يتيح الفحص المجهري لتوسيع الاحتفاظ بالملصقات (LR-ExM) التصوير فائق الدقة ووضع العلامات عالي الكفاءة
Summary
يتم عرض بروتوكول للفحص المجهري لتوسيع الاحتفاظ بالملصقات (LR-ExM). تستخدم LR-ExM مجموعة جديدة من المراسي ثلاثية الوظائف ، والتي توفر كفاءة أفضل في وضع العلامات مقارنة بمجهر التوسع التي تم إدخالها سابقا.
Abstract
المجهر التوسعي (ExM) هو تقنية تحضير العينات التي يمكن دمجها مع معظم طرق الفحص المجهري الضوئي لزيادة الدقة. بعد تضمين الخلايا أو الأنسجة في هيدروجيل قابل للتضخم ، يمكن توسيع العينات فيزيائيا من ثلاثة إلى ستة عشر ضعفا (البعد الخطي) مقارنة بالحجم الأصلي. لذلك ، يتم زيادة الدقة الفعالة لأي مجهر بواسطة عامل التوسع. أحد القيود الرئيسية على ExM الذي تم إدخاله سابقا هو تقليل التألق بعد البلمرة وإجراء الهضم. وللتغلب على هذا القيد، تم تطوير الفحص المجهري لتوسيع نطاق الاحتفاظ بالملصقات (LR-ExM)، الذي يمنع فقدان الإشارة ويعزز إلى حد كبير كفاءة وضع العلامات باستخدام مجموعة من المراسي ثلاثية الوظائف الجديدة. تسمح هذه التقنية للمرء بتحقيق دقة أعلى عند التحقيق في الهياكل الخلوية أو دون الخلوية على نطاق نانومتري مع الحد الأدنى من فقدان إشارة الفلورسنت. يمكن استخدام LR-ExM ليس فقط لوضع العلامات على التألق المناعي ، ولكن أيضا مع علامات البروتين ذاتية الوسم ، مثل علامات SNAP و CLIP ، وبالتالي تحقيق كفاءة أعلى في وضع العلامات. يقدم هذا العمل الإجراء واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لهذا النهج القائم على التلطيخ المناعي ، بالإضافة إلى مناقشة نهج وضع العلامات الذاتية ل LR-ExM كبديل.
Introduction
تم استخدام المجهر التوسعي (ExM) من قبل الباحثين منذ تقديمه لأول مرة كنهج مناسب لتحقيق تصوير فائق الدقة باستخدام المجاهر التقليدية ، مثل المجاهر فوق الفلورية والمجاهر البؤرية1،2،3،4،5،6،7 . باستخدام ExM ، من الممكن تحقيق دقة جانبية ~ 70 نانومتر حتى مع المجاهر البؤرية العادية. عندما يتم دمج ExM مع التصوير فائق الدقة ، يتم تحسين الدقة بشكل أكبر. على سبيل المثال ، يمكن للمرء تحقيق دقة 30 نانومتر تقريبا باستخدام مجهر الإضاءة المنظم (SIM) ، ودقة 4 نانومتر تقريبا باستخدام مجهر إعادة الإعمار البصري العشوائي (STORM) 1,5.
ومع ذلك ، فإن كفاءة وضع العلامات المنخفضة هي مشكلة حرجة في طرق ExM القياسية. يمكن أن يختلف فقدان التألق بناء على نوع مجموعات الفلورسنت ووقت الهضم. ومع ذلك ، في المتوسط ، تم الإبلاغ عن فقدان أكثر من 50٪ من الفلوروفورات بعد البلمرة وخطوات هضم البروتين في ExM ، مما يضر بجودة التصوير 3,4.
وهكذا، تم تطوير الفحص المجهري لتوسيع نطاق الاحتفاظ بالملصقات (LR-ExM)، والذي يمكنه الاحتفاظ بالملصقات بكفاءة وتقليل فقدان الإشارة1. الابتكار الرئيسي ل LR-ExM هو استخدام مجموعة من المراسي ثلاثية الوظائف بدلا من مجرد استخدام أصباغ الفلورسنت – كما هو الحال في إجراء ExM القياسي – لتلطيخ البروتينات ذات الأهمية. تتكون هذه الروابط ثلاثية الوظائف من ثلاثة أجزاء: (1) الموصل (على سبيل المثال ، N-hydroxysuccinimide (NHS)) للاتصال بالجسم المضاد ، (2) المرساة (على سبيل المثال ، ميثاكريلاميد (MA)) لتثبيت البروتينات على البوليمر ، و (3) المراسل (على سبيل المثال ، البيوتين أو الديجوكسيجينين (DIG)) للاقتران بصبغة عضوية. تنجو المراسي ثلاثية الوظائف من خطوات البلمرة وهضم البروتين ، وبالتالي تمنع فقدان الفلوروفور.
علاوة على ذلك ، تحمل هذه الطريقة إمكانات كبيرة لأنها متوافقة مع العلامات الأنزيمية ذاتية التصنيف مثل SNAP أو CLIP. نهج العلامة الأنزيمية لها بعض الفوائد على نهج تلطيخ المناعة فيما يتعلق بالخصوصية العالية وكفاءة وضع العلامات8،9،10.
في هذه المخطوطة، يظهر إجراء مفصل ل LR-ExM. LR-ExM هي طريقة فعالة ومرنة للغاية لتحقيق دقة مكانية عالية مع تحسين كفاءة وضع العلامات.
Protocol
Representative Results
Discussion
الابتكار الرئيسي ل LR-ExM هو استخدام المراسي ثلاثية الوظائف لتسمية البروتينات المستهدفة بفعالية وتحسين جودة الصورة. هذه الطريقة محدودة بالمراسي ثلاثية الوظائف ، والتي ليست متاحة بسهولة للباحثين. ومع ذلك ، يمكن مشاركة المراسي ثلاثية الوظائف مع باحثين آخرين عند الطلب ، وتتوفر الآن منتجات مم?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة (R00 GM126136 to X.S.) والمؤسسة الوطنية الأمريكية للعلوم (DMS1763272 to S.P.) ومؤسسة سيمونز (594598 إلى S.P).
Materials
| Acrylamide | Sigma | A9099 | ExM Gel |
| AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 711–005-152 | Antibody |
| AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 712–005-153 | Antibody |
| Alexa Fluor 488-Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-540-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-580-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 647 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-600-084 | Fluorescent probes |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | ExM Gel |
| anti-H3K4me3 | Abcam | ab8580 | Antibody |
| anti-H3K9me3 | Abcam | ab176916 | Antibody |
| DAPI dilacetate | Thermofisher Scientific | D3571 | Fluorescent probes |
| DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7488 | Fluorescent probes |
| DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7594 | Fluorescent probes |
| EGTA | EMD Millipore Corp. | 324626-25GM | Fixation buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | EDTA | Digestion buffer |
| Glutaraldehyde 10% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 50-262-13 | Anchoring |
| Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass | Grace Bio-Labs | GBL112358-8EA | Cell culture chamber |
| Grace Bio-Labs CultureWell removal tool | Grace Bio-Labs | GBL103259 | Removal tool |
| Guanidine HCl | Sigma | G3272 | Digestion buffer |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266-1KG | Fixation buffer |
| McCoy's 5a | ATCC | 30–2007 | Celll culture medium |
| Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98% (MA-NHS) | Sigma | 730300-1G | Anchoring |
| monoclonal mouse anti-Nup153 antibody | Abcam | ab24700 | Antibody |
| N,N′Methylenebisacrylamide | Sigma | M7279 | ExM Gel |
| N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024 | ExM Gel |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions | Electron Microscopy Sciences | 50-980-487 | Fixation buffer |
| PIPES | Sigma | P6757-25G | Fixation buffer |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920-100ML | Chamber coating |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P4850-5ML | Digestion buffer |
| Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody | Abcam | ab21679 | Antibody |
| rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2 | Millipore Sigma | MAB1864-I | Antibody |
| Sodium Acrylate | Sigma | 408220 | ExM Gel |
| Streptavidin / Biotin blocking kit | Vector Laboratories | SP-2002 | Blocking buffer |
| Tris-HCl | Life Technologies | AM9855 | Digestion buffer |
| U2OS | ATCC | HTB-96 | Cell line |
| 6 well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Imaging plate |
References
- Shi, X., et al. Label-retention expansion microscopy. The Journal of Cell Biology. 220 (9), 202105067 (2021).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Wang, Y., et al. Combined expansion microscopy with structured illumination microscopy for analyzing protein complexes. Nature Protocols. 13 (8), 1869-1895 (2018).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super resolution imaging of three-dimensional protein localization in size adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
- Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (27), 9955-9959 (2004).
- Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super resolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (19), 45836 (2018).
- Damstra, H. G. J., et al. Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx). eLife. 11, 73775 (2021).
- M’Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850 (2020).
