ラベル保持拡張顕微鏡(LR-ExM)は、超解像イメージングと高効率ラベリングを可能にします
Summary
ラベル保持拡張顕微鏡(LR-ExM)のプロトコルが実証されています。LR-ExMは、以前に導入された膨張顕微鏡と比較して、より優れたラベリング効率を提供する新しい三官能アンカーのセットを使用しています。
Abstract
膨張顕微鏡(ExM)は、ほとんどの光学顕微鏡法と組み合わせて分解能を高めることができるサンプル調製技術です。細胞または組織を膨潤性ヒドロゲルに包埋した後、サンプルは元のサイズと比較して物理的に3〜16倍(直線寸法)に拡大することができる。したがって、顕微鏡の有効分解能は膨張係数によって増加します。先に導入されたExMの主な制限は、重合および消化手順後の蛍光の減少である。この制限を克服するために、新しい三官能アンカーのセットを使用して信号損失を防ぎ、標識効率を大幅に向上させるラベル保持拡張顕微鏡(LR-ExM)が開発されました。この技術により、蛍光シグナル損失を最小限に抑えながら、ナノメートルスケールで細胞または細胞内構造を調べる際に、より高い分解能を達成することができます。LR-ExMは、免疫蛍光標識だけでなく、SNAPタグやCLIPタグなどの自己標識タンパク質タグにも使用できるため、より高い標識効率を実現します。この研究では、この免疫染色ベースのアプローチの手順とトラブルシューティング、および代替としてのLR-ExMの自己標識タグ付けアプローチについて説明します。
Introduction
膨張顕微鏡(ExM)は、落射蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡などの従来の顕微鏡で超解像イメージングを実現するための便利なアプローチとして最初に導入されて以来、研究者によって使用されてきました1,2,3,4,5,6,7 .ExMを使用すると、通常の共焦点顕微鏡でも~70nmの横方向の分解能を達成することができます。ExMを超解像イメージングと組み合わせると、解像度がさらに向上します。例えば、構造化照明顕微鏡(SIM)では約30nmの分解能、確率的光学再構成顕微鏡(STORM)では約4nmの分解能を達成できます1,5。
ただし、ラベリング効率の低さは、標準的なExMメソッドでは重要な問題です。蛍光損失は、蛍光基の種類および消化時間に基づいて変化し得る。しかし、平均して、蛍光色素の50%以上がExMの重合およびタンパク質消化ステップの後に失われることが報告されており、これはイメージング品質に有害です3,4。
そのため、ラベルを効率的に保持し、シグナル損失を低減できるラベル保持拡張顕微鏡(LR-ExM)が開発されました1。LR-ExMの主な革新は、目的のタンパク質を染色するために、標準的なExM手順のように蛍光色素を単に使用するのではなく、三官能性アンカーのセットを使用することです。これらの三官能性リンカーは、(1)抗体に接続するためのコネクター(例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS))、(2)タンパク質をポリマーにアンカーするためのアンカー(例えば、メタクリルアミド(MA))、および(3)有機色素に結合するためのレポーター(例えば、ビオチンまたはジゴキシゲニン(DIG))の3つの部分からなる。三官能性アンカーは、重合およびタンパク質消化ステップに耐え、蛍光色素の損失を防ぎます。
さらに、この方法は、SNAPやCLIPなどの自己標識酵素タグと互換性があるため、大きな可能性を秘めています。酵素タグアプローチは、高い特異性と標識効率に関して免疫染色アプローチに比べていくつかの利点があります8、9、10。
この原稿では、LR-ExMの詳細な手順を示しています。LR-ExMは、ラベリング効率を高めて高い空間分解能を実現するための非常に効果的で柔軟な方法です。
Protocol
Representative Results
Discussion
LR-ExMの主な革新は、三官能アンカーを使用して標的タンパク質を効果的に標識し、画質を向上させることです。この方法は、研究者がそれほど容易に利用できない三機能アンカーによって制限されています。ただし、三機能アンカーはリクエストに応じて他の研究者と共有することができ、ChrometaのExMプローブなどの同様の製品も現在市販されています。
このプロトコル…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米国国立衛生研究所(R00 GM126136からX.S.)、米国国立科学財団(DMS1763272からS.P.)、およびサイモンズ財団(594598からS.P.)の支援を受けました。
Materials
| Acrylamide | Sigma | A9099 | ExM Gel |
| AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 711–005-152 | Antibody |
| AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearch | H+L, 712–005-153 | Antibody |
| Alexa Fluor 488-Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-540-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-580-084 | Fluorescent probes |
| Alexa Fluor 647 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-600-084 | Fluorescent probes |
| Ammonium Persulfate | Sigma | A3678 | ExM Gel |
| anti-H3K4me3 | Abcam | ab8580 | Antibody |
| anti-H3K9me3 | Abcam | ab176916 | Antibody |
| DAPI dilacetate | Thermofisher Scientific | D3571 | Fluorescent probes |
| DyLight 488 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7488 | Fluorescent probes |
| DyLight 594 Labeled Anti-Digoxigenin/Digoxin (DIG) | Vector Laboratories | DI-7594 | Fluorescent probes |
| EGTA | EMD Millipore Corp. | 324626-25GM | Fixation buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | EDTA | Digestion buffer |
| Glutaraldehyde 10% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 50-262-13 | Anchoring |
| Grace Bio-Labs CultureWell removable chambered coverglass | Grace Bio-Labs | GBL112358-8EA | Cell culture chamber |
| Grace Bio-Labs CultureWell removal tool | Grace Bio-Labs | GBL103259 | Removal tool |
| Guanidine HCl | Sigma | G3272 | Digestion buffer |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266-1KG | Fixation buffer |
| McCoy's 5a | ATCC | 30–2007 | Celll culture medium |
| Methacrylic acid N-hydroxysuccinimide ester,98% (MA-NHS) | Sigma | 730300-1G | Anchoring |
| monoclonal mouse anti-Nup153 antibody | Abcam | ab24700 | Antibody |
| N,N′Methylenebisacrylamide | Sigma | M7279 | ExM Gel |
| N,N,N′,N′ Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024 | ExM Gel |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solutions | Electron Microscopy Sciences | 50-980-487 | Fixation buffer |
| PIPES | Sigma | P6757-25G | Fixation buffer |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920-100ML | Chamber coating |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P4850-5ML | Digestion buffer |
| Rabbit anti-clathrin heavy-chain antibody | Abcam | ab21679 | Antibody |
| rat anti–α-tubulin antibody,tyrosinated, clone YL1/2 | Millipore Sigma | MAB1864-I | Antibody |
| Sodium Acrylate | Sigma | 408220 | ExM Gel |
| Streptavidin / Biotin blocking kit | Vector Laboratories | SP-2002 | Blocking buffer |
| Tris-HCl | Life Technologies | AM9855 | Digestion buffer |
| U2OS | ATCC | HTB-96 | Cell line |
| 6 well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Imaging plate |
References
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