Biology

使用冻热裂解和同量异位载体进行质谱分析的单细胞蛋白质组学制备

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63802

Aleksandra A. Petelski*¹, Nikolai Slavov^1,2,3, Harrison Specht*¹

¹Department of Bioengineering, Northeastern University, ²Barnett Institute, Northeastern University, ³Department of Biology, Northeastern University

* These authors contributed equally

Summary

在该协议中，我们描述了如何使用市售试剂和设备通过质谱 法制备 哺乳动物细胞以进行单细胞蛋白质组学分析，并提供手动和自动移液选项。

Abstract

单细胞蛋白质组学分析需要灵敏、定量准确、广泛可及且稳健的方法。为了满足这些要求，单细胞蛋白质组学（SCoPE2）方案被开发为第二代方法，用于定量来自有限样品的数百至数千种蛋白质，直至单个细胞的水平。使用这种方法的实验在10天的质谱仪仪器时间内实现了1，500个单个哺乳动物细胞（每个细胞500-1，000个蛋白质）的3，000多种蛋白质的定量。SCoPE2利用冻热循环进行细胞裂解，无需对单个细胞进行净化，从而减少样品损失，同时加快样品制备并简化其自动化。此外，该方法使用同量异位载体，这有助于蛋白质鉴定并减少样品损失。

该视频实验方案提供了详细的指导，以便仅使用广泛使用的设备和试剂即可采用自动化单细胞蛋白质分析。我们展示了制备用于蛋白质组学分析的单细胞过程中的关键步骤，从收获到进样再到液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。此外，还将引导观众了解同量异位载体的实验设计原则、同量异位载体和单细胞制备的质量控制，以及讨论该方法局限性的代表性结果。

Introduction

单细胞分析被广泛用于研究生物系统内的异质性水平，否则通过^{批量测量无法}辨别1，²^，³。这种细胞多样性可以产生功能后果，可以进一步了解整体生物过程，从癌细胞治疗耐药性⁴，⁵，⁶到糖尿病的细胞间异质性⁷，⁸，⁹^，¹⁰。许多研究都集中在通过测量遗传或转录组水平来测量单细胞中的核酸，并能够对细胞类型和状态进行分类。然而，核酸领域的这种进展无法填补转录后调控¹¹的知识空白，这推动了对单细胞¹²，13^，¹⁴^，¹⁵中类似高通量蛋白质测量的需求。

我们开发了SCoPE2^16，17^，^以满足对哺乳动物系统严格而强大的单细胞蛋白质组学的需求。它是一种多路复用方法，与在^时间19，²⁰分析一个细胞的无标记mthod相反^，通过并行标记和分析许多细胞¹⁸来提高通量。样品制备方法、质谱方法和随后的数据分析步骤允许对每个单细胞的数百至数千种蛋白质进行准确定量。该方法使得通过同量异位载体21对单细胞进行质谱分析成为可能，同量异位载体²¹是一小批细胞样品（通常为25-200），在生物学上与感兴趣的单细胞群相似。通过使用串联质量标签（TMT标签），该载体材料与相同材料和单个细胞的参考通道成组复用。载体通道可减少样品损失到表面积，并为成功鉴定肽提供离子骨架片段。参比通道是批量制备的，随后稀释至每个单细胞组的5-10个细胞当量，有助于控制分析中的技术变异性。具体而言，该基准电压源允许对LC-MS/MS相关效应（如离子采样和电离效率）引起的变异性进行归一化。通常，参比和载体通道由相同的细胞群组成。

该样品制备方案是在SCoPE-MS²²的基础上通过多种协同改进构建的第二代方法。这些改进包括避免样品净化的细胞裂解方法，这是MS蛋白质组学制备的常见步骤。它使用mPOP（最小蛋白质组学样品制备）²³，这是一种冷冻热裂解方法。该方法能够以更小的体积和多孔板而不是小瓶裂解单细胞，从而促进热循环仪的更高通量和自动化。总之，与SCoPE-MS¹⁶，²⁴相比，该方法降低了每个单细胞的成本^，提高了定量准确性。

该协议描述了如何制备用于蛋白质组学分析的单细胞，包括如何使用TMTpro 18重同量异位标记制备载体和参考通道。处于单细胞悬液中并且可以分离到384孔板中的哺乳动物细胞可能适合该协议。还包括成功的单细胞组的代表性结果，显示了由R Shiny应用程序DO-MS²⁵生成的几个质量控制图。其他已发表的软件工具26，27和实验指南¹⁷^，²¹改进了该协议的采用。我们希望该视觉指南将进一步帮助研究人员进行单细胞蛋白质组学实验。

Protocol

注意：在此协议中，室温（RT）为18-22°C。

1. 载体和参考物质生成

细胞分离
1. 将感兴趣的细胞收集到冰冷的1x PBS中的细胞悬浮液中。
  注意：如果可能，载体和参考物质应从选择在单细胞水平上研究的细胞群中制备。来自不同实验条件的相似数量的细胞（如受刺激和未受刺激的免疫细胞）应构成载体和参考。在无法收获足够数量的这些细胞的情况下，应根据生物学相似性选择合适的细胞群。
2. 使用血细胞计数器或其他细胞计数方法（如FACS），计数悬浮液中的细胞数量。
3. 将每种细胞类型的 22，000 个细胞分别旋转并重悬于 11 μL HPLC 级水中，分别放入 PCR 管（标准 250 μL PCR 管）中。
  注意：此处建议的细胞数量对于载体和参考文献来说足以满足可以从充满单细胞的384孔板制备的组数。此步骤中的细胞输入和后续步骤中的试剂量可以按比例缩放，以获得更多的组数。旋转的速度取决于实验室的细胞培养实践。典型的旋转下降：300 × g 5 分钟。
4. 将样品转移到-80°C冰箱中至少30分钟。
  暂停点：样品可以保持冷冻数月，对单细胞数据没有影响。
细胞裂解
1. 将带有细胞的PCR管加热至90°C10分钟（热循环仪盖设置为105°C），然后在加热循环后立即让管冷却至12°C。
2. 短暂涡旋试管，然后在室温下在台式PCR管旋转器中向下旋转，以收集管底部的所有液体。
3. 在水浴超声仪中，将试管超声处理5分钟，然后将它们放在室温的冰上。
胰蛋白酶消化
1. 在冰上向每个样品管中加入 2.2 μL 预混液（组分见 表 1 ）。
  注意：胰蛋白酶会引起皮肤、呼吸道和眼睛刺激。请务必穿戴个人防护装备。在化学通风橱下处理。
2. 短暂涡旋试管以混合并在室温的台式PCR管旋转器中旋转，以收集每个试管底部的所有液体。
3. 将样品在37°C下加热3小时（热循环仪盖设置为52°C）。
TMT标记反应
1. 在室温下在台式PCR管旋转器中消化后旋转样品。
2. 将每个样品分成两个相等体积，每个体积为 6.6 μL，使每个试管包含 11，000 个细胞。
3. 向用于载体的管中，加入 3.3 μL TMT 标记物 126，该标记物已以 85 mM 的浓度重悬。
4. 向用于参考的试管中加入 3.3 μL TMT 标记物 127N，该标记物已以 85 mM 的浓度重悬。
5. 短暂涡旋试管并在室温下在台式PCR管旋转器中向下旋转以收集底部的液体。
6. 将试管在室温下放置1小时。
TMT标记反应的淬灭
1. 向每个试管中加入 1.65 μL 0.5% 羟胺。
  注意：羟胺会引起皮肤刺激。请务必穿戴个人防护装备。
2. 短暂涡旋试管并在室温下在台式PCR管旋转器中向下旋转以收集底部的液体。
3. 将试管在室温下放置30分钟。
载波和参考的组合
1. 如果构成载体的样品已单独标记，请以相等的比例混合。
2. 如果构成参比的样品已单独标记，请以相等的比例混合它们。
3. 混合载体和参比物，使载体的终浓度为100-200个细胞/μL，参比浓度为5-10个细胞/μL。
4. 在将载体和参考材料与单细胞组组合之前，评估载体和参考材料的质量。
  注意：载体和参考物质的质量控制可以通过多种方法进行，但建议使用DO-MS软件，该软件可在^{do-ms.slavovlab.net 17}中找到。质量的关键测量值包括错裂率（<25%，该指标的计算方法是：漏裂的可靠鉴定肽数除以可信鉴定肽总数）和标记效率（>99%，该指标计算为标记位点的数量，即肽N末端和赖氨酸，标记除以标记位点总数）。
  暂停点：载体和参考物质可以储存在-80°C，直到需要为止。

元件	混合浓度	每管最终浓度
胰蛋白酶金	50 纳克/微升	8.33 纳克/微升
钛，pH = 8.5	500 毫米	83.33 毫米
苄佐酶核酸酶	1.2 单位	0.2 单位

表1：预混液的试剂量。 列出了胰蛋白酶消化所需的试剂的最终浓度。

2. SCoPE2样品制备

细胞分离
1. 每μL合成肽溶液中每肽补充25 fmol的HPLC级水。
  注意：沃特世MassPrep肽溶液是可以使用的一个例子。它由七种不能很好地电离的肽组成。这是该解决方案的一个关键方面：这些肽不会干扰单细胞的准确质谱定量。任何不太可能在目标样品中的几种肽的高度纯化混合物都是合适的。
2. 使用液体分配机器人或手动移液器向 384 孔板的每个孔中加入 1 μL 该混合物。
3. 密封板并在室温的台式板旋转器中旋转，以收集底部的液体。
  暂停点：带有该溶液的板可以储存在-80°C，直到需要为止。
4. 获得解聚的未固定细胞的悬浮液。
  注意：如何准确获得细胞悬液取决于感兴趣的细胞类型。以下是广泛的示例：
  1. 悬浮细胞：将细胞旋转成沉淀，并除去细胞培养基。
  2. 贴壁细胞：通过胰蛋白酶消化或刮擦从培养皿或烧瓶中取出细胞。然后，旋转它们以除去细胞培养基。
5. 用1x冰冷的PBS清洗细胞悬液两次。第二次洗涤后，将细胞悬浮在1x PBS中。
6. 如果384孔板被冷冻，请在室温下解冻。旋转以确保所有液体都在孔底部。
7. 使用细胞分选仪或其他可用方法（例如手动手动拾取）将单个细胞分配到相应的孔中。
  注意：将单个细胞添加到孔中，同时将一些孔留空以进行阴性和阳性对照（请参阅讨论）。使用流式细胞术时，应使用尽可能低的流式速进行流式细胞仪。较低的流速被认为对细胞处理更温和。此外，喷嘴尺寸应适合与感兴趣的细胞一起使用。建议与流式细胞术设施合作。
8. 将 2-5 个细胞当量裂解物的阳性对照添加到手动移液或使用液体处理机器人移液的选定孔中。
9. 在室温的台式板旋转器中用分选的细胞密封并旋转板，以收集底部的液体。尽快将板冷冻在-80°C。
  暂停点：带有分选单细胞的板可以储存在-80°C，直到需要为止。
细胞裂解
1. 取带有分选单细胞的384孔板，并尽快将其放入热循环仪中。
2. 将板加热至90°C10分钟（盖子温度设置为105°C），然后让板冷却至12°C。
3. 在室温下在台式板旋转器中短暂旋转板。
4. 在水浴超声仪中，在室温下超声处理板5分钟，然后将其放在冰上。
胰蛋白酶消化
1. 每 384 孔板准备 100 μL 预混液（组分见 表 1 ）。
2. 向 384 孔板的每个孔中，使用液体处理器加入 0.2 μL 在步骤 2.3.1 中制备的预混液。
  注意：如果使用手动移液，请使用更大的体积，确保每孔试剂的最终浓度仍然相同。
3. 密封板，涡旋5秒，然后在室温下在台式板旋转器中向下旋转。
4. 将384孔板在37°C（盖子温度设置为52°C）下加热3小时。
TMT标记反应
1. 从-80°C冰箱中取出85 mM的TMT标签（128N至135N）库存。在打开试管之前将试管加热至室温。
2. 将标记物在无水乙腈中稀释至22mM。
  注意：乙腈是一种易燃液体。它会刺激皮肤、眼睛、呼吸道和中枢神经系统。请务必穿戴个人防护装备。在化学通风橱下处理。
3. 使用此标记策略，向 384 孔板的每个孔中加入 0.5 μL 稀释的 TMT 标记。使用液体分配机器人（如果使用液体处理器，请确保使用适用于有机溶剂的相关设备）或手动移液器。
  注意：有关标记策略，请参阅 表 2 。有关板布局示例，请参见 表 3 。
4. 密封板，涡旋5秒，然后在室温下在台式板旋转器中向下旋转。
5. 让标记反应在室温下进行1小时。
TMT标记反应的淬灭
1. 向 384 孔板的每个孔中，使用液体处理器加入 0.2 μL 0.5% 羟胺（在 HPLC 级水中稀释）。
  注意：如果使用手动移液，请使用更大的体积，确保每孔试剂的最终浓度仍然相同。
2. 密封板，涡旋5秒，然后在室温下在台式板旋转器中向下旋转。
3. 将板保持在室温下30分钟。
LC-MS/MS分析的制备：将单细胞和对照孔与载体/参考物质相结合
1. 从-80°C冰箱中取出组合的载体/参考物质。
2. 对于每组，将 1 μL 载体和参考物质移液到将成为单组一部分的第一孔中。将第一口井的全部体积移液到后续孔中。继续将整个体积从一个细胞移液到下一个细胞，直到要包含在一组中的所有孔都合并到最终孔中。
  注意：载体和参考物质的浓度应分别为200和5细胞当量，但如前^所述21，这些量可能会有所不同。如标记策略（见表2）所述，当使用TMTpro-16plex或TMTpro-18plex时，每组应分别包含载体、参比和最多12或14个单细胞或对照样品（参见步骤2.4.3）。
3. 对于每组，向每组中包含的第一个单细胞孔中加入 5 μL 50% 乙腈（用 HPLC 级水稀释）。将整个体积从第一个孔移液到下一个孔。继续将整个体积从一个细胞移液到下一个细胞，直到要包含在一组中的所有孔都合并到最终孔中。
  注意：该洗涤步骤有助于从孔中回收样品。
4. 将每组转移到各自的自动进样器玻璃插件中。
  注意：这些套件也可以组合成384孔板的单孔，并直接放置在自动进样器中进行进样²⁸。
5. 将所有组组合并放入玻璃插入物中后，干燥样品。
  暂停点：干燥的套装可以在-80°C下储存至少1周，然后再在质谱仪上运行。
6. 在进行LC-MS/MS分析之前，向每组添加1.2 μL 0.1%甲酸（用HPLC级水稀释），以重悬标记的肽。
  注意：甲酸是一种易燃液体。它可能导致严重的眼睛损伤或皮肤灼伤。请务必穿戴个人防护装备。在通风良好的地方处理。
7. 将自动进样器插入物放入玻璃自动进样器小瓶中，并用盖子关闭每个样品。
8. 涡旋每个小瓶5秒以确保重悬完成，然后在室温下在小瓶旋转器中旋转。
9. 确保每个样品都在插入物的底部，而不是溅在侧面。
10. 将样品瓶放入自动进样器托盘中。
11. 对于每组，进样 1 μL 进行 LC-MS/MS 分析。

标签	126	127N	127C	128N	128摄氏度	129N	129摄氏度	130N	130摄氏度	....	135N
样品类型	载体	参考	空	空	SC/控制	SC/控制	SC/控制	SC/控制	SC/控制	....	SC/控制

表 2：SCoPE2 TMTpro-18plex 标记方案示例。 载波和参考通常在前两个TMT标签中标记。然后，由于潜在的同位素污染，接下来的两个标记被跳过，这将使定量准确性降低。剩下的其他标签用于单个单元格或控件。

128摄氏度

129N

129摄氏度

130N

130摄氏度

131N

131C

132N

132C

133N

133C

134N

128摄氏度

129N

129摄氏度

130N

130摄氏度

131N

131C

132N

132C

133N

133C

134N

一个

南卡罗来纳州

我

南卡罗来纳州

表 3：使用 TMTpro-16plex 标记的印版布局示例。 使用384孔板格式（或任何其他板格式），随机化细胞分选的孔很重要。TMTpro-18plex将使用不同的板布局。

Representative Results

协议的积极结果需要验证协议中的一些关键步骤是否已成功执行;其中包括载体制备、单细胞分离、裂解、消化、条形码标记和 MS 参数优化。DO-MS图可以轻松评估协议中每个关键步骤的完成情况。成功制备的载体，通常相当于25和200个细胞的数量（每组），被充分消化和标记。DO-MS的绘图可以量化样品的强度（估计数量），消化效率（理想情况下<25%的裂解）和标记效率（必须为>99%）。最关键的是，未完全标记的载体样品可能允许与用于单细胞的条形码发生交叉反应，并为单细胞肽的定量添加杂散信号。

阴性对照孔包括所有实验试剂，但缺少细胞。这样不仅可以评估背景噪声，还可以通过提供空孔的代表性信号来确定电池隔离效率。DO-MS报告提供了评估对照孔和单细胞孔测量信号的图，以确定细胞分离和背景噪声的成功。此外，可以使用SCoPE2管道（可在GitHub：github.com/SlavovLab/SCoPE2 上获得）或SCP Bioconductor包²⁹来评估定量质量。

单细胞的酶切和标记效率可能不像载体那样直接测定，但DO-MS再次提供了允许估计消化和标记效率的图。通过在制备单细胞的同时包括100-200个细胞的对照（即，接受所有相同的试剂添加），可以评估该对照的酶切和标记效率，并假设由一起制备的单细胞共享。消化不良将通过混裂肽与其完全裂解的对应物的强度高来表示（图1）。

集合中要考虑的另一个因素是缺失数据的比例和每个TMT通道中报告离子强度的中位数（图2）。当成功制备单细胞时，每个细胞和阳性对照的缺失数据量远低于阴性对照样品。同样，单细胞和阳性对照中前体的中位强度远高于阴性对照。MS参数的优化已在其他地方²¹中进行了广泛讨论，并且可以使用DO-MS或SCP Companion²⁵^，²⁷等工具确定最佳参数。

图 1：载体制备质量控制。 DO-MS图描绘了（A）成功制备的载体在TMT标记位点的标记效率：赖氨酸侧链上的伯胺和肽N末端，以及（B）胰蛋白酶切割氨基酸残基的消化效率。缩写：TMT = 串联质量标签。请点击此处查看此图的大图。

图 2：单细胞制备质量控制。 DO-MS图描述了（A）单细胞（C5-10），对照（C13，16），载体（C1）和参考（C2）中缺失数据的比例，以及（B）单细胞和对照的强度。对应于 C3、C4、C11、C12 和 C15 的标记 127C、128N、131C、132N、133N 和 133C 在此特定集中未使用。阳性对照包括大量加工成肽的细胞材料，然后在标记前稀释至2-5个细胞/μL的水平。阴性对照包括一个接受用于单细胞的所有准备步骤的孔，只是没有添加单个细胞。缩写：TMT = 串联质量标签。请点击此处查看此图的大图。

Discussion

通过SCoPE2成功制备和分析单细胞的关键之一是载体和参比通道的制备。建议的载体大小为100至200个细胞;然而，特定单细胞实验所需的细胞数量可以根据其他地方讨论的^{原理确定21}。对于建议的大小，每384孔板至少需要~11，275个细胞，允许每组200细胞载体和5细胞参考。如果所需的细胞群不是限制因素，则分离更多细胞可能是有利的，只需在出现错误的情况下获得额外的材料（如本协议中所做的那样，分离22，000个细胞而不是11，275个细胞）。所需板数所需的载体和参比量应在单个批次中制备，以尽量减少可能导致批次间肽鉴定或定量差异的任何批次间差异。

在将单细胞分离到384孔板的孔中之前，重要的是要考虑板布局的设计。在每个384孔板内，建议同时实施阳性和阴性对照。阴性对照是未添加细胞但经历与单细胞孔相同的试剂添加和程序的孔。阳性对照是加入稀释至2-5个细胞/μL的细胞裂解物而不是单个细胞的孔。当单细胞分离方法没有得到充分验证时，这一点尤其重要。理想情况下，每个384孔板应具有单细胞和对照的随机分布（例如，不要仅在一行中具有阴性或阳性对照）。每个平板应具有所有感兴趣的细胞群的均匀分布，而不是在一个平板中分离一种细胞类型，在第二个平板中分离第二种细胞类型。这将避免将批次效应与感兴趣的细胞类型联系起来。此外，如果需要一个以上的384孔板进行分析，建议在单个会话中分离细胞，而不是尽可能将分离步骤分散几天。

单细胞和载体/参比物质的裂解通过冻热循环在水中发生²³。预计大多数蛋白酶在此步骤中已经变性。然后在变性步骤后立即以高浓度加入胰蛋白酶，其浓度甚至比最丰富的细胞蛋白酶高出许多数量级。通过质量作用，蛋白酶活性的大多数产物将由胰蛋白酶引起。

在胰蛋白酶消化之前，半胱氨酸残基的还原/烷基化不在本方案中进行。含半胱氨酸的肽约占人类蛋白质组胰蛋白酶肽的 10%。我们使用没有还原/烷基化的方法观察到较少的含半胱氨酸肽。这些步骤使用与消化后立即通过TMT（NHS-酯化学）标记不相容的试剂。

在这种TMT标记策略中，载流子和参比物分别用126和127N标记，而单细胞和对照孔用128C至135N标记。参考文献之后的两个标记127C和128N由于载体和参比通道引起的同位素交叉污染而未使用，而载体和参考通道在肽材料中的含量显然比单细胞丰富得多。总共每组有12个TMT通道，可用于用TMTpro-16plex标记单细胞或对照孔，或者用TMTpro-18plex每组有14个TMT通道。

使用该协议进行单细胞蛋白质组学测量的方案中的关键步骤包括载体制备、单细胞分离、裂解、消化、条形码标记和适当的质谱参数。这些步骤已在本文档中概述，并在其他地方进行了广泛的详细说明¹⁷，²¹^，²⁵。每个步骤都有一个相应的图或一组图在DO-MS中，可以轻松进行质量控制。例如，在成功创建载体的情况下，描述鉴定肽的数量、标记效率和裂解率百分比的图可以验证其成功制备。具有代表性的DO-MS报告包含在本出版物中，原始数据可在 http://scope2.slavovlab.net/ 中看到¹⁶。这些DO-MS报告允许在作者尚未研究的方向上评估方法的优化，例如更长的LC梯度，不同的消化酶或替代化学条形码。

目前，通过数据依赖性采集算法对肽进行连续分析限制了在合理长度的液相色谱运行中可以分析的肽数量。这部分是由于成功采集足够离子以进行可靠的单细胞定量所需的较长填充时间²¹。使用载体的一个固有限制是缺乏对单细胞的消化和标记效率的直接评估。目前，解决这一限制的一种解决方案是对与单细胞一起处理的较大样品进行质量控制。

我们提出了许多改进单细胞蛋白质组学的机会，例如使用多个分析仪构建质谱仪。目前的方法允许使用市售试剂和设备以每天约100个细胞的速度定量来自单个哺乳动物细胞的数千种蛋白质。SCoPE2是第二代SCoPE-MS方法，在单位时间内可分析的细胞数量、单位时间内可分析的蛋白质数量、样品制备所需的时间、试剂和设备的可及性以及每个单细胞制备和分析的总体成本方面，均显著改进了其前代方法。使用冻热裂解和蛋白酶消化即可获得膜结合蛋白，如尿素裂解²³相比所示。该方法根据丰度从蛋白质组的前三分之一中鉴定出许多蛋白质¹⁶。如果修饰的蛋白质型位于蛋白质组的前三分之一，并且修饰的肽适合质谱分析（电离良好，与未修饰的肽具有质量数差异），则更有可能适合该协议。该方法可以有效地应用于细胞之间存在有意义的异质性的生物系统，例如分化，衰老或免疫反应（即吞噬作用）。

Disclosures

作者没有利益冲突。

Acknowledgments

我们要感谢资助本出版物的 2021 年秋季 NSF I-Corps 计划（东北大学网站）奖。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
384-well plate, standard PCR plate	Thermo Fisher Scientific	AB1384	Polypropylene plates should be used, if need to substitute. If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Acetonitrile (for preparation of buffers), Optima LC-MS/MS grade	Fisher Scientific	A955-1	This acetonitrile is used for any buffers, namely the 50% acetonitrile that is used to pass through wells after passing through the carrier and reference when combining SCoPE2 sets. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Acetonitrile (for preparation of TMT ), anhydrous, 99.8%	Sigma Aldrich	271004-100ML	This acetonitrile is used to resuspend TMT labels at the manufacturer concentration. Caution: Acetonitrile is a flammable liquid. It can irritate skin, eyes, respiratory tract, and central nervous system. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Adhesive PCR plate foils	Thermo Fisher Scientific	AB0626
Autosampler vial screw thread caps	Thermo Fisher Scientific	C5000-51B
Autosampler vial spinner (i.e. myFuge 5)	MTC Bio	C2595	This model does not have any speed control. It is simply used to colelct liquid at the bottom of autosampler vials.
Benzonase nuclease	Sigma Aldrich	E1014-25KU
Clear glass screw thread vials, 9 mm	Thermo Fisher Scientific	60180-509
Formic Acid, Pierce, LC-MS/MS grade	Thermo Fisher Scientific	85178	Caution: Formic acid is a flammable liquid. It can cause serious eye damage or skin burns. Be sure to wear personal protective equipment. Handle in a well-ventilated area.
Glass autosampler inserts, 9 mm	Thermo Fisher Scientific	C4010-630
Hydroxylamine (HA), 50% wt/vol	Sigma Aldrich	467804-50ML	Caution: Hydroxylamine can cause skin irritation. Be sure to wear personal protective equipment.
Mantis microfluidic chips, low-volume 3PFE chips	Formulatrix	MCLVPR2	These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense organic solutions. These can be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic chips, low-volume silicone chips	Formulatrix	MCLVS12	These chips are meant to be used with the Mantis microfluidics liquid handler to dispense aqueous solutions. These cannot be used to dispense TMT labels.
Mantis microfluidic liquid handler	Formulatrix		Liquid handler can be substituted. However, it is important to check if the system is compatible with 100% acetonitrile (as in the case of TMT labels), and that the system does not introduce polymer contamination or other type of contamination into the samples.
Mantis PCR plate adapter with wide conical pins for automated plate handling	Formulatrix	232400
MassPREP peptide mixture	Waters	186002337	Mixture of nine nontryptic peptides
PCR tube spinner (i.e., 16-place microcentrifuge for 0.2 mL tubes)	USA Scientific	2621-0016	This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of tubes.
PCR tubes: TempAssure 0.2 mL PCR 8-tube strips	USA Scientific	1402-3900	If substituted, levels of potential polymer contamination from other plates should be assessed prior to SCoPE2 preparation.
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4, RNase-free	Thermo Fisher Scientific	AM9625
Plate spinner (i.e., PlateFuge microcentrifuge)	Benchmark Scientific	Model C2000	This model does not have any speed control. It is simply used to collect liquid at the bottom of wells.
Thermal Cycler (i.e., C1000 Touch with 384-well module)	Biorad	1851138
TMTpro 16plex Label Reagent Set, 1 x 5 mg	Thermo Fisher Scientific	A44520
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M, pH 8.5	Sigma Aldrich	T7408100ML
Trypsin Gold Mass Spectrometry Grade	Promega	V5280	This is trypsin is of very high purity. Other trypsin reagents can vary in their levels of purity. Level of purity is important for achieving positive SCoPE2 results. Caution: Trypsin can cause skin, respiratory, and eye irritation. Be sure to wear personal protective equipment. Handle under a chemical fume hood.
Vortex (Analog vortex mixer)	VWR	Model 58816-121
Water bath sonicator (i.e., 2.8 L ultrasonic cleaner with digital timer)	VWR	97043964
Water, Optima LC-MS/MS grade	Fisher Scientific	W6-1	All solutions that need to be diluted or made are recommended to be made with mass-spectrometry grade water. Any dilutions and/or master mixes should be made fresh. Contamination resulting from lower-grade water can negatively affect peptide detection and single-cell data quality .