En protokol for udvidelsesmikroskopi af etiketretention (LR-ExM) er demonstreret. LR-ExM bruger et nyt sæt trifunktionelle ankre, som giver bedre mærkningseffektivitet sammenlignet med tidligere introducerede ekspansionsmikroskopier.
Ekspansionsmikroskopi (ExM) er en prøveforberedelsesteknik, der kan kombineres med de fleste lysmikroskopimetoder for at øge opløsningen. Efter indlejring af celler eller væv i svulmende hydrogel kan prøver fysisk udvides tre til seksten gange (lineær dimension) sammenlignet med den oprindelige størrelse. Derfor øges den effektive opløsning af ethvert mikroskop med ekspansionsfaktoren. En væsentlig begrænsning af den tidligere introducerede ExM er reduceret fluorescens efter polymerisation og fordøjelsesproceduren. For at overvinde denne begrænsning er der udviklet udvidelsesmikroskopi af etiketretention (LR-ExM), som forhindrer signaltab og i høj grad forbedrer mærkningseffektiviteten ved hjælp af et sæt nye trifunktionelle ankre. Denne teknik gør det muligt for en at opnå højere opløsning, når man undersøger cellulære eller subcellulære strukturer på nanometrisk skala med minimalt fluorescerende signaltab. LR-ExM kan bruges ikke kun til immunfluorescensmærkning, men også med selvmærkede proteinmærker, såsom SNAP- og CLIP-tags, og dermed opnå højere mærkningseffektivitet. Dette arbejde præsenterer proceduren og fejlfinding for denne immunostaining-baserede tilgang samt diskussion af selvmærkningsmærkningsmetoder for LR-ExM som et alternativ.
Ekspansionsmikroskopi (ExM) er blevet brugt af forskere, siden den først blev introduceret som en bekvem tilgang til at opnå superopløsningsbilleddannelse med konventionelle mikroskoper, såsom epifluorescens og konfokale mikroskoper 1,2,3,4,5,6,7 . Ved hjælp af ExM er det muligt at opnå ~ 70 nm lateral opløsning selv med almindelige konfokale mikroskoper. Når ExM kombineres med superopløsningsbilleddannelse, forbedres opløsningen yderligere. For eksempel kan man opnå ca. 30 nm opløsning med struktureret belysningsmikroskopi (SIM) og ca. 4 nm opløsning med stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM)1,5.
Imidlertid er lav mærkningseffektivitet et kritisk problem med standard ExM-metoder. Fluorescenstab kan variere afhængigt af typen af fluorescerende grupper og fordøjelsestid. I gennemsnit er det imidlertid blevet rapporteret, at mere end 50% af fluorophorer går tabt efter polymerisationen og proteinfordøjelsestrinnene i ExM, hvilket er skadeligt for billeddannelseskvaliteten 3,4.
Således er der udviklet udvidelsesmikroskopi af etiketretention (LR-ExM), som effektivt kan bevare etiketter og reducere signaltab1. Den vigtigste innovation i LR-ExM er brugen af et sæt trifunktionelle ankre i stedet for blot at bruge fluorescerende farvestoffer – som i standard ExM-proceduren – til farvning af proteiner af interesse. Disse trifunktionelle linkere består af tre dele: (1) stikket (f.eks. N-hydroxysuccinimid (NHS)) til at forbinde til antistoffet, (2) ankeret (f.eks. methacrylamid (MA)) til at forankre proteiner til polymeren og (3) reporteren (f.eks. biotin eller digoxigenin (DIG)) til at konjugere til et organisk farvestof. De trifunktionelle ankre overlever polymerisations- og proteinfordøjelsestrinnene og forhindrer derfor fluorophortab.
Desuden har denne metode et stort potentiale, da den er kompatibel med selvmærkede enzymatiske tags som SNAP eller CLIP. Enzymatiske tagmetoder har nogle fordele i forhold til immunostaining-tilgangen med hensyn til høj specificitet og mærkningseffektivitet 8,9,10.
I dette manuskript demonstreres en detaljeret procedure for LR-ExM. LR-ExM er en yderst effektiv og fleksibel metode til at opnå høj rumlig opløsning med forbedret mærkningseffektivitet.
Den vigtigste innovation i LR-ExM er at bruge trifunktionelle ankre til effektivt at mærke målproteinerne og forbedre billedkvaliteten. Denne metode er begrænset af trifunktionelle ankre, som ikke er så let tilgængelige for forskere. Trifunktionelle ankre kan dog deles med andre forskere efter anmodning, og lignende produkter som ExM-sonder fra Chrometa er nu også kommercielt tilgængelige.
I denne protokol er 1 timers inkubation ved stuetemperatur blevet udført for de primære og sekun…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af U.S. National Institutes of Health (R00 GM126136 til X.S.), US National Science Foundation (DMS1763272 til S.P.) og Simons Foundation (594598 til S.P.).
Acrylamide | Sigma | A9099 | ExM Gel |
AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 711–005-152 | Antibody |
AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 712–005-153 | Antibody |
Alexa Fluor 488-Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-540-084 | Fluorescent probes |
Alexa Fluor 594 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-580-084 | Fluorescent probes |
Alexa Fluor 647 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-600-084 | Fluorescent probes |
Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | ExM Gel |
anti-H3K4me3 | Abcam | ab8580 | Antibody |
anti-H3K9me3 | Abcam | ab176916 | Antibody |
DAPI dilacetate | Thermofisher Scientific | D3571 | Fluorescent probes |
DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7488 | Fluorescent probes |
DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7594 | Fluorescent probes |
EGTA | EMD Millipore Corp. | 324626-25GM | Fixation buffer |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | EDTA | Digestion buffer |
Glutaraldehyde 10% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 50-262-13 | Anchoring |
Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass | Grace Bio-Labs | GBL112358-8EA | Cell culture chamber |
Grace Bio-Labs CultureWell removal tool | Grace Bio-Labs | GBL103259 | Removal tool |
Guanidine HCl | Sigma | G3272 | Digestion buffer |
Magnesium chloride | Sigma | M8266-1KG | Fixation buffer |
McCoy's 5a | ATCC | 30–2007 | Celll culture medium |
Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98% (MA-NHS) | Sigma | 730300-1G | Anchoring |
monoclonal mouse anti-Nup153 antibody | Abcam | ab24700 | Antibody |
N,N′Methylenebisacrylamide | Sigma | M7279 | ExM Gel |
N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024 | ExM Gel |
16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions | Electron Microscopy Sciences | 50-980-487 | Fixation buffer |
PIPES | Sigma | P6757-25G | Fixation buffer |
Poly-L-Lysine | Sigma | P8920-100ML | Chamber coating |
Proteinase K | Sigma-Aldrich | P4850-5ML | Digestion buffer |
Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody | Abcam | ab21679 | Antibody |
rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2 | Millipore Sigma | MAB1864-I | Antibody |
Sodium Acrylate | Sigma | 408220 | ExM Gel |
Streptavidin / Biotin blocking kit | Vector Laboratories | SP-2002 | Blocking buffer |
Tris-HCl | Life Technologies | AM9855 | Digestion buffer |
U2OS | ATCC | HTB-96 | Cell line |
6 well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Imaging plate |