Label-Retention Expansion Microscopy (LR-ExM) maakt beeldvorming met superresolutie en zeer efficiënte etikettering mogelijk
Summary
Een protocol van labelretentie expansie microscopie (LR-ExM) wordt gedemonstreerd. LR-ExM maakt gebruik van een nieuwe set trifunctionele ankers, die een betere etiketteringsefficiëntie biedt in vergelijking met eerder geïntroduceerde uitbreidingsmicroscopieën.
Abstract
Expansiemicroscopie (ExM) is een monstervoorbereidingstechniek die kan worden gecombineerd met de meeste lichtmicroscopiemethoden om de resolutie te verhogen. Na het inbedden van cellen of weefsels in opzwellende hydrogel, kunnen monsters fysiek drie- tot zestienvoudig (lineaire dimensie) worden uitgebreid in vergelijking met de oorspronkelijke grootte. Daarom wordt de effectieve resolutie van elke microscoop verhoogd door de expansiefactor. Een belangrijke beperking van de eerder geïntroduceerde ExM is verminderde fluorescentie na polymerisatie en de verteringsprocedure. Om deze beperking te overwinnen, is labelretentie-uitbreidingsmicroscopie (LR-ExM) ontwikkeld, die signaalverlies voorkomt en de etiketteringsefficiëntie aanzienlijk verbetert met behulp van een reeks nieuwe trifunctionele ankers. Deze techniek maakt het mogelijk om een hogere resolutie te bereiken bij het onderzoeken van cellulaire of subcellulaire structuren op nanometrische schaal met minimaal fluorescerend signaalverlies. LR-ExM kan niet alleen worden gebruikt voor immunofluorescentie-etikettering, maar ook met zelfetikettering van eiwittags, zoals SNAP- en CLIP-tags, waardoor een hogere etiketteringsefficiëntie wordt bereikt. Dit werk presenteert de procedure en probleemoplossing voor deze op immunostaining gebaseerde benadering, evenals een bespreking van zelflabelende taggingbenaderingen van LR-ExM als alternatief.
Introduction
Expansiemicroscopie (ExM) wordt door onderzoekers gebruikt sinds het voor het eerst werd geïntroduceerd als een handige benadering om superresolutiebeeldvorming te bereiken met conventionele microscopen, zoals epifluorescentie en confocale microscopen 1,2,3,4,5,6,7 . Met behulp van ExM is het mogelijk om ~ 70 nm laterale resolutie te bereiken, zelfs met gewone confocale microscopen. Wanneer ExM wordt gecombineerd met beeldvorming met superresolutie, wordt de resolutie verder verbeterd. Men kan bijvoorbeeld ongeveer 30 nm resolutie bereiken met gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM) en ongeveer 4 nm resolutie met stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM)1,5.
Een lage etiketteringsefficiëntie is echter een kritiek probleem bij standaard ExM-methoden. Fluorescentieverlies kan variëren op basis van het type fluorescerende groepen en de verteringstijd. Gemiddeld is echter gemeld dat meer dan 50% van de fluoroforen verloren gaat na de polymerisatie en de eiwitverteringsstappen van ExM, wat schadelijk is voor de beeldvormingskwaliteit 3,4.
Zo is labelretentie-expansiemicroscopie (LR-ExM) ontwikkeld, die efficiënt labels kan behouden en signaalverlies kan verminderen1. De belangrijkste innovatie van LR-ExM is het gebruik van een set trifunctionele ankers in plaats van alleen fluorescerende kleurstoffen te gebruiken – zoals in de standaard ExM-procedure – voor het kleuren van eiwitten van belang. Deze trifunctionele linkers bestaan uit drie delen: (1) de connector (bijv. N-hydroxysuccinimide (NHS)) om verbinding te maken met het antilichaam, (2) het anker (bijv. Methacrylamide (MA)) om eiwitten aan het polymeer te verankeren, en (3) de verslaggever (bijv. Biotine of digoxigenine (DIG)) om te conjugeren aan een organische kleurstof. De trifunctionele ankers overleven de polymerisatie- en eiwitverteringsstappen en voorkomen daarom fluorofoorverlies.
Bovendien heeft deze methode een groot potentieel omdat het compatibel is met zelfetiketterende enzymatische tags zoals SNAP of CLIP. Enzymatische tagbenaderingen hebben enkele voordelen ten opzichte van de immunostaining-benadering met betrekking tot hoge specificiteit en etiketteringsefficiëntie 8,9,10.
In dit manuscript wordt een gedetailleerde procedure van LR-ExM gedemonstreerd. LR-ExM is een zeer effectieve en flexibele methode om een hoge ruimtelijke resolutie te bereiken met verbeterde etiketteringsefficiëntie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De belangrijkste innovatie van LR-ExM is het gebruik van trifunctionele ankers om de doeleiwitten effectief te labelen en de beeldkwaliteit te verbeteren. Deze methode wordt beperkt door trifunctionele ankers, die niet zo gemakkelijk beschikbaar zijn voor onderzoekers. Trifunctionele ankers kunnen echter op verzoek worden gedeeld met andere onderzoekers en vergelijkbare producten zoals ExM-sondes van Chrometa zijn nu ook in de handel verkrijgbaar.
In dit protocol is 1 uur incubatie bij kamerte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health (R00 GM126136 tot X.S.), de Amerikaanse National Science Foundation (DMS1763272 tot S.P.) en de Simons Foundation (594598 tot S.P.).
Materials
| Acrylamide | Sigma | A9099 | ExM Gel |
| AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 711–005-152 | Antibody |
| AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 712–005-153 | Antibody |
| Alexa Fluor 488-Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-540-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-580-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 647 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-600-084 | Fluorescent probes |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | ExM Gel |
| anti-H3K4me3 | Abcam | ab8580 | Antibody |
| anti-H3K9me3 | Abcam | ab176916 | Antibody |
| DAPI dilacetate | Thermofisher Scientific | D3571 | Fluorescent probes |
| DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7488 | Fluorescent probes |
| DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7594 | Fluorescent probes |
| EGTA | EMD Millipore Corp. | 324626-25GM | Fixation buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | EDTA | Digestion buffer |
| Glutaraldehyde 10% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 50-262-13 | Anchoring |
| Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass | Grace Bio-Labs | GBL112358-8EA | Cell culture chamber |
| Grace Bio-Labs CultureWell removal tool | Grace Bio-Labs | GBL103259 | Removal tool |
| Guanidine HCl | Sigma | G3272 | Digestion buffer |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266-1KG | Fixation buffer |
| McCoy's 5a | ATCC | 30–2007 | Celll culture medium |
| Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98% (MA-NHS) | Sigma | 730300-1G | Anchoring |
| monoclonal mouse anti-Nup153 antibody | Abcam | ab24700 | Antibody |
| N,N′Methylenebisacrylamide | Sigma | M7279 | ExM Gel |
| N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024 | ExM Gel |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions | Electron Microscopy Sciences | 50-980-487 | Fixation buffer |
| PIPES | Sigma | P6757-25G | Fixation buffer |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920-100ML | Chamber coating |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P4850-5ML | Digestion buffer |
| Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody | Abcam | ab21679 | Antibody |
| rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2 | Millipore Sigma | MAB1864-I | Antibody |
| Sodium Acrylate | Sigma | 408220 | ExM Gel |
| Streptavidin / Biotin blocking kit | Vector Laboratories | SP-2002 | Blocking buffer |
| Tris-HCl | Life Technologies | AM9855 | Digestion buffer |
| U2OS | ATCC | HTB-96 | Cell line |
| 6 well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Imaging plate |
References
- Shi, X., et al. Label-retention expansion microscopy. The Journal of Cell Biology. 220 (9), 202105067 (2021).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Wang, Y., et al. Combined expansion microscopy with structured illumination microscopy for analyzing protein complexes. Nature Protocols. 13 (8), 1869-1895 (2018).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super resolution imaging of three-dimensional protein localization in size adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
- Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (27), 9955-9959 (2004).
- Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super resolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (19), 45836 (2018).
- Damstra, H. G. J., et al. Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx). eLife. 11, 73775 (2021).
- M’Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850 (2020).
