מיקרוסקופיית הרחבה לשמירת תוויות (LR-ExM) מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה ועיצוב תוויות ביעילות גבוהה
Summary
הודגם פרוטוקול של מיקרוסקופיה להרחבת שמירת תוויות (LR-ExM). LR-ExM משתמשת במערך חדשני של עוגנים תלת-תכליתיים, המספקים יעילות תיוג טובה יותר בהשוואה למיקרוסקופיות הרחבה שהוצגו בעבר.
Abstract
מיקרוסקופיית הרחבה (ExM) היא טכניקת הכנת דגימות שניתן לשלב עם רוב שיטות המיקרוסקופיה הקלה כדי להגדיל את הרזולוציה. לאחר הטמעת תאים או רקמות בהידרוג’ל מתנפח, ניתן להרחיב פיזית דגימות פי שלושה עד שש עשרה (ממד ליניארי) בהשוואה לגודל המקורי. לכן, הרזולוציה האפקטיבית של כל מיקרוסקופ גדלה על ידי גורם ההרחבה. מגבלה מרכזית של ExM שהוצגה בעבר היא פלואורסצנטיות מופחתת לאחר פילמור והליך העיכול. כדי להתגבר על מגבלה זו, פותחה מיקרוסקופיית הרחבה לשמירת תוויות (LR-ExM), המונעת אובדן אותות ומשפרת מאוד את יעילות הסימון באמצעות קבוצה של עוגנים תלת-תכליתיים חדשניים. טכניקה זו מאפשרת להשיג רזולוציה גבוהה יותר בעת חקירת מבנים תאיים או תת-תאיים בקנה מידה ננומטרי עם אובדן אות פלואורסצנטי מינימלי. ניתן להשתמש ב- LR-ExM לא רק לתיוג אימונופלואורסצנטי, אלא גם עם תגי חלבון עם תיוג עצמי, כגון תגי SNAP ו- CLIP, ובכך להשיג יעילות תיוג גבוהה יותר. עבודה זו מציגה את הפרוצדורה ופתרון הבעיות עבור גישה מבוססת חיסון זו, כמו גם דיון בגישות תיוג עצמי של LR-ExM כחלופה.
Introduction
מיקרוסקופיית הרחבה (ExM) שימשה חוקרים מאז שהוצגה לראשונה כגישה נוחה להשגת הדמיה ברזולוציה גבוהה עם מיקרוסקופים קונבנציונליים, כגון אפיפלואורסצנציה ומיקרוסקופים קונפוקליים 1,2,3,4,5,6,7 . באמצעות ExM, ניתן להשיג רזולוציה רוחבית של ~ 70 ננומטר גם עם מיקרוסקופים קונפוקליים רגילים. כאשר ExM משולב עם הדמיה ברזולוציה גבוהה, הרזולוציה משופרת עוד יותר. לדוגמה, ניתן להשיג רזולוציה של כ-30 ננומטר באמצעות מיקרוסקופיית תאורה מובנית (SIM), ורזולוציה של כ-4 ננומטר באמצעות מיקרוסקופיית שחזור אופטית סטוכסטית (STORM)1,5.
עם זאת, יעילות תיוג נמוכה היא בעיה קריטית בשיטות ExM סטנדרטיות. אובדן פלואורסצנטי יכול להשתנות בהתאם לסוג הקבוצות הפלואורסצנטיות וזמן העיכול. עם זאת, בממוצע, דווח כי יותר מ -50% מהפלואורופורים הולכים לאיבוד לאחר הפילמור ושלבי העיכול של החלבון של ExM, מה שפוגע באיכות ההדמיה 3,4.
לפיכך, פותחה מיקרוסקופיה להרחבת שמירת תוויות (LR-ExM), שיכולה לשמור ביעילות על תוויות ולהפחית את אובדן האות1. החידוש העיקרי של LR-ExM הוא השימוש בקבוצה של עוגנים תלת-תפקודיים במקום להשתמש רק בצבעים פלואורסצנטיים – כמו בנוהל ExM הסטנדרטי – להכתמת חלבונים מעניינים. המקשרים התלת-תכליתיים האלה מורכבים משלושה חלקים: (1) המחבר (למשל, N-הידרוקסיסוקינימיד (NHS)) כדי להתחבר לנוגדן, (2) העוגן (למשל, מתקרילאמיד (MA)) כדי לעגן חלבונים לפולימר, ו-(3) הכתב (למשל, ביוטין או דיגוקסיגנין (DIG)) כדי להצמיד לצבע אורגני. העוגנים התלת-תפקודיים שורדים את שלבי הפילמור ועיכול החלבונים, ולכן מונעים אובדן פלואורופור.
יתר על כן, שיטה זו טומנת בחובה פוטנציאל רב מכיוון שהיא תואמת לתיוג עצמי של תגים אנזימטיים כגון SNAP או CLIP. לגישות תג אנזימטיות יש כמה יתרונות על פני גישת החיסון לגבי ספציפיות גבוהה ויעילות תיוג 8,9,10.
בכתב יד זה מודגם הליך מפורט של LR-ExM. LR-ExM היא שיטה יעילה וגמישה ביותר להשגת רזולוציה מרחבית גבוהה עם יעילות תיוג משופרת.
Protocol
Representative Results
Discussion
החידוש העיקרי של LR-ExM הוא להשתמש בעוגנים תלת-תכליתיים כדי לתייג ביעילות את חלבוני המטרה ולשפר את איכות התמונה. שיטה זו מוגבלת על ידי עוגנים תלת-תפקודיים, שאינם זמינים כל כך לחוקרים. עם זאת, ניתן לשתף עוגנים תלת-שימושיים עם חוקרים אחרים על פי בקשה, ומוצרים דומים כגון בדיקות ExM של Chrometa זמינים כ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות של ארה”ב (R00 GM126136 עד X.S.), הקרן הלאומית למדע של ארה”ב (DMS1763272 ל- S.P.) וקרן סימונס (594598 ל- S.P.).
Materials
| Acrylamide | Sigma | A9099 | ExM Gel |
| AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 711–005-152 | Antibody |
| AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 712–005-153 | Antibody |
| Alexa Fluor 488-Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-540-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-580-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 647 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-600-084 | Fluorescent probes |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | ExM Gel |
| anti-H3K4me3 | Abcam | ab8580 | Antibody |
| anti-H3K9me3 | Abcam | ab176916 | Antibody |
| DAPI dilacetate | Thermofisher Scientific | D3571 | Fluorescent probes |
| DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7488 | Fluorescent probes |
| DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7594 | Fluorescent probes |
| EGTA | EMD Millipore Corp. | 324626-25GM | Fixation buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | EDTA | Digestion buffer |
| Glutaraldehyde 10% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 50-262-13 | Anchoring |
| Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass | Grace Bio-Labs | GBL112358-8EA | Cell culture chamber |
| Grace Bio-Labs CultureWell removal tool | Grace Bio-Labs | GBL103259 | Removal tool |
| Guanidine HCl | Sigma | G3272 | Digestion buffer |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266-1KG | Fixation buffer |
| McCoy's 5a | ATCC | 30–2007 | Celll culture medium |
| Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98% (MA-NHS) | Sigma | 730300-1G | Anchoring |
| monoclonal mouse anti-Nup153 antibody | Abcam | ab24700 | Antibody |
| N,N′Methylenebisacrylamide | Sigma | M7279 | ExM Gel |
| N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024 | ExM Gel |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions | Electron Microscopy Sciences | 50-980-487 | Fixation buffer |
| PIPES | Sigma | P6757-25G | Fixation buffer |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920-100ML | Chamber coating |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P4850-5ML | Digestion buffer |
| Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody | Abcam | ab21679 | Antibody |
| rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2 | Millipore Sigma | MAB1864-I | Antibody |
| Sodium Acrylate | Sigma | 408220 | ExM Gel |
| Streptavidin / Biotin blocking kit | Vector Laboratories | SP-2002 | Blocking buffer |
| Tris-HCl | Life Technologies | AM9855 | Digestion buffer |
| U2OS | ATCC | HTB-96 | Cell line |
| 6 well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Imaging plate |
References
- Shi, X., et al. Label-retention expansion microscopy. The Journal of Cell Biology. 220 (9), 202105067 (2021).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Wang, Y., et al. Combined expansion microscopy with structured illumination microscopy for analyzing protein complexes. Nature Protocols. 13 (8), 1869-1895 (2018).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super resolution imaging of three-dimensional protein localization in size adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
- Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (27), 9955-9959 (2004).
- Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super resolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (19), 45836 (2018).
- Damstra, H. G. J., et al. Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx). eLife. 11, 73775 (2021).
- M’Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850 (2020).
