La microscopia a espansione per la conservazione delle etichette (LR-ExM) consente l'imaging a super-risoluzione e l'etichettatura ad alta efficienza
Summary
Viene dimostrato un protocollo di microscopia ad espansione di ritenzione dell’etichetta (LR-ExM). LR-ExM utilizza un nuovo set di ancoraggi trifunzionali, che fornisce una migliore efficienza di etichettatura rispetto alle microscopie di espansione introdotte in precedenza.
Abstract
La microscopia ad espansione (ExM) è una tecnica di preparazione del campione che può essere combinata con la maggior parte dei metodi di microscopia ottica per aumentare la risoluzione. Dopo aver incorporato cellule o tessuti in idrogel gonfiabile, i campioni possono essere fisicamente espansi da tre a sedici volte (dimensione lineare) rispetto alla dimensione originale. Pertanto, la risoluzione effettiva di qualsiasi microscopio è aumentata dal fattore di espansione. Una delle principali limitazioni dell’ExM precedentemente introdotto è la fluorescenza ridotta dopo la polimerizzazione e la procedura di digestione. Per superare questa limitazione, è stata sviluppata la microscopia a espansione per la conservazione delle etichette (LR-ExM), che previene la perdita di segnale e migliora notevolmente l’efficienza dell’etichettatura utilizzando una serie di nuovi ancoraggi trifunzionali. Questa tecnica consente di ottenere una risoluzione più elevata quando si studiano strutture cellulari o subcellulari su scala nanometrica con una minima perdita di segnale fluorescente. LR-ExM può essere utilizzato non solo per la marcatura con immunofluorescenza, ma anche con tag proteici auto-etichettanti, come i tag SNAP e CLIP, ottenendo così una maggiore efficienza di etichettatura. Questo lavoro presenta la procedura e la risoluzione dei problemi per questo approccio basato sull’immunocolorazione, nonché la discussione degli approcci di etichettatura automatica di LR-ExM come alternativa.
Introduction
La microscopia ad espansione (ExM) è stata utilizzata dai ricercatori sin da quando è stata introdotta per la prima volta come approccio conveniente per ottenere immagini a super risoluzione con microscopi convenzionali, come l’epifluorescenza e i microscopi confocali 1,2,3,4,5,6,7 . Utilizzando ExM, è possibile raggiungere una risoluzione laterale di ~ 70 nm anche con normali microscopi confocali. Quando ExM è combinato con l’imaging a super-risoluzione, la risoluzione viene ulteriormente migliorata. Ad esempio, si può ottenere una risoluzione di circa 30 nm con la microscopia a illuminazione strutturata (SIM) e una risoluzione di circa 4 nm con la microscopia a ricostruzione ottica stocastica (STORM)1,5.
Tuttavia, la bassa efficienza dell’etichettatura è un problema critico con i metodi ExM standard. La perdita di fluorescenza può variare in base al tipo di gruppi fluorescenti e al tempo di digestione. In media, tuttavia, è stato riportato che oltre il 50% dei fluorofori viene perso dopo la polimerizzazione e le fasi di digestione delle proteine di ExM, il che è dannoso per la qualità dell’imaging 3,4.
Pertanto, è stata sviluppata la microscopia ad espansione per la conservazione delle etichette (LR-ExM), che può conservare in modo efficiente le etichette e ridurre la perdita di segnale1. L’innovazione chiave di LR-ExM è l’uso di una serie di ancoraggi trifunzionali invece di utilizzare semplicemente coloranti fluorescenti – come nella procedura standard ExM – per colorare le proteine di interesse. Questi linker trifunzionali sono costituiti da tre parti: (1) il connettore (ad esempio, N-idrossisuccinimide (NHS)) per connettersi all’anticorpo, (2) l’ancora (ad esempio, metacrilammide (MA)) per ancorare le proteine al polimero e (3) il reporter (ad esempio, biotina o digossigenina (DIG)) per coniugare a un colorante organico. Le ancore trifunzionali sopravvivono alle fasi di polimerizzazione e digestione delle proteine, e quindi prevengono la perdita di fluorofori.
Inoltre, questo metodo ha un grande potenziale poiché è compatibile con tag enzimatici auto-etichettanti come SNAP o CLIP. Gli approcci di tag enzimatici hanno alcuni vantaggi rispetto all’approccio immunocolorante per quanto riguarda l’elevata specificità e l’efficienza di etichettatura 8,9,10.
In questo manoscritto viene dimostrata una procedura dettagliata di LR-ExM. LR-ExM è un metodo altamente efficace e flessibile per ottenere un’elevata risoluzione spaziale con una maggiore efficienza di etichettatura.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’innovazione chiave di LR-ExM è l’utilizzo di ancoraggi trifunzionali per etichettare efficacemente le proteine bersaglio e migliorare la qualità dell’immagine. Questo metodo è limitato da ancore trifunzionali, che non sono così facilmente disponibili per i ricercatori. Tuttavia, le ancore trifunzionali possono essere condivise con altri ricercatori su richiesta e prodotti simili come le sonde ExM di Chrometa sono ora disponibili in commercio.
In questo protocollo, è stata eseguita un’in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health degli Stati Uniti (R00 GM126136 a X.S.), dalla National Science Foundation degli Stati Uniti (DMS1763272 a S.P.) e dalla Simons Foundation (da 594598 a S.P.).
Materials
| Acrylamide | Sigma | A9099 | ExM Gel |
| AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 711–005-152 | Antibody |
| AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 712–005-153 | Antibody |
| Alexa Fluor 488-Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-540-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-580-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 647 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-600-084 | Fluorescent probes |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | ExM Gel |
| anti-H3K4me3 | Abcam | ab8580 | Antibody |
| anti-H3K9me3 | Abcam | ab176916 | Antibody |
| DAPI dilacetate | Thermofisher Scientific | D3571 | Fluorescent probes |
| DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7488 | Fluorescent probes |
| DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7594 | Fluorescent probes |
| EGTA | EMD Millipore Corp. | 324626-25GM | Fixation buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | EDTA | Digestion buffer |
| Glutaraldehyde 10% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 50-262-13 | Anchoring |
| Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass | Grace Bio-Labs | GBL112358-8EA | Cell culture chamber |
| Grace Bio-Labs CultureWell removal tool | Grace Bio-Labs | GBL103259 | Removal tool |
| Guanidine HCl | Sigma | G3272 | Digestion buffer |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266-1KG | Fixation buffer |
| McCoy's 5a | ATCC | 30–2007 | Celll culture medium |
| Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98% (MA-NHS) | Sigma | 730300-1G | Anchoring |
| monoclonal mouse anti-Nup153 antibody | Abcam | ab24700 | Antibody |
| N,N′Methylenebisacrylamide | Sigma | M7279 | ExM Gel |
| N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024 | ExM Gel |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions | Electron Microscopy Sciences | 50-980-487 | Fixation buffer |
| PIPES | Sigma | P6757-25G | Fixation buffer |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920-100ML | Chamber coating |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P4850-5ML | Digestion buffer |
| Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody | Abcam | ab21679 | Antibody |
| rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2 | Millipore Sigma | MAB1864-I | Antibody |
| Sodium Acrylate | Sigma | 408220 | ExM Gel |
| Streptavidin / Biotin blocking kit | Vector Laboratories | SP-2002 | Blocking buffer |
| Tris-HCl | Life Technologies | AM9855 | Digestion buffer |
| U2OS | ATCC | HTB-96 | Cell line |
| 6 well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Imaging plate |
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