تقييم كفاءة التمثيل الضوئي في الطفرات التنفسية الضوئية عن طريق تحليل الكلوروفيل الفلوري
Summary
وصفنا نهجا لقياس التغيرات في كفاءة التمثيل الضوئي في النباتات بعد المعالجة بانخفاض ثاني أكسيد الكربون2 باستخدام مضان الكلوروفيل.
Abstract
يمثل البناء الضوئي والتنفس الضوئي أكبر تدفقات الكربون في التمثيل الغذائي الأولي للنبات وهما ضروريان لبقاء النبات. تمت دراسة العديد من الإنزيمات والجينات المهمة لعملية التمثيل الضوئي والتنفس الضوئي جيدا لعقود من الزمن ، ولكن بعض جوانب هذه المسارات الكيميائية الحيوية وحديثها المتبادل مع العديد من العمليات تحت الخلوية ليست مفهومة تماما بعد. تم إجراء الكثير من العمل الذي حدد الجينات والبروتينات المهمة في عملية التمثيل الغذائي للنبات في بيئات شديدة التحكم قد لا تمثل بشكل أفضل كيفية عمل التمثيل الضوئي والتنفس الضوئي في البيئات الطبيعية والزراعية. بالنظر إلى أن الإجهاد اللاأحيائي يؤدي إلى ضعف كفاءة التمثيل الضوئي ، فمن الضروري تطوير شاشة عالية الإنتاجية يمكنها مراقبة كل من الإجهاد اللاأحيائي وتأثيره على التمثيل الضوئي.
لذلك ، قمنا بتطوير طريقة سريعة نسبيا لفحص التغيرات الناجمة عن الإجهاد اللاأحيائي في كفاءة التمثيل الضوئي والتي يمكنها تحديد الجينات غير المميزة التي لها أدوار في التنفس الضوئي باستخدام تحليل مضان الكلوروفيل وفحص CO2 المنخفض. يصف هذا البحث طريقة لدراسة التغيرات في كفاءة التمثيل الضوئي في طفرات خروج المغلوب المنقولة DNA (T-DNA) في Arabidopsis thaliana. يمكن استخدام نفس الطريقة لفحص الطفرات التي يسببها إيثيل ميثان سلفونات (EMS) أو فحص الكابت. يمكن أن يؤدي استخدام هذه الطريقة إلى تحديد الجينات المرشحة لمزيد من الدراسة في التمثيل الغذائي الأولي للنبات واستجابات الإجهاد اللاأحيائي. يمكن أن توفر البيانات من هذه الطريقة نظرة ثاقبة لوظيفة الجينات التي قد لا يتم التعرف عليها حتى التعرض لبيئات الإجهاد المتزايدة.
Introduction
يمكن أن تؤثر ظروف الإجهاد اللاأحيائي الشائعة في حقول المزارعين سلبا على غلة المحاصيل عن طريق تقليل كفاءة التمثيل الضوئي. يمكن أن تسبب الظروف البيئية الضارة مثل موجات الحرارة وتغير المناخ والجفاف وملوحة التربة ضغوطا غير أحيائية تغير توافر CO2 وتقلل من استجابة النبات لإجهاد الضوء العالي. أكبر تدفقين للكربون الأرضي هما التمثيل الضوئي والتنفس الضوئي ، وهما ضروريان لنمو النبات وغلة المحاصيل. تم تمييز العديد من البروتينات والإنزيمات المهمة المشاركة في هذه العمليات في ظل ظروف المختبر وتم تحديدها على المستوى الجيني1. على الرغم من إحراز تقدم كبير في فهم عملية البناء الضوئي والتنفس الضوئي ، إلا أن العديد من الخطوات ، بما في ذلك النقل بين عضيات النبات ، لا تزال غير مميزة 2,3.
يبدأ التنفس الضوئي ، وهو ثاني أكبر تدفق كربوني في النباتات بعد عملية التمثيل الضوئي ، عندما يقوم إنزيم روبيسكو بتثبيت الأكسجين بدلا من ثاني أكسيد الكربون إلى ريبولوز 1,5 ثنائي الفوسفات (RuBP) ، مما يولد المركب المثبط 2-فوسفوجليكولات (2PG) 1. لتقليل التأثيرات المثبطة ل 2PG وإعادة تدوير الكربون الثابت سابقا ، طورت نباتات C3 عملية التنفس الضوئي متعددة العضيات. يحول التنفس الضوئي جزيئين من 2PG إلى جزيء واحد من 3-فوسفوجليسرات (3PGA) ، والذي يمكن أن يدخل مرة أخرى في دورة تثبيت الكربون C31. وبالتالي ، فإن التنفس الضوئي يحول فقط 75٪ من الكربون الثابت سابقا من توليد 2PG ويستهلك ATP في هذه العملية. نتيجة لذلك ، فإن عملية التنفس الضوئي هي سحب كبير بنسبة 10٪ -50٪ على عملية التمثيل الضوئي ، اعتمادا على توافر المياه ودرجات حرارة موسم النمو4.
كانت الإنزيمات المشاركة في التنفس الضوئي مجالا للتركيز البحثي لعقود ، ولكن تم تمييز عدد قليل فقط من بروتينات النقل على المستوى الجيني ، على الرغم من مشاركة 25 خطوة نقل على الأقل في العملية5،6،7. بروتينا النقل اللذان يشاركان بشكل مباشر في حركة الكربون المتولد في عملية التنفس الضوئي هما ناقل الجليكولات / الجليسرات PLGG1 وحمض الصوديوم الصفراوي BASS6 ، وكلاهما يشارك في تصدير الجليكولات من البلاستيدات الخضراء 5,6.
تحت المحيط [CO2] ، يقوم Rubisco بتثبيت جزيء الأكسجين إلى RuBP حوالي 20٪ من الوقت1. عندما تتعرض النباتات لانخفاض [CO 2] ، تزداد معدلات التنفس الضوئي ، مما يجعل انخفاض [CO2] بيئة مثالية لاختبار الطفرات التي قد تكون مهمة في ظل ضغط التنفس الضوئي المرتفع. أدى اختبار خطوط T-DNA الإضافية المفترضة لبروتين نقل البلاستيدات الخضراء تحت CO2 المنخفض لمدة 24 ساعة وقياس التغيرات في مضان الكلوروفيل إلى تحديد خطوط نبات bass6-1 التي أظهرت نمطا ظاهريامتحورا للتنفس الضوئي 5. أظهر التوصيف الإضافي أن BASS6 هو ناقل جليكولات في الغشاء الداخلي للبلاستيدة الخضراء.
تصف هذه الورقة بالتفصيل بروتوكولا مشابها لما تم استخدامه في البداية لتحديد BASS6 كناقل للتنفس الضوئي ، والذي جاء من قائمة بروتينات النقل المفترضة الموجودة داخل غشاء البلاستيدات الخضراء8 يمكن استخدام هذا البروتوكول في تجربة عالية الإنتاجية تميز طفرات Arabidopsis T-DNA أو النباتات الطافرة الناتجة عن EMS كطريقة لتحديد الجينات المهمة للحفاظ على كفاءة التمثيل الضوئي تحت مجموعة من الضغوط اللاأحيائية مثل الحرارة ، الإجهاد العالي للضوء والجفاف وتوافر CO2 . تم استخدام طفرات النباتات باستخدام مضان الكلوروفيل في الماضي لتحديد الجينات المهمة لعملية التمثيل الغذائي الأوليبسرعة 9. مع وجود ما يصل إلى 30٪ من جينوم Arabidopsis الذي يحتوي على جينات ترمز لبروتينات ذات وظيفة غير معروفة أو سيئة التوصيف ، يمكن أن يوفر التحليل الناجم عن الإجهاد لكفاءة التمثيل الضوئي نظرة ثاقبة للوظائف الجزيئية التي لم يتم ملاحظتها في ظل ظروف خاضعة للرقابة في النباتات الطافرة10. الهدف من هذه الطريقة هو تحديد طفرات المسار التنفسي الضوئي باستخدام فحص CO2 منخفض. نقدم طريقة لتحديد الطفرات التي تعطل التنفس الضوئي بعد التعرض لانخفاض ثاني أكسيد الكربون2. ميزة هذه الطريقة هي أنها فحص عالي الإنتاجية للشتلات يمكن إجراؤه في فترة زمنية قصيرة نسبيا. توفر أقسام بروتوكول الفيديو تفاصيل حول تحضير البذور وتعقيمها ، ونمو النبات ومعالجة CO2 المنخفضة ، وتكوين نظام التصوير الفلوري ، وقياس العائد الكمي للعينات المعالجة ، والنتائج التمثيلية ، والاستنتاجات.
Protocol
Representative Results
Discussion
تأتي الطرق التجريبية الموضحة في هذه الورقة مع بعض المزايا والقيود. تتمثل إحدى المزايا في أن هذه الطريقة يمكنها فحص العديد من شتلات النباتات ، على الرغم من أنه يجب اتخاذ بعض الاحتياطات لمنع تلوث لوحة وسائط النبات أثناء عملية الطلاء والنمو. لذلك ، من الأهمية بمكان ختم ألواح Arabidopsis بشريط جراح…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث من قبل مجلس حكام لويزيانا (AWD-AM210544).
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | VWR | 10810-070 | container for seed sterilization |
| agarose | VWR | 9012-36-6 | chemical used to suspend seeds for ease of plating |
| Arabidopsis thaliana seeds (abcb26) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_085232 | arabidopsis seeds used as experimental group |
| Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_053469C | parental arabidopsis seeds |
| Arabidopsis thaliana seeds (WT) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | Col-0 | arabidopsis wild type seeds used as a control group |
| bleach | clorox | generic bleach | chemical used to sterilize seeds |
| Carbolime absorbent | Medline products | S232-104-001 | CO2 absorbent |
| Closed FluorCam | Photon Systems Instruments | FC 800-C | Fluorescence imager |
| FluoroCam FC 800-C | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence imager |
| FluoroCam7 | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence image analysis software |
| Gelzan (plant agar) | Phytotech labs | 71010-52-1 | chemical used to solidify MS media as plates |
| glass flask 1 L | Fisherbrand | FB5011000 | container for making and autoclaving MS media |
| growth chamber | caron | 7317-50-2 | growth chamber used to grow plants |
| Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS) | Phytotech labs | M5531 | growth media for arabidopsis seedlings |
| potassium Hydroxide (KOH) | Phytotech labs | 1310-58-3 | make as 1 M solution for ph adjustment |
| spider lights | Mean Well Enterprises | XLG-100-H-AB | lights used in the light assay |
| Square Petri Dish with Grid, sterile | Simport Scientific | D21016 | used to hold MS media for arabidopsis seedlings |
| surgical tape | 3M | 1530-1 | tape used to seal plates |
| tween 20 | biorad | 9005-64-5 | surfactant used to assist seed sterilization |
References
- Peterhansel, C., et al. Photorespiration. Arabidopsis Book. 8, 0130 (2010).
- Bordych, C., Eisenhut, M., Pick, T. R., Kuelahoglu, C., Weber, A. P. Co-expression analysis as tool for the discovery of transport proteins in photorespiration. Plant Biology. 15 (4), 686-693 (2013).
- Eisenhut, M., Pick, T. R., Bordych, C., Weber, A. P. Towards closing the remaining gaps in photorespiration–the essential but unexplored role of transport proteins. Plant Biology. 15 (4), 676-685 (2013).
- Walker, B. J., VanLoocke, A., Bernacchi, C. J., Ort, D. R. The costs of photorespiration to food production now and in the future. Annual Review of Plant Biology. 67 (1), 107-129 (2016).
- South, P. F., et al. Bile acid sodium symporter BASS6 can transport glycolate and is involved in photorespiratory metabolism in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 29 (4), 808-823 (2017).
- Pick, T. R., et al. PLGG1, a plastidic glycolate glycerate transporter, is required for photorespiration and defines a unique class of metabolite transporters. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 110 (8), 3185-3190 (2013).
- Kuhnert, F., Schlüter, U., Linka, N., Eisenhut, M. Transport proteins enabling plant photorespiratory metabolism. Plants. 10 (5), 880 (2021).
- Badger, M. R., Fallahi, H., Kaines, S., Takahashi, S. Chlorophyll fluorescence screening of Arabidopsis thaliana for CO2 sensitive photorespiration and photoinhibition mutants. Funct Plant Biology. 36 (11), 867-873 (2009).
- Ogawa, T., Sonoike, K. Screening of mutants using chlorophyll fluorescence. Journal of Plant Research. 134 (4), 653-664 (2021).
- Kleffmann, T., et al. The Arabidopsis thaliana chloroplast proteome reveals pathway abundance and novel protein functions. Current Biology. 14 (5), 354-362 (2004).
- Hempel, J. J. . Molecular characterization of the plastid-localized ABC protein TAP1 in Arabidopsis thaliana. , (2018).
