripotente stamceller, hiPSC’er) blev oprindeligt dyrket på forskellige typer fødeceller til vedligeholdelse i en udifferentieret tilstand i langvarig kultur. Denne tilgang er i vid udstrækning blevet erstattet af feeder-fri kulturprotokoller, men disse involverer dyrere reagenser og kan fremme en overgang til en primet tilstand, hvilket begrænser cellernes differentieringskapacitet. Under både feeder- og feederfrie forhold er høst af hESC- eller hiPSC-kolonier til passaging en nødvendig procedure for at udvide kulturerne.
For at give en nem og højtydende procedure til overførsel af hESC’er/hiPSC’er, der dyrkes på fødeceller, har vi etableret en høstmetode ved hjælp af vedhæftning fremkaldt af calciumchelatoren ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA). Vi har vurderet udbyttet og kvaliteten af de resulterende passerede celler ved at sammenligne denne tilgang med den oprindelige mekaniske høstmetode, hvor kolonier isoleres med en skalpel under et mikroskop (mekanisk høst blev valgt som komparator for at undgå reagensvariabiliteten forbundet med enzymatisk høst).
I et sæt eksperimenter blev to forskellige hESC-linjer opretholdt på et fødecellelag af humane forhudsfibroblaster. Hver linje blev udsat for flere passager ved hjælp af EDTA-baseret eller mekanisk høst og vurderet for kolonistørrelse og morfologi, celletæthed, stamhedsmarkørekspression, differentiering til de tre kimlag i embryoidlegemer og genomiske aberrationer. I et andet sæt eksperimenter brugte vi EDTA-baseret høst på to forskellige hiPSC-linjer og opnåede lignende resultater. EDTA-induceret vedhæftning sparede tid og gav et højere udbytte af kolonier af en mere gunstig størrelse og mere ensartet morfologi sammenlignet med mekanisk høst. Det var også hurtigere end enzymatisk høst og ikke tilbøjelig til enzymbatchvariabilitet. EDTA-induceret dis-adhæsionsmetoden letter også overførslen af hESC/hiPSC-linjer fra fødecellebaseret kultur til føderfrie betingelser, hvis det ønskes til downstream-brug og analyse.
Korrekt vedligeholdelse af hESC’er og hiPSC’er in vitro er en grundlæggende og praktisk metode til flere forskningsveje inden for human celle- og udviklingsbiologi. På grund af hESC’ers og hiPSC’ers iboende drivkraft til at differentiere kræver opretholdelse af den udifferentierede tilstand in vitro særlig omhu og opmærksomhed. Udvikling af omkostningseffektive protokoller til vedligeholdelse og overførsel af hESC’er og hiPSC’er med så lidt metodologisk variation som muligt er således af stor generel nytteværdi.
Oprindeligt blev hESC’er og hiPSC’er dyrket på forskellige typer fødeceller for at hjælpe med den langsigtede dyrkning og vedligeholdelse af den udifferentierede tilstand 1,2,3. For nylig er kultur under feederfrie forhold blevet normen, da den helt undgår at håndtere fødeceller4. Nogle laboratorier og kernefaciliteter dyrker dog stadig hESC’er eller hiPSC’er på fødeceller. Feederfri kultur er dyrere, fordi den kræver brug af kulturmedier med specielle sammensætninger og en eller anden form for belægning af kulturoverfladen for at sikre kolonivedhæftning (større ekstracellulære matrixkomponenter [ECM] eller en kommerciel ECM-forbindelse eller ved hjælp af kommercielt tilgængelige coatede plader). Udgiften er ikke ubetydelig og udgør en potentiel økonomisk hindring for nogle laboratorier, der er interesserede i at forfølge hESC- eller hiPSC-baseret forskning og udvikling. Desuden har kultur under feederfrie forhold tendens til at drive hESC’erne og hiPSC’erne til en mindre naiv tilstand end den, der opretholdes på fødeceller5, og dette kan kompromittere efterfølgende differentiering og føre til genetiske variationer6.
Historisk set involverede overførslen af hESC’er og hiPSC’er dyrket på fødeceller mekanisk høst – ved hjælp af en skalpel til punktafgiftskolonier under et mikroskop7 – men dette blev senere stort set erstattet af enzymatisk fordøjelse med eller uden blid skrabning for at isolere kolonier eller dissocierede celler. Mekanisk høst er kedelig og kræver præcisionsmikrokirurgi. Enzymatisk høst kan variere i effektivitet på grund af batch-til-batch enzymforskelle og har tendens til at favorisere fuldstændig dissociation, hvilket fremmer celledød, medmindre det modvirkes af ROCK-hæmmere 8,9 og øger forekomsten af unormale karyotyper9.
For at drage fordel af de lavere omkostninger og større differentieringspotentiale ved dyrkning af hESC’er og hiPSC’er på føderceller og samtidig undgå ulemperne ved mekanisk og enzymatisk høst har vi etableret en hurtig, effektiv, omkostningseffektiv metode med højt udbytte til høst af hESC- og hiPSC-kolonier, der opretholdes på et fødelag af humane forhudsfibroblaster ved hjælp af EDTA-medieret dis-vedhæftning. Vi har sammenlignet udbyttet, variabiliteten og stamcellekvaliteten med det, der opnås ved mekanisk høst (vi sammenlignede ikke med enzymatisk fordøjelse på grund af den ekstra variabilitet, denne tilgang indebærer). Vi bemærker, at EDTA-medieret vedhæftning også fungerer godt til overførsel af kolonier fra feeder-baseret kultur til feeder-frie forhold, hvis det ønskes til downstream-brug og analyser. Denne metode giver en overgang med en konsekvent passaging-metode, da EDTA-induceret dis-adhæsion er en populær tilgang, der anvendes til feederfrie kulturer.
Vi har beskrevet en hurtig og omkostningseffektiv metode til høst af hESC’er og hiPSC’er dyrket på fødeceller ved hjælp af EDTA-medieret vedhæftning og sammenlignet dette primært med den konventionelle metode til mekanisk høst ved hjælp af en skalpel. Vi sammenlignede også EDTA-baseret høst med enzymatisk høst med hensyn til metodens hastighed, men ikke aspekter af den resulterende kolonikvalitet. Årsagen til dette er, at enzymatisk høst i sagens natur er mere variabel og har været forbundet med en højere forekomst af genomiske aberrationer5, hvilket kunne skjule forskellene mellem metoderne.
Vi demonstrerer, at EDTA-baseret høst er hurtigere og mere effektiv end nogen af de andre metoder og genererer mindre og morfologisk mere homogene kolonier end mekanisk høst. Denne sidstnævnte funktion er gavnlig med hensyn til celleoverlevelse, da de større klumper opnået med mekanisk høst er tilbøjelige til central nekrose, mens enzymatisk fordøjelse har tendens til at generere isolerede hESC’er og hiPSC’er, som er mere tilbøjelige til apoptose og kræver ekstra behandling, for eksempel med ROCK-hæmmere, for at overleve. EDTA-baseret høst kan bruges til mindst 20 passager. De EDTA-baserede og mekaniske høstmetoder er sammenlignelige, når det kommer til kolonicelletæthed, mRNA og proteinekspression af stammegener, differentiering af de tre kimlag i embryoidlegemer og genomiske abnormiteter. Hvis målet er effektivitet, højere udbytte, mindre variabilitet og mere skånsom håndtering af hESC’er og hiPSC’er, foretrækkes EDTA-baseret høst.
Vi bemærker også, at EDTA-baseret høst af hESC’er og hiPSC’er dyrket på fødeceller er en billig måde at opretholde en mere naiv tilstand på og giver en jævn overgang fra feederbaseret til feederfri kultur, hvor dette er ønskeligt.
Kritiske trin i protokollen
De mest kritiske trin i EDTA-medieret dis-adhæsion er protokolafsnit 3 (inkubation i EDTA-opløsningen) og afsnit 4 (trituration). Hvis eksponeringen for EDTA-opløsningen er længere end 1 min, øges risikoen for fuldstændig dissociation til enkeltceller. Dette kan også forekomme, hvis triturationen er for langvarig eller for hård. Sidstnævnte påvirkes af pipettens spidsstørrelse. Brug af 1 ml cellekulturpipetter som beskrevet her er ideel. Brug af en anden type pipette med en mindre spidsdiameter er risikabelt.
Fejlfinding
Hvis fødecellerne fortsætter med at sprede sig, har mitotisk anholdelse ikke været effektiv, og en ny batch skal tages, og proceduren genstartes. Hvis kolonierne ikke løsner sig fra fødecellelaget, skal man sørge for, at der ikke er Ca2+ i EDTA, og at dyrkningsskålen, der indeholder kolonierne, skylles godt med PBS for at fjerne eventuelt resterende cellekulturmedium, før EDTA tilsættes. For meget dissociation, som genererer isolerede celler eller celleklumper, der er for små, kan opstå på grund af overdreven trituration og kompromitterer etableringen af nye kolonier. Triturationsgraden bør bestemmes empirisk i forsøgskørsler af protokollen for at bekræfte, at de resulterende celleklumper er ~ 60 μm i diameter. Hvis føderlaget løsner sig spontant fra dyrkningslaget, især før hESC’erne/hiPSC’erne er klar til høst, kan det skyldes, at fødecellerne ikke er blevet brugt inden for ~7 dage efter tilberedning. Derfor bør tidsrammen for brug af fødercellerne overvåges nøje. Hvis føderlaget dissocieres under EDTA-eksponering (noget vi aldrig har observeret med de fødeceller, der anvendes her), skal enten typen af fødecelle eller deres dyrkningsmetode ændres.
Begrænsninger af teknikken
Den største begrænsning af teknikken er, at den kræver visuel inspektion af vedhæftningsprocessen for at opnå et vellykket resultat. Det betyder, at brugerne skal lære at identificere, hvornår kolonierne frigives fra fødecellelaget, og fødecellelaget løsner sig fra substratet. Dette er dog ikke svært, og efter vores erfaring kan nye brugere af teknikken mestre det inden for et par forsøg.
Der er også en iboende mulighed for, at de høstede hESC’er eller hiPSC’er kan være forurenet af nogle få fødeceller. Hvis hensigten er at overføre til ikke-føderforhold eller at isolere hESC’erne eller hiPSC’erne til assays, vil en sådan kontaminering kompromittere renheden. Vi bemærker, at med de føderceller, der anvendes her (humane forhudfibroblaster), er det ekstremt vanskeligt at adskille fødercellelaget, selv med enzymatisk fordøjelse (ikke vist). Da det ikke-dissocierede fødecellelag fjernes i toto, vil kontaminering af de høstede hESC’er eller hiPSC’er sandsynligvis være ubetydelig. Da fødecellerne desuden er mitotisk arresteret, vil enhver kontaminering i sidste ende falde til nul med yderligere passage af hESC’erne eller hiPSC’erne.
Betydning i forhold til eksisterende metoder
Den nuværende norm for dyrkning af hESC’er og hiPSC’er er at gøre det under feederfrie forhold, hvor brugen af EDTA til passaging er udbredt. Feederfri kultur afhænger af brugen af specielt formulerede medier og kultursubstrater, der sikrer vedhæftning. Disse reagenser medfører en ekstra udgift, der kan overstige nogle laboratoriebudgetter. Derudover har kultur under feederfrie forhold været forbundet med et forstyrret differentieringspotentiale på grund af manglen på specifikke faktorer i de feederfrie kulturmedier og en deraf følgende overgang fra den naive tilstand til den primede tilstand. Vækst på mitotisk arresterede fødeceller undgår denne overgang og kan bringe de samlede omkostninger ned på et håndterbart niveau og dermed lette den bredere anvendelse af pluripotente stamceller i laboratorieforskning.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Lars Moen for hjælp under indledende forsøg og den norske kernefacilitet for humane pluripotente stamceller ved det norske center for stamcelleforskning, Oslo Universitetshospital, for brugen af faciliteter. H9 hESC linjen blev opnået fra WiCell, og HS429 hESC linjen blev opnået fra Outi Hovatta på Karolinska Institutet. Begge blev brugt i overensstemmelse med aftaler om materialeoverførsel. NCS001 og NCS002 hiPSC-linjerne blev genereret af den norske kernefacilitet for humane pluripotente stamceller. Denne omprogrammering og alt det arbejde, der rapporteres her, blev udført med godkendelse fra den sydøstlige norske regionale etiske komité (godkendelse REK 2017/110).
0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
15 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
2-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
50 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
Basic fibroblast growth factor (bFGF) | PeproTech | AF-100-18B-250UG | |
Brand Bürker Chamber | Fisher Scientific | 10628431 | |
Disposable scalpels no.15 | Susann-Morton | 505 | |
DPBS (1x) without Ca/Mg | Gibco | 14190-094 | |
Easy Grip tissue culture dish, 35 x 10 mm | Falcon | 353001 | |
Eppendorf pipette 1 mL | Eppendorf | ||
Eppendorf pipette 200 μL | Eppendorf | ||
FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 10270-106 | |
Filter tip 1,000 μL | Sarstedt | 70.1186.210 | |
Filter tip 200 μL | Sarstedt | 70.760.211 | |
Gamma Cell 3000 ELAN irradiation machine (alternatively, use Mitomycin C to arrest proliferation) | Best Theratronics | BT/MTS 8007 GC3000E | |
Glutamax 100x | Gibco | 35050-038 | |
Growth Factor Reduced Matrixgel | Corning | 734-0269 | |
H9 hESC line | WiCell | WAe009-A | |
hPSC Genetic Analysis Kit | Stem Cell Technologies | #07550 | |
HS429 hESC line | ECACC | KIe024-A | |
Human Foreskin Fibroblasts -CRL2429 line | ATTC | CRL2429 | |
IMDM (1x) | Gibco | 21980-032 | |
iPSC lines | Norwegian Core Facility for Human Pluripotent Stem Cells | NCS001 & NCS002 | |
Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
Laser Scanning Confocal Microscope or equivalent (we use the LSM 700 from Zeiss) | Zeiss | ||
Microscope | CETI | ||
Mitomycin C | Sigma Aldrich | M4287 | |
Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140.035 | |
Pipettes, plastic 10 mL | Sarstedt | 86.1254.001 | |
Pipettes, plastic, 5 mL | Sarstedt | 86.1253.001 | |
Serum Replacement (SR) | Gibco | 10828-028 | |
Sterile filters 0.22 um | Sarstedt | 83.1826.102 | |
T-75 culture flask | ThermoScientific | 156499 | |
Trypan Blue Stain (0.4 %) | Gibco | 15250-061 | |
Trypsin-EDTA, 500 mL | Gibco | 25300062 |