クロロフィル蛍光解析による光呼吸変異体の光合成効率評価
Summary
クロロフィル蛍光を用いて低CO2 処理後の植物の光合成効率の変化を測定する手法について述べる。
Abstract
光合成と光呼吸は、植物の一次代謝における最大の炭素フラックスを表し、植物の生存に必要です。光合成と光呼吸に重要な酵素と遺伝子の多くは、何十年にもわたってよく研究されてきましたが、これらの生化学的経路のいくつかの側面といくつかの細胞内プロセスとのクロストークはまだ完全には理解されていません。植物の代謝に重要な遺伝子とタンパク質を特定した研究の多くは、高度に制御された環境下で行われており、自然環境や農業環境下で光合成と光呼吸がどのように機能するかを最もよく表していない可能性があります。非生物的ストレスが光合成効率を阻害することを考慮すると、非生物的ストレスとその光合成への影響の両方をモニタリングできるハイスループットスクリーンの開発が必要である。
そこで、クロロフィル蛍光解析と低CO2 スクリーニングを用いて、光呼吸に関与する特徴のない遺伝子を同定できる、非生物的ストレスによる光合成効率の変化を比較的迅速にスクリーニングする方法を開発しました。本論文では、 シロイヌナズナの転写DNA(T-DNA)ノックアウト変異体の光合成効率の変化を調べる方法について説明します。同じ方法を、エチルメタンスルホン酸(EMS)誘発変異体のスクリーニングまたはサプレッサースクリーニングに使用することができる。この方法を利用することで、植物の一次代謝と非生物的ストレス応答のさらなる研究のための遺伝子候補を特定することができます。この方法からのデータは、増加したストレス環境にさらされるまで認識されない可能性のある遺伝子機能への洞察を提供することができます。
Introduction
農家の畑で一般的に見られる非生物的ストレス条件は、光合成効率を低下させることにより、作物収量に悪影響を与える可能性があります。熱波、気候変動、干ばつ、土壌塩分などの有害な環境条件は、CO2の利用可能性を変化させ、高い光ストレスに対する植物の反応を低下させる非生物的ストレスを引き起こす可能性があります。2つの最大の陸生炭素フラックスは、植物の成長と作物収量に不可欠な光合成と光呼吸です。これらのプロセスに関与する重要なタンパク質および酵素の多くは、実験室条件下で特性評価され、遺伝子レベルで同定されています1。光合成と光呼吸の理解には多くの進歩が見られましたが、植物小器官間の輸送を含む多くのステップは特徴付けられていません2,3。
光合成に次いで植物で2番目に大きい炭素フラックスである光呼吸は、酵素Rubiscoが二酸化炭素の代わりに酸素をリブロース1,5ビスリン酸(RuBP)に固定し、阻害化合物2-ホスホグリコール酸(2PG)1を生成するときに始まります。2PGの阻害効果を最小限に抑え、以前に固定された炭素をリサイクルするために、C3植物は光呼吸の多器官プロセスを進化させました。光呼吸は、2分子の2PGを1分子の3-ホスホグリセリン酸(3PGA)に変換し、C3炭素固定サイクル1に再入することができます。したがって、光呼吸は、2PGの生成から以前に固定された炭素の75%のみを変換し、その過程でATPを消費します。その結果、光呼吸のプロセスは、水の利用可能性と成長期の気温に応じて、光合成プロセスに10%〜50%の大幅な抗力をもたらします4。
光呼吸に関与する酵素は何十年にもわたって研究の焦点となってきましたが、少なくとも25の輸送ステップがプロセスに関与しているにもかかわらず、遺伝子レベルで特徴付けられている輸送タンパク質はごくわずかです5,6,7。光呼吸過程で発生する炭素の移動に直接関与する2つの輸送タンパク質は、プラスチジン酸/グリセリン酸トランスポーターPLGG1と胆汁酸ナトリウムシンポーターBASS6であり、どちらも葉緑体5,6からのグリコール酸の輸出に関与しています。
周囲[CO2]の下で、Rubiscoは酸素分子を約20%の確率でRuBPに固定します1。植物が低[CO2]にさらされると、光呼吸速度が増加するため、低[CO2]は、高い光呼吸ストレス下で重要になる可能性のある突然変異体を試験するのに理想的な環境になります。追加の推定葉緑体輸送タンパク質T-DNA株を低CO2下で24時間テストし、クロロフィル蛍光の変化を測定することで、光呼吸変異表現型5を示すbass6-1植物株が同定されました。さらなる特性評価により、BASS6が葉緑体の内膜にあるグリコール酸トランスポーターであることが実証されました。
この論文は、葉緑体膜内に位置する推定輸送タンパク質のリストから来た、光呼吸トランスポーターとしてBASS6を同定するために最初に使用されたものと同様のプロトコルを詳細に説明しています8 このプロトコルは、熱などの非生物的ストレスの範囲下で光合成効率を維持するために重要な遺伝子を同定する方法として、シロイヌナズナT-DNA変異体またはEMS生成変異植物を特徴付けるハイスループット実験に使用することができる。 高い光ストレス、干ばつ、およびCO2 の可用性。クロロフィル蛍光を用いた植物変異体のスクリーニングは、一次代謝に重要な遺伝子を迅速に同定するために過去に使用されてきました9。シロイヌナズナのゲノムの30%にも、機能が不明または特性が不十分なタンパク質をコードする遺伝子が含まれているため、ストレス誘発による光合成効率の解析は、変異植物の制御条件下では観察されない分子機能に関する洞察を提供する可能性があります10。この方法の目的は、低CO2 スクリーニングを用いて光呼吸経路の変異体を同定することである。我々は、低CO2への曝露後に光呼吸を妨害する変異体を特定する方法を提示する。この方法の利点は、比較的短時間で行うことができる苗のハイスループットスクリーニングであるということです。ビデオプロトコルセクションは、種子の調製と滅菌、植物の成長と低CO2 処理、蛍光イメージングシステムの構成、処理されたサンプルの量子収率の測定、代表的な結果、および結論に関する詳細を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このホワイトペーパーで概説されている実験方法には、いくつかの利点と制限があります。1つの利点は、この方法が多くの植物苗をスクリーニングできることですが、メッキおよび成長プロセス中の植物培地プレートの汚染を防ぐためにいくつかの予防措置を講じる必要があります。したがって、シロイヌナズナプレートをサージカルテープで密封することが重要です。この実験の別の利点…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ルイジアナ州理事会(AWD-AM210544)から資金提供を受けました。
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | VWR | 10810-070 | container for seed sterilization |
| agarose | VWR | 9012-36-6 | chemical used to suspend seeds for ease of plating |
| Arabidopsis thaliana seeds (abcb26) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_085232 | arabidopsis seeds used as experimental group |
| Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_053469C | parental arabidopsis seeds |
| Arabidopsis thaliana seeds (WT) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | Col-0 | arabidopsis wild type seeds used as a control group |
| bleach | clorox | generic bleach | chemical used to sterilize seeds |
| Carbolime absorbent | Medline products | S232-104-001 | CO2 absorbent |
| Closed FluorCam | Photon Systems Instruments | FC 800-C | Fluorescence imager |
| FluoroCam FC 800-C | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence imager |
| FluoroCam7 | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence image analysis software |
| Gelzan (plant agar) | Phytotech labs | 71010-52-1 | chemical used to solidify MS media as plates |
| glass flask 1 L | Fisherbrand | FB5011000 | container for making and autoclaving MS media |
| growth chamber | caron | 7317-50-2 | growth chamber used to grow plants |
| Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS) | Phytotech labs | M5531 | growth media for arabidopsis seedlings |
| potassium Hydroxide (KOH) | Phytotech labs | 1310-58-3 | make as 1 M solution for ph adjustment |
| spider lights | Mean Well Enterprises | XLG-100-H-AB | lights used in the light assay |
| Square Petri Dish with Grid, sterile | Simport Scientific | D21016 | used to hold MS media for arabidopsis seedlings |
| surgical tape | 3M | 1530-1 | tape used to seal plates |
| tween 20 | biorad | 9005-64-5 | surfactant used to assist seed sterilization |
References
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