Summary

Lr-ExM(Label-Retention Expansion Microscopy) muliggør billedbehandling i superopløsning og højeffektiv mærkning

Published: October 11, 2022
doi:

Summary

En protokol for udvidelsesmikroskopi af etiketretention (LR-ExM) er demonstreret. LR-ExM bruger et nyt sæt trifunktionelle ankre, som giver bedre mærkningseffektivitet sammenlignet med tidligere introducerede ekspansionsmikroskopier.

Abstract

Ekspansionsmikroskopi (ExM) er en prøveforberedelsesteknik, der kan kombineres med de fleste lysmikroskopimetoder for at øge opløsningen. Efter indlejring af celler eller væv i svulmende hydrogel kan prøver fysisk udvides tre til seksten gange (lineær dimension) sammenlignet med den oprindelige størrelse. Derfor øges den effektive opløsning af ethvert mikroskop med ekspansionsfaktoren. En væsentlig begrænsning af den tidligere introducerede ExM er reduceret fluorescens efter polymerisation og fordøjelsesproceduren. For at overvinde denne begrænsning er der udviklet udvidelsesmikroskopi af etiketretention (LR-ExM), som forhindrer signaltab og i høj grad forbedrer mærkningseffektiviteten ved hjælp af et sæt nye trifunktionelle ankre. Denne teknik gør det muligt for en at opnå højere opløsning, når man undersøger cellulære eller subcellulære strukturer på nanometrisk skala med minimalt fluorescerende signaltab. LR-ExM kan bruges ikke kun til immunfluorescensmærkning, men også med selvmærkede proteinmærker, såsom SNAP- og CLIP-tags, og dermed opnå højere mærkningseffektivitet. Dette arbejde præsenterer proceduren og fejlfinding for denne immunostaining-baserede tilgang samt diskussion af selvmærkningsmærkningsmetoder for LR-ExM som et alternativ.

Introduction

Ekspansionsmikroskopi (ExM) er blevet brugt af forskere, siden den først blev introduceret som en bekvem tilgang til at opnå superopløsningsbilleddannelse med konventionelle mikroskoper, såsom epifluorescens og konfokale mikroskoper 1,2,3,4,5,6,7 . Ved hjælp af ExM er det muligt at opnå ~ 70 nm lateral opløsning selv med almindelige konfokale mikroskoper. Når ExM kombineres med superopløsningsbilleddannelse, forbedres opløsningen yderligere. For eksempel kan man opnå ca. 30 nm opløsning med struktureret belysningsmikroskopi (SIM) og ca. 4 nm opløsning med stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM)1,5.

Imidlertid er lav mærkningseffektivitet et kritisk problem med standard ExM-metoder. Fluorescenstab kan variere afhængigt af typen af fluorescerende grupper og fordøjelsestid. I gennemsnit er det imidlertid blevet rapporteret, at mere end 50% af fluorophorer går tabt efter polymerisationen og proteinfordøjelsestrinnene i ExM, hvilket er skadeligt for billeddannelseskvaliteten 3,4.

Således er der udviklet udvidelsesmikroskopi af etiketretention (LR-ExM), som effektivt kan bevare etiketter og reducere signaltab1. Den vigtigste innovation i LR-ExM er brugen af et sæt trifunktionelle ankre i stedet for blot at bruge fluorescerende farvestoffer – som i standard ExM-proceduren – til farvning af proteiner af interesse. Disse trifunktionelle linkere består af tre dele: (1) stikket (f.eks. N-hydroxysuccinimid (NHS)) til at forbinde til antistoffet, (2) ankeret (f.eks. methacrylamid (MA)) til at forankre proteiner til polymeren og (3) reporteren (f.eks. biotin eller digoxigenin (DIG)) til at konjugere til et organisk farvestof. De trifunktionelle ankre overlever polymerisations- og proteinfordøjelsestrinnene og forhindrer derfor fluorophortab.

Desuden har denne metode et stort potentiale, da den er kompatibel med selvmærkede enzymatiske tags som SNAP eller CLIP. Enzymatiske tagmetoder har nogle fordele i forhold til immunostaining-tilgangen med hensyn til høj specificitet og mærkningseffektivitet 8,9,10.

I dette manuskript demonstreres en detaljeret procedure for LR-ExM. LR-ExM er en yderst effektiv og fleksibel metode til at opnå høj rumlig opløsning med forbedret mærkningseffektivitet.

Protocol

1. Cellekultur Brug U2OS-celler dyrket i McCoys 5A-medium suppleret med 10% FBS ved 37 °C i 5% CO2. Kulturceller på et 16 godt aftageligt kammerdækglas (kulturareal 0,4 cm2) for nem håndtering. 2. Fiksering og permeabilisering BEMÆRK: Fikserings- og permeabiliseringsbetingelser afhænger af de optimerede immunostaining-protokoller. Følgende er en fikserings- og permeabiliseringspro…

Representative Results

Clathrinbelagte gruber (CCP’er) immunfarves ved hjælp af trifunktionelle ankre (figur 1B), og LR-ExM udføres som beskrevet i figur 1A. LR-ExM (figur 2C,E) viser meget højere fluorescensintensitet sammenlignet med proteinretentionsekspansionsmikroskopi (proExM, figur 2A) eller biotin-ExM (figur 2B); signalet for LR-ExM var ca. seks gange højere end proEx…

Discussion

Den vigtigste innovation i LR-ExM er at bruge trifunktionelle ankre til effektivt at mærke målproteinerne og forbedre billedkvaliteten. Denne metode er begrænset af trifunktionelle ankre, som ikke er så let tilgængelige for forskere. Trifunktionelle ankre kan dog deles med andre forskere efter anmodning, og lignende produkter som ExM-sonder fra Chrometa er nu også kommercielt tilgængelige.

I denne protokol er 1 timers inkubation ved stuetemperatur blevet udført for de primære og sekun…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af U.S. National Institutes of Health (R00 GM126136 til X.S.), US National Science Foundation (DMS1763272 til S.P.) og Simons Foundation (594598 til S.P.).

Materials

Acrylamide  Sigma  A9099  ExM Gel
AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch H+L, 711–005-152 Antibody
AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG Jackson ImmunoResearch H+L, 712–005-153 Antibody
Alexa Fluor 488-Streptavidin Jackson ImmunoResearch 016-540-084 Fluorescent probes 
Alexa Fluor 594 Streptavidin Jackson ImmunoResearch 016-580-084 Fluorescent probes 
Alexa Fluor 647 Streptavidin Jackson ImmunoResearch 016-600-084 Fluorescent probes 
Ammonium Persulfate  Sigma  A3678  ExM Gel
anti-H3K4me3 Abcam ab8580 Antibody
anti-H3K9me3 Abcam ab176916 Antibody
DAPI dilacetate Thermofisher Scientific D3571 Fluorescent probes 
DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) Vector Laboratories DI-7488 Fluorescent probes 
DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) Vector Laboratories DI-7594 Fluorescent probes 
EGTA EMD Millipore Corp. 324626-25GM Fixation buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid  Sigma  EDTA Digestion buffer
Glutaraldehyde 10% EM Grade Electron Microscopy Sciences 50-262-13 Anchoring
Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass Grace Bio-Labs  GBL112358-8EA Cell culture chamber
Grace Bio-Labs CultureWell removal tool Grace Bio-Labs  GBL103259 Removal tool
Guanidine HCl  Sigma  G3272  Digestion buffer
Magnesium chloride Sigma M8266-1KG Fixation buffer
McCoy's 5a ATCC 30–2007 Celll culture medium
Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98%  (MA-NHS) Sigma  730300-1G Anchoring
monoclonal mouse anti-Nup153 antibody Abcam ab24700 Antibody
N,N′Methylenebisacrylamide  Sigma  M7279  ExM Gel
N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma  T7024  ExM Gel
16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions Electron Microscopy Sciences 50-980-487 Fixation buffer
PIPES Sigma P6757-25G Fixation buffer
Poly-L-Lysine Sigma P8920-100ML Chamber coating
Proteinase K  Sigma-Aldrich P4850-5ML Digestion buffer
Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody Abcam ab21679 Antibody
rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2 Millipore Sigma MAB1864-I Antibody
Sodium Acrylate  Sigma 408220 ExM Gel
Streptavidin / Biotin blocking kit Vector Laboratories SP-2002 Blocking buffer
Tris-HCl  Life Technologies  AM9855  Digestion buffer
U2OS ATCC HTB-96 Cell line
6 well glass bottom plates Cellvis P06-1.5H-N Imaging plate

References

  1. Shi, X., et al. Label-retention expansion microscopy. The Journal of Cell Biology. 220 (9), 202105067 (2021).
  2. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  3. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
  4. Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
  5. Wang, Y., et al. Combined expansion microscopy with structured illumination microscopy for analyzing protein complexes. Nature Protocols. 13 (8), 1869-1895 (2018).
  6. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  7. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super resolution imaging of three-dimensional protein localization in size adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  8. Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  9. Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (27), 9955-9959 (2004).
  10. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super resolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  11. Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (19), 45836 (2018).
  12. Damstra, H. G. J., et al. Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx). eLife. 11, 73775 (2021).
  13. M’Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850 (2020).

Play Video

Cite This Article
Park, S., Zhuang, Y., Shi, X. Label-Retention Expansion Microscopy (LR-ExM) Enables Super-Resolution Imaging and High-Efficiency Labeling. J. Vis. Exp. (188), e63793, doi:10.3791/63793 (2022).

View Video